보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법
Abstract
포유 동물의 코는 복잡한 내부 구조를 가진 다기능 기관이다. 비강은 이러한 해부학 적 위치, 형태 및 기능에 크게 차이, 후각 호흡하고, 편평 상피 등 다양한 상피 세포에 늘어서있다. 성인 쥐에서 코는 특히 내부 구조, 주요 후각 상피 세포 (MOE)와 같은 후방 등의 사람들에게 실험적인 접근을 제한하는 각종 두개골 뼈 덮여있다. 여기에 우리가 보존 해부 조직과 거의 전체와 그대로 비강 조직을 얻기위한 효과적인 방법을 설명합니다. 해부 현미경 수술 도구를 사용하여, 우리는 순차적으로 비강 조직을 둘러싼 두개골 뼈를 제거합니다. 이 절차는 모두 파라 포름 알데히드 고정 갓 해부, 피부 마우스 머리에 수행 할 수 있습니다. 전체 발골 절차는 기존 화학 기반 데 필요한 실험 시간보다 훨씬 짧은 20 ~ 30 분 정도를 소요석회화. 또한, 우리는 비강 조직 준비에서 그대로 얇은 수평 또는 관상 또는 시상 부분을 얻기위한 중요한 비갑개 사이에 갇힌 공기 방울을 제거하는 쉬운 방법을 제시한다. 우리의 방법을 사용하여 준비 비강 조직은 특히 특정 지역과 관련된 검사와 비교가 관심의 연구에서, 전체 마운트 전체 상피 세포의 관찰뿐만 아니라, 형태 학적, 면역 세포, RNA 등의 현장 하이브리드 화, 그리고 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
포유류 비강은 조직과 별개의 기능을 제공 기관의 다양한 유형을 포함하고 있습니다. 비강은 폐에 그리고 밖으로 항공 여행을 할 수 상부 호흡기의 입구 부분을 차지합니다. 흡입 공기는 그것뿐만 아니라 청소를하거나, 자극성 및 독성 물질 및 전염성 미생물 2를 제거하는 필터링으로 온도와 습도 조절 1 거쳐 비강을 통해 전달합니다. 두 치료는 비강 상피와 땀샘과 혈관을 포함하여 피하 조직에 의해 수행과 하부기도와 폐를 보호하기 위해 중요합니다. 호흡 상피 방어의 역할뿐만 아니라, 비강 조직은 지나가는 공기에 화학 물질의 넓은 범위를 감지 후각과 삼차 시스템의 말초 감각기구를 포함합니다. 활성화되는 시스템에 따라, 코 화학 물질의 감각 감지 중 하나를 유도 할 수냄새, 자극, 또는 고통 3,4의 감각.
주변 후각 시스템은 복잡하고 비강 내에서 여러 해부학 적으로 분리 후각 감각 기관으로 구성되어 있습니다. 그 중에서도, 주요 후각 상피 세포 (MOE)는 설치류 5 비강 상피 세포의 약 45~52%을하게하고 후방 지역에 위치한 가장 큰 것입니다. anteroventral 지역에서 비중격의 각 측면을 따라 앉아 vomeronasal 기관 6로 알려진 관상 구조의 쌍입니다. Masera 7,8와 Gruneberg 신경절 9 중격 기관으로 알려진 후각 감각 뉴런의 두 개의 추가 작은 그룹, 각각 복부 중격과 비강 등의 항목 영역을 함께 상주합니다. 이러한 주변 장기 독특한 형태의 기능, 세포 마커 발현 및 생리 기능과 신경 상피가 포함되어 있습니다. 이들은 냄새의 수천을 감지절묘한 감도 10-12를 가진 분자.
후각 감각 기관뿐만 아니라, 비강도 다른 감각 시스템을 전시하고 있습니다. 그것은 peptidergic 삼차 신경 섬유는 비강 상피 세포, 특히 호흡기 상피 세포 13,14에 존재하는 것으로 알려져있다. 이러한 섬유의 일부는 자극과 독성 화학 물질을 감지하고 기침과 4,15 재채기 등의 보호 반사를 개시 할 책임이 있습니다. 자극성 악취 쓴 화합물은 또한 그 중 대부분은 삼차 신경 섬유 16-19로 떨어짐을하는 고독한 chemosensory 세포 (SCC에)의 최근에 발견 된 인구 감지 할 수 있습니다. 이 SCC에들은 또한 보호 기능에게 16-18를 제공 할 수 있다는 암시, 비강 및 vomeronasal 항목 덕트의 입구 영역에서 높은 밀도에 있습니다. 따라서, 비강 상피 기능, 형태 실질적으로 다를 수 있고, 세포 성분은에 따라해부학 적 위치.
심지어 하나의 전문 상피 세포 내에서 지역적 차이가 있습니다. 환경부는 하나의 예입니다. 복잡하고 구조 말려 MOE 줄 다양한 비갑개. 따라서 그 때문에, 다른 MOE 경험을 다른 공기 유량 영역, 그리고 다른 확산 및 공기 냄새 분자 (20)의 제거율. 또한, 그것은 특정 냄새 수용체를 표현하는 후각 감각 뉴런 (OSNs)은 환경부 21,22의 영역을 우회 네 가지 중 하나에있는 것으로 알려져있다. 이 위치의 차이에 미치는 영향에 악취에 OSN의 반응은 대부분 알려져 있지 않다. 또한, 일부 OSN 인구는 지역의 환경 설정을 나타냅니다. Guanylyl cyclase의-D (GC-D) 표현 OSNs는 ectoturbinates 23,24의 막 다른 골목 영역을 선호 존의 분포가있다. 더 최근에, 우리는 (TR 일시적인 수용체 잠재적 인 채널 M5를 표현 정식 OSNs의 모집단을 발견PM5)과는 우선적으로 측면과 복부 지역 25에 위치하고 있습니다. 이러한 결과는 환경부가 균일하지 않습니다 나타냅니다. 그러나 이러한 지역적 차이는 후각 코딩에 어떻게 영향을 미치는지 이해되지 않습니다. 철저한 생리 환경부의 조사와 코는 현재의 방법을 사용하여 보존 해부학 적 조직 손상 비강 상피 세포를 얻기의 어려움에 의해 제한되어 있기 때문에이 부분에 있습니다.
비강 상피는 주로 비강, 상악, 라틴, 광대뼈, 그리고 사골 뼈를 포함하여 두개골의 앞쪽 뼈에 의해 둘러싸여 있습니다. 성인 마우스 및 기타 설치류 모델에서,이 뼈는 특히 밀접한 관련이 비강 조직, 섬세한 비갑개를 손상없이 제거하기 어렵고 어렵다. 종종, 화학 기반의 탈회는 면역, 형태, 및 현장 하이브리드 화 연구에서 비강 조직의 cryosectioning 수 있도록 뼈를 부드럽게하는 데 사용되지만, depen딩은 동물의 연령, 탈회 과정은 하룻밤 7 일에게 24,26-28을 지속 할 수있다. 그것은 조직이 정착 보존 할 필요하기 때문에이 치료는 제한됩니다. 또한, 화학 탈회는 가혹한 일부 민감한 항체 29,30의 immunolabeling의 영향을 미칠 수 있습니다. 생리 학적 연구에, 살아있는 조직이 필요하며, 따라서이 실험은 종종 고립 OSNs 또는 그 두개골 뼈 얇고 17,31,32 부드러운 신생아에서 얻은 MOE 조각에 실시하고 있습니다. 생리 학적 연구는 또한 분할 머리 25,33,34에게로 전체 마운트 준비를 활용할 수 있지만, 코의 내측 표면에 일반적으로 다른 영역에 생리 녹음을 제한, 쉽게 액세스 할 수 있습니다.
여기, 우리는 보존 원래의 해부학 적 조직 형태로 그대로 비강 조직을 준비하는 효과적인, 수동 발골 방법을 설명합니다. 우리는 순차적으로 전방의 주요 뼈를 제거마우스가 아주 오래된 않는 얇은 비갑개의 뼈는 그대로 유지하고 cryosectioning 동안 거의 그대로 비강 상피 세포를 노출 해부 현미경 두개골이 필요합니다. 우리는 또한 이렇게 주변과 중앙 두 회로의 동시 검사를 촉진, 비강 조직과 후각 전구 사이의 연결뿐만 아니라, 뇌의 나머지 부분을 유지하기 위해 방법을 확장합니다. 우리의 방법은 파라 포름 알데히드 고정뿐만 아니라, 신선한, 살아있는 비강 조직을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 호흡, 후각, 그리고 비강 손상 및 질병, 형태 면역 및 생리 학적 연구를 촉진 할 것으로 예상된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에, 우리는 아래 조직을 살려주는 동안 순차적으로 주변의 뼈를 제거하여 마우스 코에서 그대로 후각 및 호흡기 조직을 분리하기위한 단계별 절차를 보여 주었다. 우리는 조심 뼈 제거가 전체에서도 가장 민감한 조직을 보존 할 수 있다는 것을 보여. 우리는 또한 우리가 신경 연결을 유지하기 위해 함께 뇌와 코 조직을 모두 분리하는이 기술의 가능성 개조에 대한 통찰력을 공유 할 수 있습니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Weihong 린에 연구 보조금 (NIH / NIDCD 009269, 012831 및 ARRA 관리 보충 NIH 보조금)에 의해 지원되었다. 우리는 특히 찍고 및 처리에있는 그의 기술 지원 UMBC에서 씨 팀 포드 감사합니다. 우리는 또한 찍고 자신의 장비 지원을 올림푸스 미국 주식 박사 다프네 베르크, UMBC에서 양 Chere 페티 니콜라스 McCollum에 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. . Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l’esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
