Summary
Abstract
الأنف الثدييات هو جهاز متعدد الوظائف مع الهياكل الداخلية المعقدة. واصطف تجويف الأنف مع مختلف ظهائر مثل ظهائر حاسة الشم والجهاز التنفسي، والحرشفية التي تختلف بشكل ملحوظ في المواقع التشريحية، مورفولوجيا، ووظائفها. في فئران بالغة، ويتم تغطية الأنف مع مختلف عظام الجمجمة، مما يحد من وصول التجريبية إلى الهياكل الداخلية، خصوصا تلك الموجودة في تلك الخلفية كما الظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية). نحن هنا وصف وسيلة فعالة للحصول على ما يقرب من الأنسجة الأنفية كامل وسليمة مع منظمة التشريحية الحفاظ عليها. باستخدام أدوات جراحية تحت مجهر تشريح، ونحن بشكل تسلسلي إزالة عظام الجمجمة المحيطة الأنسجة الأنفية. يمكن تنفيذ هذا الإجراء على حد سواء، ورؤساء الماوس البشرة بارافورمالدهيد ثابتة وتشريح طازجة. الإجراء deboning كامل يستغرق حوالي 20-30 دقيقة، والذي هو أقصر بكثير من الوقت التجريبية اللازمة لدي التقليدية القائمة على المواد الكيميائيةتكلس. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة سهلة لإزالة فقاعات الهواء المحبوس بين القرائن، وهو أمر حاسم للحصول على أجزاء متصلة أفقيا أو الاكليلية أو السهمي رقيقة من إعداد الأنسجة الأنفية. الأنسجة الأنفية إعدادها باستخدام طريقة لدينا يمكن استخدامها لمراقبة كامل جبل من ظهائر بأكمله، فضلا عن المورفولوجية، immunocytochemical، RNA التهجين في الموقع، والدراسات الفسيولوجية، وخاصة في الدراسات حيث منطقة محددة الفحص والمقارنة هي من الفائدة.
Introduction
تجويف الأنف الثدييات يحتوي على أنواع مختلفة من الأنسجة والأجهزة التي تخدم وظائف متميزة. تجويف الأنف تشكل جزء من دخول الجهاز التنفسي العلوي، والذي يسمح السفر الجوي من وإلى الرئتين. استنشاق الهواء يمر عبر تجويف الأنف حيث يخضع لدرجة الحرارة والرطوبة تكييف 1 وكذلك تنظيف أو تصفية لإزالة المواد المهيجة والسامة والكائنات الحية الدقيقة المعدية 2. يتم تنفيذ كل من العلاجات بها الأنف ظهائر والأنسجة تحت الظهارة، بما في ذلك الغدد والأوعية وحاسمة لحماية الشعب الهوائية السفلى والرئتين. بالإضافة إلى دورها في التنفس والدفاع الظهارية، يحتوي على أنسجة الأنف أيضا الأجهزة الحسية الطرفية للأنظمة حاسة الشم والعصب الثلاثي التوائم، الذي كشف عن مجموعة واسعة من المواد الكيميائية في الهواء يمر. اعتمادا على أي نظام يتم تنشيط والكشف الحسي للمواد الكيميائية في الأنف يمكن أن تثير إماوحاسة الشم، وتهيج، أو ألم 3،4.
نظام حاسة الشم الطرفية معقدة وتتكون من عدة مفصولة تشريحيا الحواس حاسة الشم داخل تجويف الأنف. فيما بينها، والظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية) هو أكبر، والتي تشكل ما يقرب من 45-52٪ من ظهائر الأنف في القوارض (5) ويقع في المنطقة الخلفية. في المنطقة أمامي بطني، وهناك زوج من تركيبات أنبوبية المعروفة باسم الجهاز الميكعي 6، الذي يجلس على طول كل جانب من الحاجز الأنفي. مجموعتين إضافية صغيرة من الخلايا العصبية الحسية الشمية، والمعروفة باسم الجهاز الحاجز من ماسيرا 7،8 والعقدة Gruneberg 9، يقيمون على طول الحاجز البطني والمنطقة الظهرية من دخول تجويف الأنف، على التوالي. هذه الأجهزة الطرفية العصبية تحتوي على ظهائر مع السمات المميزة في التشكل والتعبير علامة الخلية، وظيفة فسيولوجية. معا أنها الكشف عن الآلاف من رائحةالجزيئات مع مجموعة رائعة وحساسية 10-12.
بالإضافة إلى الأجهزة الحسية الشمية، تجويف الأنف أيضا يضم أنظمة الحسية الأخرى. ومن المعروف أن ببتيدي المفعول الألياف العصبية مثلث التوائم موجودة في الظهارة الأنفية، وخصوصا ظهارة التنفسي 13،14. بعض من هذه الألياف كشف المواد الكيميائية المهيجة والسامة، وهي المسؤولة عن الشروع في ردود الافعال واقية مثل السعال والعطس 4،15. ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن مركبات معطر ومريرة مزعجة من قبل اكتشفت مؤخرا السكان من الخلايا حسي كيميائي الانفرادي (SCCS)، وكثير منها يتم معصب بواسطة الألياف العصبية مثلث التوائم 16-19. وتقع هذه SCCS في كثافة العالي في المنطقة من دخول تجويف الأنف والقنوات دخول الميكعي، ملمحا الى انه قد تخدم أيضا وظيفة وقائية 16-18. وبالتالي، يمكن أن الأنف ظهائر تختلف اختلافا جوهريا في وظيفة، مورفولوجيا، وتكوين الخلية اعتمادا على هممواقع التشريحية.
حتى داخل الظهارة واحدة والمتخصصة، وهناك اختلافات إقليمية. وزارة التربية والتعليم هو أحد الأمثلة على ذلك. خطوط زارة التربية والتعليم مختلف القرائن، التي هي معقدة وكرة لولبية الهياكل. بسببهم، مناطق مختلفة من تجربة وزارة التربية مختلف معدلات تدفق الهواء، وبالتالي، معدلات إزالة جزيئات رائحة المحمولة جوا 20 نشر مختلفة و. أيضا، فمن المعروف أن الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) تعبر عن مستقبلات الرائحة نظرا تقع في واحدة من أربع مناطق التحايل من وزارة التربية 21،22. كيف يؤثر هذا الاختلاف الموقع استجابة لOSN لعطور وإلى حد كبير غير معروفة. وبالإضافة إلى ذلك، بعض السكان OSN يحمل تفضيل الإقليمية. OSNs غوانيليل محلقة-D (GC-D)، معربا عن ديها توزيعات منطقتين لصالح المناطق طريق مسدود دي الكيس من ectoturbinates 23،24. وفي الآونة الأخيرة، وجدنا جزء من السكان من OSNs الكنسي الذي يعبر عابر مستقبلات المحتملة قناة M5 (TRPM5) ويقع تفضيلي في المناطق الجانبية وبطني 25. هذه النتائج تشير إلى أن وزارة التربية ليست موحدة. ولكن، كيف تؤثر هذه الاختلافات الإقليمية الترميز حاسة الشم ليست مفهومة. هذا هو في جزء منه لأن التحقيق الفسيولوجية شامل من وزارة التربية والأنف كان محدودا بسبب صعوبة الحصول على حالها الأنف ظهائر مع منظمة التشريحية المحفوظة باستخدام الأساليب الحالية.
ويحيط الأنف ظهائر في الغالب من قبل العظام الأمامي من الجمجمة، بما في ذلك الأنف، الفك العلوي، الحنكي، الوجني، وعظام الغربالي. في فئران بالغة ونماذج القوارض الأخرى، هذه العظام هي شاقة وصعبة لإزالة دون الإضرار الأنسجة الأنفية مرتبطة ارتباطا وثيقا، ولا سيما القرائن دقيق. في كثير من الأحيان، يتم استخدام زوال الكلس القائمة على المواد الكيميائية لتليين العظام للسماح cryosectioning من الأنسجة الأنفية للالمورفولوجية، المناعى، والدراسات التهجين في الموقع، ولكن depenقرع على عمر الحيوان، ويمكن أن تستمر عملية إزالة الكلس بين عشية وضحاها يصل إلى 7 أيام 24،26-28. يتم هذا العلاج محدودة أيضا لأنه يتطلب أن تكون الأنسجة تثبيتي الحفاظ عليها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة الكلس الكيميائية أن تكون قاسية وتؤثر على الوسم المناعي من بعض الأجسام المضادة الحساسة 29،30. الدراسات الفسيولوجية، مطلوب الأنسجة الحية، وبالتالي، وكثيرا ما تجرى هذه التجارب في OSNs معزولة أو شرائح زارة التربية والتعليم التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة الذين هم رقيقة وناعمة 17،31،32 عظام الجمجمة. يمكن أيضا الاستفادة من الدراسات الفسيولوجية الاستعدادات جبل بأكمله عن طريق تقسيم رأس 25،33،34، ولكن عادة فقط على السطح الإنسي من الأنف يمكن الوصول إليه بسهولة، مما يحد من التسجيلات الفسيولوجية على مجالات أخرى.
