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Biology

Zebrafish लार्वा में पेशी समारोह का आकलन करने के संकुचन के दौरान सेना के मापन

doi: 10.3791/50539 Published: July 23, 2013

Summary

सेना माप विकास, चोट, बीमारी, इलाज या रासायनिक विषाक्तता के कारण पेशी समारोह में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस वीडियो में, हम zebrafish लार्वा ट्रंक मांसपेशियों की एक अधिकतम संकुचन के दौरान बल को मापने के लिए एक विधि का प्रदर्शन.

Abstract

Zebrafish लार्वा मांसपेशी विकास, मांसपेशियों के रोग और मांसपेशियों से संबंधित रासायनिक विषाक्तता के मॉडल उपलब्ध कराते हैं, लेकिन संबंधित अध्ययन अक्सर पेशी स्वास्थ्य के कार्यात्मक उपायों की कमी है. इस वीडियो लेख में, हम zebrafish लार्वा ट्रंक मांसपेशियों के संकुचन के दौरान बल पीढ़ी को मापने के लिए एक विधि का प्रदर्शन. सेना माप एक नमक समाधान के साथ भरा एक कक्ष में एक anesthetized लार्वा रखकर पूरा कर रहे हैं. लार्वा के पूर्वकाल अंत एक बल transducer से जुड़ा हुआ है और लार्वा के पीछे अंत एक लंबाई नियंत्रक से जुड़ा हुआ है. एक isometric चिकोटी संकुचन बिजली के क्षेत्र उत्तेजना से हासिल किया जाता है और बल प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए दर्ज की गई है. संकुचन के दौरान सेना पीढ़ी समग्र मांसपेशियों स्वास्थ्य का एक उपाय प्रदान करता है और विशेष रूप से मांसपेशियों समारोह का एक उपाय प्रदान करता है. हम जंगली प्रकार लार्वा के साथ उपयोग करने के लिए इस तकनीक का वर्णन है, इस विधि, आनुवंशिक रूप से संशोधित लार्वा के साथ या दवाओं या विषैले पदार्थ के साथ इलाज के लार्वा के साथ प्रयोग किया जा सकता हैमांसपेशियों की बीमारी मॉडल विशेषताएँ और उपचार का मूल्यांकन, या मांसपेशियों के विकास, चोट, या रासायनिक विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए.

Introduction

युवा zebrafish (Danio rerio) लार्वा, 3-7 दिनों के बाद निषेचन (DPF), तेजी से कंकाल की मांसपेशी अनुसंधान के लिए एक उपयोगी जीव के रूप में पहचाने जाते हैं. युवा लार्वा मॉडल मानव मांसपेशियों की बीमारी 1-9 करने के लिए उपयोग किया जाता है,, दवाओं और चिकित्सकीय रणनीति 10-11, अध्ययन मांसपेशियों की चोट के 12 मूल्यांकन विकास 13-16 मांसपेशियों को समझते हैं, और मांसपेशियों से संबंधित रासायनिक विषाक्तता 17-19 की जांच. इन क्षेत्रों में विशिष्ट पढ़ाई जो स्वस्थ मांसपेशी आनुवंशिक हेरफेर या विषैले पदार्थ के लिए जोखिम के असामान्य प्रदान की गई है करने के लिए डिग्री की जांच, और कुछ अध्ययनों जो असामान्य मांसपेशी इलाज का जवाब करने के लिए डिग्री की जांच. इन अध्ययनों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण सही मांसपेशियों के स्वास्थ्य का आकलन करने की क्षमता है.

Zebrafish लार्वा में पेशी स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए उपलब्ध तरीकों की एक किस्म है, वहीं कुछ मांसपेशी समारोह के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान करते हैं. स्नायु स्वास्थ्य आमतौर पर appearanc द्वारा मूल्यांकन किया हैके रूप में 9,15,16,18 immunostaining ऊतकीय धुंधला 6,8,11, प्रकाश माइक्रोस्कोपी 3,13, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3,4,14,16, या birefringence 7,9,11 द्वारा मूल्यांकन ई,, लेकिन इन तकनीकों प्रदान रूपात्मक जानकारी ही. ट्रंक और पूंछ विस्थापन और गति 4,17 मोटर समारोह का मूल्यांकन, लेकिन वे भी तंत्रिका इनपुट, ऊर्जा चयापचय, और अन्य प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित के बाद से इन मांसपेशियों समारोह का सीधा उपाय नहीं कर रहे हैं तैराकी.

इसके विपरीत, संकुचन के दौरान बल पीढ़ी को मापने मांसपेशी समारोह का प्रत्यक्ष आकलन प्रदान करता है और समग्र मांसपेशियों स्वास्थ्य का एक उपाय का प्रतिनिधित्व करता है. इस दृष्टिकोण का अतिरिक्त लाभ सीधा डेटा विश्लेषण और मात्रात्मक परिणाम शामिल हैं. इस वीडियो लेख में, हम और अधिक शोधकर्ताओं ने अपने शोध में पेशी स्वास्थ्य के मौजूदा उपायों पूरक करने के लिए इस विधि का उपयोग करेगा, इस उम्मीद में लार्वा की मांसपेशियों द्वारा बल पीढ़ी को मापने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं.

स्पष्ट है, इस तकनीक को तैराकी के दौरान लार्वा मांसपेशियों द्वारा उत्पन्न बलों उपाय नहीं है. लार्वा के दोनों सिरों उपकरणों से जुड़ी हैं और लार्वा संवेदनाहृत रहता है, क्योंकि यह परीक्षण के दौरान आंदोलन आरंभ नहीं कर सकते हैं. इसके अलावा, क्षेत्र उत्तेजना एक अरब प्रेरित करने के लिए एक ही समय में सभी मांसपेशी फाइबर को सक्रियस्वाभाविक रूप से 20 होता है क्या नहीं है जो ateral संकुचन,. इसलिए, बल्कि तैराकी के दौरान उत्पन्न वास्तविक बलों को मापने की तुलना में, इस तकनीक के लार्वा की मांसपेशियों की शक्ति पैदा करने की क्षमता निर्धारित करता है.

हम पेशी nemaline मायोपथी 21 की एक zebrafish मॉडल में कमजोरी है, साथ ही बहु - minicore रोग 22 की एक zebrafish मॉडल में पेशी समारोह पर एंटीऑक्सीडेंट उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शित करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. दूसरों मांसपेशी समारोह 19 पर एक पर्यावरणीय प्रदूषक के प्रभाव की जांच के लिए एक समान तकनीक 23 का इस्तेमाल किया है.

Protocol

नोट: zebrafish से जुड़े सभी प्रक्रियाओं प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों, और नियामक एजेंसियों के अनुसार किया जाना चाहिए. इस लेख में दिखाया सभी पशु उपयोग प्रक्रियाओं पशु का उपयोग और देखभाल पर मिशिगन समिति विश्वविद्यालय (UCUCA) द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. सिवनी लूप्स करें

  1. तीन किस्में में गैर बाँझ सिवनी (खासियत 10/0 monofilament नायलॉन, 3 प्लाई) को अलग करने के संदंश का प्रयोग करें.
  2. किस्में में से एक में एक डबल overhand गाँठ बाँध शुरू करो. बजाय एक गाँठ के एक छोटे (~ 1 मिमी व्यास) पाश बनाने के लिए पूरी तरह से गाँठ कस पहले बंद करो.
  3. पाश पूंछ से अतिरिक्त सीवन में कटौती के लिए कैंची का प्रयोग करें. एक समाप्त पाश का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है.
  4. यह बाद के बाद में उपयोग के लिए नोट के चिपचिपा पक्ष पर पाश रखें. सिवनी छोरों शक्ति परीक्षण के दौरान जगह में लार्वा पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  5. दोहराएँ आवश्यक के रूप में 1.1-1.4 कदम. पहुंचपरीक्षण किया जाएगा कि प्रत्येक लार्वा के लिए ई दो सीवन छोरों.

2. परीक्षण समाधान करें

  1. के 1000 मिलीलीटर के लिए 7.977 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.373 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड, 0.265 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड dihydrate, 0.102 ग्राम मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate, 0.048 ग्राम सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार, 1.000 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट, और 0.037 ग्राम ethylenediaminetetraacetic एसिड disodium नमक dihydrate जोड़कर Tyrodes समाधान करें शुद्ध पानी.
  2. लवण पूरी तरह से भंग कर रहे हैं जब तक समाधान हिलाओ. यह समाधान 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है
  3. 47.9 मिलीलीटर Tyrodes समाधान और मिश्रण करने के लिए 4 मिलीग्राम / एमएल tricaine के 2.1 मिलीलीटर, Zebrafish बुक 24 के अनुसार तैयार, जोड़ें. एक काले कांच की बोतल में या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक कांच की बोतल में भंडारण से प्रकाश से इस समाधान को सुरक्षित रखें. यह समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत और हर दिन नए सिरे से बनाया जाना चाहिए.

