Summary
Differential sperm konkurranseevne blant
Abstract
Konkurransen blant conspecific menn for gjødsling ova er en av mekanismene for seksuell seleksjon, det vil si utvalg som opererer på å maksimere antall vellykkede parring hendelser snarere enn på å maksimere overlevelse og levedyktighet en. Spermolje konkurranse representerer konkurransen mellom hanner etter copulating med de samme to hunn, hvor deres spermier er tilfeldig i tid og rom. Dette fenomenet har blitt rapportert i flere arter av planter og dyr 3. For eksempel, villfanget D. melanogaster kvinner vanligvis inneholde sædceller 2-3 hanner fire. Sæden lagres i spesialiserte organer med begrenset lagringskapasitet, noe som kan føre til direkte konkurranse av sperm fra forskjellige menn 2,5.
Sammenligning av sperm konkurranseevne forskjellige hanner av interesse (eksperimentelle mannlige typer) er utført gjennom kontrollert dobbelt-parring experiments i laboratoriet 6,7. Kort fortalt er en singel kvinne utsatt for to forskjellige menn etter hverandre, en eksperimentell mannlige og en cross-parring referansen hann. Det samme parring ordningen blir så fulgt ved hjelp av andre eksperimentelle mannlige typer derved letter indirekte sammenligning av konkurranseevne sperm sine gjennom en felles referanse. Fraksjonen av individer far av de eksperimentelle og referanse menn er identifisert ved hjelp av markører, noe som tillater en å anslå sperm konkurranseevne ved hjelp av enkle matematiske uttrykk 7,8. I tillegg kan sperm konkurranseevne anslås i to forskjellige scenarier avhengig av om den eksperimentelle mann er andre eller første til å mate (angrep og forsvar analysen, henholdsvis) 9, som antas å være representative for ulike kompetanse attributter.
Her beskriver vi en tilnærming som bidrar til å avhøre den rollen ulike genetiske faktorer som putatively ligger til grunn than fenomenet sperm konkurransekraft i D. melanogaster.
Introduction
Siden Geoff Parker bemerket utbredelsen av sperm konkurranse i insekter og dets evolusjonære konsekvenser to, har en bølge av studier i Drosophila og andre arter forsøkt å kaste lys over dette fenomenet på mange ulike nivåer. Noen eksempler på områder av interesse har vært kartlegging av variasjonen sin i naturlige populasjoner 9,10, dens genetiske arkitektur og relevansen av underliggende genetiske faktorer 11-14, og dens rolle i å drive coevolution mellom kjønnene 15,16. I D. melanogaster kvinner, den begrensede kapasiteten til de spesialiserte sperm-lagring organer, et par spermatheca og banebrytende mottaket 6,17, bidrar til konkurransen av sperm fra forskjellige menn. Omtrent 1500 sperm overføres under paring til den kvinnelige, men bare ~ 500 kan bli innkvartert i de nevnte organer 18,19. I laboratoriet, kontrollert dobbelt-parring erfaringmenter som involverer en referanse mannlig og en eller flere hanner av interesse har vært mye brukt for å vurdere sperm konkurransekraft 7,8.
Sperm konkurranseevne beregnes som andel av avkom avlet av den eksperimentelle mann i dobbel-parring eksperimenter over total avkom, det vil si at fra både eksperimentelle og referanse hanner. Spermolje konkurranseevne består av to komponenter, hver av dem undersøkt i en separat analyse. I handling assay, evnen av den eksperimentelle mannlige sæd for å fortrenge spermier fra det første male, dvs. referansen hann, blir evaluert. Omvendt, i forsvaret analysen, til evnen hos den eksperimentelle mannlige sæd motstå forskyvning, eller for å redusere befruktning suksess av referansen mannlige sæd blir evaluert. Avhengig av hvilken type analyse, forsvar eller krenkelser, er sperm konkurransekraft anslått gjennom resultatet P 1 eller 2 P, henholdsvis. P1 og P 2 kan bare ta verdier mellom 0 og 1. Mellomliggende verdier er vanligvis tolkes som indirekte bevis på sperm miksing, noe som antyder en fysiologisk scenario som involverer direkte sperm konkurranse. Etter samme begrunnelsen, kan ekstreme verdier tolkes som bevis for sterk differensial sperm konkurranseevne. Tidlige studier viste at P 2 i D. melanogaster er over 0,8 øker ettersom tiden har gått mellom de to parringer forlenger 7. Denne samme eksperimentell design har vært brukt i andre Drosophila arter, P 2 er den vanlige statistikken i studier for å evaluere sperm konkurransekraft 20. For de fleste arter, er P to verdier av påkjenningen testet høyere enn 0,6 21. Likevel kan flere andre mekanismer som ikke er relatert til direkte konkurranse mellom sperm forskjellige hanner gi identiske score (se diskusjon).
Distinguishing avkom sired av den første eller andre hanner er mulig ved bruk av lett identifiserbare markører. I tidlige studier, ble en av hannene bestrålt ved sublethal doser, for eksempel røntgen slik at nesten all ova befruktet av bestrålt sperm ikke klarte å klekke 7. Senere har mutasjoner forandre øye pigmentering eller vingeformen vært de mest brukte markører. Eksempler på det tidligere er mutasjoner kroppsvekt (brun) 9, cn (sinober) 22 og w (hvit) 23, mens mutasjon Cy (Curly) 24 tilsvarer den andre typen fenotyper, og noen av disse mutasjonene har blitt kombinert i samme individ, for eksempel cn kroppsvekt. I mindre grad har allozymes 25 og mikrosatellitter 26,27 med kjente arv mønstre også blitt brukt.
Den eksperimentelle design for å teste for forskjeller isperm konkurranseevne beskrevet her følger i hovedsak at av Clark et al. 9. Resultatene stammer fra disse eksperimentene gi opplysninger utelukkende om differensial farskap av de eksperimentelle mannlige typer som granskes. Analyser som også ta høyde for post-befruktning forskjeller i fitness 14,28 og sperm visualiseringsteknikker 24 aktiver forskjeller i P 1 (eller P 2) score for å tolkes som forskjeller i sperm kompetanse.
Figur 1 skisserer begrunnelsen for både krenkelser og forsvaret analyser. For å illustrere logistikken av prosessen, gjennomførte et lovbrudd eksperiment i D. melanogaster 14 vil bli forklart i detalj. Dette bestemte lovbruddet analysen ble brukt til å teste for en målbar effekt av multigene familien Sperm-spesifikk dynein mellomliggende kjeden (Sdic) på sperm konkurranseevne. All medlems av denne multigene familien bor i tandem på X-kromosomet. Knockout hanner ble generert ved å slette Sdic klyngen. Fordi slettet segmentet også inkludert de essensielle genet kort fløyen (SW) og formålet med undersøkelsen var å vurdere relevansen av Sdic, ble menn som bærer Sdic-sw sletting reddet av en transgen kopi av sw (symbolisert som P {sw} , som også bar en mini-hvit reportergen) på kromosom 2. Øye farge ble brukt som en synlig markør for paternity identifikasjon. Alle fluene var i en hvit bakgrunn mutant med unntak av de fra belastningen Oregon-R, som ble anvendt som referanse hanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Småskalaforsøk bør utføres for å bli kjent med hele prosedyren.
En. Samle Virgin Kvinner og naiv Hanner
Den enkleste versjonen av den skisserte eksperimentet består av fire typer innledende kors, som innebærer følgende kombinasjon av voksne: a) w 1118 enkeltpersoner for å samle jomfruelige kvinner, b) Oregon-R enkeltpersoner for å samle naive referanse menn, c ) P {sw} homozygote menn og jomfruelige kvinner fra en kontroll linje som bærer vill-type organisering av Sdic for å samle naive eksperimentelle menn (Type I), og d) P {sw} homozygote menn og Sdic-sw-sletting -bærer jomfruelige kvinner for å samle naive eksperimentelle menn som bærer Sdic-sw-mangel (Type II).
- Sett opp flere hetteglass som inneholder 8-10 kvinner og fem menn hver. Tillate kvinner å leggeegg og overføre de voksne til nye ampuller hver 3-5 dager. Bruk flasker i stedet hetteglass om nødvendig, og alltid bruke fersk mat. Antallet hetteglass som kreves vil avhenge av antall eksperimentelle mannlige typer som undersøkes, og det antall individer anslått til å være nødvendig for å detektere forskjeller (tabell 1). Mer enn 10 kvinner per hetteglass kan føre til over-trengsel under larvenes vekst, noe som kan gi variasjoner i fruktbarheten i avkom. Oppbevar hetteglass på 25 ° C i et temperert kammer.
- Begynne å samle jomfruelige kvinner og naive menn på dager 11. og 12. etter å ha satt opp de første kors. Ventetiden varierer med temperatur, lavere temperaturer fører til lengre utviklingsmessig tid forsinke samling av individer. En annen faktor som påvirker timing til eklosjonshormon er den type medium. Næringsrik mat, som for eksempel cornmeal-gjær medium 29, sikrer god utvikling av den voksnereproduktive system, noe som letter parring. Samle unmated flyr hver 4-6 time. Ved innsamling, anesthetize fluer ved å innføre CO 2 inn i hetteglasset, trykk fluene ned, og sex dem under stereomikroskop (figur 2). Plasser de ønskede fluer i forskjellige ampuller etter kjønn og fenotype og merke flaskene riktig måte.
Note 1. Samling rutine starter i morgen ved å forkaste de voksne som fremkom under forrige natt. Samle jomfruelige kvinner og naive menn en eller to ganger i løpet av dagen. Vanligvis D. melanogaster hanner blir kjønnsmodne 8 time etter eklosjonshormon ved 25 ° C 30. Hvis fluene blir forvaltet under 12:12 hr lys / mørke sykluser, er to toppene i eklosjonshormon forventet: i løpet av første 1-2 timer etter at lyset er slått på, og i løpet av to timer før lyset er slått av. Eclosion skjer innen 24 timer etter puppe dempes.
Note 2. Ikke mer enn 10 kvinner shOuld bli satt i samme hetteglass for å unngå over-crowding. Dette begrenser også tap av kvinner i tilfelle de må kasseres fordi minst en av dem er ikke jomfru.
Note 3. For å samle inn riktig antall jomfruelige kvinner og naive menn i en kort tidsperiode, kan følgende tiltak vedtas. Sett opp 15-20 ampuller med w 1118 for forsøk med to typer eksperimentelle menn (tabell 1). Lett dryss overflaten av media og legge noen tørkede aktive gjær pellets til rette oviposition. Overfør foreldre minst fire ganger på påfølgende dager. For å øke tilgjengelig overflate for pupation i hvert hetteglass, setter multi-brettet papir (7 x 5 cm) i løpet av 4. eller 5. dag etter at foreldrene blir overført til et annet hetteglass (figur 3). Hvis antallet dukket voksne fra den første korsene er ikke nok, vent noen dager og samle individerals fra ampuller satt opp på forskjellige datoer. Planlegg å utføre eksperimenter over flere etterfølgende dager for å jevne ut arbeidsmengden.
2. Double-parring Experiments
Figur 4 viser de viktigste trinnene involvert i dobbel-parring eksperimenter utført i 14.
- På morgenen dag 1, satt opp den første parring. De Oregon-R hanner er de første til å pare seg i krenkelser analysen.
- Ved hjelp av vifte, sette opp hetteglass som inneholder 4 til 5 oktober-dag-gamle white-eyed w 1118 jomfruelige kvinner og 10 rød-eyed Oregon-R naive menn hver. To til tre ampuller er satt opp daglig i fem påfølgende dager. Antallet av hetteglass som skal settes opp kan variere avhengig av antall tilgjengelige individer. La fluene å pare for to hr.
- Forkast Oregon-R hanner og plassere hvert dyr i en ny beholder ved hjelp av en aspirator (figur 5). Sex identifikasjon kan oppnås ved visuell inspeksjon av noenmorfologiske forskjeller (figur 2). Merke hvert hetteglass hensiktsmessig og la den kvinnelige i hetteglass i 2 dager (heretter "v1").
- På dag tre, sette opp andre parring. Valg av hanner og kryss satt opp skal utføres ved tilfeldig for å minimalisere eventuelle skjevhet mot hvilken som helst av de eksperimentelle mannlige typer.
- To timer før lyset er slått av, overføre igjen den kvinnelige til et nytt hetteglass med en vifte. Etiketten den nye ampulle hensiktsmessig (heretter "V2").
- Innføre tre 5-6-dagers-gamle eksperimentelle hanner av samme genotype inn v2.
- Gjenta 2.2.1 og 2.2.2 for hvert dyr.
- På dag 4 er to timer rett før lyset slått på (dvs. ikke mer enn 12 timer etter 2.2.1), forkaste hanner ved hjelp av vifte.
- På dag 6, overføre hvert dyr på nytt inn i en annen ny ampulle. Merke nye pakningene riktig (heretter "v3").
- På dag 10, forkaste w 1118
- Undersøke progenies i v2 og v3. Den første inspeksjonen utføres etter 13-15 dager etter den kvinnelige er innført i v2 (eller v3), f.eks på dag 17 etter den kvinnelige første gang ovipositing i v2. Den andre kontrollen utføres nøyaktig etter 17 dager. Denne tidsrammen utgjør en sikker øvre tidsmessig grense som garanterer ingen andre generasjon i samme hetteglass. To inspeksjoner hindre over-crowding mens tilrettelegging avkom telling.
- På dag 17, inspisere v1 og sikre at det er rød-eyed avkom til stede, hvis ikke markere hetteglass tilsvarende. Tilstedeværelse av hvite øyne avkom indikerer at hunn var ikke jomfru ved tidspunktet for innledende mating, mens ingen avkom indikerer at parring med referanse eller de eksperimentelle hanner inntraff ikke.
- På dag 17, utføre den første inspeksjon av v2. Anesthetize dukket avkom i v2 med CO 2 og sortere dem etter øyenfarge og kjønn. Record avkom tall far av den første og sekond menn. Figur 6 viser de forventede fenotyper i avkom av hver parring ordningen. I dette spesielle eksperiment 14, kan bare kvinnelig avkom være entydig tilordnet som avlet ved referanse eller de eksperimentelle hanner og derfor bare informasjonen fra døtre kan brukes til å beregne P 2. Hvis med andre markører farskap av mannlig avkom kan være entydig tilordnet, kan avkom tellinger av begge kjønn skal brukes i nedstrøms beregninger. Kast avkom, men beholde v2 for andre inspeksjon.
- På dag 20, fortsett som i 2.5.2 med den nylig dukket opp avkom i v2 og kast hetteglasset.
- På dag 20, inspisere dukket avkom i v3 for første gang og følge trinn 2.5.2.
- På dag 23, fortsett som i 2.5.3 med den nylig dukket opp avkom i v3.
Merknad 1: På grunn av den potensielle blåse effekt på P score som flere parring kan ha (2.2.2 og 2.2.3), parringkan være begrenset til en spesiell tidsramme. Tidsrommet avhenger av remating frekvens forbundet med genotypen av den kvinnelige og hanner benyttes. Sannsynligheten for flere parring er spesielt redusert i løpet av natten 11.
Note 2: Ikke legg levende gjær pellets fordi dette kan føre til problemer på grunn av potensiell overvekst av gjær når antall voksne fluer er lav.
3. Data Analysis
- Registrert avkom teller bør organiseres hensiktsmessig for enkel visuell inspeksjon og effektiv analyse med en egnet statistisk pakke (f.eks JMP fra SAS Institute) eller gratis web-baserte verktøy (f.eks http://vassarstats.net/ ).
- Sperm konkurranseevne. Legg teller fra v2 og v3. Kvinnelige fluer som har gitt opphav til svært begrensede eller ingen avkom (f.eks <10), døde under inngrepet, eller var bare hell inseminated ved en av de to hanner anses som ikke-informative og er ekskludert fra en hvilken som helst nedstrøms statistisk analyse (2.5.1 og tabell 2). Beregn P 2 poeng for hver informativ kvinnelige.
- Teste om det er statistisk signifikante forskjeller i P 2 verdier blant de eksperimentelle menn enn. Dette kan gjøres ved hjelp av parametriske (f.eks Tukey sin HSD) eller ikke-parametriske (f.eks Steel-Dwass) tester avhengig av flere faktorer, inkludert skjevhet i fordelingen av P 2 verdier og avhengigheten mellom varians og middelverdi. Vinkelhastigheten transformasjonen blir vanligvis brukt til proporsjoner som P 2 før anvendelsen av parametriske tester 31.
- Parring rente forskjeller (valgfritt). For hver eksperimentell mannlig type, beregne antall dobbelt parret kvinner og de som bare parret med den første mannlige (referansen mann i lovbruddet analysen og den eksperimentelle mann i defense analyse). Ved hjelp av en tosidig Fishers eksakte test (tilgjengelig på http://www.langsrud.com/fisher.htm ), avgjøre om det er statistisk signifikante forskjeller mellom de to typer eksperimentelle menn.
- Sex ratio (valgfritt). For hver eksperimentell male, bruke chi-kvadrat test for å fastslå om kjønnsfordelingen i avkom fra hver kvinnelige avviker fra den forventede 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 2 oppsummerer noen fremtredende trekk ved to krenkelser eksperimenter (Analyser 1 og 2) i hvilken D. melanogaster eksperimentelle hanner med og uten (type I og II, henholdsvis) et funksjonelt Sdic klynge sammenlignes 14.. Etter å ha tatt hensyn til ulike hendelser oppstår med noen gjentak, ble 58-83% av kvinner funnet å være informativ og derfor farskap tellinger av deres avkom kan brukes for å beregne P 2. Resultater av ikke-parametriske tester var i samsvar med en lavere sperm konkurransedyktig evne hos menn uten Sdic klynge (type II), sammenlignet med hanner med den intakte klynge (Type I) 14. Dette mønsteret var reproduserbar tvers av lovovertredelsen analyser utført. En lignende, men ikke statistisk signifikant tendens ble funnet på forsvars-analyser som ble utført i parallell (ikke vist). Viktigere, hersket fravær av parring rente forskjeller (trinn 3.4) ut muligheten for atden mannlige genotype kan påvirke kvinnelige remating oppførsel 14.
| Krenkelser analysen | Defense analysen | |||||
| Eksperimentell ♂ Type | w 1118 ♀ | OR-R ♂ | Eksperimentell ♂ | w 1118 ♀ | Eksperimentell ♂ | OR-R ♂ |
| Jeg | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Tabell 1. Aktuelle personene i dobbel-parring eksperimenter for å sammenligne to eksperimentelle mannlige typer. ELLER-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Eksperimentell ♂ Type | Initial Count | Ingen vellykket befruktning med referanse ♂ | Ingen vellykket befruktning med eksperimentell ♂ | Problematisk 1 | Informativ (%) | P 2 2 |
| Analysen en | ||||||
| B +(Type I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1.000 (1,000 til 0,987) |
| A-(Type II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0,986 (1.000-0.936) |
| Analysen 2 | ||||||
| I + (Type I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1.000 (1,000 til 0,979) |
| E-(Type II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1.000-0.927) |
Tabell 2. Oppsummering av virkningen av ulike hendelser på antall hunner som brukes i lovovertredelsen analyser utført for å teste forskjeller mellom eksperimentelle mannlige typer. 1 Død, escaped under analysen, eller som gir opphav til et antall avkom under en terskelverdi. 2. Median (interkvartile området).
Figur 1. Eksperimentell design for angrep og forsvar analyser. Fargen koden som brukes for hver genotype betegner øyenfarge av den voksne fly. Oregon-R hanner benyttes som en referanse for sammenligning av indirekte sperm konkurranseevne to eksperimentelle hanner: en bærer villtype-form av den genetiske faktor under studien (Type I), og en hvor funksjonaliteten til den genetiske faktor har vært opprørt (Type II). Den Sdic klynge, den genetisk faktor i dette tilfellet ligger på X-kromosomet mens sw transgenet er lokalisert på kromosom 2. Eksperimentene som er avbildet er en del av det som utføres i
Figur 2. Sex identifikasjon i D. melanogaster. (A) Dorsal, (B) lateral, og (C) ventral utsikt over en time gamle kvinner (venstre) og menn (høyre) bedøvet med CO 2 under stereomikroskop. Den mannlige kjønnsorgan er vesentlig mer pigmentert enn vaginal plate som gir opphav til en tilsynelatende mørk flekk, og dette er den mest pålitelige tegn som skal brukes for sexing. Også tarsus av de mannlige forbena har en utkant av mørk bust (sex kam) fraværende ikvinnelige. (D) Pålitelig og rask kjønn identifisering av eldre fluer med blotte øye er sterkt anbefalt når du overfører enkeltpersoner i ampuller med suge. I eldre voksne, er mannlige magen dorsally mye mørkere enn den kvinnelige. Kvinner er vanligvis større og har en blekere magen enn menn. Den ovipositor gjør det kvinnelige underliv pekte.
Figur 3. Multi-brettet papir brukes til å øke den tilgjengelige flaten for vandrende larver.
Figur 4. Skissere av forsøket til analysen forskjeller i sperm konkurransekraft i D. melanogaster. Mass parring for to timers bruk vir gin w 1118 kvinner og Oregon-R hanner er initiert hver dag i 5 dager. I hvert masse parring, en gang avsluttet, må 12-14 hunner suges separat i individuelle hetteglass (v1). To dager senere, blir hvert dyr overført til en ny beholder (v2) sammen med tre eksperimentelle hanner av den samme genotype. Disse personene får lov til å pare seg over natten. Menn er forkastet etter ~ 12 hr mens kvinner har lov til å oviposit i 2 dager. Deretter er kvinner overført til nye rør (v3), lov til å oviposit igjen, og til slutt kastes etter tre dager. Tretten til femten og 17 dager etter at hunnene begynte å oviposit både v2 og v3, avkom far av den eksperimentelle og referanse menn er identifisert ved hjelp av egnede markører og registrert. Etter progenies i V2 og V3 er inspisert to ganger, blir ampuller kassert. Pil som peker nedover, kasserte individer, øye symbol, hetteglass inspeksjon. Tilpasset fra 9.d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 5. Fleksibel vifte. Samlet fra amber latex slange, uteksaminert en 1 ml spissen for mottak av fluer og en annen funksjon som disponibel mouthpart. For å forhindre fluer blir sugd inn i røret, er finmasket stoff som brukes til å skjerme fly-mottak tips ved krysset til røret.
Figur 6. Forventet fenotyper i avkom av lovbruddet analysen. Venstre og høyre, krysser å evaluere sperm konkurranseevne av kontroll og knock-out menn henholdsvis. Genotype og øyenfarge for parentals og avkom av både fathers vises. På grunn av de spesielle genetiske markører som brukes i dette assay, kan bare den kvinnelige avkom brukt til å beregne P 1 (eller P-2)-score (se tekst for detaljer); del av den mannlige avkom avlet ved den eksperimentelle hann er hvit og øyne . derfor fenotypisk umulig å skille fra den mannlige avkom av referansen mannlige Df, mangel, P {sw}, transgene;. w 1118 mutant allel av det hvite genet Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet den eksperimentelle design for å vurdere forskjeller i det relative bidraget av genetisk distinkt D. melanogaster menn til avkommet i kontrollerte dobbelt-parring eksperimenter 7,8. Dette er gjort i sammenheng med en genetisk faktor hypotese å påvirke sædcellene konkurranseevne og det har blitt illustrert i anstøt assay selv om en lignende prosedyre gjelder feltet analysen (figur 1). Det eksperimentelle design kan bli endret for å teste andre aspekter av paternity suksess slik som påvirkning av den kvinnelige genotype 32.. Et eksempel på de modifikasjoner som kan innarbeides er den direkte overvåking av paring mellom hunnen og den andre hann. Videre er det også viktig å merke seg at den relative ytelsen til den eksperimentelle mannlige typer er avhengig av genotypen til testeren mannlige og kvinnelige brukt og derfor ikke kan ekstrapoleres til andre scenarierinvolverer ulike tester menn og kvinner 10,32,33.
Siden samling av de aktuelle personene (jomfruelige kvinner og naive menn) og scoring av avkommet er arbeidsintensiv, bør antall forskjellige eksperimentelle mannlige typer skal evalueres bli justert i henhold til antall veltrente personell tilgjengelig. Forsøkene som er skissert her kan enkelt håndteres av en person over seks uker. Faktisk kunne opptil fem eksperimentelle mannlige typer bli evaluert parallelt. Den eneste ekstra tiltak for å bli vedtatt, er å forlenge antall dager å sette opp innledende masse parringer og samle de aktuelle personene for dem.
I vår erfaring, er utgangspunktet antall hunner som brukes (60-70) nok til å romme reduksjon i størrelsen på utvalget uten at det går vår statistisk styrke til å påvise forskjeller mellom de eksperimentelle mannlige typer (tabell 2). Reduksjonen i antall Informative kvinner kan skyldes ulike faktorer, for eksempel mangel på bevis av dobbelt parring eller tidlig død. Ikke desto mindre vil antall kvinner som trengs for hver eksperimentell mannlig type for å oppnå tilstrekkelig statistisk styrke variere avhengig av størrelsen av effekten av den genetiske faktor under studien. En pilot eksperimentet er svært gunstig for å anslå passende nivå av replikering.
Statistiske forskjeller i P 1 (eller P 2) score indikerer variasjon i mannlig befruktning effektivitet selv om de ikke informerer om de underliggende mekanismene som bidrar til slike forskjeller. Dette er på grunn av flere variabler som kan påvirke sperm konkurranseevne (grundig gjennomgått i 20 og 34). Sperm attributter som størrelse, antall og motilitet kan påvirke konkurransen i sperm direkte 35. I tillegg kommer andre mekanismer som ikke er relatert til direkte sperm konkurranse can også bidra til forskjeller 1 P eller P to verdier. For eksempel kan første mannlige sæd fortrinnsvis fjernet, omplasseres, eller tømmes ut før eller under kontakt med den andre hann 19,20. Dette kan skje ved mekanisk stimulering, for eksempel under kopulasjon og via molekyler tilstede i den forutgående væske av den andre hann, noe som vil påvirke første mannlige sæd negativt 19,36. Derfor må komplementære analyser som evaluerer effekten av de ekstra indirekte mekanismer utføres, helst før den doble parring eksperimentet beskrevet her. Eksempel på disse analysene er de som testing for forskjeller i zygote levedyktighet (f.eks larve overlevelse) og egg hatchability (en proxy for vellykket egg befruktning) 28,37, som til slutt resultere i forskjeller i avkom nummer.
Sperm imaging teknikker kan også være svært informativ 19,24,28. Hovedsak, en of hannene er genetisk modifisert slik at spermier er merket med et fluorescent fusjonsprotein (f.eks med referanseproduktet hann med et grønt fluorescerende protein) hjelpende overvåking sperm dynamikken i den kvinnelige skjede. Denne tilnærmingen kombinert med ytterligere farging ved anvendelse av 4 ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) ble anvendt for å identifisere direkte spermier fra det første og andre hanner i dissekert seminale beholdere med D. melanogaster kvinner 24,28. I en studie 24, var forskjeller i antall spermier i god avtale med forskjeller i P 2 verdier som støtter forestillingen om at disse forskjellene i mannlig farskap var reflekterende av sanne forskjeller i sperm konkurranseevne og ikke av indirekte mekanismer.
Etterfølgende forbedringer har blitt oppnådd ved å generere transgene stammer som uttrykte grønne og røde fluorescerende tags smeltet til sperm-spesifikke proteiner 19. Disse improvementene har tillatt forskere å overvåke sperm av de to direkte konkurrerende mannlige sperm med en enestående grad av oppløsning. I konklusjonen, foreslo gjennomføring av dobbel-parring eksperimenter og ytterligere analyser som de bidra til å innskrenke arten av eventuelle forskjeller i P 1 eller P to score funnet blant eksperimentelle mannlige typer, som åpner muligheten for å dissekere genetikk grunnlag av naturlig forekommende variasjon i sperm konkurranseevne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne takker NSF (MCB-1157876) for finansiering. Vi takker også Alberto Civetta, John roote, og to anonyme referees for sine kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G.
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A.
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S.
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A.
- Wigby, S., Chapman, T.
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