هنا، نحن تصف، طريقة deboning دليل فعالة لإعداد الأنسجة الأنفية سليمة مع الحفاظ على منظمة التشريحية الأصلي والتشكل. نحن بالتسلسل إزالة العظام الرئيسية للالأماميوهناك حاجة الجمجمة تحت المجهر تشريح لفضح ظهارة الأنفية سليمة تماما تقريبا مع الحفاظ على العظام المحارة رقيقة سليمة إلا إذا كانت الفئران هي قديمة جدا وcryosectioning. ونعرب أيضا عن طريقة للحفاظ على العلاقة بين الأنسجة الأنفية وبصيلات الشم، فضلا عن بقية الدماغ، مما يسهل الفحص المتزامن للدوائر كلا الطرفية والمركزية. لدينا وسيلة يمكن استخدامها لإعداد بارافورمالدهيد ثابتة، وكذلك الطازجة، والأنسجة الأنفية الحية. وبالتالي، من المتوقع لدينا وسيلة لتسهيل الدراسات المورفولوجية، المناعى والفسيولوجية للتنفس، الشم، والأنف الضرر والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الماوس إعداد الأنف
كنا الكبار C57BL / 6 الفئران الخلفية في هذه الدراسة. تمت الموافقة على جميع الرعاية والإجراءات الحيوانية رعاية الحيوان واللجان الاستخدام (IACUC) من جامعة ميريلاند، مقاطعة بالتيمور.
1.1 الحصول على الأنف من الفئران paraformaldahyde ثابت
الشكل 1. عظام جمجمة فأر A: شاهد الظهري للجمجمة B: عرض بطني من الجمجمة مع الفك السفلي إزالتها. وقد أعد الجمجمة من الماوس القديمة 40 يوما. يتم تلوين العظام الفردية لأفضل تصور. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
- يروي transcardially لإصلاح الفئران الفردية التالية الالبريد بروتوكول لين، وآخرون، (2008) 16. لفترة وجيزة، وكانت الفئران تخدير عميق مع ثلاثي بروم إيثانول (آفيرتين 250 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم)، perfused transcardially مع 0.1M الفوسفات العازلة (PB، 30-50 مل)، تليها الفوسفات مخزنة تثبيتي تحتوي على 3٪ بارافورمالدهيد، 19 مم L-يسين monohydrochloride، و 0.23٪ من الصوديوم M-بريودات (حوالي 35-50 مل). يمكن للمرء أيضا اتباع الخطوات الواردة في المقالة إن الرب لنضح الحيوان 35.
- استخدام زوج من مقص لقطع الفك السفلي (أو الفك السفلي) وإزالة الجلد على الرأس.
- فصل الرأس كله من بقية الجسم.
- إزالة الحنك. أيضا، وتنظيف وإزالة ما تبقى من النسيج الضام والعضلات على سطح الجمجمة للحصول على عينة هو مبين في الأرقام 1A و 1B.
- تحت المجهر تشريح، وإزالة عظم الجمجمة التي تغطي الدماغ وبصيلات الشم. تقليم قبالة الأنسجة الزائدة والعظام. لاالشركة المصرية للاتصالات، لإعداد الأنسجة الموسعة في الدماغ والتي الأنف البقاء على اتصال، يتم إزالة سوى عظام الجمجمة. للتجارب المناعى، وكان النسيج آخر ثابت لمدة 1.5 ساعة ونقلها إلى 0.1M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 25٪ سكروز بين عشية وضحاها. يجب أن تبقى الأنسجة الأنفية مرطب طوال تشريح بواسطة غمس في محلول السكروز مخزنة عدة مرات.
1.2 الحصول على الأنف من الفئران الموت الرحيم طازجة
- تم نقل الفئران الفردية إلى قفص نظيفة وتتعرض لثاني أكسيد الكربون غاز 2، الذي تبعه عنق الرحم التفكك 5 دقائق بعد الرمق الأخير. للحد من الدم في الأنسجة الأنف، استخدم مقصا لفتح الصدر وقطع القلب للسماح لاستنزاف الدم.