3. प्रायोगिक चैंबर में Aanesthetized लार्वा टाई

    <ली> प्लेस एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के मंच पर परीक्षण उपकरण (चित्रा 2).
  1. उपकरण का परीक्षण करने के लिए बल ट्रांसड्यूसर और लंबाई नियंत्रक केबल जोडें. बल ट्रांसड्यूसर पर मुड़ें. यह कठोर बना हुआ है कि इतनी लंबाई नियंत्रक पर मुड़ें. (नोट:.. लंबाई नियंत्रक एक संकुचन के दौरान मांसपेशियों की तैयारी खिंचाव या छोटा करने की क्षमता प्रदान करता है, हालांकि, लंबाई नियंत्रक की इस सुविधा के साथ साथ वर्णित विधि में उपयोग नहीं किया है इसलिए, लंबाई नियंत्रक एक कठोर लगाव के बारे में सोचा जा सकता है बिंदु) एक xyz के पोजीशनिंग सिस्टम के लिए मुहिम शुरू की.
  2. एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक के साथ, परीक्षण के समाधान के साथ प्रयोगात्मक चैम्बर भरें.
  3. पूंछ में से एक ने एक सीवन पाश लेने और बल ट्रांसड्यूसर ट्यूब पर लटका संदंश का प्रयोग करें. लंबाई नियंत्रक से जुड़ी ट्यूब पर एक दूसरे सिवनी पाश रुको. (नोट: घुमावदार भाग पर एक सीवन पाश मनोरंजक सिवनी और cau गुत्थी सकते हैंयह) बाद के चरणों के दौरान तोड़ने के लिए से.
  4. एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक के साथ, परीक्षण के समाधान के साथ भरा एक छोटा सा पेट्री डिश के लिए एक zebrafish लार्वा हस्तांतरण. प्रभाव (~ 1 मिनट) लेने के लिए परीक्षण समाधान (tricaine) में संवेदनाहारी के लिए प्रतीक्षा करें. एक संदंश के साथ, धीरे पूंछ कुहनी से हलका धक्का और लार्वा स्पर्श पैदा की तैराकी की कमी से anesthetized है कि सत्यापित.
  5. प्रायोगिक कक्ष को लार्वा स्थानांतरित करने के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग करें.
  6. धीरे बंद संदंश साथ लार्वा परोक्ष दबाव डाल द्वारा, बल ट्रांसड्यूसर ट्यूब पर सीवन पाश के माध्यम से लार्वा का अग्र भाग गाइड. ट्यूब पर सीवन पाश के माध्यम से लार्वा का अग्र भाग गाइड. संदंश के साथ सीवन पाश पूंछ दोनों समझ और जर्दी थैली या swimbladder (चित्रा 3) के लिए पीछे सीवन पाश मजबूत करने के लिए उन्हें एक साथ खींच.
  7. एक संदंश के साथ, एक सीवन पाश पूंछ पकड़ और खींच, लार्वा चेहरे के पार्श्व पक्ष तक ट्यूब के चारों ओर 90 डिग्री घुमाना लार्वा पैदाएस (3B चित्रा). पाश काफी कड़ी कर दी गई थी, तो पुल को कुछ प्रतिरोध हो जाएगा, लार्वा आसानी कुंडा नहीं होना चाहिए. पाश भी ज्यादा कड़ी कर दी गई थी, तो लार्वा ट्यूब चारों ओर घुमाना नहीं होगा.
  8. लंबाई नियंत्रक से जुड़ी एक्सवाईज़ेड पोजीशनिंग डिवाइस का प्रयोग, एक्स अक्ष (2A चित्रा में अक्ष परिभाषा) के साथ और लार्वा के ट्रंक और पूंछ के नीचे लंबाई नियंत्रक ट्यूब चाल. लंबाई नियंत्रक ट्यूब के सिरों और बल ट्रांसड्यूसर ट्यूब के बीच जगह छोड़ दें.
  9. लार्वा की पूंछ से अधिक सीवन पाश गाइड और पहले (चित्रा -3 सी) के रूप में वर्णित सिवनी पाश कस लें. आप पार्श्व पक्ष तक चेहरे इतना है कि लार्वा के पीछे भाग कुंडा करना पड़ सकता है. सिवनी पाश पूंछ (चित्रा 3 डी) ट्रिम.

4. प्रायोगिक चैंबर में स्थिति लार्वा

  1. लार्वा डब्ल्यू सुनिश्चित करने के लिए कक्ष के नीचे से एक उचित दूरी के लार्वा ले जाएँबीमार बाद के चरणों के दौरान एक औंधा माइक्रोस्कोप के उद्देश्य से 'दूरी काम "के भीतर हो. इसे पूरा करने के ट्यूब सिर्फ चैम्बर के नीचे स्पर्श तक धीरे z-अक्ष के साथ ट्यूब (संलग्न लार्वा के साथ) कम करने के लिए XYZ पोजीशनिंग उपकरणों का उपयोग करें. लार्वा चैम्बर नीचे (~ 100 माइक्रोन) से एक उचित दूरी है जब तक फिर, ट्यूब बढ़ा.
  2. लंबाई नियंत्रक से जुड़ी एक्सवाईज़ेड पोजीशनिंग डिवाइस का प्रयोग, बल ट्रांसड्यूसर ट्यूब की लंबी अक्ष के साथ लार्वा की लंबी अक्ष के लिए पंक्ति में वाई अक्ष के साथ लंबाई नियंत्रक ट्यूब समायोजित.

5. एक अधिकतम चिकोटी संकुचन के दौरान रिकार्ड फोर्स

  1. एक औंधा माइक्रोस्कोप के चरण के लिए परीक्षण उपकरण ले जाएँ.
  2. एक वांछित मूल्य के लिए कक्ष के तापमान को समायोजित करें. शुरू करने के लिए, पानी के स्नान फैलानेवाला, थर्मामीटर, और उपकरण का परीक्षण करने के लिए तापमान नियंत्रक कनेक्ट. आवश्यक घटकों पर मुड़ें और तापमान contr पर सेटिंग समायोजित करेंथर्मामीटर तक Oller वांछित मूल्य रिपोर्ट. इस आलेख में शामिल डाटा 25 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किए गए थे, लेकिन माप भी आरटी पर या 28.5 से कम किया जा सकता डिग्री सेल्सियस
  3. उपकरण का परीक्षण करने के लिए उत्तेजक से केबल जोडें. उत्तेजक को सत्ता पर बारी लेकिन कदम 5.6 जब तक लार्वा को प्रोत्साहित नहीं करते.
  4. लार्वा कक्ष तल के समानांतर है सुनिश्चित करें. एक 40x उद्देश्य के माध्यम से, ट्यूबों के सिरों के बीच लार्वा के हिस्से को देखने. नीचे करने के लिए समानांतर हैं, लार्वा के दोनों सिरों को ध्यान में होगा. यदि जरूरी हुआ तो दोनों सिरों को ध्यान में हैं, जब तक z-अक्ष के साथ बल ट्रांसड्यूसर ट्यूब समायोजित.
  5. लार्वा लंबाई इष्टतम से कम है कि सत्यापित करें. वीडियो sarcomere लंबाई प्रणाली पर बारी और striations वीडियो फ्रेम के पक्ष के समानांतर हैं कि वीडियो कैमरा इस तरह बारी बारी से. इस प्रणाली के हित के एक उपयोगकर्ता से परिभाषित क्षेत्र के भीतर पिक्सल के प्रत्येक क्षैतिज पंक्ति के साथ पिक्सेल तीव्रता में बदलाव का विश्लेषण करके striation रिक्ति पर नजर रखता है(आरओआई). रॉय के भीतर सभी पंक्तियों के लिए परिणाम औसत और वीडियो फ्रेम दर (≥ 80 सेकंड -1) के बराबर एक आवृत्ति के साथ सूचित कर रहे हैं. striation रिक्ति sarcomere लंबाई का एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  6. माइक्रोस्कोप परिधीय तंतुओं पर ध्यान केंद्रित करने और संकेत sarcomere लंबाई नोट करने के लिए समायोजित करें. यदि आवश्यक हो, sarcomere लंबाई (जैसे 1.90 माइक्रोन) इष्टतम से कम नहीं है जब तक लार्वा की लंबाई को समायोजित करने के लिए लंबाई नियंत्रक (एक्स अक्ष) से जुड़ी एक्सवाईज़ेड पोजीशनिंग डिवाइस का उपयोग करें.
  7. चिकोटी बल अनुकूलन करने के लिए वर्तमान उत्तेजना को समायोजित करें. शुरू करने के लिए, एक कम परिमाण (जैसे 100 मा) को उत्तेजक पर वर्तमान उत्पादन सेट. उत्तेजक स्वयं या एक कस्टम LabVIEW का कार्यक्रम चल रहा है एक कंप्यूटर से चालू किया जा सकता है. अवधि में 0.2 मिसे के एक वर्तमान नाड़ी के साथ लार्वा मांसपेशियों की ऐंठन को प्रकाश में लाना.
  8. बल के रिकॉर्ड उत्पादन और आस्टसीलस्कप के कर्सर का उपयोग कर शिखर चिकोटी बल को मापने के लिए एक आस्टसीलस्कप का उपयोग करें. वर्तमान में वृद्धि50 मा वेतन वृद्धि से और प्रत्येक वर्तमान स्तर पर शिखर चिकोटी बल उपाय. थकान को रोकने के लिए twitches के बीच 30 मिनट रुको. उत्तेजना वर्तमान बढ़ जाती है, शिखर चिकोटी बल आम तौर पर एक अधिकतम करने के लिए बढ़ जाती है और फिर धीरे - धीरे कम हो जाती है. लार्वा सबसे बड़ी ताकत उत्पन्न करता है, जिस पर वर्तमान इष्टतम उत्तेजना चालू है. इष्टतम उत्तेजना चालू करने के लिए वर्तमान आयाम निर्धारित करें.
  9. Xyz के पोजीशनिंग डिवाइस का उपयोग करना, अधिकतम चिकोटी बल बटोर क्रम में लार्वा (और इस प्रकार, sarcomere लंबाई) की लंबाई को समायोजित. जंगली प्रकार zebrafish लार्वा (3-7 DPF) 2.10 माइक्रोन या 2.15 माइक्रोन की sarcomere लंबाई में अधिकतम चिकोटी बल उत्पन्न करते हैं. हालांकि, sarcomere लंबाई लार्वा पर अतिरिक्त दबाव से बचने के लिए 2.08 माइक्रोन के लिए सेट किया जा सकता है.
  10. लार्वा मांसपेशियों की ऐंठन को प्रकाश में लाना. बल प्रतिक्रिया रिकॉर्ड और बाद के विश्लेषण के लिए रिकॉर्ड को बचाने के लिए आस्टसीलस्कप का उपयोग करें.

