Zebrafish लार्वा में पेशी समारोह का आकलन करने के संकुचन के दौरान सेना के मापन
Summary
सेना माप विकास, चोट, बीमारी, इलाज या रासायनिक विषाक्तता के कारण पेशी समारोह में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस वीडियो में, हम zebrafish लार्वा ट्रंक मांसपेशियों की एक अधिकतम संकुचन के दौरान बल को मापने के लिए एक विधि का प्रदर्शन.
Abstract
Zebrafish लार्वा मांसपेशी विकास, मांसपेशियों के रोग और मांसपेशियों से संबंधित रासायनिक विषाक्तता के मॉडल उपलब्ध कराते हैं, लेकिन संबंधित अध्ययन अक्सर पेशी स्वास्थ्य के कार्यात्मक उपायों की कमी है. इस वीडियो लेख में, हम zebrafish लार्वा ट्रंक मांसपेशियों के संकुचन के दौरान बल पीढ़ी को मापने के लिए एक विधि का प्रदर्शन. सेना माप एक नमक समाधान के साथ भरा एक कक्ष में एक anesthetized लार्वा रखकर पूरा कर रहे हैं. लार्वा के पूर्वकाल अंत एक बल transducer से जुड़ा हुआ है और लार्वा के पीछे अंत एक लंबाई नियंत्रक से जुड़ा हुआ है. एक isometric चिकोटी संकुचन बिजली के क्षेत्र उत्तेजना से हासिल किया जाता है और बल प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए दर्ज की गई है. संकुचन के दौरान सेना पीढ़ी समग्र मांसपेशियों स्वास्थ्य का एक उपाय प्रदान करता है और विशेष रूप से मांसपेशियों समारोह का एक उपाय प्रदान करता है. हम जंगली प्रकार लार्वा के साथ उपयोग करने के लिए इस तकनीक का वर्णन है, इस विधि, आनुवंशिक रूप से संशोधित लार्वा के साथ या दवाओं या विषैले पदार्थ के साथ इलाज के लार्वा के साथ प्रयोग किया जा सकता हैमांसपेशियों की बीमारी मॉडल विशेषताएँ और उपचार का मूल्यांकन, या मांसपेशियों के विकास, चोट, या रासायनिक विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए.
Introduction
युवा zebrafish (Danio rerio) लार्वा, 3-7 दिनों के बाद निषेचन (DPF), तेजी से कंकाल की मांसपेशी अनुसंधान के लिए एक उपयोगी जीव के रूप में पहचाने जाते हैं. युवा लार्वा मॉडल मानव मांसपेशियों की बीमारी 1-9 करने के लिए उपयोग किया जाता है,, दवाओं और चिकित्सकीय रणनीति 10-11, अध्ययन मांसपेशियों की चोट के 12 मूल्यांकन विकास 13-16 मांसपेशियों को समझते हैं, और मांसपेशियों से संबंधित रासायनिक विषाक्तता 17-19 की जांच. इन क्षेत्रों में विशिष्ट पढ़ाई जो स्वस्थ मांसपेशी आनुवंशिक हेरफेर या विषैले पदार्थ के लिए जोखिम के असामान्य प्रदान की गई है करने के लिए डिग्री की जांच, और कुछ अध्ययनों जो असामान्य मांसपेशी इलाज का जवाब करने के लिए डिग्री की जांच. इन अध्ययनों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण सही मांसपेशियों के स्वास्थ्य का आकलन करने की क्षमता है.
Zebrafish लार्वा में पेशी स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए उपलब्ध तरीकों की एक किस्म है, वहीं कुछ मांसपेशी समारोह के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान करते हैं. स्नायु स्वास्थ्य आमतौर पर appearanc द्वारा मूल्यांकन किया हैके रूप में 9,15,16,18 immunostaining ऊतकीय धुंधला 6,8,11, प्रकाश माइक्रोस्कोपी 3,13, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3,4,14,16, या birefringence 7,9,11 द्वारा मूल्यांकन ई,, लेकिन इन तकनीकों प्रदान रूपात्मक जानकारी ही. ट्रंक और पूंछ विस्थापन और गति 4,17 मोटर समारोह का मूल्यांकन, लेकिन वे भी तंत्रिका इनपुट, ऊर्जा चयापचय, और अन्य प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित के बाद से इन मांसपेशियों समारोह का सीधा उपाय नहीं कर रहे हैं तैराकी.
इसके विपरीत, संकुचन के दौरान बल पीढ़ी को मापने मांसपेशी समारोह का प्रत्यक्ष आकलन प्रदान करता है और समग्र मांसपेशियों स्वास्थ्य का एक उपाय का प्रतिनिधित्व करता है. इस दृष्टिकोण का अतिरिक्त लाभ सीधा डेटा विश्लेषण और मात्रात्मक परिणाम शामिल हैं. इस वीडियो लेख में, हम और अधिक शोधकर्ताओं ने अपने शोध में पेशी स्वास्थ्य के मौजूदा उपायों पूरक करने के लिए इस विधि का उपयोग करेगा, इस उम्मीद में लार्वा की मांसपेशियों द्वारा बल पीढ़ी को मापने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं.
<pवर्ग = "jove_content"> इस विधि के समग्र लक्ष्य zebrafish लार्वा ट्रंक मांसपेशियों के संकुचन के दौरान बल पीढ़ी को मापने के लिए है. इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, एक zebrafish लार्वा anesthetized और एक नमक समाधान के साथ भरा एक कक्ष में रखा गया है. लार्वा के पूर्वकाल अंत एक बल transducer से जुड़ा हुआ है और लार्वा के पीछे अंत एक लंबाई नियंत्रक से जुड़ा हुआ है. मांसपेशी सक्रियण बिजली के क्षेत्र उत्तेजना से पूरा किया है, और उत्तेजना वर्तमान और लार्वा की लंबाई अधिकतम चिकोटी बल के उत्पादन के लिए समायोजित कर रहे हैं. एक isometric चिकोटी संकुचन हासिल है और बल प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए दर्ज की गई है.स्पष्ट है, इस तकनीक को तैराकी के दौरान लार्वा मांसपेशियों द्वारा उत्पन्न बलों उपाय नहीं है. लार्वा के दोनों सिरों उपकरणों से जुड़ी हैं और लार्वा संवेदनाहृत रहता है, क्योंकि यह परीक्षण के दौरान आंदोलन आरंभ नहीं कर सकते हैं. इसके अलावा, क्षेत्र उत्तेजना एक अरब प्रेरित करने के लिए एक ही समय में सभी मांसपेशी फाइबर को सक्रियस्वाभाविक रूप से 20 होता है क्या नहीं है जो ateral संकुचन,. इसलिए, बल्कि तैराकी के दौरान उत्पन्न वास्तविक बलों को मापने की तुलना में, इस तकनीक के लार्वा की मांसपेशियों की शक्ति पैदा करने की क्षमता निर्धारित करता है.
हम पेशी nemaline मायोपथी 21 की एक zebrafish मॉडल में कमजोरी है, साथ ही बहु – minicore रोग 22 की एक zebrafish मॉडल में पेशी समारोह पर एंटीऑक्सीडेंट उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शित करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. दूसरों मांसपेशी समारोह 19 पर एक पर्यावरणीय प्रदूषक के प्रभाव की जांच के लिए एक समान तकनीक 23 का इस्तेमाल किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि zebrafish लार्वा के ट्रंक मांसपेशियों में पेशी समारोह का आकलन करने के लिए एक चिकोटी दौरान बल पीढ़ी के उपाय. धनुस्तंभीय संकुचन (0.2 सेकंड की अवधि के लिए 200 उत्तेजना दालों / सेक द्वारा जैसे) zebrafish लार्वा में हासिल किया जा सकता है, अधिकतम धनुस्तंभीय बल अधिकतम चिकोटी बल से केवल 10-15% अधिक है. इसलिए, एक चिकोटी के दौरान उत्पन्न बल बल पैदा करने की क्षमता का एक उचित उपाय है. Twitches तेजस्वी या सीवन संबंधों पर फिसल पैदा होने की संभावना कम होती है क्योंकि twitches धनुस्तंभीय संकुचन से अधिक पसंद कर रहे हैं.
इस तकनीक के साथ सार्थक डेटा उत्पन्न करने के लिए, अधिकतम चिकोटी बल प्रत्येक लार्वा के लिए हासिल किया जाना चाहिए और प्रयोगात्मक समूहों के बीच परिवर्तनशीलता को कम से कम किया जाना चाहिए. मन में इन लक्ष्यों के साथ, हम निम्नलिखित सुझाव प्रदान करते हैं. बल ट्रांसड्यूसर और लंबाई नियंत्रक ट्यूबों को लार्वा बांधने जब सबसे पहले, ध्यान रखना. सिवनी छोरों भी कड़ा कर रहे हैंबहुत, सीवन मांसपेशियों के ऊतकों के माध्यम से कट जाएगा. सिवनी छोरों काफी कड़ा नहीं कर रहे हैं, लार्वा द्वारा उत्पन्न बल पूरी तरह से बल ट्रांसड्यूसर को प्रेषित नहीं की जाएगी. दोनों स्थितियों, लेकिन विशेष रूप से उत्तरार्द्ध, अधिकतम चिकोटी बल कम. लार्वा के परीक्षण अवधि के दौरान विकास जारी रहेगा क्योंकि दूसरा, कई प्रयोगात्मक समूहों के परीक्षण के बाद से समूहों के बीच बारी – बारी से कई घंटे (20-30 मिनट / लार्वा), ले जा सकते हैं.
उल्लेख उपकरणों के कुछ अधिकतम चिकोटी बल की माप (जैसे बल ट्रांसड्यूसर, वर्तमान उत्तेजक) के लिए आवश्यक है, जबकि अन्य मदों बिल्कुल आवश्यक नहीं कर रहे हैं. वीडियो sarcomere लंबाई प्रणाली वांछनीय लेकिन आवश्यकता नहीं है. एक विकल्प के रूप में, twitches की एक श्रृंखला अधिकतम चिकोटी बल हासिल की है जब तक लार्वा की लंबाई निकाला जाता है, जिसके दौरान अधिकतम लंबाई को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक तापमान नियंत्रण प्रणाली भी बिल्कुल आवश्यक नहीं है. तापमान नियंत्रण जब विदेश मंत्रालय महत्वपूर्ण हैअधिकतम चिकोटी बल तापमान में छोटे बदलाव करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील नहीं है और कमरे के तापमान पर मापा जा सकता है, जबकि तापमान को अत्यधिक संवेदनशील होते हैं जो suring चिकोटी कैनेटीक्स,. परवाह किए बिना शक्ति परीक्षण के दौरान कक्ष में तापमान की, लार्वा डिग्री सेल्सियस 24 पूर्व मजबूर करने के लिए 28.5 का इष्टतम विकास तापमान पर रखा जाना चाहिए कि नोट सटीक मंचन के लिए परीक्षण.
