Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.
Larvas de pez cebra proporcionar modelos de desarrollo muscular, enfermedades musculares y los músculos relacionados con la toxicidad química, pero los estudios relacionados a menudo carecen de las medidas funcionales de la salud muscular. En este artículo de vídeo, se demuestra un método para medir la generación de la fuerza durante la contracción de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Mediciones de la fuerza se llevan a cabo mediante la colocación de una larva anestesiados en una cámara llena con una solución de sal. El extremo anterior de la larva está ligado a un transductor de fuerza y el extremo posterior de la larva está ligado a un controlador de longitud. Una contracción contracción isométrica se provoca por la estimulación de campo eléctrico y la fuerza de respuesta se registra para el análisis. Generación de la fuerza durante la contracción proporciona una medida de la salud muscular general y establece específicamente una medida de la función muscular. Aunque se describe esta técnica para su uso con larvas de tipo salvaje, este método se puede utilizar con larvas modificado genéticamente o con larvas tratadas con los medicamentos o las sustancias tóxicas,para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar tratamientos, o para estudiar el desarrollo muscular, lesión o toxicidad química.
Joven pez cebra (Danio rerio) larvas, 3-7 días después de la fertilización (dpf), se reconoce cada vez más como un organismo útil para la investigación del músculo esquelético. Las larvas jóvenes se utilizan para modelar la enfermedad del músculo humano 1-9, evaluar medicamentos y estrategias terapéuticas 10-11, estudio lesión muscular 12, entender el desarrollo muscular 13-16, e investigar muscular relacionada con la toxicidad química 17-19. Los estudios típicos en estas áreas examinar el grado en el que el músculo sano se representa anormal por manipulación genética o la exposición a sustancias tóxicas, y algunos estudios examinan el grado en el cual el músculo anormal responde al tratamiento. Crítico para el éxito de estos estudios es la capacidad para evaluar con precisión la salud del músculo.
Mientras que hay una variedad de métodos disponibles para evaluar la salud del músculo en larvas de pez cebra, pocos proporcionan información directa sobre la función muscular. Salud muscular generalmente es evaluada por appearance, según la evaluación de la tinción histológica 6,8,11, inmunotinción 9,15,16,18, microscopio óptico 3,13, microscopía electrónica 3,4,14,16 o birrefringencia 7,9,11, pero estas técnicas proporcionan información morfológica solamente. Tronco y desplazamientos cola y velocidad de nado 4,17 evaluar la función motora, pero éstas no son medidas directas de la función muscular, ya que también reflejan la entrada de los nervios, el metabolismo energético, y otros procesos.
En contraste, la medición de generación de la fuerza durante la contracción proporciona una evaluación directa de la función muscular y representa una medida de la salud del músculo general. Los beneficios adicionales de este enfoque incluyen el análisis de datos sencilla y los resultados cuantitativos. En este artículo de vídeo, se proporciona un procedimiento detallado para medir la generación de fuerza por parte de los músculos de las larvas, con la esperanza de que más investigadores utilizarán este método para complementar las medidas existentes de salud del músculo en sus investigaciones.
<pclass = "jove_content"> El objetivo general de este método es medir la generación de fuerza durante la contracción de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Para lograr este objetivo, una larva de pez cebra se anestesia y se colocaron en una cámara llena con una solución de sal. El extremo anterior de la larva está ligado a un transductor de fuerza y el extremo posterior de la larva está ligado a un controlador de longitud. La activación del músculo se logra por la estimulación de campo eléctrico, y la corriente de estimulación y la longitud de la larva se ajusta para producir la máxima fuerza de contracción. Una contracción contracción isométrica y se provoca la respuesta de la fuerza se registra para el análisis.Para que quede claro, esta técnica no mide las fuerzas generadas por los músculos de larvas durante la natación. Debido a que ambos extremos de la larva se atan a los equipos y porque la larva permanece anestesiado, que no pueden iniciar el movimiento durante la prueba. Por otra parte, la estimulación de campo se activa todas las fibras musculares al mismo tiempo para inducir una BILcontracción ateral, que no es lo que naturalmente se produce 20. Por lo tanto, en lugar de medir las fuerzas reales generados durante la natación, esta técnica determina la capacidad de generación de la fuerza de los músculos de las larvas.
Hemos usado esta técnica para demostrar la debilidad muscular en un modelo de pez cebra de nemalínica miopatía 21, así como para evaluar el efecto del tratamiento antioxidante sobre la función muscular en un modelo de pez cebra de la enfermedad de múltiples MiniCore 22. Otros han utilizado una técnica similar 23 para examinar los efectos de un contaminante del medio ambiente sobre la función muscular 19.
Este método mide la generación de fuerza durante una contracción para evaluar la función muscular en los músculos del tronco de larvas de pez cebra. Aunque las contracciones tetánicas pueden ser provocados en larvas de pez cebra (por ejemplo, por 200 pulsos de estimulación / seg para una duración de 0,2 segundos), la fuerza tetánica máxima es sólo un 10-15% mayor que la fuerza máxima de contracción. Por lo tanto, la fuerza generada durante un tic es una medida razonable de la capacidad de generación de fuerza. Twitches se prefieren sobre las contracciones tetánicas debido a contracciones nerviosas son menos propensos a causar que rasga o se deslice en los lazos de sutura.
Con el fin de generar datos significativos con esta técnica, la máxima fuerza de contracción se debe lograr para cada larva y la variabilidad entre los grupos experimentales debe reducirse al mínimo. Con estos objetivos en mente, ofrecemos las siguientes sugerencias. En primer lugar, tenga cuidado al atar la larva al transductor de fuerza y los tubos del regulador de longitud. Si los bucles de sutura se aprietan demasiadomucho, la sutura se corte a través del tejido muscular. Si los bucles de sutura no se aprietan lo suficiente, la fuerza generada por la larva no será totalmente transmitido al transductor de fuerza. Ambas situaciones, pero sobre todo este último, subestiman la fuerza máxima de contracción. En segundo lugar, dado que las pruebas múltiples grupos experimentales pueden tardar varias horas (20-30 min / larva), alternan entre grupos porque las larvas continuará desarrollando durante el periodo de prueba.
Mientras que algunos de los equipos mencionados es esencial para la medición de la fuerza máxima de contracción (por ejemplo, transductor de fuerza, estimulador de corriente), otros artículos no son absolutamente necesarias. El sistema de la longitud del sarcómero vídeo es deseable, pero no necesario. Como una alternativa, una serie de contracciones nerviosas se puede utilizar para encontrar la longitud óptima, durante el cual la longitud de la larva se ajusta hasta que se consigue la máxima fuerza de contracción. Un sistema de control de la temperatura también no es absolutamente necesario. El control de temperatura es crítico cuando measuring cinética de contracción, que son altamente sensibles a la temperatura, mientras que la máxima fuerza de contracción no es particularmente sensible a pequeños cambios en la temperatura y se puede medir a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que, independientemente de la temperatura en la cámara durante la prueba de fuerza, las larvas debe mantenerse a la temperatura óptima de crecimiento de 28,5 ° C 24 antes de forzar a las pruebas para la estadificación precisa.
Las larvas se ponen a prueba en una solución que contiene Tyrodes tricaína. Utilizamos 0,02% (w / v) tricaína, la concentración recomendada para la anestesia 24, para eliminar las contracciones espontáneas evocadas por el sistema nervioso y por lo tanto prevenir la fatiga durante las pruebas de fuerza. Tricaína también facilita el paso para atar y reduce el tiempo total de prueba. Sin embargo, se observa que la inclusión de tricaína en la solución de prueba se reduce constantemente la fuerza máxima de contracción en un 30%. Un efecto similar se ha observado también en el músculo cola de renacuajo, donde tricaine reduce la generación de fuerza después de que se bloquea la transmisión neuromuscular, lo que sugiere que tricaína tiene un efecto directo sobre el músculo 25. Tricaína puede reducir la excitabilidad de las células musculares mediante la reducción de la conductancia de sodio a través de la membrana de la célula, como lo hace en las células nerviosas 26. Otras opciones para el bloqueo de la activación de las neuronas motoras son d-tubocurarina y α-bungarotoxina pero, a diferencia de tricaína, estos compuestos no son la piel permeable y deben ser inyectados directamente en la cabeza, la médula espinal, o del corazón 27. Investigadores individuales tendrán que evaluar si tricaína es conveniente para su aplicación específica. Si tricaína se incluye en la solución de prueba, la concentración debe ser consistente entre los experimentos y los investigadores deben verificar que el efecto de la tricaína no varía entre los grupos experimentales.
Se describe este método para las larvas de tan sólo 3 dpf y tan viejo como 7 dpf. Aunque las fibras musculares parecen ser functional tan pronto como 17 horas después de la fertilización, cuando los movimientos espontáneos comienzan cola 27, la corta longitud de la cola antes de 3 dpf impide atar la larva para el equipo de prueba. Por lo general no probamos larva después de 7 dpf ya que muchos modelos de enfermedad no sobreviven mucho más tiempo esta vez. Si las pruebas larvas allá 5 dpf, las larvas deben ser alimentados. Hemos observado que las larvas sin alimentar tienen los músculos más pequeños y genera menos fuerza máxima de contracción de las larvas alimentadas, probablemente debido a la disminución de saco vitelino. Por lo tanto, puede ser deseable para probar las larvas entre 3-5 dpf, para evitar la variable adicional de alimentación externa.
En resumen, se describe un método cuantitativo y fiable para medir la generación de la fuerza durante una contracción contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Este método se puede utilizar para evaluar la salud general de los músculos de larvas de pez cebra y proporciona específicamente información sobre la función muscular. Además de proporcionar información acerca de lamagnitud de generación de la fuerza, esta técnica se puede utilizar para estudiar la cinética de generación de la fuerza o ser adaptado para estudiar la fatiga muscular 22. Aunque se describe esta técnica para su uso con larvas de tipo salvaje, este método se puede utilizar para las larvas modificado genéticamente o para larvas tratadas con los medicamentos o las sustancias tóxicas, para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar los tratamientos, o para estudiar el desarrollo muscular, lesión muscular, o muscular relacionada con la toxicidad química.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Angela Busta para obtener ayuda con la cría de pez cebra. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (AG-020591 de SVB y 1K08AR054835 a JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |