संरक्षित संरचनात्मक संगठन के साथ बरकरार माउस नाक ऊतक तैयार करने के लिए एक प्रभावी मैनुअल Deboning विधि
Abstract
स्तनधारी नाक जटिल आंतरिक संरचना के साथ एक बहुआयामी अंग है. नाक गुहा इस तरह के संरचनात्मक स्थानों, आकारिकी, और कार्यों में स्पष्ट रूप से अलग है, जो घ्राण श्वसन, और स्क्वैमस epithelia के रूप में विभिन्न epithelia के साथ तैयार है. वयस्क चूहों में, नाक विशेष रूप से आंतरिक संरचना, मुख्य घ्राण उपकला (मो) के रूप में पीछे ऐसे में उन लोगों के लिए प्रयोगात्मक उपयोग को सीमित करने, विभिन्न खोपड़ी हड्डियों के साथ कवर किया जाता है. यहाँ हम संरक्षित संरचनात्मक संगठन के साथ लगभग पूरे बरकरार है और नाक के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी विधि का वर्णन है. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करना, हम क्रमिक रूप से नाक के आसपास के ऊतक खोपड़ी हड्डियों को हटा दें. यह प्रक्रिया दोनों paraformaldehyde के निर्धारित और हौसले से विच्छेदित, चमड़ी माउस सिर पर प्रदर्शन किया जा सकता है. पूरे deboning प्रक्रिया पारंपरिक रसायन आधारित डे के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक समय की तुलना में काफी कम है जिसके बारे में 20-30 मिनट लगते हैं,कड़ा हो जाना. इसके अलावा, हम नाक ऊतक तैयारी से बरकरार पतली क्षैतिज या राज्याभिषेक या बाण के समान वर्गों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है जो turbinates, के बीच फंस हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक आसान तरीका मौजूद है. हमारे विधि का उपयोग कर तैयार नाक ऊतक विशेष रूप से क्षेत्र विशेष परीक्षा और तुलना रुचि के हैं, जहां पढ़ाई में, पूरे माउंट पूरे epithelia की प्रेक्षण, साथ रूपात्मक, immunocytochemical, शाही सेना के रूप में स्वस्थानी संकरण में, और शारीरिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
स्तनधारी नाक गुहा के ऊतकों और विशिष्ट कार्यों की सेवा है कि अंगों के विभिन्न प्रकार के होते हैं. नाक गुहा फेफड़ों में और से बाहर हवाई यात्रा की अनुमति देता है, जो ऊपरी श्वास नलिका, के प्रवेश के हिस्से का निर्माण करता है. साँस हवा के रूप में यह अच्छी तरह से सफाई या परेशान और विषाक्त पदार्थों और संक्रामक सूक्ष्मजीवों 2 दूर करने के लिए छानने के रूप में तापमान और नमी कंडीशनिंग 1 से होकर गुजरती है, जहां नाक गुहा से होकर गुजरता है. दोनों उपचार नाक epithelia और ग्रंथियों और जहाजों सहित subepithelial ऊतकों, द्वारा किया जाता है और निचले वायुमार्ग और फेफड़ों की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं. श्वसन और उपकला रक्षा में अपनी भूमिका के अलावा, नाक ऊतक भी गुजर हवा में रासायनिक पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के जो घ्राण और त्रिपृष्ठी प्रणाली, के परिधीय संवेदी apparatuses शामिल हैं. सक्रिय है जो सिस्टम पर निर्भर करता है, नाक में रसायनों का संवेदी पता लगाने या तो बटोर सकते हैंगंध, जलन, या दर्द 3,4 की भावना.
परिधीय घ्राण प्रणाली जटिल और नाक गुहा के भीतर कई संरचनात्मक रूप से अलग घ्राण संवेदी अंगों से बना है. उनमें से, मुख्य घ्राण उपकला (मो) कृन्तकों 5 में नाक epithelia की लगभग 45-52% बनाता है और पीछे क्षेत्र में स्थित है, जो सबसे बड़ा है. Anteroventral क्षेत्र में, नाक पट के प्रत्येक पक्ष के साथ बैठते हैं जो vomeronasal अंग 6, के रूप में जाना ट्यूबलर संरचना की एक जोड़ी है. Masera 7,8 और Gruneberg नाड़ीग्रन्थि 9 की सेप्टल अंग के रूप में जाना घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की दो अतिरिक्त छोटे समूहों, क्रमशः, उदर पट और नाक गुहा के पृष्ठीय प्रविष्टि क्षेत्र के साथ रहते हैं. ये परिधीय अंगों विशिष्ट आकारिकी में सुविधाओं, सेल मार्कर अभिव्यक्ति, और शारीरिक समारोह के साथ न्यूरो epithelia होते हैं. साथ में वे गंध के हजारों का पता लगाउत्तम संवेदनशीलता 10-12 के साथ अणुओं.
घ्राण संवेदी अंगों के अलावा, नाक गुहा भी अन्य संवेदी प्रणाली मकान. यह पेप्टिडर्जिक trigeminal तंत्रिका तंतुओं नाक उपकला, विशेष रूप से श्वसन उपकला 13,14 में मौजूद हैं जाना जाता है. इन तंतुओं से कुछ परेशान और जहरीले रसायनों का पता लगाने और इस तरह खांसने और 4,15 छींकने के रूप में सुरक्षात्मक सजगता की शुरुआत करने के लिए जिम्मेदार हैं. चिड़चिड़ी सुगंधित और कड़वा यौगिकों भी, जिनमें से कई trigeminal तंत्रिका तंतुओं 16-19 द्वारा innervated हैं एकान्त chemosensory कोशिकाओं (SCCs), के एक हाल ही में खोज की आबादी से पता लगाया जा सकता है. ये SCCs वे भी एक सुरक्षात्मक कार्य 16-18 सेवा कर सकता है कि इशारा है, नाक गुहा और vomeronasal प्रविष्टि नलिकाओं की प्रविष्टि क्षेत्र में उच्च घनत्व में स्थित हैं. इस प्रकार, नाक epithelia समारोह, आकारिकी में काफी अलग कर सकते हैं, और सेल रचना अपने पर निर्भर करता हैसंरचनात्मक स्थानों.
यहां तक कि एक भी और विशेष उपकला भीतर, क्षेत्रीय मतभेद हैं. मो ऐसा ही एक उदाहरण है. जटिल और संरचनाओं कर्ल करवाने रहे हैं जो मो लाइनों विभिन्न turbinates,. इस प्रकार उनकी वजह से, अलग मो अनुभव अलग वायु प्रवाह की दर के क्षेत्रों, और, विभिन्न प्रसार और हवाई गंध अणुओं 20 की निकासी दरों. इसके अलावा, यह एक दिया गंध रिसेप्टर व्यक्त घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (OSNs) मो 21,22 के क्षेत्रों circumvented चार में से एक में स्थित हैं कि जाना जाता है. इस स्थान अंतर को कैसे प्रभावित करता odorants के लिए एक OSN की प्रतिक्रिया काफी हद तक ज्ञात नहीं है. इसके अलावा, कुछ OSN आबादी क्षेत्रीय वरीयता दिखा रहे हैं. Guanylyl साइक्लेस डी (जीसी डी) व्यक्त OSNs ectoturbinates 23,24 की संस्कृति-de-थैली क्षेत्रों पक्ष जोनल वितरण किया है. हाल ही में, हम (टीआर क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल M5 व्यक्त किया कि विहित OSNs के एक subpopulation पायाpM5) और रियायत के पार्श्व और उदर क्षेत्रों के 25 में स्थित है. ये परिणाम है कि मो वर्दी नहीं है का संकेत मिलता है. हालांकि, इन क्षेत्रीय मतभेद घ्राण कोडिंग कैसे प्रभावित नहीं समझा गया है. संपूर्ण शारीरिक मो की जांच और नाक मौजूदा तरीकों का उपयोग कर संरक्षित संरचनात्मक संगठन के साथ बरकरार नाक epithelia प्राप्त करने की कठिनाई के द्वारा ही सीमित कर दिया गया है क्योंकि इस हिस्से में है.
नाक epithelia मुख्य रूप से नाक, जबडा, तालु, गाल की हड्डी, और सलाखें हड्डियों सहित खोपड़ी की पूर्वकाल हड्डियों, से घिरे हैं. वयस्क चूहों और अन्य कृंतक मॉडल में, इन हड्डियों को विशेष रूप से बारीकी से जुड़े नाक ऊतक, नाजुक turbinates को नुकसान पहुँचाए बिना दूर करने के लिए कठिन और मुश्किल है. अक्सर, रासायनिक आधारित विकैल्सीकरण immunohistochemical, रूपात्मक, और सीटू संकरण अध्ययन में नाक के ऊतकों के cryosectioning अनुमति देने के लिए हड्डियों को नरम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन, निर्भरताडिंग जानवर की उम्र पर, विकैल्सीकरण प्रक्रिया रातोंरात अप करने के लिए 7 दिनों 24,26-28 पिछले कर सकते हैं. यह ऊतक लगानेवाला से संरक्षित किया जा आवश्यकता है क्योंकि यह इलाज भी सीमित है. इसके अतिरिक्त, रासायनिक विकैल्सीकरण कठोर हो सकता है और कुछ संवेदनशील एंटीबॉडी 29,30 के immunolabeling प्रभावित कर सकते हैं. शारीरिक अध्ययन के लिए, जीवित ऊतक की आवश्यकता है, और इस प्रकार, इन प्रयोगों अक्सर अलग OSNs या जिसका खोपड़ी हड्डियों पतली और 17,31,32 नरम हैं नवजात शिशुओं से प्राप्त मो स्लाइस पर आयोजित की जाती हैं. शारीरिक पढ़ाई भी बंटवारे सिर 25,33,34 द्वारा पूरे माउंट तैयारी का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन नाक की औसत दर्जे का सतह आमतौर पर केवल अन्य क्षेत्रों पर शारीरिक रिकॉर्डिंग सीमित है, आसानी से सुलभ है.
यहाँ, हम संरक्षित मूल संरचनात्मक संगठन और आकारिकी साथ बरकरार नाक के ऊतकों को तैयार करने के लिए एक प्रभावी, मैनुअल deboning विधि का वर्णन है. हम क्रमिक रूप से पूर्वकाल के प्रमुख हड्डियों को दूरचूहों बहुत पुराने हैं, जब तक कि पतली turbinate हड्डियों को बरकरार रखे हुए है और cryosectioning जबकि एक लगभग पूरी तरह से बरकरार नाक उपकला का पर्दाफाश करने के लिए एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे खोपड़ी की जरूरत है. हम भी इस प्रकार परिधीय और केंद्रीय दोनों सर्किट के एक साथ परीक्षा की सुविधा है, नाक के ऊतकों और घ्राण बल्ब के बीच संबंध है, साथ ही मस्तिष्क के बाकी संरक्षित करने के लिए विधि का विस्तार. हमारे विधि paraformaldehyde तय है, साथ ही नए सिरे से, जीना नाक ऊतक तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, हमारे विधि श्वसन, गंध, और नाक की क्षति और बीमारी की, रूपात्मक immunohistochemical और मनोवैज्ञानिक अध्ययन की सुविधा होने की उम्मीद है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम नीचे ऊतक बख्शते हुए क्रमिक रूप से आसपास के हड्डियों को निकाल कर माउस नाक से बरकरार घ्राण और श्वसन ऊतक अलग करने के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया का प्रदर्शन किया. हम सावधान हड्डी को हटाने की उनकी सं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम Weihong लिन के लिए अनुसंधान अनुदान (एनआईएच / NIDCD 009269, 012831 और ARRA प्रशासनिक पूरक एनआईएच अनुदान) द्वारा समर्थित किया गया था. हम विशेष रूप से videotaping और प्रसंस्करण में उनकी तकनीकी सहायता के लिए UMBC पर श्री टिम फोर्ड धन्यवाद. हम भी videotaping में उनके उपकरणों की सहायता के लिए ओलिंप अमेरिका इंक से डा. डाफ्ने ब्लमबर्ग, UMBC पर सुश्री Chere पैटी और श्री निकोलस McCollum शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
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