लार्वा tricaine युक्त Tyrodes समाधान में जांच की जाती है. हम तंत्रिका तंत्र द्वारा पैदा की सहज संकुचन को खत्म करने और इस प्रकार शक्ति परीक्षण के दौरान थकान को रोकने के लिए (w / वी) tricaine, संज्ञाहरण 24 के लिए सिफारिश की एकाग्रता, 0.02% का उपयोग करें. Tricaine भी टाई पर कदम की सुविधा और समग्र परीक्षण के समय कम कर देता है. हालांकि, हम परीक्षण के समाधान में tricaine सहित लगातार लगभग 30% की अधिकतम चिकोटी बल कम कर देता है कि निरीक्षण करते हैं. एक समान प्रभाव भी tricai जहां, मेढक पूंछ मांसपेशी में देखा गया हैन्यूरोमस्कुलर संचरण अवरुद्ध किया गया था के बाद पूर्वोत्तर के tricaine पेशी 25 पर सीधा प्रभाव पड़ता है, सुझाव है कि बल पीढ़ी कम कर दिया. यह तंत्रिका कोशिकाओं 26 में है tricaine, कोशिका झिल्ली में सोडियम प्रवाहकत्त्व को कम करने से मांसपेशी सेल उत्तेजना कम हो सकता है. Motoneurons के द्वारा सक्रियण को रोकने के लिए अन्य विकल्पों घ tubocurarine और α-bungarotoxin हैं लेकिन, tricaine के विपरीत, इन यौगिकों त्वचा पारगम्य नहीं हैं और सिर, रीढ़ की हड्डी, या दिल 27 में सीधे इंजेक्ट किया जाना चाहिए. व्यक्तिगत जांचकर्ताओं tricaine उनके विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए वांछनीय है या नहीं, का आकलन करने की आवश्यकता होगी. Tricaine परीक्षण समाधान में शामिल किया जाता है tricaine का प्रभाव प्रयोगात्मक समूहों के बीच अलग अलग नहीं है कि सत्यापित करना चाहिए, एकाग्रता प्रयोगों और शोधकर्ताओं के बीच अनुरूप होना चाहिए.
हम 3 DPF के रूप में युवा और 7 DPF के रूप में के रूप में पुराने के रूप में लार्वा के लिए इस विधि का वर्णन है. मांसपेशी फाइबर फू होना दिखाई देते हैं3 DPF उपकरणों का परीक्षण करने के लार्वा बांधने hinders पहले सहज पूंछ आंदोलनों 27, पूंछ की कम लंबाई शुरू जब 17 घंटे बाद निषेचन, के रूप में जल्दी के रूप में nctional. कई रोग मॉडल इस समय की तुलना में बहुत लंबे समय तक जीवित नहीं है, क्योंकि हम आम तौर पर 7 DPF के बाद लार्वा परीक्षण नहीं है. 5 DPF परे लार्वा का परीक्षण करते हैं, लार्वा खिलाया जाना चाहिए. हम भूखा लार्वा संभावना खिलाया लार्वा, ह्रासमान जर्दी थैली की वजह से छोटी मांसपेशियों है और कम अधिकतम चिकोटी बल उत्पन्न करते देखा है. इस प्रकार यह बाहरी खिलाने के अतिरिक्त चर से बचने के लिए, 3-5 DPF बीच लार्वा परीक्षण करने के लिए वांछनीय हो सकता है.
संक्षेप में, हम zebrafish लार्वा ट्रंक मांसपेशियों की एक अधिकतम चिकोटी संकुचन के दौरान बल पीढ़ी को मापने के लिए एक मात्रात्मक और विश्वसनीय विधि का वर्णन है. इस विधि zebrafish लार्वा पेशी के समग्र स्वास्थ्य का आकलन किया और विशेष रूप से मांसपेशियों के समारोह के बारे में जानकारी प्रदान करता है हो सकता है. के बारे में जानकारी प्रदान करने के अलावाबल पीढ़ी की भयावहता, इस तकनीक के बल पीढ़ी के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए या 22 थकान मांसपेशियों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. हम जंगली प्रकार लार्वा के साथ उपयोग करने के लिए इस तकनीक का वर्णन है, इस विधि मांसपेशियों की बीमारी मॉडल विशेषताएँ और उपचार का मूल्यांकन, या मांसपेशियों के विकास, मांसपेशियों की चोट, या अध्ययन करने के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित लार्वा के लिए या दवाओं या विषैले पदार्थ के साथ इलाज लार्वा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मांसपेशियों से संबंधित रासायनिक विषाक्तता.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों zebrafish के पालन के साथ सहायता के लिए एंजेला गाया धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (एजी-020591 के लिए SVB और JJD को 1K08AR054835) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| REAGENTS | |||
| Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EQUIPMENT | |||
| Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
| Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
| Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
| XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
| Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
| Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
| Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
| Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
| Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |
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