6. इष्टतम लंबाई में लार्वा के साथ मांसलता आयाम उपाय

स्टीरियो माइक्रोस्कोप को वापस परीक्षण उपकरण ले जाएँ.
  • ऐपिस पैमाने का उपयोग करना, पक्ष से देखा के रूप में मांसलता की ऊंचाई मापने. फिर, लार्वा की लंबाई को बदलने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, 90 से लार्वा कुंडा डिग्री नीचे से लार्वा को देखने के क्रम में सिवनी पाश पूंछ का उपयोग कर. नीचे से देखा के रूप में मांसलता की चौड़ाई उपाय. एक संरचनात्मक मील का पत्थर (जैसे मूत्रजननांगी खोलने) (चित्रा 4) में नाप लो.
  • परीक्षण उपकरण से लार्वा जारी करने के लिए एक microblade साथ सीवन छोरों काटें.
  • Representative Results

    स्वस्थ जंगली प्रकार zebrafish लार्वा में, मांसपेशी फाइबर एक उन दोनों के बीच बड़े अंतराल के बिना दूसरे के समानांतर होना चाहिए और स्पष्ट striations (चित्रा 5A) होना चाहिए. इन सुविधाओं को दिखा रहे हैं, या इस तरह के अलग फाइबर (चित्रा 5 ब), के रूप में स्पष्ट क्षति के साथ नहीं है कि जंगली प्रकार zebrafish लार्वा खारिज किया जाना चाहिए.

    शिखर चिकोटी बल की तुलना में एक भी zebrafish लार्वा के लिए वर्तमान उत्तेजना का एक प्रतिनिधि साजिश 6 चित्र में दिखाया गया है. 3-7 DPF के बीच जंगली प्रकार zebrafish लार्वा के लिए, इष्टतम उत्तेजना मौजूदा 3 DPF लार्वा आम तौर पर 6-7 DPF लार्वा की तुलना में वर्तमान में अधिक से अधिक उत्तेजना की आवश्यकता के साथ, 400-600 मा के बीच आम तौर पर है.

    कच्चे बल डेटा (कदम 5.8 दौरान एकत्र) संसाधित और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया है. सबसे पहले, बल रिकॉर्ड की आधारभूत शून्य पर सेट है. दूसरा, बल ट्रांसड्यूसर की वोल्टेज निर्गम (एम मजबूर करने के लिए बदल जाती हैएन) (बल transducer के लिए एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें). एक एकल लार्वा की एक अधिकतम चिकोटी संकुचन के दौरान एकत्र की एक प्रतिनिधि बल प्रतिक्रिया 7 चित्र में दिखाया गया है. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर शिखर शक्ति और बल प्रतिक्रिया की अन्य विशेषताओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

    अधिक से अधिक चिकोटी संकुचन से शिखर बल डेटा का एक प्रतिनिधि सेट चित्रा 8A में दिखाया गया है. ठेठ शिखर चिकोटी बल पुराने लार्वा युवा लार्वा से अधिक बल पैदा करने के साथ 0.9 से 1.7 करोड़ तक जंगली प्रकार 3-7 DPF लार्वा रेंज, के लिए मान. शिखर चिकोटी बल में अंतर वृद्धि और विकास की तरह सामान्य प्रक्रियाओं (8 चित्रा) या ऐसे जीन उत्परिवर्तन से संबंधित विकृति 21,22 रूप में असामान्य प्रक्रियाओं के कारण हो सकता है.

    मांसपेशी पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) द्वारा सामान्य जो शिखर चिकोटी बल में मतभेद differe के कारण बस के लिए डिग्री का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मांसलता 21,22 के आकार में NCES. स्नायु सीएसए सूत्र का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है: सीएसए (बी / 2) (ए / 2) = π, एक तरफ से देखा के रूप में मांसलता की ऊंचाई है जहां, बी, नीचे से देखा के रूप में मांसलता की चौड़ाई है और पार अनुभाग एक अण्डाकार माना जाता है. 0.027 से 3-4 DPF लार्वा आम तौर पर 5-7 DPF लार्वा से छोटी सीएसए मूल्यों को दिखाने के साथ 0.034 मिमी 2, के लिए जंगली प्रकार 3-7 DPF लार्वा श्रृंखला के लिए विशिष्ट सीएसए मूल्यों. अधिक से अधिक चिकोटी संकुचन से सामान्यीकृत शिखर बल डेटा का एक प्रतिनिधि सेट चित्रा 8B में दिखाया गया है. 4-7 DPF लार्वा आम तौर पर 3 DPF लार्वा से अधिक मूल्यों को दिखाने के साथ 34 से 51 करोड़ / 2 मिमी तक जंगली प्रकार 3-7 DPF लार्वा श्रृंखला के लिए ठेठ सामान्यीकृत शिखर चिकोटी बल मूल्यों.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. सिवनी पाश पूंछ को सिवनी पाश. तीर बिंदु.

