Силы измерения можно использовать для демонстрации изменения в мышечной функции в связи с развитием, травмы, болезни, лечение или химической токсичности. В этом видео, мы демонстрируем метод измерения силы во время максимального сокращения данио личиночные мышцы туловища.
Личинки данио предоставить модели развития мышц, мышц и мышечных заболеваний связанных химической токсичности, но соответствующих исследований часто не хватает функциональной меры мышечного здоровья. В этом видео статье мы демонстрируем метод измерения силы поколения при сокращении мышц личиночной данио ствола. Силы измерения достигнуто путем размещения под наркозом личинка в камеру, заполненную раствором соли. Передний конец тела личинки связана с датчиком силы и задний конец личинки связана с длиной контроллера. Изометрическое сокращение дергаться это вызвало путем электрической стимуляции поля и сил реагирования записывается для анализа. Формирование сил во время сокращения позволяет определить общее состояние здоровья мышц и, в частности обеспечивает измерение мышечной функции. Хотя мы опишем эту технику для использования с диким типом личинки, этот способ может быть использован с генетически модифицированной личинок или личинок лечить с помощью препаратов или токсических веществ,Для характеристики моделей мышечных заболеваний и оценку лечения, или для изучения развития мышц, травмы или химической токсичности.
Молодые данио (Danio рерио) личинки, 3-7 дней после оплодотворения (DPF), получают все большее признание в качестве полезного для организма исследований скелетных мышц. Молодые личинки используются для моделирования человеческих заболеваний мышц 1-9, оценивать лекарственных препаратов и терапевтических стратегий 10-11, кабинет 12 мышечных травм, понять развитие мышц 13-16, а также расследовать мышц связанных химической токсичности 17-19. Типичные исследования в этих областях исследовать степень, до которой здоровых мышц отображается ненормальное генетической манипуляции или воздействие токсикантов, а некоторые исследования исследовать степень, до которой аномальный мышца реагирует на лечение. Важнейшее значение для успеха этих исследований является возможность точно оценить мышцы здоровья.
Хотя существуют различные методы для оценки здоровья в мышцах личинки данио, только немногие имеют прямую информацию о функции мышц. Мышцы здоровья, как правило, оцениваются appearancе, по оценке гистологического окрашивания 6,8,11, иммунным 9,15,16,18, 3,13 световой микроскопии, электронной микроскопии 3,4,14,16 или двулучепреломления 7,9,11, но эти методы обеспечивают морфологической информации. Туловища и хвоста перемещений и скорости плавания 4,17 оценить двигательную функцию, но они не являются прямыми мерами функции мышц, так как они также отражают нервный входной сигнал, энергетический обмен, и другие процессы.
В противоположность этому, измерение генерации силы при сжатии обеспечивает прямой оценки мышечной функции и представляет собой меру общего состояния здоровья мышц. Дополнительные преимущества этого подхода включают непосредственный анализ данных и количественных результатов. В этом видео статье, мы предоставляем подробную процедуру для измерения силы поколения личиночной мышц, в надежде, что больше исследователей будет использовать этот метод в дополнение к существующим мерам мышечного здоровья в своих исследованиях.
<pкласс = "jove_content"> Общая цель этого метода заключается в измерении силы поколения при сокращении мышц личиночной данио ствола. Для достижения этой цели, личинки данио находится под наркозом, и помещают в камеру, наполненную раствором соли. Передний конец тела личинки связана с датчиком силы и задний конец личинки связана с длиной контроллера. Мышцы активации осуществляется электрическое стимулирование поле и ток возбуждения и длины личинки корректируются, чтобы достичь максимальной силы сокращений. Изометрическое сокращение дергаться это вызвало и Силах реагирования записывается для анализа.Чтобы было ясно, этот метод не измеряет сил, возникающих при личиночной мышц во время плавания. Поскольку оба конца личинки привязаны к оборудованию и потому, что личинка остается под наркозом, он не может начать движение во время тестирования. Кроме того, поле стимуляция активирует все мышечных волокон, в то же время, чтобы вызвать млрд.ateral сокращения, которые не то, что естественно происходит 20. Поэтому вместо того, измерения фактически сил, возникающих во время плавания, этот метод определяет возможность генерирования силы личиночной мышц.
Мы использовали эту технику, чтобы продемонстрировать слабость мышц в данио модель немалиновой миопатия 21, а также для оценки влияния антиоксидантов на лечении мышечной функции в данио модель мульти-MiniCore болезни 22. Другие использовали подобную технику 23 по изучению влияния загрязнителя окружающей среды на мышечную функцию 19.
Этот метод мер по формированию сил во время дергаться для оценки функции мышц в багажник мышцы личинки данио. Хотя тетаническое сокращения могут быть выявлены в личинки данио (например, путем стимуляции 200 имп / сек в течение от 0,2 сек), то максимальное усилие тетаническое только на 10-15% больше, чем максимальное силы сокращений. Таким образом, сила, создаваемая во время дергаться является разумной мерой силы возможностью генерации. Twitches предпочтительнее тетаническое сокращений, потому что дергается, менее вероятно, чтобы вызвать разрыв или соскальзывание на шовный связей.
Для того, чтобы генерировать значимые данные с этой техникой, максимальная силы сокращений должна быть достигнута для каждой личинки и изменчивости между экспериментальными группами должны быть минимизированы. С учетом этих целей, мы предлагаем следующие предложения. Во-первых, будьте внимательны, когда личинка связывая с преобразователем силы и длины труб контроллера. Если шовные петли затянуты слишкоммного, шовный будет прорезать мышечной ткани. Если шовные петли не затянут достаточно, усилие, создаваемое личинки не будет полностью передается на датчик силы. Обе ситуации, но особенно последнего, недооценивать максимальной силы сокращений. Во-вторых, поскольку тестирования нескольких экспериментальных группах может занять несколько часов (20-30 мин / личинка), чередуются между группами, потому что личинки продолжают развиваться в течение периода тестирования.
Хотя некоторые из указанных приборов необходимо для измерения максимальной силы сокращений (например, датчик силы, текущие стимулятор), другие предметы не являются абсолютно необходимыми. Продолжительность ролика саркомер системы желательна, но не обязательна. В качестве альтернативы, серии подергивания может быть использован, чтобы найти оптимальную продолжительность, в течение которой Длина личинки доводили до максимальной силы сокращений не будет достигнута. Система контроля температуры также не является абсолютно необходимым. Контроль температуры очень важно при измеренияхSuring подергивание кинетика, которые очень чувствительны к температуре, тогда как максимальный силы сокращений не особенно чувствительны к небольшим изменениям температуры и может быть измерено при комнатной температуре. Следует отметить, что независимо от температуры в камере во время тестирования силы, личинки должны быть сохранены при оптимальной температуре роста 28,5 ° C до 24, чтобы заставить тестирования для точного определения стадии.
Личинки испытывают в растворе, содержащем Tyrodes Tricaine. Мы используем 0,02% (вес / объем) Tricaine, концентрации, рекомендованной для анестезии 24, для устранения спонтанных сокращений вызванные нервной системы и таким образом предотвратить усталость во время сила тестирования. Tricaine также облегчает тай-на шаг и уменьшает общее время тестирования. Тем не менее, заметим, что в том числе Tricaine в тестировании решений последовательно снижает максимальную силы сокращений примерно на 30%. Аналогичный эффект наблюдается и в мышцах хвоста головастика, где tricaiNE уменьшена сила поколения после нервно-мышечной передачи был заблокирован, предполагая, что Tricaine имеет прямое влияние на мышцы 25. Tricaine может уменьшить возбудимость мышечных клеток путем снижения натрия проводимость через клеточную мембрану, как это происходит в нервных клетках 26. Другие варианты для блокирования активации мотонейронов являются D-тубокурарина и α-бунгаротоксина но, в отличие Tricaine, эти соединения не являются кожу проницаемой и должны быть введены непосредственно в головной, спинной мозг, или сердце 27. Отдельных исследователей нужно будет оценить, является ли или нет Tricaine желательно для их конкретного применения. Если Tricaine входит в тестировании растворе концентрацию должны быть согласованы между экспериментами и исследователи должны проверить, что эффект Tricaine не изменяется между экспериментальными группами.
Опишем этот метод для личинок в возрасте 3 и DPF же стара, как 7 DPF. Хотя мышечных волокон кажутся фуnctional уже в 17 часов после оплодотворения, когда спонтанных движений хвоста начинают 27, короткая длина хвоста до 3 DPF мешает связывая личинке тестирования оборудования. Как правило, мы не испытываем личинки после 7 DPF, так как многие модели болезни не выживают гораздо дольше, чем на этот раз. Если тестирование личинки за пределы 5 DPF, личинки должны питаться. Мы заметили, что голодные личинки имеют меньшие мышцы и выделяют меньше максимальной силы сокращений, чем кормят личинок, вероятно, связано с уменьшением желточного мешка. Таким образом, может быть желательно для проверки личинок между 3-5 денье, чтобы избежать дополнительной переменной внешнего питания.
Таким образом, мы описываем количественных и надежный метод измерения силы поколения во время максимального сокращения подергивание мышц личиночной данио ствола. Этот метод может быть использован для оценки общего состояния здоровья рыбок данио личиночной мышц и, в частности предоставляет информацию о функции мышц. В дополнение к предоставлению информации оВеличина силы поколения, этот метод может быть использован для изучения кинетики формирования сил или адаптировать для изучения мышечной усталости 22. Хотя мы опишем эту технику для использования с диким типом личинки, этот способ может быть использован для генетически модифицированных личинок или личинок лечить с помощью препаратов или токсических веществ, охарактеризовать модели мышечных заболеваний и оценки лечения, или для изучения развития мышц, мышечную травму или мышцы связанных химической токсичности.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Ангела Busta за помощь данио хозяйства. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (AG-020591 в СВБ и 1K08AR054835 к JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |