Kraftmålinger kan bruges til at påvise ændringer i musklernes funktion på grund af udviklingen, skade, sygdom, behandling eller kemisk toksicitet. I denne video viser vi en metode til at måle kraft i løbet af en maksimal sammentrækning af zebrafisk larver trunk muskler.
Zebrafisk larver giver modeller for muskel udvikling, muskel sygdom og muskel-relaterede kemiske toksicitet, men beslægtede studier ofte mangler funktionelle mål for muskel sundhed. I denne video artiklen, viser vi en metode til at måle force generation under sammentrækning af zebrafisk larver trunk muskler. Kraftmålinger opnås ved at placere en bedøvet larve ind i et kammer fyldt med en saltopløsning. Den forreste ende af larve er bundet til en krafttransducer og den bageste ende af larve er bundet til en længde controller. En isometrisk spjæt kontraktion fremkaldes ved elektrisk felt stimulering og kraften respons registreres til analyse. Kraft generation under sammentrækning giver et mål for den samlede muskel sundhed og specifikt giver et mål for muskel funktion. Selvom vi beskrive denne teknik til brug med vildtype-larver, kan denne fremgangsmåde anvendes med genetisk modificeret larver eller med larver behandlet med medicin eller giftstoffer,at karakterisere muskelsygdom modeller og evaluere behandlinger eller for at studere muskel udvikling, skade eller kemisk toksicitet.
Young zebrafisk (Danio rerio) larver, 3-7 dage efter befrugtningen (DPF), anerkendes i stigende grad som en nyttig organisme til skeletmuskulatur forskning. Unge larver bruges til model menneskelige muskelsygdom 1-9, vurdere lægemidler og terapeutiske strategier 10-11 studie muskel skade 12, forstår muskelfylde 13-16, og undersøger muskel-relaterede kemiske toksicitet 17-19. Typiske undersøgelser på disse områder undersøge i hvilken grad sund muskel gøres unormal ved genetisk manipulation eller udsat for giftige stoffer, og nogle undersøgelser undersøge i hvilken grad unormal muskel reagerer på behandlingen. Afgørende for succes af disse undersøgelser er evnen til præcist at vurdere muskel sundhed.
Mens der er en række forskellige metoder til at vurdere muskel sundhed i zebrafisk larver par giver direkte information om muskel funktion. Muskel sundhed sædvanligvis evalueret af udseee, som vurderet af histologiske farvning 6,8,11, immunfarvning 9,15,16,18, lysmikroskopi 3,13, elektronmikroskopi 3,4,14,16 eller dobbeltbrydning 7,9,11, men disse teknikker giver morfologisk information. Trunk og hale fordrivelser og svømning hastighed 4,17 evaluere motorik, men disse er ikke direkte mål for muskel funktion, da de afspejler også neural input, energiomsætning, og andre processer.
Derimod giver måling force generation under sammentrækning en direkte vurdering af muskel funktion og repræsenterer et mål for den samlede muskel sundhed. Ekstra fordele af denne fremgangsmåde omfatter ligetil dataanalyse og kvantitative resultater. I denne video artiklen, giver vi en detaljeret procedure for måling af force generation ved larvernes muskler, i håb om at flere forskere vil bruge denne metode til at supplere eksisterende foranstaltninger af muskler sundhed i deres forskning.
<pclass = "jove_content"> Det overordnede mål for denne metode er at måle force generation under sammentrækning af zebrafisk larver trunk muskler. At opnå dette mål, en zebrafisk larve er bedøvet og anbragt i et kammer fyldt med en saltopløsning. Den forreste ende af larve er bundet til en krafttransducer og den bageste ende af larve er bundet til en længde controller. Muskelaktivering opnås ved elektrisk felt stimulering, og stimulering strøm og længden af larve er justeret til at frembringe maksimal ryk kraft. En isometrisk spjæt kontraktion fremkaldes og kraften respons registreres til analyse.For at være klar, er denne teknik ikke måle kræfter, der genereres af larvernes musklerne under svømning. Fordi begge ender af larve er bundet til udstyr og fordi larve stadig bedøvet, kan det ikke initiere bevægelse under testning. Endvidere felt stimulation aktiverer alle muskelfibre samtidig at inducere en miaateral sammentrækning, som er ikke hvad forekommer naturligt 20. Derfor, snarere end at måle faktiske kræfter, der genereres under svømning, bestemmer denne teknik kraft frembringende evne larve muskler.
Vi har brugt denne teknik til at påvise muskelsvaghed i en zebrafisk model af nemaline myopati 21, samt at evaluere effekten af antioxidant behandling på muskel funktion i en zebrafisk model af multi-minicore sygdom 22.. Andre har brugt en lignende teknik 23 til at undersøge virkningerne af en miljømæssig forurenende stof på muskelfunktion 19..
Denne metode måler force generation under en trækning for at vurdere muskelfunktionen hos trunk muskler zebrafisk larver. Selvom tetaniske sammentrækninger kan blive fremkaldt i zebrafisk larver (f.eks 200 stimulationspulser / sek med en varighed på 0,2 sek), den maksimale tetaniske kraft er kun 10-15% større end den maksimale ryk kraft. Derfor, den kraft, der frembringes under en trækning er en rimelig grad af kraft frembringende kapacitet. Ryk foretrækkes frem tetaniske sammentrækninger fordi ryk er mindre tilbøjelige til at forårsage rippe eller glider på suturen bånd.
For at generere meningsfulde data med denne teknik, bør maksimal ryk kraft opfyldes for hver larve og variabilitet mellem forsøgsgrupper bør minimeres. Med disse mål for øje, kan vi tilbyde følgende forslag. Først, skal du passe, når binde larve til krafttransducer og længden controller rør. Hvis suturløkkerne spændes formeget, vil suturen skære gennem muskelvæv. Hvis suturløkkerne ikke er strammet nok, vil den kraft, der frembringes af larven ikke fuldt overføres til krafttransducer. Begge situationer, men især sidstnævnte, undervurderer maksimal twitch kraft. For det andet kan da teste flere forsøgsgrupper tage flere timer (20-30 min / larve), veksler mellem grupper, fordi larver vil fortsætte med at udvikle sig i løbet af testperioden.
Mens nogle af de nævnte udstyr er afgørende for måling af maksimal twitch force (f.eks force transducer, aktuelle stimulator), andre punkter er ikke absolut nødvendigt. Videoen sarkomer længde system er ønskeligt, men ikke påkrævet. Som et alternativ, kan en række ryk bruges til at finde optimale længde, hvor længden af larve indstilles til maksimal spjæt kraft er opnået. En temperatur kontrolsystem er heller ikke absolut nødvendigt. Temperaturkontrol er kritisk, når MEASuring ryk kinetik, som er yderst følsomme over for temperatur, hvorimod maksimum ryk kraft ikke er særlig følsom over for små ændringer i temperatur og kan måles ved stuetemperatur. Bemærk, at uanset temperaturen i kammeret under kraft testen bør larverne holdes på den optimale vækst temperatur på 28,5 ° C 24 inden tvinge testning for præcis stadieinddeling.
Larverne testes i en Tyrodes opløsning indeholdende tricaine. Vi bruger 0,02% (w / v) tricaine, koncentrationen anbefales til anæstesi 24, at fjerne spontane kontraktioner fremkaldt af nervesystemet og dermed forhindre træthed under kraft testning. Tricaine letter også tie-on trin og reducerer den samlede testtid. Men vi konstatere, at bl.a. tricaine i afprøvningen løsningen konsekvent reducerer den maksimale twitch kraft med ca 30%. En lignende virkning er også blevet observeret i haletudse hale muskel, hvor tricaine reducerede force generation efter neuromuskulær transmission blev blokeret, hvilket tyder på, at tricaine har en direkte effekt på muskel 25.. Tricaine kan reducere muskel celle uro ved at reducere natrium ledningsevne over cellemembranen, som det gør i nerveceller 26. Andre muligheder for blokering aktivering af motorneuroner er d-tubocurarin og α-bungarotoxin, men i modsætning tricaine er disse forbindelser ikke hud-gennemtrængelig og skal injiceres direkte ind i hovedet, rygmarv, eller hjerte 27. Individuelle efterforskere bliver nødt til at vurdere, hvorvidt tricaine er ønskeligt for deres specifikke anvendelse. Hvis tricaine indgår i test løsning, bør koncentrationen være konsekvent mellem eksperimenter og forskere bør kontrollere, at effekten af tricaine ikke varierer mellem forsøgsgrupper.
Vi beskriver denne metode til larver så unge som 3 dpf og så gammel som 7 dpf. Selvom muskelfibre synes at være functional så tidligt som 17 timer efter befrugtningen, når spontane hale bevægelser begynder 27 den korte længde af halen inden den 3. dpf hindrer binde larve til det udstyr. Vi typisk ikke teste larve efter 7. dpf da mange sygdomsmodeller ikke overlever meget længere end dette tidspunkt. Hvis testning larver over 5 dpf, bør larverne fodres. Vi har observeret, at unfed larver har mindre muskler og producere mindre maksimal spjæt kraft end fodret larver, sandsynligvis på grund af den faldende blommesækken. Således kan det være ønskeligt at teste larver mellem 3-5 dpf, at undgå yderligere variabel ekstern fodring.
Sammenfattende beskriver vi en kvantitativ og pålidelig metode til måling af kraft generation i løbet af en maksimal spjæt sammentrækning af zebrafisk larver trunk muskler. Denne metode kan anvendes til at vurdere den generelle sundhed i zebrafisk larver muskler og specifikt indeholder oplysninger om muskel funktion. Ud over at give oplysninger omstørrelsen af force generation, kan denne teknik bruges til at studere kinetikken af force generation eller tilpasses til at studere muskeltræthed 22.. Selvom vi beskriver denne teknik til brug med vildtype-larver, kan denne metode bruges til genetisk modificerede larver eller larver behandlet med medicin eller giftstoffer, til at karakterisere muskelsygdom modeller og evaluere behandlinger eller for at studere muskel udvikling, muskel skade, eller muskel-beslægtet kemisk toksicitet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Angela Busta for hjælp med zebrafisk dyrehold. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (AG-020.591 til SVB og 1K08AR054835 til JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |