Kraftmessungen können verwendet werden, um Veränderungen in Muskel-Funktion aufgrund der Entwicklung, Verletzungen, Krankheit, Behandlung oder chemische Toxizität nachzuweisen. In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Kraft während einer maximalen Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen.
Zebrafisch-Larven bieten Modelle der Entwicklung der Muskulatur, Muskel-Erkrankungen und Muskel-bezogene chemische Toxizität, aber verwandte Studien mangelt es häufig an funktionellen Maßnahmen der Muskel Gesundheit. In diesem Video-Artikel zeigen wir eine Methode zur Krafterzeugung während der Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen. Kraftmessungen werden, indem ein narkotisierten Larve in eine Kammer mit einer Salzlösung gefüllt erreicht. Das vordere Ende der Raupe wird mit einem Kraftaufnehmer verbunden und das hintere Ende der Raupe wird auf eine Länge Controller verbunden. Eine isometrische Zuckung Kontraktion wird durch ein elektrisches Feld Stimulation hervorgerufen und die Kraft Reaktion zur Analyse aufgezeichnet. Krafterzeugung während der Kontraktion ein Maß für die allgemeine Gesundheit und speziell Muskel liefert ein Maß für die Muskelfunktion. Obwohl wir diese Technik für den Einsatz mit dem Wildtyp-Larven zu beschreiben, kann dieses Verfahren mit gentechnisch veränderten oder Larven mit Larven mit Medikamenten oder Giftstoffen behandelt werden,zu Muskelerkrankung Modelle charakterisieren und bewerten Behandlungen oder Muskel-Entwicklung, Verletzungen oder chemische Toxizität zu untersuchen.
Junge Zebrafisch (Danio rerio) Larven, 3-7 Tage nach der Befruchtung (DPF), werden zunehmend als nützlich Organismus für Skelettmuskel Forschung anerkannt. Junge Larven Modell menschlichen Muskelerkrankung 1-9 verwendet werden, bewerten Arzneimittel und therapeutische Strategien 10-11, Studie Muskelverletzung 12, verstehen die Entwicklung der Muskulatur 13-16, und zu untersuchen, Muskel-verwandten chemischen Toxizität 17-19. Typische Studien in diesen Bereichen zu untersuchen, inwieweit die gesunden Muskel abnormal wird durch genetische Manipulation oder durch Einwirkung von Schadstoffen gemacht, und einige Studien zu untersuchen, inwieweit die abnorme Muskel auf die Behandlung anspricht. Entscheidend für den Erfolg dieser Studien ist die Fähigkeit, genau zu beurteilen Muskel Gesundheit.
Zwar gibt es eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung, um Muskeln Gesundheit in Zebrafisch-Larven zu beurteilen sind, bieten nur wenige direkte Informationen über Muskelfunktion. Muscle Gesundheit wird in der Regel durch appearanc ausgewertete, wie durch histologische Färbung 6,8,11, Immunfärbung 9,15,16,18, Lichtmikroskopie 3,13, Elektronenmikroskopie 3,4,14,16 oder Doppelbrechung 7,9,11 beurteilen, aber diese Techniken bieten morphologische Information. Trunk und Schwanz Verschiebungen und Schwimmen Geschwindigkeit 4,17 auszuwerten Motorik, aber diese sind nicht direkt Maßnahmen der Muskelfunktion, da sie spiegeln auch neuronale Input, Energiestoffwechsel und andere Prozesse.
Im Gegensatz dazu messen Krafterzeugung während der Kontraktion eine direkte Beurteilung der Muskelfunktion und stellt ein Maß für die allgemeine Gesundheit Muskel. Hinzugefügt Vorteile dieses Ansatzes sind einfach Datenanalyse und quantitative Ergebnisse. In diesem Video-Artikel stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Messung von Kraft Generation von Larven Muskeln, in der Hoffnung, dass mehr Forscher wird diese Methode verwenden, um bestehende Maßnahmen des Muskels Gesundheit in ihrer Forschung zu ergänzen.
<pclass = "jove_content"> Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Krafterzeugung während der Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist ein Zebrafischlarve betäubt und in eine Kammer mit einer Salzlösung gefüllt ist. Das vordere Ende der Raupe wird mit einem Kraftaufnehmer verbunden und das hintere Ende der Raupe wird auf eine Länge Controller verbunden. Muscle Aktivierung wird durch das elektrische Feld Stimulation erreicht, und die Reizstrom und die Länge der Larven werden eingestellt, um maximale Zuckungskraft erzeugen. Eine isometrische Zuckung Kontraktion ausgelöst und die Kraft Reaktion zur Analyse aufgezeichnet.Um klar zu sein, diese Technik nicht zu messen Kräfte, die durch Larven Muskeln beim Schwimmen generiert. Da beide Enden der Larve zum Gerät gebunden und weil die Larve bleibt anästhesiert, kann es sich nicht in Bewegung während des Tests. Darüber hinaus aktiviert Feldstimulation alle Muskelfasern gleichzeitig eine bil induzierenateral Kontraktion, die nicht ist, was natürlich vorkommt 20. Deshalb, anstatt Messung des tatsächlichen Kräfte beim Schwimmen erzeugt, bestimmt dieser Technik die Kraft erzeugenden Fähigkeit der Larven Muskeln.
Wir haben diese Technik verwendet, um Muskelschwäche in einem Zebrafisch-Modell der Nemalin Myopathie 21, sowie um die Wirkung von antioxidativen Behandlung von Muskel-Funktion in einem Zebrafisch-Modell der multi-minicore Krankheit 22 bewerten demonstrieren. Andere haben eine ähnliche Technik 23, um die Auswirkungen eines Umweltschadstoff auf die Muskelfunktion 19 untersuchen eingesetzt.
Diese Methode misst Krafterzeugung während einer zuckenden Muskel Funktion in der Rumpfmuskulatur Zebrafischlarven beurteilen. Obwohl tetanische Kontraktionen können in Zebrafisch-Larven hervorgerufen werden (z. B. durch 200 Stimulationspulse / sec für eine Dauer von 0,2 sec), ist die maximale tetanische Kraft nur 10-15% größer als die maximale Zuckungskraft. Deshalb ist die Kraft, die während einer Zuckung erzeugt ein gewisses Maß an Kraft erzeugende Fähigkeit. Twitches werden über tetanische Kontraktionen bevorzugt, da zuckt weniger wahrscheinlich zu verursachen Rippen oder Abrutschen an den Naht Bindungen sind.
Um aussagekräftige Daten mit dieser Technik zu erzeugen, sollte maximal Zuckungskraft für jede Larve erreicht werden und die Variabilität zwischen den experimentellen Gruppen sollte minimiert werden. Mit diesen Zielen vor Augen, bieten wir die folgenden Vorschläge. Erstens, achten Sie bei der Bindung der Larve auf den Kraftaufnehmer und die Länge Controller Röhren. Wenn die Nahtschleifen sind zu fest angezogenviel, wird der Faden durch das Muskelgewebe zu schneiden. Wenn die Naht Schleifen nicht fest genug angezogen, wird die Kraft, die von den Larven erzeugt wird, nicht vollständig auf den Kraftaufnehmer übertragen. Beide Situationen, vor allem aber die letzteren, unterschätzen maximale Zuckungskraft. Zweitens kann, da die Prüfung mehrerer experimentellen Gruppen mehrere Stunden dauern (20-30 min / Larve), wechseln zwischen Gruppen, weil Larven werden weiterhin während der Testphase zu entwickeln.
Während einige der genannten Geräte ist wichtig für die Messung der maximalen Zuckungskraft (zB Kraftaufnehmer aktuellen Stimulator), sind andere Elemente nicht unbedingt notwendig. Das Video Sarkomerlänge System ist wünschenswert, aber nicht erforderlich. Alternativ kann eine Reihe von Zuckungen verwendet, um eine optimale Länge, wobei die Länge der Larve eingestellt, bis maximal Zuckungskraft erreicht wird, zu finden. Temperatur-Steuersystem ist auch nicht zwingend erforderlich. Temperaturregelung ist kritisch, wenn meaSuring zucken Kinetik, die sehr empfindlich auf Temperatur sind, während maximal Zuckungskraft ist nicht besonders empfindlich auf kleine Änderungen in der Temperatur und konnte bei Raumtemperatur gemessen werden. Beachten Sie, dass unabhängig von der Temperatur in der Kammer während der Kraftmessungen die Larven in der optimalen Wachstumstemperatur von 28,5 ° C aufrechterhalten 24 vor, um zu erzwingen Tests zur genauen Staging.
Die Larven werden in einer Lösung, die Tyrodes Tricaine getestet. Wir verwenden 0,02% (w / v) Tricaine, die Konzentration für Anästhesie 24 empfohlen, spontane Kontraktionen durch das Nervensystem hervorgerufen zu beseitigen und somit die Ermüdung während Kraft-Tests. Tricaine erleichtert auch die tie-on Schritt und reduziert die Gesamtkosten Testzeit. Allerdings beobachten wir, dass auch in der Tricaine Testlösung konsequent reduziert die maximale Zuckungskraft um ca. 30%. Ein ähnlicher Effekt ist auch in Kaulquappenschwanzes Muskel beobachtet worden, wo tricaine Kraft reduziert Generation nach neuromuskuläre Übertragung blockiert wurde, was darauf hindeutet, dass Tricaine eine direkte Wirkung auf Muskel-25 hat. Tricaine kann Muskelzelle Erregbarkeit indem Natriumleitfähigkeit durch die Zellmembran zu reduzieren, wie es in Nervenzellen 26 tut. Weitere Optionen zum Blockieren Aktivierung durch Motoneuronen sind d-Tubocurarin und α-Bungarotoxin aber im Gegensatz Tricaine sind diese Verbindungen nicht hautpermeable und muss direkt in den Kopf, Rückenmark, Herz oder 27 injiziert werden. Einzelne Forscher müssen beurteilen, ob Tricaine wünschenswert für ihre spezifische Anwendung ist. Wenn Tricaine in der Testing-Lösung enthalten ist, sollte die Konzentration im Einklang zwischen den Experimenten und Forscher sollten sicherstellen, dass die Wirkung der Tricaine nicht zwischen experimentellen Gruppen variieren.
Wir beschreiben diese Methode für Larven so jung wie 3 dpf und so alt wie die 7 dpf. Obwohl Muskelfasern scheinen fu seinnctional so früh wie 17 Stunden nach der Befruchtung, wenn spontane Bewegungen Schwanz 27, die kurze Länge des Schwanzes beginnen vor 3 dpf behindert binden die Larve der Prüfeinrichtungen. Wir in der Regel nicht testen Larve nach 7 dpf da viele Krankheiten Modelle nicht überleben viel länger als diese Zeit. Wird die Prüfung Larven über 5 dpf, sollte die Larven gefüttert werden. Wir haben beobachtet, dass Larven unfed kleineren Muskeln haben und erzeugen weniger maximale Zuckungskraft als fed Larven, wahrscheinlich aufgrund der abnehmenden Dottersack. So kann es wünschenswert sein, Larven zwischen 3-5 dpf testen, um die zusätzliche variable externe Zufuhr zu vermeiden.
Zusammenfassend beschreiben wir eine quantitative und zuverlässige Methode zur Messung von Kraft Generation während einer maximalen Kontraktion zucken Zebrafisch Larven Rumpfmuskulatur. Diese Methode kann verwendet werden, um die allgemeine Gesundheit der Zebrafisch Larven Muskel beurteilen und gezielt informiert über Muskelfunktion. Neben der Bereitstellung von Informationen über dieGröße der Kraft Generation kann diese Technik verwendet, um die Kinetik der Kraftentwicklung studieren oder angepasst, um Muskelermüdung 22 studieren werden. Obwohl wir diese Technik für den Einsatz mit dem Wildtyp-Larven zu beschreiben, kann diese Methode für genetisch veränderte oder für Larven Larven mit Medikamenten oder Giftstoffen behandelt werden, um Muskelerkrankung Modelle charakterisieren und bewerten Behandlungen oder die Entwicklung der Muskulatur, Muskel-Verletzungen, oder studieren Muskel-verwandten chemischen Toxizität.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Angela Busta für die Unterstützung bei Zebrafisch Tierhaltung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (AG-020591 zum SVB und 1K08AR054835 zu JJD) unterstützt.
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |