Medições da força pode ser usada para demonstrar as alterações na função muscular, devido ao desenvolvimento, lesões, doença, o tratamento ou a toxicidade química. Neste vídeo, demonstramos um método para medir a força durante uma contração máxima de zebrafish músculos do tronco larval.
Larvas do peixe fornecer modelos de desenvolvimento muscular, doença muscular e toxicidade química músculo-relacionados, mas os estudos relacionados muitas vezes a falta de medidas funcionais de saúde muscular. Neste artigo, vídeo, demonstramos um método para medir a geração de força durante a contração dos músculos do tronco de zebrafish larval. Força medições são realizadas por uma larva de anestesiados colocando dentro de uma câmara cheia com uma solução salina. A extremidade anterior da larva é ligada a um transdutor de força e a extremidade posterior da larva está ligada a um controlador de comprimento. Uma contração contração isométrica é provocada por estimulação do campo elétrico ea resposta vigor é gravado para análise. A geração de força durante a contracção proporciona uma medida da saúde em geral e, especificamente, do músculo, dá uma medida da função do músculo. Embora nós descrevemos esta técnica para uso com larvas de tipo selvagem, este método pode ser usado com larvas geneticamente modificado ou com larvas tratadas com drogas ou substâncias tóxicas,para caracterizar modelos de doenças musculares e avaliar tratamentos, ou para estudar o desenvolvimento muscular, lesão ou toxicidade química.
Larvas de peixe-zebra mulher (Danio rerio), 3-7 dias pós-fertilização (dpf), estão cada vez mais reconhecido como um organismo útil para a pesquisa do músculo esquelético. Larvas jovens são usados para modelar doenças músculo humano 1-9, avaliação de medicamentos e estratégias terapêuticas 10-11, estudo de lesão muscular 12, compreender desenvolvimento muscular 13-16, e investigar a toxicidade química muscular relacionada com 17-19. Estudos típicos nessas áreas examinar o grau a que o músculo saudável é processado por manipulação genética anormal ou a exposição a produtos tóxicos, e alguns estudos examinar o grau a que muscular anormal responde ao tratamento. Fundamental para o sucesso destes estudos é a capacidade de avaliar com precisão a saúde muscular.
Embora haja uma variedade de métodos disponíveis para avaliar a saúde muscular em larvas de peixe-zebra, poucos fornecem informação directa sobre a função muscular. Saúde muscular é geralmente avaliada por apariçõE, tal como avaliado por coloração histológica 6,8,11, imunocoloração 9,15,16,18, 3,13 microscopia de luz, microscopia electrónica 3,4,14,16, ou birrefringência 7,9,11, mas estas técnicas proporcionam informação morfológica só. Tronco e deslocamentos cauda e natação Velocidade 4,17 avaliar a função motora, mas estas não são medidas diretas da função muscular, uma vez que também refletem input neural, no metabolismo energético, e outros processos.
Em contraste, medindo a geração de força durante a contração fornece uma avaliação direta da função muscular e representa uma medida de saúde geral muscular. Adicionado benefícios dessa abordagem incluem a análise de dados simples e resultados quantitativos. Neste artigo de vídeo, nós fornecemos um procedimento detalhado para medir a geração de força pelos músculos das larvas, na esperança de que mais pesquisadores vão usar esse método para complementar as medidas existentes de saúde muscular em suas pesquisas.
<pclass = "jove_content"> O objetivo geral deste método é medir a geração de força durante a contração dos músculos do tronco zebrafish larval. Para alcançar este objetivo, uma larva do peixe-zebra é anestesiado e colocado dentro de uma câmara cheia com uma solução salina. A extremidade anterior da larva é ligada a um transdutor de força e a extremidade posterior da larva está ligada a um controlador de comprimento. Activação do músculo é conseguido por estimulação do campo eléctrico, e a corrente de estimulação e a duração da larva são ajustadas para produzir a força máxima de contração. Uma contração contração isométrica é provocada ea resposta vigor é gravado para análise.Para ser claro, esta técnica não mede forças geradas pelos músculos das larvas durante a natação. Como ambas as extremidades da larva estão ligados ao equipamento e devido à permanência da larva anestesiado, não pode iniciar o movimento durante o ensaio. Além disso, a estimulação do campo activa todas as fibras musculares ao mesmo tempo, para induzir uma bilateral contracção, o que não é o que ocorre naturalmente 20. Portanto, em vez de medir forças reais gerados durante a natação, esta técnica determina a capacidade de geração de força dos músculos das larvas.
Usámos esta técnica para demonstrar a fraqueza muscular em um modelo de peixe-zebra de nemalínica miopatia 21, assim como para avaliar o efeito do tratamento antioxidante em função muscular em peixes-zebra de um modelo de doença multi-minifocos 22. Outros usaram uma técnica semelhante 23 para examinar os efeitos de um poluente ambiental em função do músculo 19.
Este método mede a geração de força durante uma contração muscular para avaliar a função muscular em músculos do tronco de larvas de peixe-zebra. Embora as contracções tetânica pode ser atingida em larvas do peixe (por exemplo, através de estimulação de 200 pulsos / seg para uma duração de 0,2 segundos), a força máxima tetânica é só 10-15% maior do que a força máxima de contração. Portanto, a força gerada durante um tique é uma medida razoável da capacidade de geração de força. Twitches têm preferência sobre contrações tetânicas porque contracções são menos propensos a causar rasgar ou escorregar na sutura laços.
A fim de gerar dados significativos com esta técnica, a força máxima de contração deve ser conseguida para cada larva e a variabilidade entre os grupos experimentais, deve ser minimizado. Com esses objetivos em mente, oferecemos as seguintes sugestões. Primeiro, tome cuidado ao amarrar a larva do transdutor de força e os tubos de controlador de comprimento. Se os lacetes de suturas são apertadas demaisem muito, a sutura vai cortar através do tecido muscular. Se os lacetes de sutura não são suficientemente apertada, a força gerada pela larva não será totalmente transmitida ao transdutor de força. Ambas as situações, mas especialmente o último, subestimar a força máxima contração muscular. Em segundo lugar, uma vez testando vários grupos experimentais, pode levar várias horas (20-30 min / larva), alternam entre os dois grupos, pois as larvas continuarão a desenvolver-se durante o período de testes.
Enquanto alguns dos equipamentos mencionados é essencial para a medição da força máxima contração muscular (por exemplo, transdutor de força, estimulador de corrente), outros itens não são absolutamente necessárias. O sistema de comprimento de sarcômero vídeo é desejável, mas não é obrigatório. Como uma alternativa, uma série de contracções podem ser usados para encontrar a duração óptima, durante o qual o comprimento da larva é ajustado até a força de contração máxima é alcançada. Um sistema de controlo de temperatura também não é absolutamente necessário. O controle de temperatura é crítico quando measuring cinética contração, que são altamente sensíveis à temperatura, ainda que a força máxima de contração não é particularmente sensível a pequenas mudanças na temperatura e pode ser medida à temperatura ambiente. Note-se que, independentemente da temperatura na câmara de força durante os testes, as larvas devem ser mantidas à temperatura óptima de crescimento de 28,5 ° C, 24, antes de forçar o teste para teste preciso.
As larvas são testados numa solução de Tyrodes contendo tricaina. Usamos 0,02% (w / v) tricaina, a concentração recomendada para a anestesia 24, para eliminar as contracções espontâneas evocadas pelo sistema nervoso e, assim, prevenir a fadiga durante o teste de força. Tricaina também facilita o tie-on passo e reduz tempo de teste em geral. No entanto, observa-se que a inclusão tricaina na solução de teste consistente reduz a força de contração máxima de aproximadamente 30%. Um efeito similar foi também observado em músculo da cauda de girino, onde tricaine reduziu a geração de força após a transmissão neuromuscular foi bloqueado, o que sugere que tricaina tem um efeito direto no músculo 25. Tricaina pode reduzir a excitabilidade das células do músculo, reduzindo a condutância de sódio através da membrana celular, tal como faz em células nervosas 26. Outras opções para bloquear a ativação de neurônios motores são d-tubocurarina e α-bungarotoxina mas, ao contrário tricaina, estes compostos não são pele permeável e deve ser injetado diretamente na cabeça, medula espinhal, ou o coração 27. Pesquisadores individuais terão de avaliar se deve ou não tricaina é desejável para a sua aplicação específica. Se tricaina está incluído na solução de teste, a concentração deve ser consistente entre as experiências e os investigadores devem verificar se o efeito do tricaina não variar entre os grupos experimentais.
Descrevemos este método para as larvas jovens como 3 dpf e tão antiga quanto 7 dpf. Apesar das fibras musculares parece ser functional tão cedo quanto 17 horas após a fecundação, quando os movimentos da cauda espontâneas começam 27, o curto comprimento da cauda antes de 3 de dpf dificulta amarrar a larva para o equipamento de teste. Nós normalmente não testam larva após 7 dpf uma vez que muitos modelos de doenças não sobrevivem muito mais do que este tempo. Se o teste de larvas para além de 5 dpf, as larvas devem ser alimentados. Temos observado que as larvas não alimentadas têm músculos menores e gerar menos força máxima contração de larvas alimentadas, provavelmente devido à diminuição saco vitelino. Assim, pode ser desejável testar larvas entre 3-5 dpf, para evitar a variável adicional de alimentação externa.
Em resumo, nós descrevemos um método quantitativo e confiável para medir a geração de força durante uma contração contração máxima dos músculos do tronco zebrafish larval. Este método pode ser utilizado para avaliar a saúde geral do músculo larvas do peixe-zebra e, especificamente, proporciona informação sobre a função muscular. Além de fornecer informações sobre omagnitude da geração de força, esta técnica pode ser utilizada para estudar a cinética de geração de força ou ser adaptado para estudar a fadiga muscular 22. Embora nós descrevemos esta técnica para uso com larvas de tipo selvagem, este método pode ser utilizado para as larvas geneticamente modificados ou para as larvas tratadas com drogas ou de substâncias tóxicas, para caracterizar modelos de doenças musculares e avaliação de tratamentos, ou para estudar o desenvolvimento muscular, a lesão muscular, ou toxicidade química muscular relacionada.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem Angela Busta para a assistência com criação de peixes-zebra. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (AG-020591 a SVB e 1K08AR054835 a JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |