Kraft målinger kan brukes til å påvise forandringer i muskel-funksjon på grunn av utvikling, skade, sykdom, behandling eller kjemisk toksisitet. I denne videoen viser vi en metode for å måle kraft i løpet av en maksimal sammentrekning av sebrafisk larve bagasjerommet muskler.
Sebrafisk larver gir modeller for muskel utvikling, muskel sykdom og muskel-relaterte kjemisk giftighet, men relaterte studier mangler ofte funksjonelle tiltak av muskel helse. I denne videoen artikkelen viser vi en metode for å måle kraft generasjon under sammentrekning av sebrafisk larve bagasjerommet muskler. Kraft målinger blir oppnådd ved å plassere en bedøvet larve inn i et kammer fylt med en saltoppløsning. Den fremre ende av larven er knyttet til en kraft transduseren og den bakre ende av larven er knyttet til en lengde kontrolleren. Et isometrisk kontraksjon trekning blir fremkalt ved elektrisk stimulering felt og kraften responsen, blir registrert for analyse. Force generering i løpet av sammentrekning er et mål på den generelle muskel helse og spesifikt er et mål på muskelfunksjon. Selv om vi beskriver denne teknikk for bruk med villtype larver, kan denne metode benyttes med genetisk modifisert larver eller med larver behandlet med medikamenter eller giftstoffer,å karakterisere muskel sykdom modeller og evaluere behandlinger, eller for å studere muskel utvikling, skade eller kjemisk giftighet.
Young sebrafisk (Danio rerio) larver, 3-7 dager etter befruktning (DPF), blir stadig mer anerkjent som et nyttig organisme for skjelettmuskulatur forskning. Unge larver brukes til å modellere menneskelige muskelsykdom 1-9, evaluere narkotika og terapeutiske strategier 10-11, studie muskelskade 12, forstår muskelutvikling 13-16, og undersøke muskel-relaterte kjemiske giftighet 17-19. Typiske studier i disse områdene undersøke i hvilken grad frisk muskel gjengis unormal ved genetisk manipulering eller eksponering for giftstoffer, og noen studier undersøke i hvilken grad unormal muskel reagerer på behandling. Kritisk for å lykkes med disse studiene er evnen til nøyaktig vurdere muskel helse.
Mens det er en rekke metoder for å vurdere muskel helse i sebrafisk larver, noen gir direkte informasjon om muskel funksjon. Muscle helse er vanligvis evaluert av appearance, som vurderes av histologisk farging 6,8,11, farging 9,15,16,18, lysmikroskopi 3,13, elektronmikroskopi 3,4,14,16, eller 7,9,11 dobbeltbrytningen, men disse teknikkene gir morfologisk informasjon. Bagasjerommet og hale forskyvninger og svømming hastighet 4,17 vurdere motorisk funksjon, men disse er ikke direkte mål på muskel funksjon siden de også reflektere nevrale input, energiomsetningen, og andre prosesser.
I kontrast til måling av kraft generasjon under sammentrekning gir en direkte vurdering av muskelfunksjon og representerer et mål på den generelle muskel helse. Lagt fordeler med denne tilnærmingen er grei data analyse og kvantitative resultater. I denne videoen artikkelen gir vi en detaljert fremgangsmåte for å måle styrken generasjon av larver muskler, i håp om at flere forskere vil bruke denne metoden for å utfylle eksisterende tiltak av muskel helse i sin forskning.
<pclass = "jove_content"> Det overordnede målet med denne metoden er å måle kraft generasjon under sammentrekning av sebrafisk larve bagasjerommet muskler. For å oppnå dette målet, er en zebrafisk larve bedøvd og plassert i et kammer fylt med en saltoppløsning. Den fremre ende av larven er knyttet til en kraft transduseren og den bakre ende av larven er knyttet til en lengde kontrolleren. Muskel aktivering oppnås ved hjelp av elektrisk felt stimulering og stimulering strøm og lengden av larven er justert for å produsere maksimal rykk kraft. Et isometrisk sammentrekning fremkalte rykk og kraften responsen, blir registrert for analyse.For å være klar, ikke denne teknikken ikke måle kreftene som genereres av larve muskler under svømming. Fordi begge ender av larven er knyttet til utstyr, og fordi larven forblir bedøvet, kan den ikke innlede bevegelse under testingen. Videre aktiverer felt stimulering alle muskelfibrene samtidig å indusere en milliateral sammentrekning, som ikke er det naturlig oppstår 20. Derfor, i stedet for å måle faktiske krefter som oppstår under svømming, bestemmer denne teknikken kraften genererer evne av larver muskler.
Vi har brukt denne teknikk for å demonstrere muskelsvakhet i en modell av zebrafisk nemalin myopati 21, samt for å evaluere effekten av antioksidantbehandling på muskelfunksjon i zebrafisk en modell av multi-Minicore sykdom 22.. Andre har brukt en lignende teknikk 23 for å undersøke effekten av en miljøgift på muskelfunksjon 19.
Denne metoden måler styrken generasjon under en trekning for å vurdere muskelfunksjon i bagasjerommet muskler av sebrafisk larver. Selv tetanic sammentrekninger kan oppnås hos sebrafisk larver (for eksempel ved 200 stimulering pulser / sek for en varighet på 0,2 sek), er den maksimale tetanic kraft bare 10-15% større enn den maksimale rykk kraft. Derfor er den kraft som genereres under et rykk en rimelig grad av kraft genererer evne. Rykninger er å foretrekke fremfor tetanic sammentrekninger fordi rykninger er mindre sannsynlighet for å forårsake ripping eller skli på suture bånd.
For å frembringe meningsfylte data med denne teknikken, bør maksimum rykk kraft oppnås for hver larve og variabiliteten mellom eksperimentelle grupper bør minimaliseres. Med disse målene i tankene, tilbyr vi følgende forslag. Først, ta vare når knytte larven til kraft svinger og lengde kontrolleren rør. Hvis suture sløyfene er strammet formye, vil suturen skjære gjennom muskelvev. Hvis suture sløyfene ikke er strammet tilstrekkelig, vil den kraft som genereres av larven ikke være fullt overføres til styrken transduseren. Begge situasjoner, men spesielt sistnevnte, undervurdere maksimal rykk kraft. Sekund, kan siden testing av flere eksperimentelle grupper ta flere timer (20-30 min / larve), veksler mellom grupper fordi larvene vil fortsette å utvikle seg i løpet av testperioden.
Mens noen av de nevnte utstyr er avgjørende for måling av maksimal rykk kraft (f.eks kraft svinger, nåværende stimulator), andre elementer er ikke absolutt nødvendig. Den video sarkomerlengde system er ønskelig men ikke nødvendig. Som et alternativ, kan en serie av rykninger bli brukt til å finne optimale lengde, der lengden av larven justert inntil maksimal rykk kraft er oppnådd. Et temperaturreguleringssystem er heller ikke absolutt nødvendig. Temperaturkontroll er kritisk når measuring rykk kinetikk, som er svært følsomme for temperatur, mens maksimal rykk styrken ikke er spesielt følsomme overfor små forandringer i temperatur, og kan måles ved romtemperatur. Legg merke til at uavhengig av temperaturen i kammeret i løpet av kraft prøver bør larvene holdes på den optimale veksttemperatur på 28,5 ° C 24 før tvinge testing for nøyaktig oppsetning.
Larvene blir testet i en Tyrodes løsning inneholdende Tricaine. Vi bruker 0,02% (w / v) Tricaine, konsentrasjonen anbefalt for anestesi 24, for å eliminere spontane kontraksjoner fremkalt av nervesystemet og således forhindre tretthet under kraft testing. Tricaine forenkler også tie-on trinnet og reduserer totale testing tid. Men ser vi at blant annet Tricaine i testing løsning konsekvent reduserer den maksimale rykk kraft med ca 30%. En lignende effekt har også blitt observert i rumpetroll hale muskel, hvor tricaine redusert kraft generasjon etter nevromuskulær transmisjon ble blokkert, noe som tyder på at Tricaine har en direkte effekt på muskel 25. Tricaine kan redusere muskel celleeksiterbarhet ved å redusere natrium-konduktans over cellemembranen, som det gjør i nerveceller 26. Andre alternativer for å blokkere aktiveringen av motoneurons er d-tubocurarine og α-bungarotoxin men i motsetning Tricaine, disse forbindelsene er ikke hud-gjennomtrengelig og må injiseres direkte inn i hodet, ryggmargen, eller hjerte 27. Individuelle etterforskere må vurdere hvorvidt Tricaine er ønskelig for deres spesifikke applikasjonen. Hvis Tricaine er inkludert i testløsning, bør konsentrasjonen være konsekvent mellom eksperimenter og forskere burde verifisere at effekten av den Tricaine ikke varierer mellom eksperimentelle grupper.
Vi beskriver denne metoden for larvene så unge som tre DPF og like gammel som 7 DPF. Selv muskelfibre synes å være functional så tidlig som 17 timer etter befruktning, når spontane halebevegelser begynner 27, den korte lengden på halen før tre DPF hindrer knytte larven til testing av utstyr. Vi vanligvis ikke teste larve etter 7 DPF siden mange sykdom modeller ikke overleve mye lenger enn denne gangen. Ved testing av larver utover 5 dpf, bør larvene bli matet. Vi har observert at unfed larvene har mindre muskler og genererer mindre maksimal rykk kraft enn matet larver, sannsynligvis på grunn av den synkende plommesekken. Således kan det være ønskelig å teste larver mellom 3-5 dpf, for å unngå den ekstra variable av ytre foring.
Oppsummert beskriver vi en kvantitativ og pålitelig metode for å måle kraft generering i løpet av en maksimal rykk sammentrekning av zebrafisk larve stammen muskel. Denne metoden kan brukes til å vurdere den generelle helsen til sebrafisk larve muskel og spesifikt gir informasjon om muskel funksjon. I tillegg til å gi informasjon omStørrelsen av kraften generasjon, kan denne teknikken brukt for å studere kinetikken til kraft generasjon eller være tilpasset for å studere muskeltretthet 22.. Selv om vi beskriver denne teknikk for bruk med villtype larver, kan denne metoden anvendes for genetisk modifisert for larver eller larver behandlet med medikamenter eller giftstoffer, for å karakterisere muskel sykdomsmodeller og evaluere behandlinger, eller for å studere muskel-utvikling, muskelskade eller muskel-relaterte kjemisk giftighet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Angela Busta for å få hjelp med sebrafisk dyrehold. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (AG-020591 til SVB og 1K08AR054835 til JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |