Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kraftmaalingen Under Sammentrækning at vurdere muskelfunktionen hos zebrafisk Larver

doi: 10.3791/50539 Published: July 23, 2013

Summary

Kraftmålinger kan bruges til at påvise ændringer i musklernes funktion på grund af udviklingen, skade, sygdom, behandling eller kemisk toksicitet. I denne video viser vi en metode til at måle kraft i løbet af en maksimal sammentrækning af zebrafisk larver trunk muskler.

Abstract

Zebrafisk larver giver modeller for muskel udvikling, muskel sygdom og muskel-relaterede kemiske toksicitet, men beslægtede studier ofte mangler funktionelle mål for muskel sundhed. I denne video artiklen, viser vi en metode til at måle force generation under sammentrækning af zebrafisk larver trunk muskler. Kraftmålinger opnås ved at placere en bedøvet larve ind i et kammer fyldt med en saltopløsning. Den forreste ende af larve er bundet til en krafttransducer og den bageste ende af larve er bundet til en længde controller. En isometrisk spjæt kontraktion fremkaldes ved elektrisk felt stimulering og kraften respons registreres til analyse. Kraft generation under sammentrækning giver et mål for den samlede muskel sundhed og specifikt giver et mål for muskel funktion. Selvom vi beskrive denne teknik til brug med vildtype-larver, kan denne fremgangsmåde anvendes med genetisk modificeret larver eller med larver behandlet med medicin eller giftstoffer,at karakterisere muskelsygdom modeller og evaluere behandlinger eller for at studere muskel udvikling, skade eller kemisk toksicitet.

Introduction

Young zebrafisk (Danio rerio) larver, 3-7 dage efter befrugtningen (DPF), anerkendes i stigende grad som en nyttig organisme til skeletmuskulatur forskning. Unge larver bruges til model menneskelige muskelsygdom 1-9, vurdere lægemidler og terapeutiske strategier 10-11 studie muskel skade 12, forstår muskelfylde 13-16, og undersøger muskel-relaterede kemiske toksicitet 17-19. Typiske undersøgelser på disse områder undersøge i hvilken grad sund muskel gøres unormal ved genetisk manipulation eller udsat for giftige stoffer, og nogle undersøgelser undersøge i hvilken grad unormal muskel reagerer på behandlingen. Afgørende for succes af disse undersøgelser er evnen til præcist at vurdere muskel sundhed.

Mens der er en række forskellige metoder til at vurdere muskel sundhed i zebrafisk larver par giver direkte information om muskel funktion. Muskel sundhed sædvanligvis evalueret af udseee, som vurderet af histologiske farvning 6,8,11, immunfarvning 9,15,16,18, lysmikroskopi 3,13, elektronmikroskopi 3,4,14,16 eller dobbeltbrydning 7,9,11, men disse teknikker giver morfologisk information. Trunk og hale fordrivelser og svømning hastighed 4,17 evaluere motorik, men disse er ikke direkte mål for muskel funktion, da de afspejler også neural input, energiomsætning, og andre processer.

Derimod giver måling force generation under sammentrækning en direkte vurdering af muskel funktion og repræsenterer et mål for den samlede muskel sundhed. Ekstra fordele af denne fremgangsmåde omfatter ligetil dataanalyse og kvantitative resultater. I denne video artiklen, giver vi en detaljeret procedure for måling af force generation ved larvernes muskler, i håb om at flere forskere vil bruge denne metode til at supplere eksisterende foranstaltninger af muskler sundhed i deres forskning.

For at være klar, er denne teknik ikke måle kræfter, der genereres af larvernes musklerne under svømning. Fordi begge ender af larve er bundet til udstyr og fordi larve stadig bedøvet, kan det ikke initiere bevægelse under testning. Endvidere felt stimulation aktiverer alle muskelfibre samtidig at inducere en miaateral sammentrækning, som er ikke hvad forekommer naturligt 20. Derfor, snarere end at måle faktiske kræfter, der genereres under svømning, bestemmer denne teknik kraft frembringende evne larve muskler.

Vi har brugt denne teknik til at påvise muskelsvaghed i en zebrafisk model af nemaline myopati 21, samt at evaluere effekten af antioxidant behandling på muskel funktion i en zebrafisk model af multi-minicore sygdom 22.. Andre har brugt en lignende teknik 23 til at undersøge virkningerne af en miljømæssig forurenende stof på muskelfunktion 19..

Protocol

Bemærk: alle procedurer, der involverer zebrafisk bør udføres i overensstemmelse med de relevante retningslinjer, bestemmelser og reguleringsorganer. Alle animalske brug procedurer er vist i denne artikel er godkendt af University of Michigan Udvalg om brug og pleje af dyr (UCUCA).

1.. Gør suturløkkerne

  1. Brug pincet til at adskille usterile sutur (USP 10/0 monofil nylon, 3 lags) i tre delområder.
  2. Begynd at binde en dobbelt overhånd knude i en af ​​de tråde. Stop før stramning knuden fuldstændigt at gøre en lille (~ 1 mm i diameter) løkke i stedet for en knude.
  3. Brug en saks til at klippe overskydende sutur fra sløjfen haler. Et eksempel på en færdig løkke er vist i figur 1..
  4. Placer løkken på den klæbende side af en Post-it Note til senere brug. De suturløkkerne vil blive brugt til at holde larverne på plads under gældende test.
  5. Gentag trin 1,1-1,4 som nødvendigt. Make to suturløkkerne for hver larve der vil blive testet.

2.. Gør Testing Solution

  1. Gør Tyrodes opløsning ved tilsætning af 7,977 g natriumchlorid, 0,373 g kaliumchlorid, 0,265 g calciumchlorid-dihydrat, 0,102 g magnesiumchloridhexahydrat, 0,048 g monobasisk natriumphosphat, 1,000 g natriumbicarbonat og 0,037 g dinatriumethyltendiamintetracetat dihydrat til 1.000 ml renset vand.
  2. Opløsningen omrøres indtil saltene er fuldstændig opløst. Denne opløsning kan opbevares i en måned ved 4 ° C.
  3. Tilføj 2,1 ml 4 mg / ml tricaine, fremstillet ifølge zebrafisk Bog 24, til 47,9 ml Tyrodes saltsyre og blandes. Beskyt denne løsning fra lys ved at opbevare den i et mørkt glas flaske eller i en glasflaske dækket med aluminiumsfolie. Denne opløsning bør opbevares ved stuetemperatur og lavet frisk hver dag.

3.. Tie Aanesthetized Larve i Eksperimentel Afdeling

    <li> Placer testapparaturet (figur 2) på scenen af et stereo mikroskop.
  1. Forbind force transducer og længde controller kabler testapparaturet. Tænd krafttransducer. Tænd længden controller, så det forbliver stift. (Bemærk:.. Længden controlleren giver mulighed for at strække eller forkorte en muskel præparat under en sammentrækning Imidlertid er denne funktion af længden controlleren ikke anvendes i den heri beskrevne fremgangsmåde kan derfor længden controlleren opfattes som en stiv fastgørelse punkt monteret på et XYZ Positioning System).
  2. Med en engangs overførselspipetten, fylde den eksperimentelle kammer med test løsning.
  3. Brug pincet til at afhente en sutur løkke af en af ​​de haler og hænge det på krafttransducer røret. Hæng en anden sutur løkke på røret fastgjort til længden controlleren. (Bemærk: gribende en sutur løkke på den buede del kan knækkes suturen og cauSE det at bryde under efterfølgende trin).
  4. Med en engangs transfer pipette en zebrafisk larve til en lille petriskål fyldt med test løsning. Vent til bedøvelse i afprøvningen opløsningen (tricaine) for at tage effekt (~ 1 min). Med en pincet, nudge forsigtigt halen og kontrollere, at larven er bedøvet af mangel på touch-fremkaldte svømning.
  5. Brug et glas pipette til at overføre larve til den eksperimentelle kammer.
  6. Ved forsigtigt nudging larve med lukkede pincet, vejlede den forreste del af larve gennem suturen loop på krafttransducer røret. Guide den forreste del af larve gennem suturen loop på røret. Tag fat i begge sutur loop haler med en pincet og trække dem samtidig for at stramme suturen loop posteriort for blommesækken eller swimbladder (figur 3A).
  7. Med en pincet, holde en sutur løkke hale og træk, hvilket larven at dreje 90 ° rundt om røret, indtil den laterale side af larve ansigts op (figur 3B). Hvis løkken blev strammet nok, vil der være en vis modstand mod træk, larve bør ikke dreje let. Hvis løkken blev strammet for meget, vil larven ikke dreje omkring røret.
  8. Brug af XYZ positionering anordning fastgjort til længden controller, længden controller røret bevæge sig langs X-aksen (akse definitioner i figur 2A) og under stammen og halen af larve. Efterlade mellemrum mellem enderne af længden controller rør og krafttransducer rør.
  9. Guide suturen løkken over halen af larve og stram sutur sløjfe som tidligere beskrevet (figur 3C). Du kan være nødt til at dreje den bageste del af den larve, således at den laterale side vender opad. Trim sutur loop haler (figur 3D).

4.. Position Larve i Eksperimentel Afdeling

  1. Flyt larve til en passende afstand fra kammeret bund for at sikre larve wdårligt være inden "working distance" af et inverteret mikroskop mål i efterfølgende trin. For at opnå dette, skal du bruge XYZ positionering enheder til langsomt sænke rørene (med vedhæftet larve) langs Z-aksen, indtil rørene bare røre bunden af ​​kammeret. Derefter hæve rørene indtil larve er en passende afstand fra kammeret bund (~ 100 um).
  2. Brug af XYZ positionering anordning fastgjort til længden controller, længden controller røret justere langs Y-aksen for at justere den lange akse af larve med den lange akse krafttransducer røret.

5.. Record Kraft Under en Maximal Twitch Sammentrækning

  1. Flyt testapparatet til den fase af et inverteret mikroskop.
  2. Juster temperaturen i kammeret til en ønsket værdi. Til at begynde, skal du tilslutte vandbad cirkulationspumpe, termometer og temperatur controller til at teste apparatet. Tænd de nødvendige komponenter og justere indstillingen af ​​temperaturen controller indtil termometret rapporterer den ønskede værdi. Data, der indgår i denne artikel blev indsamlet ved 25 ° C, men målingerne kan også foretages ved RT eller 28,5 ° C.
  3. Tilslut kablerne fra stimulatoren til at teste apparatet. Tænd for strømmen til stimulatoren, men ikke stimulere larve indtil trin 5.6.
  4. Kontroller larve er parallel med kammerets bund. Gennem en 40X mål vis den del af larve mellem enderne af rørene. Hvis parallelt med bunden, vil begge ender af larve være i fokus. Hvis det er nødvendigt, justeres krafttransducer røret langs Z-aksen, indtil begge ender er i fokus.
  5. Kontroller, at larven er kortere end optimal. Tænd video sarkomer længde, og rotere videokamera sådan at Rillerne er parallelle med siderne af videobilledet. Dette system overvåger riller afstand ved at analysere variationer i pixelintensitet langs hver vandret række af pixels i et brugerdefineret område af interesse(ROI). Resultaterne for alle rækker i ROI gennemsnitsberegnes og rapporteres med en frekvens svarende til video frame-rate (≥ 80 sek -1). Den riller afstand bruges som en indikator for sarkomer længde.
  6. Juster mikroskop for at fokusere på perifere fibre og notere den angivne sarkomeret længde. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge XYZ positionering enhed er knyttet til længden controlleren til at justere længden af larve (X-aksen), indtil sarkomeret længde er mindre end optimale (fx 1,90 um).
  7. Juster stimuleringsstrømmen at optimere twitch kraft. Til at begynde, skal du indstille udgangsstrømmen på stimulator til et lavt størrelsesorden (fx 100 mA). Stimulatoren kan udløses manuelt eller via en computer, der kører et brugerdefineret LabVIEW program. Fremkalde en spjæt larve muskler med en strømimpuls på 0,2 msek i varighed.
  8. Brug et oscilloskop til at optage den kraft output og måle peak spjæt kraft ved hjælp af oscilloskop s markører. Forhøje det nuværendemed 50 mA trin og måle peak twitch kraft på hvert nuværende niveau. Vent 30 sekunder mellem ryk for at forhindre træthed. Som stimulation aktuelle stigninger, typisk peak ryk kraft stiger til et maksimum og derefter gradvist aftager. Strømmen ved hvilken larve genererer den største kraft er den optimale stimulering strøm. Indstil det aktuelle amplitude til den optimale stimulering strøm.
  9. Brug af XYZ positionering enheden, justere længden af ​​larve (og dermed sarkomer længde) for at fremkalde maksimal ryk kraft. Vildtype zebrafisk larver (3-7 DPF) generere maksimal spjæt kraft sarkomeret længder på 2,10 m eller 2,15 um. Dog kan sarkomeret længde sættes til 2,08 um for at undgå yderligere pres på larve.
  10. Fremkalde en spjæt larve muskler. Brug oscilloskopet til at optage den kraft respons og gemme posten til efterfølgende analyse.

