Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Force Måling Under Sammentrekning å vurdere muskelfunksjon i sebrafisk Larver

doi: 10.3791/50539 Published: July 23, 2013

Summary

Kraft målinger kan brukes til å påvise forandringer i muskel-funksjon på grunn av utvikling, skade, sykdom, behandling eller kjemisk toksisitet. I denne videoen viser vi en metode for å måle kraft i løpet av en maksimal sammentrekning av sebrafisk larve bagasjerommet muskler.

Abstract

Sebrafisk larver gir modeller for muskel utvikling, muskel sykdom og muskel-relaterte kjemisk giftighet, men relaterte studier mangler ofte funksjonelle tiltak av muskel helse. I denne videoen artikkelen viser vi en metode for å måle kraft generasjon under sammentrekning av sebrafisk larve bagasjerommet muskler. Kraft målinger blir oppnådd ved å plassere en bedøvet larve inn i et kammer fylt med en saltoppløsning. Den fremre ende av larven er knyttet til en kraft transduseren og den bakre ende av larven er knyttet til en lengde kontrolleren. Et isometrisk kontraksjon trekning blir fremkalt ved elektrisk stimulering felt og kraften responsen, blir registrert for analyse. Force generering i løpet av sammentrekning er et mål på den generelle muskel helse og spesifikt er et mål på muskelfunksjon. Selv om vi beskriver denne teknikk for bruk med villtype larver, kan denne metode benyttes med genetisk modifisert larver eller med larver behandlet med medikamenter eller giftstoffer,å karakterisere muskel sykdom modeller og evaluere behandlinger, eller for å studere muskel utvikling, skade eller kjemisk giftighet.

Introduction

Young sebrafisk (Danio rerio) larver, 3-7 dager etter befruktning (DPF), blir stadig mer anerkjent som et nyttig organisme for skjelettmuskulatur forskning. Unge larver brukes til å modellere menneskelige muskelsykdom 1-9, evaluere narkotika og terapeutiske strategier 10-11, studie muskelskade 12, forstår muskelutvikling 13-16, og undersøke muskel-relaterte kjemiske giftighet 17-19. Typiske studier i disse områdene undersøke i hvilken grad frisk muskel gjengis unormal ved genetisk manipulering eller eksponering for giftstoffer, og noen studier undersøke i hvilken grad unormal muskel reagerer på behandling. Kritisk for å lykkes med disse studiene er evnen til nøyaktig vurdere muskel helse.

Mens det er en rekke metoder for å vurdere muskel helse i sebrafisk larver, noen gir direkte informasjon om muskel funksjon. Muscle helse er vanligvis evaluert av appearance, som vurderes av histologisk farging 6,8,11, farging 9,15,16,18, lysmikroskopi 3,13, elektronmikroskopi 3,4,14,16, eller 7,9,11 dobbeltbrytningen, men disse teknikkene gir morfologisk informasjon. Bagasjerommet og hale forskyvninger og svømming hastighet 4,17 vurdere motorisk funksjon, men disse er ikke direkte mål på muskel funksjon siden de også reflektere nevrale input, energiomsetningen, og andre prosesser.

I kontrast til måling av kraft generasjon under sammentrekning gir en direkte vurdering av muskelfunksjon og representerer et mål på den generelle muskel helse. Lagt fordeler med denne tilnærmingen er grei data analyse og kvantitative resultater. I denne videoen artikkelen gir vi en detaljert fremgangsmåte for å måle styrken generasjon av larver muskler, i håp om at flere forskere vil bruke denne metoden for å utfylle eksisterende tiltak av muskel helse i sin forskning.

For å være klar, ikke denne teknikken ikke måle kreftene som genereres av larve muskler under svømming. Fordi begge ender av larven er knyttet til utstyr, og fordi larven forblir bedøvet, kan den ikke innlede bevegelse under testingen. Videre aktiverer felt stimulering alle muskelfibrene samtidig å indusere en milliateral sammentrekning, som ikke er det naturlig oppstår 20. Derfor, i stedet for å måle faktiske krefter som oppstår under svømming, bestemmer denne teknikken kraften genererer evne av larver muskler.

Vi har brukt denne teknikk for å demonstrere muskelsvakhet i en modell av zebrafisk nemalin myopati 21, samt for å evaluere effekten av antioksidantbehandling på muskelfunksjon i zebrafisk en modell av multi-Minicore sykdom 22.. Andre har brukt en lignende teknikk 23 for å undersøke effekten av en miljøgift på muskelfunksjon 19.

Protocol

Merk: Alle prosedyrer som involverer sebrafisk bør utføres i samsvar med gjeldende retningslinjer, forskrifter og offentlige myndigheter. Alle dyr anvendelsesprosedyrer vist i denne artikkelen ble godkjent av University of Michigan komité for bruk og vedlikehold av dyr (UCUCA).

En. Gjør Sutur Loops

  1. Bruk pinsett til å skille ikke-sterile sutur (USP 10/0 monofilament nylon, 3 ply) i tre tilnærmingene.
  2. Begynn å knytte en dobbel halvstikk-knute i en av trådene. Stopp før du strammer knuten helt å lage en liten (~ 1 mm diameter) løkke i stedet for en knute.
  3. Bruk saks til å klippe overflødig sutur fra loop haler. Et eksempel på et ferdig sløyfe er vist i figur 1.
  4. Sett sløyfe på den klebrige siden av en Post-it lapp for senere bruk. Suturen løkker vil bli brukt til å holde larvene på plass under kraft-testing.
  5. Gjenta trinn 1.1 til 1.4 som er nødvendig. Make to suture sløyfer for hver larve som vil bli testet.

2. Gjør Testing Solution

  1. Lag Tyrodes oppløsning ved tilsetning 7,977 g natriumklorid, 0,373 g kaliumklorid, 0,265 g kalsiumkloriddihydrat, 0.102 g magnesiumkloridheksahydrat, 0,048 g natrium monobasisk, 1,000 g natriumbikarbonat og 0,037 g etylendiamintetraeddiksyre-dinatriumsalt-dihydrat i 1000 ml renset vann.
  2. Omrør løsningen inntil saltene er fullstendig oppløst. Denne løsningen kan lagres i en måned ved 4 ° C.
  3. Legg 2.1 ml av 4 mg / ml Tricaine, utarbeidet i henhold til sebrafisk Book 24, til 47,9 ml Tyrodes løsning og bland. Beskytt denne løsningen mot lys ved å lagre det i en mørk glassflaske eller i en glassflaske dekket med aluminiumsfolie. Denne løsningen bør oppbevares ved romtemperatur og gjort frisk hver dag.

3. Knyt Aanesthetized Larva inn Experimental Chamber

    <li> Sett testing apparater (figur 2) på scenen av en stereo mikroskop.
  1. Koble kraft svinger og lengde kontrolleren kabler til testing apparater. Slå på kraft svinger. Slå på lengden kontrolleren slik at den forblir stiv. (Merk:.. Lengden regulatoren gir mulighet til å strekke eller forkorte en muskel forberedelse under en kontraksjon Imidlertid er denne funksjon av lengden kontrolleren ikke anvendes ved fremgangsmåten beskrevet heri kan derfor lengden kontrolleren bli tenkt på som et stivt feste punkt montert til en XYZ posisjoneringssystem).
  2. Med en engangs overføringspipetten, fyll den eksperimentelle kammer med testing løsning.
  3. Bruk pinsett til å plukke opp en sutur løkke av en av de haler og henge den på kraft svinger røret. Heng et andre sutur løkke på røret festet til lengde-kontrolleren. (Merk: gripende en sutur sløyfe på den buede delen kan knekkes sutur og cauSE det å bryte under påfølgende trinn).
  4. Med en engangs overføringspipetten, overføre en sebrafisk larve til en liten petriskål fylt med testing løsning. Vent til bedøvelse i testing løsning (Tricaine) skal tre i kraft (~ 1 min). Med en tang, skubber halen og kontrollere at larven er bedøvet av mangel på kontakt-fremkalt svømming.
  5. Bruke et glass-pipette for å overføre larven til den eksperimentelle kammeret.
  6. Ved forsiktig nudging larven med lukkede tang, veilede fremre delen av larven gjennom sutur sløyfe på kraft svinger røret. Guide den fremre del av larve gjennom sutur-ringen på røret. Ta tak i begge suture sløyfe haler med pinsett og dra dem samtidig å stramme sutur sløyfe posterior til plommesekken eller swimbladder (figur 3A).
  7. Med en tang, hold ett sting sløyfe hale og dra, slik at larven dreie 90 ° rundt røret til den laterale siden av larven ansiktets opp (Figur 3B). Dersom sløyfen ble strammet tilstrekkelig, vil det være en viss motstand mot trekk maskinen; larven ikke skal dreies lett. Dersom sløyfen ble strammet for mye, vil larven ikke dreies rundt røret.
  8. Ved hjelp av XYZ posisjoneringsanordning festet til lengde-kontrolleren, bevege lengden kontrolleren røret langs X-aksen (akse definisjonene i figur 2A) og under stammen og hale av larven. La plass mellom endene av lengden kontrolleren røret og den kraft transduseren røret.
  9. Veilede sutur løkken over halen av larven og stram sutur sløyfe som tidligere beskrevet (Figur 3C). Du må kanskje dreie den bakre delen av larven slik at den laterale siden vender opp. Trim suture sløyfe haler (Figur 3D).

4. Posisjon Larva i Experimental Chamber

  1. Beveg larve til en passende avstand fra kammerets bunn for å sikre den larve will være innenfor "arbeidsavstand" av en omvendt mikroskop mål i løpet av påfølgende trinn. For å oppnå dette, bruker XYZ-anordninger, for å langsomt senke rørene (med vedlagte larve) langs z-aksen til rørene bare berøre bunnen av kammeret. Deretter heve rørene inntil larven er en passende avstand fra kammerets bunn (~ 100 mikrometer).
  2. Ved hjelp av XYZ posisjoneringsanordning festet til lengde-kontrolleren, justere lengden kontrolleren røret langs y-aksen for å justere den lange aksen av larven med den lange aksen av kraft transduseren røret.

Fem. Record Force Under en Maximal Twitch Contraction

  1. Beveg testapparatet til fasen av et invertert mikroskop.
  2. Juster kammeret temperatur til en ønsket verdi. Til å begynne, kan du koble vannbad sirkulasjonspumpe, termometer, og temperaturen kontrolleren til testing apparater. Slå på de nødvendige komponentene og justere innstillingen på temperatur;oller til termometeret rapporterer ønsket verdi. Data i denne artikkelen ble oppsamlet ved 25 ° C, men målinger kan også foretas ved romtemperatur eller ved 28.5 ° C.
  3. Koble kablene fra stimulator til testing apparater. Slå på strømmen til stimulator men ikke stimulere larven til trinn 5.6.
  4. Kontroller at larven er parallell til kammeret bunnen. Gjennom et 40X objektiv, vise den del av larve mellom endene av rørene. Hvis parallell med bunnen, vil begge ender av larve være i fokus. Hvis det er nødvendig, justere kraft svinger røret langs Z-aksen til begge endene er i fokus.
  5. Kontroller at larven er kortere enn optimalt. Slå på video sarkomerlengde system og rotere videokameraet slik at striper er parallelle med sidene av videorammen. Dette systemet overvåker striation avstand ved å analysere variasjoner i pikselintensiteten langs hver horisontal rekke av piksler innenfor en brukerdefinert område av interesse(ROI). Resultatene for alle radene i avkastningen er i gjennomsnitt og rapportert med en frekvens tilsvarende video frame-rate (≥ 80 sek -1). Den striation mellomrom brukes som en indikator på sarkomerlengde.
  6. Juster mikroskop for å fokusere på perifere fibre og merk den angitte sarkomerlengde. Dersom nødvendig, må XYZ posisjoneringsanordning festet til lengde-kontrolleren for å justere lengden av larven (X-aksen) til sarkomerlengde er mindre enn optimal (f.eks 1,90 mikrometer).
  7. Juster stimulering strøm for å optimalisere rykk kraft. Til å begynne, sette output gjeldende på stimulator til en lav magnitude (f.eks 100 mA). Stimulatoren kan utløses manuelt eller ved en datamaskin som kjører et egendefinert LabVIEW program. Lokke fram en trekning av larver muskler med en aktuell puls på 0,2 ms i varighet.
  8. Bruk et oscilloskop til å registrere kraft produksjon og måle peak rykk kraft ved hjelp av oscilloskop er pekere. Øke dagensved 50 mA trinn og måle peak rykk kraft på hvert nivå. Vent 30 sekunder mellom rykninger å hindre utmattelse. Som stimulering øker, øker peak rykk kraft vanligvis til et maksimum, og deretter gradvis avtar. Den gjeldende ved hvilken larven genererer den største kraft er den optimale stimulering strøm. Angi gjeldende amplitude til optimal stimulering strøm.
  9. Ved hjelp av XYZ oneringsanordningen, justere lengden på larven (og således, sarkomerlengde) for å fremkalle maksimal rykk kraft. Vill-type sebrafisk larver (3-7 DPF) generere maksimal rykk kraft ved sarkomerlengda av 2,10 mikrometer eller 2,15 mikrometer. Imidlertid kan sarkomerlengde settes til 2,08 mikrometer for å unngå overflødig belastning på larven.
  10. Lokke fram en trekning av larver muskler. Bruk oscilloskop for å spille inn kraften respons og lagre posten for senere analyse.

6. Mål muskulaturen Mål med Larva på Optimal lengde

Beveg testapparatet tilbake til den stereomikroskop.
  • Ved hjelp av okularet skala, måle høyden på muskulaturen, sett fra siden. Så, tar seg ikke å endre lengden på larven, sving larve med 90 ° ved hjelp av suture sløyfe haler for å se larven fra bunnen. Mål bredden av muskulaturen, sett fra bunnen. Ta målinger på en anatomisk landemerke (f.eks urogenitale åpning) (figur 4).
  • Skjær suture looper med en MicroBlade å frigjøre larven fra testing av utstyr.
  • Representative Results

    Hos friske villtype zebrafisk larver, bør muskelfibrene være parallelle med hverandre uten store gap mellom dem og har tydelige striper (figur 5A). Vill-type sebrafisk larver som ikke viser disse funksjonene, eller med tydelig skader som frittliggende fibre (figur 5B), skal kastes.

    Et representativt plott av peak rykk kraft versus stimulering strøm for en enkelt zebrafisk larve er vist i figur 6.. For vill-type sebrafisk larver mellom 3-7 DPF, er optimal stimulering nåværende vanligvis mellom 400-600 mA, med tre DPF larver generelt krever større stimulering strøm enn 6-7 DPF larver.

    Den rå kraft data (samlet under trinn 5.8) må bearbeides og analyseres med dataanalyse programvare. Først blir baseline av styrken rekord satt til null. For det andre blir spenningen utgangen fra kraft transduseren omdannet til kraft (mN) (se produsentens instruksjoner for å generere en kalibreringskurve for den kraft transduseren). Et representativt kraft respons samlet inn under en maksimal sammentrekning trekning av et enkelt larve er vist i figur 7.. Dataanalyse programvare kan brukes til å måle peak kraft og andre funksjoner i kraft respons.

    Et representativt sett av skyvkraft data fra maksimal napp sammentrekninger er vist i figur 8A. Typiske peak rykk force verdier for vill-type 3-7 DPF larver rekkevidde 0,9 til 1,7 MN, med eldre larver generere mer kraft enn yngre larver. Forskjeller i peak force rykk kan være på grunn av normale prosesser som vekst og utvikling (figur 8) eller unormale prosesser som genmutasjon-relatert patologi 21,22.

    Normalisering av muskel tverrsnitt (CSA) kan brukes til å bestemme i hvilken grad forskjeller i peak rykk kraft er rett og slett på grunn av differe NCE i størrelse i muskulaturen 21,22. Muskel CSA kan beregnes ved hjelp av formelen: CSA = π (A / 2) (B / 2), der A er høyden av muskulaturen som sett fra siden, B er bredden på muskulaturen, sett fra bunnen, og en elliptisk tverrsnitt er antatt. Typiske CSA verdier for vill-type 3-7 DPF larver utvalg 0,027 til 0,034 mm 2, med 3-4 DPF larver generelt viser mindre CSA verdier enn 5-7 DPF larver. Et representativt sett normaliserte skyvkraft data fra maksimale napp sammentrekninger er vist i figur 8B. Typiske normaliserte peak rykk force verdier for vill-type 3-7 DPF larver range 34-51 mN / mm 2, med 4-7 DPF larver generelt viser større verdier enn tre DPF larver.

    Figur 1
    Figur 1. Sutur sløyfe. Piler peker på suture sløyfe haler.

    ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 2
    Figur 2. (A) prøveapparat med merkede komponenter. (B) Nærbilde utsikt over den eksperimentelle kammer. (A) Eksperimentell kammer med gjennomsiktig bunn. (B) Force sensorer. (C) Lengde kontrolleren. (D) XYZ posisjonering enheter. X, Y og Z-aksene er definert i øvre høyre hjørne. (E) Temperaturkontroll system utnytte termoelektriske moduler. Tubing plass vannføring for kjøling av termoelektriske moduler. (F) Rustfritt stål rør festet å tvinge svinger. (G) Rustfritt stål slange festet til lengde kontrolleren. (H) termometer MicroProbe. (I) Platinum parallell plate elektroder, som spenner over lengden på denkammer. Platinum platene er 2,5 mm høy og 0.255 mm tykt.

    Figur 3
    Figur 3. Knytte larve i eksperimentell kammer. (A) Larva bundet på at fremre enden, men ennå ikke svinges 90 °. (B) Larva etter svingbar 90 °. (C) Larva bundet på ved bakre enden, men ennå ikke dreies. (D) Larva etter svivlende og sutur sløyfe haler er trimmet.

    Figur 4
    Figur 4. Målinger for tverrsnittsarealet estimering. Muskulatur som vist fra (A) side, og (B)

    Figur 5
    Figur 5. Lateral syn på sebrafisk larver trunk muskulatur. (A) Sunn vev. (B) Tissue med tydelig skade. Kontrakturer som følge av fiber avdelinger er merket med stjerner.

    Figur 6
    Figur 6. Representative tomt på topp rykk kraft versus stimulering strøm. Den optimale stimulering strøm er 500 mA.


    Figur 7. Representant kraft rekord for en enkelt rykk sammentrekning. Denne sammentrekning utløste med en stimulans puls på 0 ms. Toppen kraft er 1.56 mn.

    Figur 8
    Figur 8. Representative force data 3-7 DPF larver. (A) Peak force data fra maksimal napp sammentrekninger. (B) Peak force data fra maksimal napp sammentrekninger normalisert til CSA. Eldre larver (6-7 DPF) ble matet Hatchfry Encapsulon Grade 0 med Spirulina (Argent Laboratories) starter på 5 DPF. Midler + standardavvik er rapportert med N = 5 i hver gruppe. Grupper vesentlig forskjellig fra tre DPF larver (*) og 4 DPF larver (#) er angitt (ANOVA, P <0,05). Den betydelige økningen i normalisert kraft mellom 3 og 4 dpf (B) viser en økning i den iboende evne å generere kraft i løpet av denne tidsperiode, mens økningen av kraften mellom 4 og 6-7 dpf (A) er tilskrevet vekst basert på ingen endre 4-7 DPF i normalisert kraft.

    Discussion

    Denne metoden måler styrken generasjon under en trekning for å vurdere muskelfunksjon i bagasjerommet muskler av sebrafisk larver. Selv tetanic sammentrekninger kan oppnås hos sebrafisk larver (for eksempel ved 200 stimulering pulser / sek for en varighet på 0,2 sek), er den maksimale tetanic kraft bare 10-15% større enn den maksimale rykk kraft. Derfor er den kraft som genereres under et rykk en rimelig grad av kraft genererer evne. Rykninger er å foretrekke fremfor tetanic sammentrekninger fordi rykninger er mindre sannsynlighet for å forårsake ripping eller skli på suture bånd.

    For å frembringe meningsfylte data med denne teknikken, bør maksimum rykk kraft oppnås for hver larve og variabiliteten mellom eksperimentelle grupper bør minimaliseres. Med disse målene i tankene, tilbyr vi følgende forslag. Først, ta vare når knytte larven til kraft svinger og lengde kontrolleren rør. Hvis suture sløyfene er strammet formye, vil suturen skjære gjennom muskelvev. Hvis suture sløyfene ikke er strammet tilstrekkelig, vil den kraft som genereres av larven ikke være fullt overføres til styrken transduseren. Begge situasjoner, men spesielt sistnevnte, undervurdere maksimal rykk kraft. Sekund, kan siden testing av flere eksperimentelle grupper ta flere timer (20-30 min / larve), veksler mellom grupper fordi larvene vil fortsette å utvikle seg i løpet av testperioden.

    Mens noen av de nevnte utstyr er avgjørende for måling av maksimal rykk kraft (f.eks kraft svinger, nåværende stimulator), andre elementer er ikke absolutt nødvendig. Den video sarkomerlengde system er ønskelig men ikke nødvendig. Som et alternativ, kan en serie av rykninger bli brukt til å finne optimale lengde, der lengden av larven justert inntil maksimal rykk kraft er oppnådd. Et temperaturreguleringssystem er heller ikke absolutt nødvendig. Temperaturkontroll er kritisk når measuring rykk kinetikk, som er svært følsomme for temperatur, mens maksimal rykk styrken ikke er spesielt følsomme overfor små forandringer i temperatur, og kan måles ved romtemperatur. Legg merke til at uavhengig av temperaturen i kammeret i løpet av kraft prøver bør larvene holdes på den optimale veksttemperatur på 28,5 ° C 24 før tvinge testing for nøyaktig oppsetning.

    Larvene blir testet i en Tyrodes løsning inneholdende Tricaine. Vi bruker 0,02% (w / v) Tricaine, konsentrasjonen anbefalt for anestesi 24, for å eliminere spontane kontraksjoner fremkalt av nervesystemet og således forhindre tretthet under kraft testing. Tricaine forenkler også tie-on trinnet og reduserer totale testing tid. Men ser vi at blant annet Tricaine i testing løsning konsekvent reduserer den maksimale rykk kraft med ca 30%. En lignende effekt har også blitt observert i rumpetroll hale muskel, hvor tricaine redusert kraft generasjon etter nevromuskulær transmisjon ble blokkert, noe som tyder på at Tricaine har en direkte effekt på muskel 25. Tricaine kan redusere muskel celleeksiterbarhet ved å redusere natrium-konduktans over cellemembranen, som det gjør i nerveceller 26. Andre alternativer for å blokkere aktiveringen av motoneurons er d-tubocurarine og α-bungarotoxin men i motsetning Tricaine, disse forbindelsene er ikke hud-gjennomtrengelig og må injiseres direkte inn i hodet, ryggmargen, eller hjerte 27. Individuelle etterforskere må vurdere hvorvidt Tricaine er ønskelig for deres spesifikke applikasjonen. Hvis Tricaine er inkludert i testløsning, bør konsentrasjonen være konsekvent mellom eksperimenter og forskere burde verifisere at effekten av den Tricaine ikke varierer mellom eksperimentelle grupper.

    Vi beskriver denne metoden for larvene så unge som tre DPF og like gammel som 7 DPF. Selv muskelfibre synes å være functional så tidlig som 17 timer etter befruktning, når spontane halebevegelser begynner 27, den korte lengden på halen før tre DPF hindrer knytte larven til testing av utstyr. Vi vanligvis ikke teste larve etter 7 DPF siden mange sykdom modeller ikke overleve mye lenger enn denne gangen. Ved testing av larver utover 5 dpf, bør larvene bli matet. Vi har observert at unfed larvene har mindre muskler og genererer mindre maksimal rykk kraft enn matet larver, sannsynligvis på grunn av den synkende plommesekken. Således kan det være ønskelig å teste larver mellom 3-5 dpf, for å unngå den ekstra variable av ytre foring.

    Oppsummert beskriver vi en kvantitativ og pålitelig metode for å måle kraft generering i løpet av en maksimal rykk sammentrekning av zebrafisk larve stammen muskel. Denne metoden kan brukes til å vurdere den generelle helsen til sebrafisk larve muskel og spesifikt gir informasjon om muskel funksjon. I tillegg til å gi informasjon omStørrelsen av kraften generasjon, kan denne teknikken brukt for å studere kinetikken til kraft generasjon eller være tilpasset for å studere muskeltretthet 22.. Selv om vi beskriver denne teknikk for bruk med villtype larver, kan denne metoden anvendes for genetisk modifisert for larver eller larver behandlet med medikamenter eller giftstoffer, for å karakterisere muskel sykdomsmodeller og evaluere behandlinger, eller for å studere muskel-utvikling, muskelskade eller muskel-relaterte kjemisk giftighet.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Forfatterne takker Angela Busta for å få hjelp med sebrafisk dyrehold. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (AG-020591 til SVB og 1K08AR054835 til JJD).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    REAGENTS
    Tricaine powder Sigma-Aldrich A5040
    Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
    Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
    Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 223506
    Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
    Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
    Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
    EQUIPMENT
    Nonsterile-suture Ashaway Line Twine S30002 USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)
    Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5
    Spring scissors Fine Science Tools 15000-08 Vannas
    Stereo microscope Leica Microsystems MZ8 Illuminated with Fostec EKE ACE I light source
    Force transducer Aurora Scientific 400A
    Length controller Aurora Scientific 318B
    XYZ positioning devices Parker Hannifin 3936M
    Thermometer Physitemp BAT-12
    Disposable transfer pipette Fisher Scientific 13-711-9AM Cut end to widen opening and facilitate larva transfer
    Petri dish Fisher Scientific 08-757-11YZ
    Glass pipette Fisher Scientific 13-678-8B Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer
    Inverted microscope Carl Zeiss Microscopy Axiovert 100
    Water bath circulator Neslab Instruments RTE-111
    Temperature controller Alpha Omega Instruments Series 800
    Stimulator Aurora Scientific 701C High-power, follow stimulator
    Video sarcomere length system Aurora Scientific 900B-5A
    LabVIEW software National Instruments
    Oscilloscope Nicolet Technologies ACCURA 100
    Microblade Fine Science Tools 10050-00
    Microblade holder Fine Science Tools 10053-13
    Data analysis software (Signo) Alameda Applied Sciences

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, (23), 5851-5860 (2003).
    2. Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, (13), 1727-1743 (2005).
    3. Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104, (17), 7092-7097 (2007).
    4. Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
    5. Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2), e1000372 (2009).
    6. Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20, (12), 826-832 (2010).
    7. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, (4), 623-633 (2010).
    8. Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
    9. Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. (1093).
    10. Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108, (13), 5331-5336 (2011).
    11. Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15, (12), 2643-2651 (2011).
    12. Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
    13. Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318, (1), 92-101 (2008).
    14. Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181, (2), 381-394 (2008).
    15. Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
    16. Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123, (7), 1141-1150 (2010).
    17. Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98, (2), 139-147 (2010).
    18. Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32, (4), 472-480 (2010).
    19. Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33, (6), 752-764 (2011).
    20. Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87, (3), 1244-1251 (2002).
    21. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
    22. Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, (4), 1115-1127 (2012).
    23. Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
    24. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
    25. Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110, (3), 289-296 (1995).
    26. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
    27. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37, (4), 622-632 (1998).
    Force Måling Under Sammentrekning å vurdere muskelfunksjon i sebrafisk Larver
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).More

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter