有效的人工剔骨方法编写完整的鼠标鼻组织与保存的解剖组织

Summary

Abstract

哺乳动物的鼻子是一个多功能的器官，具有复杂的内部结构。鼻腔内衬各种上皮细胞，如嗅觉，呼吸，和鳞状上皮细胞明显不同的解剖位置，形态和功能。在成年小鼠中，与各种颅骨覆盖鼻子，限制了实验获得的内部结构，尤其是在后等为主体的嗅觉上皮细胞（MOE）。在这里，我们描述了一个有效的方法，获得几乎整个完整的鼻腔组织与腌制解剖组织。使用手术工具，在解剖显微镜下，我们依次取出头骨周围鼻腔组织。这个程序可以进行多聚甲醛固定，解剖新鲜，皮肤的鼠标头。去骨整个过程约需20-30分钟，这是明显短于传统化工为主的实验所需时间钙化。此外，我们提出了一个简单的方法来去除气泡被困鼻甲之间，这是获得完整的细水平线或者冠状或矢状切面​​鼻组织准备的关键。鼻组织用我们的方法制备可用于整个装载整个上皮细胞的观察，以及形态，免疫细胞化学，RNA 原位杂交，和生理的研究，尤其是在特定区域的检查和比较，还研究。

Introduction

哺乳动物鼻腔包含各种类型的组织和器官，服务于不同的功能。鼻腔，使上呼吸道的入口部分，它允许空气流入和流出肺部旅行。吸入的空气通过鼻腔的温度和湿度进行调节^1，以及作为清洁或过滤除去刺激性和毒性的物质和感染性微生物的^2。这两种治疗方法进行鼻上皮及上皮下的组织，包括腺体和血管，是至关重要的保护下呼吸道和肺部。除了它的作用在呼吸和上皮防御，鼻组织也包含外周感觉的嗅觉和三叉神经系统，使空气中的化学物质的检测范围广泛的设备。根据该系统被激活，在鼻子的化学品的感官检测既可以引起感的气味，刺激或疼痛^3,4。

的外周的嗅觉系统是复杂的，由几个解剖分离鼻腔内的嗅觉器官。其中，主要的嗅觉上皮细胞（MOE）是最大的，它构成了约45-52％的鼻上皮细胞在啮齿类动物中⁵和位于后方区域。在腹侧区域中，有一对管状结构被称为犁鼻器^6，坐在沿鼻中隔的每一侧。两个额外的嗅感觉神经元的小分组，称为室间隔器官马塞拉^7,8和在Gruneberg神经节^9，位于沿腹隔垫和背进入区域的鼻腔。这些外周器官中含有神经上皮细胞形态特色鲜明，细胞标记物的表达，和生理功能。他们共同检测成千上万的气味分子与精致的灵敏度^10-12。

除了嗅觉器官，鼻腔内还设有其他感官系统。它是已知的，三 ​​叉神经肽能神经纤维出现在鼻腔上皮细胞，特别是呼吸道上皮^13,14。这些纤维检测刺激性和有毒化学品，并负责启动保护性反射，如咳嗽和打喷嚏^4,15。有刺激性的异味和苦味化合物也可以被检测到最近发现的孤化学感受细胞（SCCS），其中有许多是由三叉神经纤维^16-19支配人口。这些的SCC位于鼻腔及犁鼻进入管道的入口区域中的高密度，暗示它们可能也有助于保护功能^16-18。因此，鼻上皮细胞可显着不同的功能，形态，取决于它们的细胞的组合物解剖位置。

即使在一个单一的和专门的上皮细胞，存在地区差异。教育部就是这样一个例子。各种鼻甲教育部线，这是很复杂的卷曲结构。因为他们，不同地区的教育部体验不同的空气流速，因此，不同的扩散，空气中的气味分子的清除率^20。此外，它被称为表达一种特定气味受体的嗅感觉神经元（OSNS）位于四规避教育部^21,22区。这个位置如何差异会影响OSN气味的反应主要是不知道的。此外，一些的OSN种群具有区域偏好。鸟苷酸环化酶-D（GC-D）表达的OSN有带状分布，有利于地区的ectoturbinates ^23,24的小路，小路。最近，我们发现了一个典型的嗅觉神经元亚群表达瞬时受体电位通道M5（TRPM5），优先地位于在横向和腹侧区域^25。这些结果表明，本部不统一。然而，如何使这些区域的差异影响嗅编码的不理解。这部分是保存完好的解剖组织，用目前的方法获得完整的鼻上皮的难度，因为彻底的生理教育部的调查和鼻子已经有限。

鼻腔上皮细胞主要是四周前，包括鼻，上颌骨，腭骨，颧骨，筛骨颅骨。在成年老鼠和其它啮齿类动物模型，这些骨头是硬而难以去除，不破坏密切相关的鼻部组织，特别是细腻鼻甲。通常，使用的化学物质为基础的脱钙软化骨骼以允许cryosectioning鼻腔组织形态，免疫组织化学， 原位杂交研究，然而，依赖丁动物的年龄，脱钙过程可以持续7天过夜^24,26-28。这种治疗方法也是有限的，因为它需要组织固定液保存。此外，化学脱钙可恶劣影响的一些敏感的抗体免疫标记^29,30。对于生理研究，活组织是必需的，因此，这些实验往往是孤立的OSN或MOE切片得到的新生儿的头骨薄而软^17,31,32进行。生理研究也可以利用整装准备分裂头^25,33,34，但通常只有内侧表面的鼻子是方便，限制了对其他方面的生理记录。

在这里，我们描述了一个有效的，手动的的去骨方法来准备完整的鼻腔组织保存了原有的解剖组织形态。我们依次取出骨头的前在解剖显微镜下，几乎完全完整的鼻上皮暴露同时保持薄鼻甲骨骼完好除非老鼠很旧，cryosectioning的头骨是必要的。我们还可以延长保存鼻组织嗅球之间的连接，以及大脑的其余部分，从而促进外周和中枢的电路的同时检查方法。我们的方法可以被用于制备多聚甲醛固定，以及新鲜的，活的鼻组织。因此，我们的方法将有利于呼吸，嗅觉，鼻腔损伤和疾病的形态学，免疫组织化学和生理研究。

Protocol

1。鼠标鼻子准备

在本研究中，我们使用成人的C57BL / 6背景的小鼠。所有动物护理和程序批准的动物护理和使用委员会（IACUC）美国马里兰大学巴尔的摩县。

1.1获取鼻子从paraformaldahyde固定小鼠

图1。鼠标头骨骨骼的头骨背视图。B：除去下颌骨的头骨与腹面观。从40日龄小鼠头骨。个别骨头的颜色更好的可视化。 点击这里查看大图 。

1. 灌注transcardially解决个别的小鼠日É林， 等。协议^{，（2008）16。}简单地说，小鼠深度麻醉，三溴乙醇（圣阿韦坦250微克/克体重），心脏灌注，用0.1M磷酸缓冲液（PB，30〜50毫升）中，然后由磷酸盐缓冲固定液中含有3％多聚甲醛，19 mM的L-赖氨酸单盐酸盐，0.23％的钠米，高碘酸（约35-50毫升）。也可以按照动物灌注³⁵的朱庇特的文章中的步骤。
2. 使用一把剪刀切断的下颌骨（或下颚）和去除皮肤的头。
3. 从身体的其余部分分开，整个头部。
4. 取出的口感。此外，清洗，除去残留的结缔组织和肌肉的头骨取得试样，在图1A和1B所示的表面上。
5. 在解剖显微镜下，取出脑和嗅球颅骨覆盖。剪掉多余的组织和骨骼。没有特扩展的组织制剂，其中大脑和鼻子保持连接，只有头骨都被删除。对于免疫组化实验中，将组织后固定1.5小时，然后转移到0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）与25％蔗糖过夜。鼻组织应保持加湿整个剥离，通过浸渍在缓冲​​的蔗糖溶液数次。

1.2获取鼻子从新鲜安乐死小鼠

1. 个别小鼠转移到一个干净的笼中，并暴露在CO ₂气体，随后用颈脱位5分钟后，最后的呼吸。为了减少血液中的鼻子组织，用一把剪刀开胸切心脏，使血液漏。
2. 重复步骤1.1.2至1.1.5，除了25％的蔗糖后的固定和冷冻保护。应保持的检体加湿保持与台氏盐含有（以mM计）：140钠氯化钾，氯，5 1的MgCl _2，1的 CaCl _2，10的丙酮酸钠，10个D-葡萄糖，10 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液（HEPES，在pH 7.4）调整。或者，折片的Kimwipes，浸泡，用台氏溶液，和这里下方的检体解剖时，偶尔浸入试样的台氏溶液或一些解决办法拖放到组织上，以保持它加湿以维持细胞和组织的可行性。

2。门齿，前犁骨和上颌骨骨去除

1. 开始腹观点。找到犁骨和牙齿咬骨钳或镊子打破最腹侧部分骨，沿其长度打破犁骨。
2. 使用锯齿钳轻轻行走碎骨离犁鼻器（VNO），取下破裂的犁骨段。请注意，这些老鼠不到一个月以前，或者如果只有兴趣在教育部，两个STEps的，可以跳过。
3. 牢牢握住头钳。使用咬骨钳打破两个门牙的前部的两个门牙和犁骨之间的接合区域的前上颌骨。
4. 额的右侧上颌骨腹侧部上面的区域只是前颧弓颧板的背侧的水平。
5. 在鼻子翻转背的观点。用咬骨钳打破背颧板的右侧上颌骨前壁。整个右上颌前颧板要宽松。用细镊子轻轻任何相关颌骨鼻组织分开，然后轻轻抬起了骨头碎片。
6. 重复步骤2.4和2.5，，松开左门牙和左上颌前牙区，，鼻骨后已被删除，并删除它们。

3。鼻骨和背颧板拆除

1. 使用锯齿钳或咬骨钳重新将剩余的额骨鼻甲骨只是尾椎。取出这块骨头，后尾部分的鼻骨可以使用镊子夹住。
2. 使用咬骨钳打破颧弓的前部，这是连接到颧板。
3. 颧板的背端外侧缘和细镊子轻轻翻转骨，并删除它。如果骨头不松，用咬骨钳轻轻松开去除。
4. 用细镊子或刀片松动之间的左，右鼻甲骨内侧缝合。
5. 使用锯齿镊子夹住尾端右鼻骨。轻轻地移动，从一侧到另一侧的骨到相关组织分开。移动骨一侧到另一侧移动钳沿尾第三鼻骨它是有用的。由于鼻骨分离，慢慢抬起骨，从尾端。
6. 而T他鼻骨轻微抬起，横向倾斜骨的骨内衬薄呼吸道上皮组织揭示了横向露头。用细镊子轻轻松开这个组织从鼻腔骨。继续解除鼻骨。当骨完全分离皮下组织，用剪刀切断鼻骨喙端。
7. 左鼻骨去除重复步骤3.1，3.5和3.6。
8. 鼻子的左侧，重复步骤3.2和3.3。

4。颧骨外侧板拆除

1. 删除颧板一侧的时间。无论是颧板可以拆下第一。
2. 从腹侧的观点，打破休息，直到达到颧弓颧弓上颌骨逊色。
3. 从背部的角度看，轻轻地抓住颧弓和正向和侧向抬起。如果颧板仍连接到任何组织，采取罚款钳轻轻地切断的组织和骨之间的连接。
4. 鼻颧板的另一侧重复上述步骤。

5。轨道骨去除

1. 从腹侧的观点，打破巴伦丁的磨牙骨之间的鼻子。
2. 使用咬骨钳的每一侧的鼻子打破3臼齿和上颌骨。
3. 打破和消除任何剩余的腹厚的骨片和后每一侧鼻孔的鼻甲。

6。筛骨去除

1. 中断任何部分筛骨突出尾鳍鼻甲。这是必要的，以避免损失的鼻甲组织，除去薄件时，筛骨覆盖鼻甲。
2. 对于鼻子的右侧，将筛骨前缘细镊子轻轻取出。如果骨的部分仍然存在，重复这个过程，直到所有薄骨覆盖鼻甲已被删除。鼻甲骨不需要除去大部分的制剂。在老年小鼠，筛板变得脆弱。如果需要鼻腔组织cryosectioning是，用细镊子取出小块板，以减少潜在的损害，引起骨。
3. 重复步骤6.2），鼻子的左侧。
4. 切片之前删除任何剩余的碎骨。注：在动物超过一岁，隔骨posterodorsal地区是有点厚和硬。人们可以用细镊子取出这部分。镊子的尖端插入到骨背侧部的隔垫骨和衬里上皮组织分离的两侧。使用一对镊子，抢骨头和保持标本。使用另一双钳打破上层部分的中隔软骨下骨部分，轻轻取出。

1. 设置抽真空泵。
2. 将鼻子嵌入模具。淹没鼻子媒体华侨城。
3. 使用真空以除去空气气泡内鼻组织。这个过程最多需要5分钟。
4. 除去气泡后，将组织在所需的方向。
5. 冻结在模具使用干冰华侨城和组织。然后包埋组织立即cryosectioned，或储存于-80℃以备将来使用。

Representative Results

使用这种方法，可以可靠地获得几乎完全完整的鼻组织图2A示出的图像的成年人鼻试样从多聚甲醛固定磁头。在这个标本，所有四个子嗅觉感官器官，包括教育部，室间隔器官中，Gruneberg节，VNO，都完好无损。此外，呼吸道上皮细胞和上皮下的组织，如腺体和血管，将被保留。我们已经成功地使用此方法，在一些研究中，我们调查形态，分布，神经的神经支配，细胞标记的表达在各专业感觉的细胞群^{16,17,36-38。}

图2B示出了试样与脑，嗅球和鼻子一起。这个扩展的制剂是特别有用的需要之间的外周和中枢的嗅觉系统的神经连接的研究。我们准备这个标本取出头骨SUrrounding大脑前去除面部骨骼。我们的扩展方法允许研究者外周和中枢嗅觉系统进行实验，在一个单一的准备。

可以用于图2中所示的鼻组织整体式的观察，以及用于制备组织切片，通过教育部和呼吸区域， 图3A中显示的水平截面切割， 图3B示出了冠状切面，通过中间切教育部。我们为了更好地观察各种类型的上皮细胞及粘膜下的结构在不同的解剖位置用中性红染色部分。这些结果表明，我们的技术保留甚至细腻教育部的鼻甲结构和解剖组织的鼻子​​，鼻形态和功能正常和病理条件下的变化，使全面的比较调查。

图2。隔离鼻腔和脑组织。答：使用我们的剔骨方法解剖完整的鼻子组织的背视图。B：背视图鼻子和脑与神经之间的连接中枢和外周的嗅觉系统完好无损。 点击这里查看大图 。

图3。第鼻腔组织。A：水平段显示嗅觉和呼吸道上皮细胞以及其他鼻腔结构。通过鼻甲ØB：冠状切面f为教育部在后路的鼻子。这两部分分别为14微米厚，并用中性红染色。 教育部：主要嗅上皮RE：呼吸道上皮细胞。 点击这里查看大图 。

Discussion

在这里，我们展示了一个隔离完好鼠标鼻子的嗅觉和呼吸道组织的顺序取出骨头，同时保留周围组织的一步一步的过程。我们发现，小心骨去除的全部，甚至可以保留最微妙的组织。我们也分享洞察可能修改这项技术，我们在其中分离大脑和鼻子组织共同维护神经连接。这种新方法提供了一个隔离装置，用于在一个单一的免疫组化，RNA 原位杂交，以便进一步处理和生理实验标本的整个嗅觉和呼吸道组织。

去骨的优点

之前，我们的方法，通常用来软化脱钙剂骨组织切片及免疫组化。然而，取决于骨的大小和动物的年龄，脱钙可以是一个漫长的过程，需要几个小时甚至几天^29,30组织在骨decalcifiers的孵化。常用的药剂还包含酸，也可以有效果，在纸巾上，可以改变或阻碍免疫标记^29,30。为了解决这个问题，一些研究者使用乙二胺四乙酸（EDTA）解决方案，固钙离子从骨^24,26-28。脱钙此方法还要求天。此处所示的夹层可以在约20至30分钟，并且不需要任何化学品的应用的解决方案，可能会改变组织的染色性。

我们的方法还可以被用来获取完整的鼻组织从新鲜解剖鼻子，提供用于获得活组织生理记录的优点。例如，鼻子片常用的Ca ^{2 +}嗅上皮^31,32中的嗅觉神经元和支持细胞成像。这些片的需要成为准备从周围的骨头组织硬化前的新生小鼠。然而，新生儿标本成人不相同的，因为嗅上皮继续发展和成熟，出生后。用我们的方法，研究人员可以获取完整的嗅觉组织的小鼠新生儿年龄以上。这带来了一个显着的优势，特别是年龄依赖性的变化的研究。

修改和故障排除

我们发现一个有效的序列除去周​​围的骨头。但是，也有其他序列的骨切除，以获得完整的鼻腔组织，并根据最感兴趣的研究人员和组织的个性化需求，可能会被修改的每一步过程。例如，如果需要的犁鼻器，犁骨应被除去的过程中的早期，因为有更多的骨覆盖的区域把握组织保持在拆卸过程中在所需之处。通过ADAP汀对每个应用程序的程序，还组织更有可能进行进一步的处理保持不变。鼻骨也往往是难以去除下面的组织，紧贴骨头，往往会撕裂骨头都抬离。此外摆动鼻骨在视频显示，小镊子轻轻插入之间的鼻骨和底层组织，帮助组织移动和拆除过程中从骨子里。

剥离也有所不同略有不同年龄的小鼠。在年轻小鼠，骨头往往是比较柔和，而年纪较大的老鼠的骨头更脆，坚定地融合到相邻的骨头，在一些地区。骨软容易分离和去除比硬骨小块。使用产钳得分或刮，以帮助他们的分离和清除干净的骨头之间的连接，这种差异可以很容易克服。在老年动物，posterodorsal重祗园隔有点厚且硬，应该之前被删除cryosectioning的。 6.4程序中所描述的，可以被删除的骨部的隔垫。虽然有小的差异，老年人和年轻小鼠解剖，年龄不是一个限制因素。在我们的研究中，我们已经成功地编写了完整的鼻腔组织的小鼠，从14天到两岁不等。

解剖用于固定液固定鼻子和鼻子新鲜的，虽然新鲜组织柔软，需要更加仔细的操作步骤有没有显着的区别。在这两种准备，在解剖组织保持加湿是很重要的。然而，这是没有必要执行缓冲盐水中的新鲜组织剥离，周期性地浸渍在台氏液的组织或滴水解剖到组织上，而该溶液是至关重要的，因为它会保持组织的加湿和营养物的供给，以保持它的Viability。

这里介绍的方法，可以进一步修改，以包括骨去除，留下完整，在一个单一的试样（ 图2B）的大脑和鼻子。此修改备件之间的神经连接大脑和鼻子，通过筛板。这个夹层比单独的鼻子都需要更多的技术技能和时间。然而，从外围向大脑保留的连接，允许更多种类的应用程序，在此方法中。

限制

我们已经用这种方法制备的鼻腔组织了多项研究，包括免疫组织化学标记和mRNA 原位杂交分析，并已成功地在信号通路，染色在不同的细胞群的细胞的标记物标记的许多蛋白质，形态学特征和细胞分布通过鼻腔^{16,17,36-39。}我们没有进出口试乘试驾限制在cryosectioning免疫标记。对于扩展的准备，让大脑和鼻组织连接在一个单一的标本需要cryosectioning的研究，我们建议使用老鼠未满4个月，因为在老年小鼠的脆性筛板可能在切片过程中创建的组织损伤。然而，新鲜组织用于电生理记录，鼻甲内侧之间的组织是不容易访问整个安装准备。去除小片在离散区域的组织或拆​​分，可以克服这个问题。因为传统的电嗅内鼻甲^25,33,34的内侧表面上完成的，我们的组织制剂可以允许从其他区域的记录很少操纵。

超越免疫组化的应用

许多应用程序存在谁掌握了技术。可能APPLICAT离子包括纬向嗅觉和呼吸系统的组织的研究，使用其他方法，已经很难取得完整，在其原来的解剖形态。应用程序也存在电允许多个同步录音于一体，新鲜组织。其中的一些应用，这是很难执行使用现有的技术，我们的去骨方法。此外，该协议也可以适合于生物化学，基因组和蛋白质组的研究，需要在各区域为关键比较一致的样品收集。

总之，我们已经开发出一种程序，除去周围的骨头迅速，可靠地访问鼠标鼻子的嗅觉和呼吸道组织中。该方法具有显着的优势，常用的技术如脱钙。此外，本方法不需要化学处理，因此，组织不局限于用于在immunohistochemistRY实验，但也可以适用于原位杂交和生理研究。因此，我们的方法是一个更快，更直接的方式来准备鼠标鼻子进行进一步的处理。我们希望我们的方法将有助于鼻地区的嗅觉和呼吸的研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width	World Precision Instruments (WPI)	501333
Fine forceps, Dumont 3	WPI	503235
Fine forceps, Dumont 55	WPI	14099
Fine forceps, Dumont AA	Fine Science Tools (FST)	11210-20
Specimen forceps, Serrated	VWR	82027-440
Operating scissors	WPI	501753
Iris scissors, Straight	Miltex	V95-304
Dissection microscope	Olympus	SZ40

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Sakura Finetek	4583
Plastic embedding mold	VWR	15160-215
Aspirator vacuum pump	Fisher Scientific	09-960-2

Name	Company	Catalog Number	Comments
Section staining
Neutral red	ACROS Organic	CAS 553-24-2	Nuclei staining