- كرر الخطوات من 1.1.2 إلى 1.1.5، باستثناء ما بعد التثبيت وcryoprotection مع 25٪ سكروز. يجب أن تبقى العينة ترطيب والحفاظ عليها مع المحتوية المالحة تايرود (مم): 140 ناCL، 5 بوكل، 1 MgCl 2، 1 و CaCl 2، 10 البيروفات نا، 10 D-الجلوكوز، و10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic حمض العازلة (HEPES، بعد تعديلها في درجة الحموضة 7.4). بدلا من ذلك، أضعاف قطعة من Kimwipes، نقع عليه مع حل تايرود، ومكان تحت العينة في حين تشريح وتراجع أحيانا العينة في حل من تايرود أو التخلي عن بعض الحل على الأنسجة للحفاظ على ترطيب للحفاظ على سلامة الخلايا والأنسجة .
2. القاطعة، الأمامي الميكعة وإزالة العظام الفك
- نبدأ من وجهة نظر بطني. تحديد موقع العظام الميكعة وكسر العظام الميكعة على طوله باستخدام مقراض أو ملقط مع الأسنان لكسر بطني جزء الأكبر من العظام.
- باستخدام ملقط مسنن، وإزالة الأجزاء المكسورة من العظام الميكعة بواسطة تبحر بلطف شظايا العظام بعيدا عن الجهاز الميكعي (VNO). ملاحظة، بالنسبة للفئران أقل من شهر من العمر، أو إذا فقط المهتمة في وزارة التربية، وهذه STE اثنينيمكن تخطي PS.
- عقد رئيس بحزم مع ملقط. استخدام مقراض لكسر الجزء الأمامي من كل من القواطع والمنطقة صوتها للفك العلوي الأمامي بين القواطع اثنين والعظام الميكعة.
- كسر جزء بطني من الفك العلوي الأيمن في المنطقة الأمامية فقط للقوس الوجني يصل إلى مستوى لوحة الوجني الظهرية.
- الوجه على الأنف لوجهة نظر الظهرية. استخدام مقراض لكسر الفك العلوي الأمامي الأيمن من لوحة الوجني الظهرية. كامل الفك العلوي الأمامي الأيمن من لوحة الوجني يجب أن تكون فضفاضة. استخدام ملقط غرامة لفصل بلطف أي نوع من الأنسجة الأنفية الكامنة وراء الفك العلوي، ومن ثم رفع بلطف بعيدا جزء العظام.
- كرر الخطوات من 2.4 و 2.5 لتخفيف القاطعة اليسار واليسار الفك العلوي الأمامية وإزالتها بعد أن تم إزالة عظم الأنف.
3. عظم الأنف والظهرية الوجني إزالة اللوحة
- استخدام ملقط مسنن أو مقراض لإعادةنقل ما تبقى من العظام الأمامية الذيلية فقط إلى عظام الأنف. بعد إزالة هذه القطعة من العظام، وجزء ذيلي من عظم الأنف يمكن أن يجتاح باستخدام ملقط.
- استخدام مقراض لكسر الجزء الأمامي من القوس الوجني، والتي يتم توصيلها إلى لوحة الوجني.
- خذ ملقط غرامة على الحافة الجانبية للنهاية ظهري من لوحة الوجني والوجه بلطف العظام وإزالته. إذا كانت العظام ليست فضفاضة، استخدام مقراض لكبح منه بلطف لتخفيف ذلك من أجل إزالة.
- استخدام ملقط غرامة أو شفرة حلاقة لتخفيف خياطة وسطي بين اليمين واليسار في عظام الأنف.
- استخدام ملقط مسنن لقبضة نهاية الذيلية للعظم الأنف اليمنى. تحرك بلطف العظم من جانب إلى جانب لفصلها عن الأنسجة الكامنة. ومن المفيد لتحريك ملقط على طول الثالثة الذيلية من عظم الأنف لتحريك الجانب العظام إلى الجانب. كما يفصل عظم الأنف، ورفع ببطء العظم من نهاية الذيلية.
- في حين Tانه عظم الأنف يتم رفع قليلا، إمالة العظام أفقيا ليكشف عن البروز الجانبي من العظام التي واصطف مع رقيقة الأنسجة الظهارية في الجهاز التنفسي. استخدام ملقط غرامة لاطلاق سراح بلطف هذا النسيج من عظم الأنف. الاستمرار في رفع عظم الأنف. عندما يتم فصل العظام تماما من الأنسجة الكامنة، واستخدام مقص لقطع عظم الأنف في نهاية منقاري.
- كرر الخطوات من 3.1 و 3.5 و 3.6 لإزالة عظم الأنف اليسرى.
- كرر الخطوات من 3.2 و 3.3 بالنسبة للجانب الأيسر من الأنف.
4. الجانبي الوجني إزالة اللوحة
- إزالة لوحة الوجني جانب واحد في وقت واحد. إما لوحة الوجني يمكن إزالتها أولا.
- من وجهة نظر بطني، كسر الفك السفلي للقوس الوجني حتى كسر يصل إلى القوس الوجني.
- من وجهة نظر الظهرية، والاستيلاء بلطف القوس الوجني ورفع إلى الأمام والوحشي. إذا كان لا يزال يتم إرفاق لوحة الوجني إلى أي نوع من الأنسجة، واتخاذ غرامةملقط وقطع بلطف الاتصالات بين الأنسجة والعظام.
- كرر لوحة الوجني على الجانب الآخر من الأنف.
5. إزالة العظام المدار
- من وجهة نظر بطني، وكسر العظام palantine بين الأضراس من الأنف.
- استخدام مقراض لكسر 3 الأضراس والفك على كل جانب من الأنف.
- كسر وإزالة أي قطعة سميكة من العظام المتبقية بطني والخلفية إلى القرائن على كل جانب من الأنف.
6. إزالة عظم الغربالي
- كسر أي جزء من العظم الغربالي جاحظ الذيلية إلى القرائن. وهذا أمر ضروري لتجنب فقدان الأنسجة المحارة عند إزالة قطعة رقيقة من العظم الغربالي تغطي القرائن.
- بالنسبة للجانب الأيمن من الأنف، ووضع ملقط غرامة على حافة الأمامية للعظم الغربالي وإزالته بلطف. إذا كان جزء من العظم يبقى، كرر هذا الإجراء حتى كل تمت إزالة العظم الرقيق الذي يغطي القرائن. العظام المحارة لا تحتاج إلى إزالتها في معظم التحضيرات. في الفئران الذين تتراوح أعمارهم، لوحة مثقب تصبح هشة. اذا كانت هناك حاجة cryosectioning من الأنسجة الأنفية، وإزالة قطع صغيرة من لوحة مع ملقط غرامة للحد من الأضرار المحتملة الناجمة عن العظام.
- كرر الخطوة 6.2) بالنسبة للجانب الأيسر من الأنف.
- إزالة أي شظايا العظام المتبقية قبل باجتزاء. ملاحظة: في الحيوانات أكثر من سنة، المنطقة posterodorsal من عظم الحاجز سميكا نوعا ما وصعبة. يمكن للمرء أن إزالة هذا الجزء باستخدام ملقط غرامة. إدراج غيض من الملقط في كل جانب من العظام لفصل الجزء الظهري للعظم الحاجز والأنسجة الطلائية بطانة. استخدام زوج واحد من ملقط للاستيلاء على العظام وعقد العينة. استخدام زوج آخر من الملقط لكسر جزء عظمي العلوي من جزء غضروفي السفلي من الحاجز وإزالته بلطف.
> 7. إعداد الأنف لCryosectioning
- إعداد مضخة فراغ الشافطة.
- وضع الأنف في قالب التضمين. يغرق أنفه في وسائل الاعلام أكتوبر
- استخدام الفراغ لإزالة فقاعات الهواء المحبوس داخل الأنسجة الأنف. هذه العملية تستغرق ما يصل الى 5 دقائق.
- بعد إزالة فقاعات الهواء، تعيين الأنسجة في الاتجاه المطلوب.
- تجميد أكتوبر والأنسجة في قالب باستخدام الثلج الجاف. ويمكن بعد ذلك cryosectioned جزءا لا يتجزأ من النسيج مباشرة أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه الطريقة، يمكننا الحصول بشكل موثوق الأنسجة الأنفية تقريبا سليمة تماما. ويبين الشكل 2A صورة عينة الأنف الكبار من رئيس بارافورمالدهيد ثابتة. في هذه العينة، وجميع الأجهزة الحسية الشمية الفرعية الأربعة، بما في ذلك وزارة التربية، الجهاز الحاجز، العقدة Gruneberg، وVNO، هي على حالها. أيضا، يتم الاحتفاظ ظهائر الجهاز التنفسي والأنسجة تحت الظهارة، مثل الغدد والأوعية،. وقد استخدمنا هذا الأسلوب بنجاح في عدد من الدراسات التي قمنا بالتحقيق التشكل، توزيع، تعصيب العصب، والتعبير علامة الخلية في مختلف السكان الخلية الحسية المتخصصة 16،17،36-38.
ويبين الشكل 2B عينة مع الدماغ، بصيلات الشم، والأنف معا. هذا التحضير الموسع هو مفيدة بشكل خاص في الدراسات التي تتطلب اتصال العصب بين النظم حاسة الشم الطرفية والمركزية. نحن على استعداد هذه العينة عن طريق إزالة الجمجمة عظام سوrrounding الدماغ قبل إزالة عظام الوجه. لدينا طريقة الموسعة يسمح للمحققين لإجراء تجارب على نظام حاسة الشم كلا الطرفية والمركزية في إعداد واحد.
الأنسجة الأنفية هو مبين في الشكل (2) يمكن أن تستخدم لمراقبة كل جبل، وكذلك لإعداد أقسام الأنسجة. إظهار الشكل 3A خفض القسم الأفقي من خلال كل من المناطق زارة التربية والتعليم والجهاز التنفسي. ويبين الشكل 3B قسم الاكليلية قطع طريق وسط من وزارة التربية. نحن ملطخة المقاطع مع أحمر محايدة لرؤية أفضل من أنواع مختلفة من هياكل الظهارية وتحت المخاطية في مواقع تشريحية مختلفة. هذه النتائج تثبت أن أسلوبنا يحفظ حتى الدقيقة هيكل المحارة زارة التربية والتعليم ومنظمة التشريحية للأنف، والتي تتيح تحقيق شامل ومقارن للتغيرات شكلية ووظيفية الأنف تحت الظروف العادية والمرضية.
الشكل 2. المعزولة الأنف وأنسجة المخ A:. عرض الظهرية من الأنسجة سليمة الأنف تشريح باستخدام طريقة deboning لدينا B: عرض الظهرية من الأنف والمخ مع الوصلات العصبية بين النظم حاسة الشم المركزي والمحيطي سليمة اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (3). أقسام الأنسجة الأنفية A:. مقطع أفقي تظهر ظهائر حاسة الشم والجهاز التنفسي، فضلا عن الهياكل الأخرى الأنف B: قسم الاكليل من خلال القرائن سو وزارة التربية في الخلفي من الأنف. وكانت كلا الفرعين 14 ميكرون سميكة وملطخة أحمر محايدة زارة التربية والتعليم:. الظهارة الشمية الرئيسية RE:. ظهارة التنفسية انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، أثبتنا إجراء خطوة بخطوة لعزل الأنسجة حاسة الشم والجهاز التنفسي سليمة من الأنف الماوس عن طريق إزالة بالتتابع العظام المحيطة في حين أن يجنب الأنسجة أدناه. وتبين لنا أن إزالة العظام دقيق يمكن الحفاظ حتى على الأنسجة الأكثر حساسية في مجملها. نحن أيضا نشارك نظرة ثاقبة التعديلات الممكنة لهذه التقنية، التي نعمل عزل كل من الدماغ والأنسجة الأنف معا للحفاظ على اتصال العصب. يوفر هذا الأسلوب الجديد وسيلة لعزل كامل أنسجة حاسة الشم والجهاز التنفسي في عينة واحدة لمزيد من المعالجة في المناعى، RNA التهجين في الموقع، والتجارب الفسيولوجية.
مزايا إزالة العظام
قبل أسلوبنا، ومزيل للكلس وكلاء عادة ما تستخدم لتليين العظام لباجتزاء الأنسجة والمناعية. ومع ذلك، اعتمادا على حجم العظام وعمر من الحيوانات، زوال الكلسيمكن أن يكون عملية طويلة وتحتاج إلى حضانة الأنسجة في decalcifiers العظام لساعات أو حتى عدة أيام 29،30. وكلاء استخداما تحتوي أيضا على الأحماض، والتي قد يكون لها آثار على الأنسجة التي يمكن أن تغير أو إعاقة الوسم المناعي 29،30. لمكافحة هذا، استخدم بعض الباحثين حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) حل لتنحية أيونات الكالسيوم من العظام 24،26-28. هذا الأسلوب من زوال الكلس يتطلب أيضا أيام. تشريح المعروضة هنا لا يمكن أن يؤديها في حوالي 20-30 دقيقة ولا تتطلب تطبيق أي المحاليل الكيميائية التي قد تغير من stainability من الأنسجة.
ويمكن أيضا لدينا وسيلة يتم استخدامها للحصول على الأنسجة الأنفية سليمة من أنوف تشريح طازجة، مما يوفر ميزة للحصول على الأنسجة الحية للتسجيلات الفسيولوجية. على سبيل المثال، يتم استخدام شرائح الأنف عادة لكا 2 + التصوير من OSNs والخلايا الداعمة في الظهارة الشمية 31،32. هذه الشرائح يجب أن تكونأعدت من الفئران حديثي الولادة قبل العظام المحيطة الأنسجة تصلب. ومع ذلك، عينات حديثي الولادة ليست متطابقة للبالغين لأن الظهارة الشمية تواصل التطور والنضوج بعد الولادة. باستخدام طريقة لدينا، يمكن للباحثين الحصول على الأنسجة حاسة الشم سليمة من الفئران الأكبر سنا من سن حديثي الولادة. هذا يمثل ميزة كبيرة، خاصة في الدراسات التغيرات التي تعتمد على العمر.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
أظهرنا واحدة تسلسل فعالة لإزالة العظام المحيطة بها. ومع ذلك، هناك تسلسلات أخرى من إزالة العظام للحصول على الأنسجة الأنفية سليمة، وخطوة خطوة الإجراء يجوز تعديل اعتمادا على الاحتياجات الفردية للباحث والأنسجة الأكثر أهمية. على سبيل المثال، إذا كان هناك حاجة الجهاز الميكعي، يجب إزالة العظام الميكعة في الإجراء في وقت مبكر لأن هناك أكثر من العظام المغطاة المناطق لفهم لعقد الأنسجة في المكان المطلوب خلال الإزالة. بواسطة ADAPتينغ الإجراء إلى كل تطبيق، أنسجة الفائدة من المرجح أن تبقى سليمة لمزيد من المعالجة. تميل العظام الأنفية أيضا أن يكون من الصعب إزالته، حيث أن الأنسجة أدناه يتمسك العظام وغالبا ما المسيل للدموع كما يتم رفع العظام بعيدا. بالإضافة إلى التلوي عظام الأنف كما هو موضح في الفيديو، ملقط صغير قد يمكن إدراج بلطف بين عظم الأنف والأنسجة الكامنة للمساعدة في تحريك الأنسجة أسفل وبعيدا عن العظام أثناء الإزالة.
يختلف تشريح أيضا اعتمادا قليلا على عمر الفئران. في صغار الفئران، وعظام تميل إلى أن تكون أكثر ليونة، في حين أن عظام الفئران الأكبر سنا أكثر هشاشة وتنصهر بقوة إلى العظام المجاورة في بعض المناطق. العظام لينة هو أسهل لفصل وإزالة قطع صغيرة من في العظام أصعب. هذا الاختلاف يمكن التغلب عليها بسهولة باستخدام ملقط ليسجل أو كشط في الاتصالات بين العظام للمساعدة في فصلهم وإزالة نظيفة. في الحيوانات الأكبر سنا، وإعادة posterodorsalجيون من الحاجز سميكا نوعا ما وصعبة، وينبغي إزالتها قبل cryosectioning. يمكن إزالة جزء عظمي من الحاجز كما هو موضح في الإجراء 6.4. على الرغم من أن هناك اختلافات صغيرة في تشريح لالفئران الأكبر سنا والأصغر سنا، العمر ليس عاملا مقيدا. في دراساتنا، قمنا بإعداد بنجاح الأنسجة الأنفية سليمة من الفئران تتراوح من 14 يوما إلى سنتين من العمر.
ليس هناك فرق كبير بين الخطوات المستخدمة لتشريح الأنف تثبيتي الثابتة والأنف الطازجة على الرغم من أن الأنسجة الطازجة هو أخف ويتطلب التلاعب أكثر حذرا. في كل الاستعدادات، والحفاظ على ترطيب الأنسجة أثناء تشريح هو المهم. فإنه ليس من الضروري لأداء تشريح أنسجة جديدة في المياه المالحة مخزنة، ومع ذلك، غمس دوري الأنسجة في حل تايرود أو نازف الحل على الأنسجة بينما تشريح أمر بالغ الأهمية لأنها سوف تبقي الأنسجة مرطب ومغذ الموردة للحفاظ الخامس والخمسينiability.
الإجراء المقدمة هنا يمكن تعديلها لتشمل إزالة العظم أن يترك كل من المخ والأنف سليمة في عينة واحدة (الشكل 2B). هذا التعديل قطع الغيار الاتصالات العصبية بين المخ والأنف التي تمر عبر لوحة مثقب. ويلزم المزيد من المهارة الفنية والوقت لهذا التشريح من الأنف وحده. ومع ذلك، والحفاظ على الاتصالات من المحيط إلى الدماغ يسمح لتطبيقات أكثر تنوعا من هذا الأسلوب.
القيود
وقد استخدمنا هذا الأسلوب لإعداد أنسجة الأنف لعدد من الدراسات، بما في ذلك وضع العلامات المناعى ومرنا تحليل التهجين في الموقع، ولقد وصفت بنجاح العديد من البروتينات في مسارات إشارات، وعلامات خلية الملون في مختلف السكان الخلية، ودرست معالم شكلية وتوزيع الخلية من خلال تجويف الأنف 16،17،36-39. ونحن لم أكن إكسبالقيود erience في cryosectioning والوسم المناعي. للدراسات التي تتطلب cryosectioning من إعداد الموسعة التي تحافظ على المخ والأنف الأنسجة المتصلة في عينة واحدة، ونحن نوصي لاستخدام الفئران الأصغر من 4 أشهر منذ في الفئران الأكبر سنا لوحة مثقب هش قد خلق تلف الأنسجة أثناء باجتزاء. ومع ذلك، لأنسجة جديدة مخصصة للالتسجيلات الكهربية، والأنسجة وسطي بين القرائن لا يمكن الوصول إليها بسهولة في إعداد جبل بأكمله. إزالة قطعة صغيرة من الأنسجة أو تقسيم في مناطق منفصلة قد تغلب على المشكلة. لأن تتم التقليدية مخطط كهربية الشم على السطح الإنسي من إندو القرائن 25،33،34، قد إعداد الأنسجة لدينا تسمح التسجيلات من مناطق أخرى مع التلاعب قليلا.
تطبيقات خارج المناعية
وجود العديد من التطبيقات من الإجراء بالنسبة لأولئك الذين اتقنوا التقنية. تطبيق و ممكنوتشمل أيونات دراسات مناطقية على أنسجة حاسة الشم والجهاز التنفسي والتي، وذلك باستخدام وسائل أخرى، كان من الصعب الحصول على حالها والتكوين التشريحي الأصلية. توجد أيضا تطبيقات للالكهربية عن طريق السماح المتزامنة متعددة التسجيلات على كله، أنسجة جديدة. يتم إجراء بعض من هذه التطبيقات، التي كان من الصعب تنفيذها باستخدام التقنيات الموجودة، وممكن عن طريق وسيلة deboning لدينا. علاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول على الدراسات البيوكيميائية، الجينوم، والبروتين التي تتطلب جمع عينة متناسقة في مختلف المناطق للمقارنة حرجة.
في ملخص، وقد وضعنا الداخلي للوصول بسرعة وبشكل موثوق أنسجة حاسة الشم والجهاز التنفسي في الأنف الماوس عن طريق إزالة العظام المحيطة بها. هذا الأسلوب له مزايا هامة على التقنيات المستخدمة عادة مثل زوال الكلس. علاوة على ذلك، لدينا وسيلة لا تحتاج الى علاج الكيميائي، وبالتالي، هي الأنسجة على سبيل المثال لا للاستخدام في immunohistochemistتجارب راي، ولكن أيضا يمكن أن تكون قابلة للتطبيق في الموقع التهجين والدراسات الفسيولوجية في. وبالتالي، لدينا وسيلة هو وسيلة أسرع وأكثر مباشرة لإعداد الأنف الماوس لمزيد من المعالجة. نتوقع أن أسلوبنا تسهيل الدراسات حاسة الشم والجهاز التنفسي في المناطق الأنفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة للبحوث (NIH / NIDCD 009269، 012831 والأذربيجانية الإدارية الملحق المنح NIH) إلى وى هونغ لين. نحن نخص بالشكر السيد تيم فورد في UMBC للحصول على المساعدة الفنية له في تصوير بالفيديو والتجهيز. ونود أيضا أن نشكر الدكتور دافني بلومبرغ، السيدة Chere تافه في UMBC والسيد نيكولاس ماكولوم من أوليمبوس أمريكا وشركة للحصول على مساعدة معداتهم في تصوير بالفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. , 2nd, Wiley-Liss. (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