6.. Mål muskulatur dimensioner med Larve ved Optimal længde

Flyt testapparatet tilbage til stereo mikroskop.
  • Brug okularet skala, måle højden af ​​muskulaturen, som set fra siden. Så pas på ikke at ændre længden på larve, dreje larve med 90 ° ved hjælp af sutur loop haler for at kunne se larve fra bunden. Mål bredden af ​​muskulaturen set fra bunden. De målinger på en anatomisk lokalitet (f.eks urogenital åbning) (figur 4).
  • Skær suturløkkerne med mikroblad at frigive larve fra testudstyr.
  • Representative Results

    Hos raske vildtype zebrafisk larver, bør muskelfibrene være parallelle med hinanden uden store huller mellem dem og har tydelige riller (figur 5A). Vildtype zebrafisk larver, der ikke udviser disse funktioner eller med tydelig skader såsom løsrevne fibre (figur 5B), skal kasseres.

    Et repræsentativt plot af top twitch kraft versus stimulering strøm til en enkelt zebrafisk larve er vist i figur 6. For vildtype zebrafisk larver mellem 3-7 dpf, er den optimale stimulering strøm typisk mellem 400-600 mA, med 3 dpf larver kræver generelt en større stimulation strøm end 6-7 dpf larver.

    De rå kraft data (indsamlet under trin 5.8) skal bearbejdes og analyseres med dataanalyse software. Først bliver baseline af den kraft rekord sat til nul. For det andet, er udgangsspændingen af ​​krafttransducer konverteret til tvinge (mN) (se producentens anvisninger til at generere en kalibreringskurve for krafttransducer). En repræsentativ kraft reaktion indsamlet under en maksimal spjæt sammentrækning af en enkelt larve er vist i figur 7. Dataanalyse software kan bruges til at måle maksimale kraft og andre funktioner i kraft respons.

    Et repræsentativt sæt topkraft data fra maksimale ryk sammentrækninger er vist i figur 8A. Typiske peak twitch kraftværdierne for vildtype 3-7 dpf larver interval 0,9-1,7 mN med ældre larver generere mere kraft, end yngre larver. Forskelle i peak spjæt gældende kan skyldes normale processer som vækst og udvikling (figur 8), eller unormale processer såsom genmutation-relaterede patologi 21,22.

    Normalisering af muskel tværsnitsareal (CSA) kan anvendes til at bestemme, i hvilket omfang forskelle i top spjæt kraft er simpelthen skyldes differe nces i størrelse af muskulaturen 21,22. Muskel CSA kan estimeres ved hjælp af formlen: CSA = π (A / 2) (B / 2), hvor A er højden af ​​muskulaturen, som set fra siden, B er bredden af ​​muskulaturen set fra bunden, og en elliptisk tværsnit forudsættes. Typiske CSA værdier for vildtype 3-7 dpf larver intervallet fra 0,027 til 0,034 mm 2 med 3-4 dpf larver generelt viser mindre CSA værdier end 5-7 dpf larver. Et repræsentativt sæt normaliserede topkraft data fra maksimale ryk sammentrækninger er vist i figur 8B. Typiske normaliserede peak twitch kraftværdier for vildtype 3-7 dpf larver intervallet 34-51 mN / mm 2 med 4-7 dpf larver generelt viser større værdier end 3 dpf larver.

    Figur 1
    Figur 1. Sutur løkke. Pile peger på suturen loop haler.

    ve_content "fo: keep-together.within-page =" altid "> Figur 2
    Figur 2. (A) Test apparat med mærkede komponenter. (B) Nærbilleder udsigt forsøgskammeret. (A) Eksperimentel kammer med transparent bund. (B) krafttransducer. (C) Længde controller. (D) XYZ positionering enheder. X, Y og Z akserne er defineret i øverste højre hjørne. (E) Temperatur kontrolsystem udnytter termoelektriske moduler. Tubing plads vandstrøm til køling af termoelektriske moduler. (F) Rustfrit stålrør fastgjort til krafttransducer. (G) rustfrit stålrør knyttet til længde controller. (H) Termometer mikroprobe. (I) Platinum parallelle pladeelektroder, der spænder over længden af Denkammer. Platinum plader er 2,5 mm høje og 0.255 mm tyk.

    Figur 3
    Figur 3. Binde larve i eksperimentel kammer. (A) Larve bundet på ved forreste ende, men endnu ikke drejes 90 °. (B) Larve efter uddrejede 90 °. (C) Larve bundet på ved bageste ende, men endnu ikke svinges. (D) Larve efter drejelige og sutur loop haler er trimmet.

    Figur 4
    Figur 4.. Målinger for tværsnitsareal estimering. Muskulatur set fra (A) side og (B)

    Figur 5
    Figur 5. Sidebillede af zebrafisk larver trunk muskulatur. (A) sundt væv. (B) Væv med tydelig skade. Kontrakturer som følge af fiber afdelinger er markeret med stjerner.

    Figur 6
    Figur 6.. Repræsentativt plot af peak twitch kraft versus stimulation strøm. Den optimale stimulation nuværende er 500 mA.


    Figur 7. Repræsentant force rekord for en enkelt twitch kontraktion. Denne sammentrækning blev fremkaldt med en stimulusimpuls ved 0 msek. Den maksimale kraft er 1.56 mN.

    Figur 8
    Figur 8. Repræsentative force data 3-7 dpf larver. (A) topkraft data fra maksimal ryk sammentrækninger. (B) topkraft data fra maksimal ryk sammentrækninger normaliseret til CSA. Ældre larver (6-7 DPF) blev fodret Hatchfry Encapsulon Grade 0 med Spirulina (Argent Laboratories) starter den 5. dpf. Midler + standardafvigelser er rapporteret med N = 5 i hver gruppe. Grupper markant forskellige fra 3 dpf larver (*) og 4 dpf larver (#) er indikeret (ANOVA, p <0,05). Den betydelige stigning i normaliseret kraft mellem 3 og 4 dpf (B) indikerer en stigning i den iboende kraft, genererer kapacitet i denne periode, mens stigning i kraft mellem 4 og 6-7 dpf (A) henføres til vækst baseret på nogen skifte 4-7 dpf i normaliseret kraft.

    Discussion

    Denne metode måler force generation under en trækning for at vurdere muskelfunktionen hos trunk muskler zebrafisk larver. Selvom tetaniske sammentrækninger kan blive fremkaldt i zebrafisk larver (f.eks 200 stimulationspulser / sek med en varighed på 0,2 sek), den maksimale tetaniske kraft er kun 10-15% større end den maksimale ryk kraft. Derfor, den kraft, der frembringes under en trækning er en rimelig grad af kraft frembringende kapacitet. Ryk foretrækkes frem tetaniske sammentrækninger fordi ryk er mindre tilbøjelige til at forårsage rippe eller glider på suturen bånd.

    For at generere meningsfulde data med denne teknik, bør maksimal ryk kraft opfyldes for hver larve og variabilitet mellem forsøgsgrupper bør minimeres. Med disse mål for øje, kan vi tilbyde følgende forslag. Først, skal du passe, når binde larve til krafttransducer og længden controller rør. Hvis suturløkkerne spændes formeget, vil suturen skære gennem muskelvæv. Hvis suturløkkerne ikke er strammet nok, vil den kraft, der frembringes af larven ikke fuldt overføres til krafttransducer. Begge situationer, men især sidstnævnte, undervurderer maksimal twitch kraft. For det andet kan da teste flere forsøgsgrupper tage flere timer (20-30 min / larve), veksler mellem grupper, fordi larver vil fortsætte med at udvikle sig i løbet af testperioden.

    Mens nogle af de nævnte udstyr er afgørende for måling af maksimal twitch force (f.eks force transducer, aktuelle stimulator), andre punkter er ikke absolut nødvendigt. Videoen sarkomer længde system er ønskeligt, men ikke påkrævet. Som et alternativ, kan en række ryk bruges til at finde optimale længde, hvor længden af ​​larve indstilles til maksimal spjæt kraft er opnået. En temperatur kontrolsystem er heller ikke absolut nødvendigt. Temperaturkontrol er kritisk, når MEASuring ryk kinetik, som er yderst følsomme over for temperatur, hvorimod maksimum ryk kraft ikke er særlig følsom over for små ændringer i temperatur og kan måles ved stuetemperatur. Bemærk, at uanset temperaturen i kammeret under kraft testen bør larverne holdes på den optimale vækst temperatur på 28,5 ° C 24 inden tvinge testning for præcis stadieinddeling.

    Larverne testes i en Tyrodes opløsning indeholdende tricaine. Vi bruger 0,02% (w / v) tricaine, koncentrationen anbefales til anæstesi 24, at fjerne spontane kontraktioner fremkaldt af nervesystemet og dermed forhindre træthed under kraft testning. Tricaine letter også tie-on trin og reducerer den samlede testtid. Men vi konstatere, at bl.a. tricaine i afprøvningen løsningen konsekvent reducerer den maksimale twitch kraft med ca 30%. En lignende virkning er også blevet observeret i haletudse hale muskel, hvor tricaine reducerede force generation efter neuromuskulær transmission blev blokeret, hvilket tyder på, at tricaine har en direkte effekt på muskel 25.. Tricaine kan reducere muskel celle uro ved at reducere natrium ledningsevne over cellemembranen, som det gør i nerveceller 26. Andre muligheder for blokering aktivering af motorneuroner er d-tubocurarin og α-bungarotoxin, men i modsætning tricaine er disse forbindelser ikke hud-gennemtrængelig og skal injiceres direkte ind i hovedet, rygmarv, eller hjerte 27. Individuelle efterforskere bliver nødt til at vurdere, hvorvidt tricaine er ønskeligt for deres specifikke anvendelse. Hvis tricaine indgår i test løsning, bør koncentrationen være konsekvent mellem eksperimenter og forskere bør kontrollere, at effekten af ​​tricaine ikke varierer mellem forsøgsgrupper.