    ve_content "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 2
    चित्रा 2. लेबल घटकों के साथ (ए) परीक्षण उपकरण. प्रायोगिक कक्ष (बी) बंद हुआ देखा गया. पारदर्शी नीचे के साथ (एक) प्रायोगिक कक्ष. (ख) सेना ट्रांसड्यूसर. (ग) की लंबाई नियंत्रक. (घ) एक्सवाईज़ेड पोजीशनिंग उपकरणों. एक्स, वाई, जेड और कुल्हाड़ियों ऊपरी दाहिने कोने में परिभाषित कर रहे हैं. Thermoelectric मॉड्यूल का उपयोग (ई) तापमान नियंत्रण प्रणाली. ट्यूबिंग thermoelectric मॉड्यूल को ठंडा करने के लिए पानी का प्रवाह ठहर सकते हैं. (च) स्टेनलेस स्टील ट्यूब ट्रांसड्यूसर मजबूर करने के लिए संलग्न. (छ) स्टेनलेस स्टील ट्यूब लंबाई नियंत्रक से जुड़ी. (ज) थर्मामीटर microprobe. (I) के प्लेटिनम समानांतर थाली इलेक्ट्रोड की लंबाई फैलेचैम्बर. प्लेटिनम प्लेटें उच्च 2.5 मिमी और मोटी 0.255 मिमी हैं.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. प्रायोगिक कक्ष में लार्वा बांधने. (ए) लार्वा पूर्वकाल अंत में पर बंधे लेकिन अभी तक 90 डिग्री swiveled नहीं. (बी) लार्वा swiveled 90 लेकिन अभी तक swiveled नहीं पीछे अंत में पर बंधे °. (सी) के लार्वा के बाद. (डी) लार्वा के बाद swiveled और सिवनी पाश पूंछ छंटनी कर रहे हैं.

    चित्रा 4
    4 चित्रा. पार के अनुभागीय क्षेत्र के आकलन के लिए माप. मांसलता के रूप में (ए) की ओर से देखा और (बी)

    चित्रा 5
    चित्रा 5. Zebrafish लार्वा ट्रंक मांसलता के पार्श्व दृश्य. स्पष्ट क्षति के साथ (ए) के स्वस्थ ऊतकों. (बी) ऊतक. फाइबर टुकड़ी से उत्पन्न contractures तारक से चिह्नित कर रहे हैं.

    चित्रा 6
    6 चित्रा. शिखर चिकोटी बल बनाम उत्तेजना के प्रतिनिधि साजिश वर्तमान. इष्टतम उत्तेजना मौजूदा 500 मा है.


    चित्रा 7. एक भी चिकोटी संकुचन के लिए प्रतिनिधि बल रिकॉर्ड. यह संकुचन 0 मिसे में एक उत्तेजना नाड़ी के साथ हासिल किया गया था. शिखर बल 1.56 करोड़ है.

    8 चित्रा
    चित्रा 8. 3-7 DPF लार्वा. से प्रतिनिधि बल डेटा (क) अधिक से अधिक चिकोटी संकुचन से पीक बल डेटा. (बी) अधिक से अधिक चिकोटी संकुचन से पीक बल डेटा सीएसए के लिए सामान्यीकृत. पुराने लार्वा (6-7 DPF) 5 DPF पर शुरू Spirulina के साथ खिलाया Hatchfry Encapsulon ग्रेड 0 (चांदी प्रयोगशालाओं) थे. साधन + मानक विचलन प्रत्येक समूह में एन = 5 के साथ सूचित कर रहे हैं. 3 DPF लार्वा (*) और 4 DPF लार्वा (#) से काफी अलग समूह (एनोवा, पी <0.05 संकेत कर रहे हैं). 4 और 6-7 DPF (ए) के बीच बल में वृद्धि नहीं के आधार पर विकास के लिए जिम्मेदार ठहराया है जबकि 3 और 4 DPF (बी) के बीच सामान्यीकृत बल में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है, इस समय अवधि के दौरान आंतरिक शक्ति पैदा करने की क्षमता में वृद्धि का संकेत है सामान्यीकृत बल में 4 से 7 DPF से बदल जाते हैं.

    Discussion

    इस विधि zebrafish लार्वा के ट्रंक मांसपेशियों में पेशी समारोह का आकलन करने के लिए एक चिकोटी दौरान बल पीढ़ी के उपाय. धनुस्तंभीय संकुचन (0.2 सेकंड की अवधि के लिए 200 उत्तेजना दालों / सेक द्वारा जैसे) zebrafish लार्वा में हासिल किया जा सकता है, अधिकतम धनुस्तंभीय बल अधिकतम चिकोटी बल से केवल 10-15% अधिक है. इसलिए, एक चिकोटी के दौरान उत्पन्न बल बल पैदा करने की क्षमता का एक उचित उपाय है. Twitches तेजस्वी या सीवन संबंधों पर फिसल पैदा होने की संभावना कम होती है क्योंकि twitches धनुस्तंभीय संकुचन से अधिक पसंद कर रहे हैं.

    इस तकनीक के साथ सार्थक डेटा उत्पन्न करने के लिए, अधिकतम चिकोटी बल प्रत्येक लार्वा के लिए हासिल किया जाना चाहिए और प्रयोगात्मक समूहों के बीच परिवर्तनशीलता को कम से कम किया जाना चाहिए. मन में इन लक्ष्यों के साथ, हम निम्नलिखित सुझाव प्रदान करते हैं. बल ट्रांसड्यूसर और लंबाई नियंत्रक ट्यूबों को लार्वा बांधने जब सबसे पहले, ध्यान रखना. सिवनी छोरों भी कड़ा कर रहे हैंबहुत, सीवन मांसपेशियों के ऊतकों के माध्यम से कट जाएगा. सिवनी छोरों काफी कड़ा नहीं कर रहे हैं, लार्वा द्वारा उत्पन्न बल पूरी तरह से बल ट्रांसड्यूसर को प्रेषित नहीं की जाएगी. दोनों स्थितियों, लेकिन विशेष रूप से उत्तरार्द्ध, अधिकतम चिकोटी बल कम. लार्वा के परीक्षण अवधि के दौरान विकास जारी रहेगा क्योंकि दूसरा, कई प्रयोगात्मक समूहों के परीक्षण के बाद से समूहों के बीच बारी - बारी से कई घंटे (20-30 मिनट / लार्वा), ले जा सकते हैं.

    उल्लेख उपकरणों के कुछ अधिकतम चिकोटी बल की माप (जैसे बल ट्रांसड्यूसर, वर्तमान उत्तेजक) के लिए आवश्यक है, जबकि अन्य मदों बिल्कुल आवश्यक नहीं कर रहे हैं. वीडियो sarcomere लंबाई प्रणाली वांछनीय लेकिन आवश्यकता नहीं है. एक विकल्प के रूप में, twitches की एक श्रृंखला अधिकतम चिकोटी बल हासिल की है जब तक लार्वा की लंबाई निकाला जाता है, जिसके दौरान अधिकतम लंबाई को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक तापमान नियंत्रण प्रणाली भी बिल्कुल आवश्यक नहीं है. तापमान नियंत्रण जब विदेश मंत्रालय महत्वपूर्ण हैअधिकतम चिकोटी बल तापमान में छोटे बदलाव करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील नहीं है और कमरे के तापमान पर मापा जा सकता है, जबकि तापमान को अत्यधिक संवेदनशील होते हैं जो suring चिकोटी कैनेटीक्स,. परवाह किए बिना शक्ति परीक्षण के दौरान कक्ष में तापमान की, लार्वा डिग्री सेल्सियस 24 पूर्व मजबूर करने के लिए 28.5 का इष्टतम विकास तापमान पर रखा जाना चाहिए कि नोट सटीक मंचन के लिए परीक्षण.

    लार्वा tricaine युक्त Tyrodes समाधान में जांच की जाती है. हम तंत्रिका तंत्र द्वारा पैदा की सहज संकुचन को खत्म करने और इस प्रकार शक्ति परीक्षण के दौरान थकान को रोकने के लिए (w / वी) tricaine, संज्ञाहरण 24 के लिए सिफारिश की एकाग्रता, 0.02% का उपयोग करें. Tricaine भी टाई पर कदम की सुविधा और समग्र परीक्षण के समय कम कर देता है. हालांकि, हम परीक्षण के समाधान में tricaine सहित लगातार लगभग 30% की अधिकतम चिकोटी बल कम कर देता है कि निरीक्षण करते हैं. एक समान प्रभाव भी tricai जहां, मेढक पूंछ मांसपेशी में देखा गया हैन्यूरोमस्कुलर संचरण अवरुद्ध किया गया था के बाद पूर्वोत्तर के tricaine पेशी 25 पर सीधा प्रभाव पड़ता है, सुझाव है कि बल पीढ़ी कम कर दिया. यह तंत्रिका कोशिकाओं 26 में है tricaine, कोशिका झिल्ली में सोडियम प्रवाहकत्त्व को कम करने से मांसपेशी सेल उत्तेजना कम हो सकता है. Motoneurons के द्वारा सक्रियण को रोकने के लिए अन्य विकल्पों tubocurarine और α-bungarotoxin हैं लेकिन, tricaine के विपरीत, इन यौगिकों त्वचा पारगम्य नहीं हैं और सिर, रीढ़ की हड्डी, या दिल 27 में सीधे इंजेक्ट किया जाना चाहिए. व्यक्तिगत जांचकर्ताओं tricaine उनके विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए वांछनीय है या नहीं, का आकलन करने की आवश्यकता होगी. Tricaine परीक्षण समाधान में शामिल किया जाता है tricaine का प्रभाव प्रयोगात्मक समूहों के बीच अलग अलग नहीं है कि सत्यापित करना चाहिए, एकाग्रता प्रयोगों और शोधकर्ताओं के बीच अनुरूप होना चाहिए.

    हम 3 DPF के रूप में युवा और 7 DPF के रूप में के रूप में पुराने के रूप में लार्वा के लिए इस विधि का वर्णन है. मांसपेशी फाइबर फू होना दिखाई देते हैं3 DPF उपकरणों का परीक्षण करने के लार्वा बांधने hinders पहले सहज पूंछ आंदोलनों 27, पूंछ की कम लंबाई शुरू जब 17 घंटे बाद निषेचन, के रूप में जल्दी के रूप में nctional. कई रोग मॉडल इस समय की तुलना में बहुत लंबे समय तक जीवित नहीं है, क्योंकि हम आम तौर पर 7 DPF के बाद लार्वा परीक्षण नहीं है. 5 DPF परे लार्वा का परीक्षण करते हैं, लार्वा खिलाया जाना चाहिए. हम भूखा लार्वा संभावना खिलाया लार्वा, ह्रासमान जर्दी थैली की वजह से छोटी मांसपेशियों है और कम अधिकतम चिकोटी बल उत्पन्न करते देखा है. इस प्रकार यह बाहरी खिलाने के अतिरिक्त चर से बचने के लिए, 3-5 DPF बीच लार्वा परीक्षण करने के लिए वांछनीय हो सकता है.

    संक्षेप में, हम zebrafish लार्वा ट्रंक मांसपेशियों की एक अधिकतम चिकोटी संकुचन के दौरान बल पीढ़ी को मापने के लिए एक मात्रात्मक और विश्वसनीय विधि का वर्णन है. इस विधि zebrafish लार्वा पेशी के समग्र स्वास्थ्य का आकलन किया और विशेष रूप से मांसपेशियों के समारोह के बारे में जानकारी प्रदान करता है हो सकता है. के बारे में जानकारी प्रदान करने के अलावाबल पीढ़ी की भयावहता, इस तकनीक के बल पीढ़ी के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए या 22 थकान मांसपेशियों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. हम जंगली प्रकार लार्वा के साथ उपयोग करने के लिए इस तकनीक का वर्णन है, इस विधि मांसपेशियों की बीमारी मॉडल विशेषताएँ और उपचार का मूल्यांकन, या मांसपेशियों के विकास, मांसपेशियों की चोट, या अध्ययन करने के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित लार्वा के लिए या दवाओं या विषैले पदार्थ के साथ इलाज लार्वा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मांसपेशियों से संबंधित रासायनिक विषाक्तता.

    Disclosures

    लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

    Acknowledgments

    लेखकों zebrafish के पालन के साथ सहायता के लिए एंजेला गाया धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (एजी-020591 के लिए SVB और JJD को 1K08AR054835) द्वारा समर्थित किया गया था.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    REAGENTS
    Tricaine powder Sigma-Aldrich A5040
    Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
    Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
    Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 223506
    Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
    Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
    Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
    EQUIPMENT
    Nonsterile-suture Ashaway Line Twine S30002 USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)
    Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5
    Spring scissors Fine Science Tools 15000-08 Vannas
    Stereo microscope Leica Microsystems MZ8 Illuminated with Fostec EKE ACE I light source
    Force transducer Aurora Scientific 400A
    Length controller Aurora Scientific 318B
    XYZ positioning devices Parker Hannifin 3936M
    Thermometer Physitemp BAT-12
    Disposable transfer pipette Fisher Scientific 13-711-9AM Cut end to widen opening and facilitate larva transfer
    Petri dish Fisher Scientific 08-757-11YZ
    Glass pipette Fisher Scientific 13-678-8B Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer
    Inverted microscope Carl Zeiss Microscopy Axiovert 100
    Water bath circulator Neslab Instruments RTE-111
    Temperature controller Alpha Omega Instruments Series 800
    Stimulator Aurora Scientific 701C High-power, follow stimulator
    Video sarcomere length system Aurora Scientific 900B-5A
    LabVIEW software National Instruments
    Oscilloscope Nicolet Technologies ACCURA 100
    Microblade Fine Science Tools 10050-00
    Microblade holder Fine Science Tools 10053-13
    Data analysis software (Signo) Alameda Applied Sciences

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    References

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    Zebrafish लार्वा में पेशी समारोह का आकलन करने के संकुचन के दौरान सेना के मापन
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    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).More

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).

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