    Vi beskriver denne metode til larver så unge som 3 dpf og så gammel som 7 dpf. Selvom muskelfibre synes at være functional så tidligt som 17 timer efter befrugtningen, når spontane hale bevægelser begynder 27 den korte længde af halen inden den 3. dpf hindrer binde larve til det udstyr. Vi typisk ikke teste larve efter 7. dpf da mange sygdomsmodeller ikke overlever meget længere end dette tidspunkt. Hvis testning larver over 5 dpf, bør larverne fodres. Vi har observeret, at unfed larver har mindre muskler og producere mindre maksimal spjæt kraft end fodret larver, sandsynligvis på grund af den faldende blommesækken. Således kan det være ønskeligt at teste larver mellem 3-5 dpf, at undgå yderligere variabel ekstern fodring.

    Sammenfattende beskriver vi en kvantitativ og pålidelig metode til måling af kraft generation i løbet af en maksimal spjæt sammentrækning af zebrafisk larver trunk muskler. Denne metode kan anvendes til at vurdere den generelle sundhed i zebrafisk larver muskler og specifikt indeholder oplysninger om muskel funktion. Ud over at give oplysninger omstørrelsen af force generation, kan denne teknik bruges til at studere kinetikken af force generation eller tilpasses til at studere muskeltræthed 22.. Selvom vi beskriver denne teknik til brug med vildtype-larver, kan denne metode bruges til genetisk modificerede larver eller larver behandlet med medicin eller giftstoffer, til at karakterisere muskelsygdom modeller og evaluere behandlinger eller for at studere muskel udvikling, muskel skade, eller muskel-beslægtet kemisk toksicitet.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Forfatterne takker Angela Busta for hjælp med zebrafisk dyrehold. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (AG-020.591 til SVB og 1K08AR054835 til JJD).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    REAGENTS
    Tricaine powder Sigma-Aldrich A5040
    Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
    Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
    Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 223506
    Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
    Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
    Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
    EQUIPMENT
    Nonsterile-suture Ashaway Line Twine S30002 USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)
    Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5
    Spring scissors Fine Science Tools 15000-08 Vannas
    Stereo microscope Leica Microsystems MZ8 Illuminated with Fostec EKE ACE I light source
    Force transducer Aurora Scientific 400A
    Length controller Aurora Scientific 318B
    XYZ positioning devices Parker Hannifin 3936M
    Thermometer Physitemp BAT-12
    Disposable transfer pipette Fisher Scientific 13-711-9AM Cut end to widen opening and facilitate larva transfer
    Petri dish Fisher Scientific 08-757-11YZ
    Glass pipette Fisher Scientific 13-678-8B Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer
    Inverted microscope Carl Zeiss Microscopy Axiovert 100
    Water bath circulator Neslab Instruments RTE-111
    Temperature controller Alpha Omega Instruments Series 800
    Stimulator Aurora Scientific 701C High-power, follow stimulator
    Video sarcomere length system Aurora Scientific 900B-5A
    LabVIEW software National Instruments
    Oscilloscope Nicolet Technologies ACCURA 100
    Microblade Fine Science Tools 10050-00
    Microblade holder Fine Science Tools 10053-13
    Data analysis software (Signo) Alameda Applied Sciences

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, (23), 5851-5860 (2003).
    2. Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, (13), 1727-1743 (2005).
    3. Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104, (17), 7092-7097 (2007).
    4. Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
    5. Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2), e1000372 (2009).
    6. Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20, (12), 826-832 (2010).
    7. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, (4), 623-633 (2010).
    8. Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
    9. Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. (1093).
    10. Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108, (13), 5331-5336 (2011).
    11. Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15, (12), 2643-2651 (2011).
    12. Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
    13. Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318, (1), 92-101 (2008).
    14. Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181, (2), 381-394 (2008).
    15. Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
    16. Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123, (7), 1141-1150 (2010).
    17. Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98, (2), 139-147 (2010).
    18. Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32, (4), 472-480 (2010).
    19. Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33, (6), 752-764 (2011).
    20. Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87, (3), 1244-1251 (2002).
    21. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
    22. Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, (4), 1115-1127 (2012).
    23. Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
    24. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
    25. Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110, (3), 289-296 (1995).
    26. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
    27. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37, (4), 622-632 (1998).
    Kraftmaalingen Under Sammentrækning at vurdere muskelfunktionen hos zebrafisk Larver
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).More

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter