Summary
Bal arısı işçiler, yaşlanma sosyal davranışları ziyade kronolojik yaşına bağlıdır. Burada çok farklı yaşlanma desenleri ile işçi-tipleri elde edilmiş ve hücresel yaşlanma için analiz edilebilir göstermek.
Abstract
Çok sosyal hayvanlar Dernekleri yakından ilgili bireyler arasında büyük farklılıklar ömrü bulunmaktadır. Sosyal böcekler arasında, bal arısı ömrü ve yaşlanmanın plastisite sosyal faktörler ile açıklanmaktadır nasıl çalışma için iyi kurulmuş bir modeldir.
Bal arılarının işçi kast nektar ve polen toplamak damızlık eğilimi hemşire arılar, arılar ve silaj içerir. Önceki iş beyin fonksiyonları ve uçuş performans hemşireler daha silaj daha hızlı senesce göstermiştir. Silaj geri hemşirelik görevleri dönmek Ancak, beyin fonksiyonları, kurtarabilirsiniz. Hızlandırılmış yaşlanma ve ters fonksiyonel bu gibi desenler protein bolca değişikler ve bağışıklık fonksiyonu, değiştirilmiş metabolik kaynak seviyeleri ile bağlantılıdır. , Vitelogenin, hormonal kontrol ve hücresel savunma uyarlanmış işlevleri olan bir yumurta sarısı protein, işçi farklı yaşlanma dinamiklerini kontrol eden bir ağda önemli bir düzenleyici eleman olarak hizmet edebilir.
Burada hemşire ve silaj ortaya çıkması izlenir, ve daha uzun ömürlü hemşire içine genellikle kısa ömürlü silaj ters dahil olmak üzere, nasıl manipüle edilebileceğini açıklar. Bizim temsilcisi sonuçları benzer kronolojik yaş ile bireylerin deneysel koşullar altında silaj ve hemşire arıların içine ayırt nasıl gösterebilir. Biz geri hemşirelerle silaj davranış tersine valide nasıl örneklemektedir. Son olarak, burada hücresel yaşlanma lipofusin birikimi, yaşlanma evrensel bir biyomarker ölçülerek değerlendirilebilir kadar farklı gösterir.
Sosyal etkileri bağlantı olabilir mekanizmaları eğitim ve plastisite yaşlanma için, bu protokol, ilgili örnek malzeme elde etmek ve gelecekteki çalışmalar arasında veri karşılaştırılabilirliği artırmak için ayarlanmış standart bir araç sağlar.
Introduction
Çok sosyal hayvanlar kompleks koloni yapıları üreme kastın etkileşimi yoluyla korunur ve farklı sosyal görev davranışları tipik olmayan-yenidenüretim işçilerin bir yardımcı kast. Farklı işçiler, belirli fizyolojik adaptasyonlar farklı sib bakım davranışlarını sağlamak ve aynı zamanda aşırı ömrü farklılıklara bağlıdır. Bal arıları ve körfareler toplumsallık hızlandırılmış, ihmal veya 1-3 yaşlanma ters kalıpları ile nasıl bağlantılı olduğunu incelemek için en gelişmiş hayvan modellerini temsil eder.
Bal arısı kolonilerinde, bir tek yumurtlayan kraliçe gıda için damızlık, yem eğilimindedir binlerce işçi tarafından destekli, ve, termoregülasyon veya hijyenik davranışları 4 koruma meşgul. Bu işçiler arasında, son derece kısa ömürlü yem, ara ile hemşire arılar, ve uzun ömürlü kış (diutinus) arı vardır. Bireyler, ancak, belirli bir kalıcı wo bağlı değildirrker-tipi, ancak esnek bir davranış ontogenezini görüntüler: Onlar ("temporal kastlara") bir sosyal görev davranışı değiştirmez. Toy arılar sonunda dışında toplayıcı değişebilir ki, yavru eğilimi hemşire arılar için değiştirebilirsiniz. Ancak, toy yuva arılar da uzun ömürlü kış arıları dönüşebilmektedir ve kısa ömürlü yem bile genellikle uzun ömürlü hemşire içine dönebilirsiniz. Aşırı (kış arılar) ve orta (hemşire arılar) ömrü ile İşçi bol kaynakları ile gıda üretim ve depolama organları iyi gelişmiştir - (1,5 gözden) kısa ömürlü aramayanlara aksine. Ancak, bireysel ömrü düzenleme bireyin kaynak dengesi basit değişiklikler ötesinde böyle jöle üretimi 6, hormonal kontrol 7, bağışıklık gibi olmayan çoğaltılması işçi kast çeşitli adapte işlevleri vardır, bir yumurta sarısı protein, üzerinde araştırma tarafından önerilmektedir 8 ve anti-oksidan savunma 9.
F Desenlerkoku için kurulmuş, ve diğer beyin veya motor fonksiyonların 10-13 gibi Fonk düşüş (ihtiyarlık) işçiler arasında ayna ömrü eşitsizlikler,. Uzun ömürlü kış arı 15 saptanabilir bir düşüş (ihmal edilebilir ihtiyarlama) eksikliği karşı Spesifik olarak, toplayıcı sadece iki hafta sonra öğrenme fonksiyonunda önemli bir düşüş, toplayıcılar 14 benzer bir ölüm ilerlemesini eşleşir.
Biz izleme ve yaşlanma-tip geçişler 8,16,17 işlemek için izin kurulan deneysel paradigmalar uyarlanmış esnek yaşlanmanın moleküler parmak izlerini tespit etmek. Kronolojik yaş ve yaşlanma üzerinde işçi-tipi belirli sosyal davranışların etkileri ayrılabilir hangi örnekleri edinme 1. ayrıntıları deneme. Deney 2 yavaşladı yaşlanma dinamikleri ile hemşire arılar içine hızlandırılmış ile arayıcıların tersine anlatılmaktadır. Deney 3 Anatomica tarafından hücresel yaşlanma etkilerini incelenmesi için bir yaklaşım sağlarHücresel yaşlanma (lipofusin) 18 için kurulmuş bir biyolojik belirteç l ölçümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kronolojik Çağı'na ihtiyarlama ayırımı
Bu bölüm aynı kronolojik yaş ("tek yaş kohort") ve yuva arıların bir grubu tespit paylaşan bireylerin bir kohort oluşan çift kohort kolonilerin, kurulumunu açıklar. Tek yaş grubu aynı yaştaki bireyler sonunda farklı yaşlanma dinamikleri farklı işçi tipe ayrı olacak - bu hızlandırılmış fonksiyonel düşüş yavaşladı ve toplayıcı arılar ile hemşire arılar vardır. Tüm prosedürler bir deney koloni için tarif edilmiştir. Biz böylece koloni etkileri (iki suret-tasarım) için kontrol edilebilir en az iki koloni için deneyler gerçekleştirmek için, ancak, çoğaltır öneriyoruz.
- Çift kohort sömürgeler için kovanı kutuları hazırlanıyor: bal ile iki gıda tarak alır normal bir kovan kutu, polen başka gıda tarak ve iki boş tarak hazırlayın. 3.000 'den fazla olan bir evlendirdi kraliçe gibi bir donör koloni bulmak için emin olunyuva arılar. Her ikisi de daha sonra tanıtılacak (1.3).
- Alınması ve benzeri kronolojik yaş ile bireylerin işaretleme: ortaya üzeredir mühürlü yavrularıyla tarak toplayın. Bir replikasını için 3.000-5.000 şapkalı kuluçka hücrelerinin toplam tarak toplamak için bekliyoruz. Her anne genotipleri (kovanı kökenli) çarpık dağılımları önlemek için en az üç farklı kovanı kaynaklardan damızlık dengeli miktarda kullanmak çoğaltmak için.
- % 60-70 bağıl nem ile 34 ° C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde kuluçka tarak yerleştirin. Gelişmekte olan damızlık kaçamaz böyle bir şekilde tarak saklamak için emin olun.
- Arılar iki gün boyunca ortaya edelim ve toraks (örneğin Uni Posca, Mitsubishi Pencil Co Ltd) üzerinde küçük bir boya etiketi ile bu arıları işaretlemek. Boya işareti tek yaş grubu (doğuşunun gün) arıları belirlenmesini sağlayacaktır, ve diğer çoğaltmak kolonilerden ayırt etmek.
- I kohort içeren bir çift kohort koloni kurmadentified, tek yaş arılar: gününde genç arılar işaretlenmiş, (bkz. (. Tartışma bölüm 1 karşılaştırmak), ve daha önce hazırlanan kovan kutusuna bu işaretlenmemiş arılar eklemek verici bir koloni yaklaşık 2,500-3,000 yuva arıları toplamak ) 1.1 adıma. İkinci bireyler tanımlanamayan yuva arı kohort teşkil edecektir.
- Başlangıçta bir kraliçe kafes (piyasada mevcut) sınırlı olacak kraliçeyi ekleyin. Yenilebilir şeker (örneğin Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Almanya) işçi arıların kraliçe yavaşça serbest bırakmak yapmak ile kafesi kapatılmalıdır.
- Tek yaş kohort teşkil edecek yeni ortaya çıkan ve işaretli arılar ekleyin. Bu arılar sadece işaretli kişiler vardır, ve tüm aşağıdaki adımları için odak grup vardır.
- Başlangıcı yem ve silaj işaretleme İzleme: başlangıcı ve tek yaş grubundaki hasta-hemşire forager geçiş dinamikleri değerlendirmek için, toplayıcı faaliyeti e demografik gelişimini izlemekHer koloninin çok gün. Koloniler (Şekil 1) kuruldu sonra beş gün saymaya başlayacaktır.
- Sabit zamanlarda 3 x 20 dk gözlem süreler içinde uçuşlar (giriş sayımları) kazarak dönen arıların toplam sayısını. (Tartışma) oryantasyon uçuş dönemlerinde arıları saymak değil emin olun.
- Giriş sayısı (> 100 giriş sayım / gün) başlaması için önemli bir yiyecek arama etkinliğini gösterir zaman, silaj işaretleme başlar. Bunu yapmak için, tek yaş grubunda (tek işaretli kişi) silaj ilk toplayıcı uçuşları dönen üzerine ikinci bir boya izi alırsınız. Bu boya işareti başlangıcını toplayıcı gününü belirler ve daha sonra her forager toplayıcı yaş tanımanızı sağlayacak.
- Arıların yeterli sayıda işaretlenmiş kadar günlük işaretlerini tekrarlayın. Bu arı tipik olarak 14 gün sonra, yaş edildikten sonra işaretli toplayıcılar yeterli sayıda tahmin etmek için, en fazla 5-10% arasında bir alma oranı beklemekforaging.
- Örnekleme: Tüm başlangıçta işaretli arılar benzer bir kronolojik yaş olduğundan silaj ≥ 14 gün boyunca foraged ne zaman, hemşire ve eski arayıcıların yaştaki gruplar, aynı anda tahsil edilebilir.
- Tek belirgin hemşire arılar kovan içinde toplanır ve hemşirelik davranış (açık yavru hücrelere aşağı koymak başkanları ile besleme ve larva temizlik) ile tanımlanır.
- Günlük toplayıcı aktivite başlamadan önce Çift işaretlenmiş silaj da kovan içinde toplanır.
- Yeterli havalandırma sağlamak kafeslere (tüpler, kutular) arıların toplayın, ve daha fazla işlem kadar karanlık tutun. Alternatif olarak, Transkriptomik, epigenetik veya proteomik çalışmalar için, doğrudan sıvı nitrojen içinde dondurularak arılar oturtun. Tüm test gruplardan bireylerin dengeli numaralarını toplamak ve koloniler çoğaltmak.
2. Hive Demografi <değiştirme tarafından Slowed Yaşlanma ile İşçi Rapid ile İşçi iptali/ P>
Bu bölümde yavaşladı yaşlanma (hemşire arılar) ile işçilere hızlandırılmış yaşlanma (silaj) ile işçiler dönüş yapılır nasıl ayrıntıları. Silaj normalde yavru bakımı meşgul hemşire arıların eksikliği, karşılaştığınızda bu tür davranışsal ters, uyarılmaktadır. Hemşire arı fraksiyonu ile bir kovan ("hemşire-türetilmiş"), ve silaj fraksiyonu ile başka bir ("toplayıcı-türetilmiş"): reversiyon yordam tek bir koloni iki kurdeşen içine çoğaltmak ayrı olacaktır. Başarılı ters, plastik olası belirtileri ve ters yaşlanma döndürüldü işçiler, devam silaj, sürekli hemşire arılar ve yeni işe silaj ile tek yaş grubunda okudu olabilir sonra. Daha önce olduğu gibi, tek bir yaş grubunda, değil tanımlanamayan yuva arıların kohort arasında belirlenen arılar, deneysel odak grubu oluşturmaktadır.
- Hazırlanışı: Bir önceki bölümde açıklandığı gibi hemşireler (tek işaretli) ve silaj (çift işaretli) ile kovanlarını Çoğaltılamıyor hazır. Dönme tamamlandıktan sonra yeterli alınmasını sağlamak için tekrarlanan koloni başına en az 500 belirgin silaj ile reversiyonunu başlamak değil emin olun.
- Dönüşü sonrası test grupları güvenli bir kimlik için orijinal kovanında tüm silaj nüfus reversiyon öncesinde kapalı işaretlendiğini önemlidir. Aşağıdaki prosedür, bir örnek için açıklanmaktadır.
- Reversiyon önce bir gün, silaj-türetilen kovanı için bir ek kovan kutusu (adım 1.1) hazırlamak. Donör kovandan iki kız ve iki kuluçka tarak bulun. Deneysel koloniler transferden önce bu taraklar Tüm yetişkin arıları uzak fırça. Bir kafesli kraliçe (adım 1.3) ve bir kuluçka tarak orijinal kovan kutusuna kraliçe ve kuluçka tarak yerini alacak. Kraliçe ve damızlık tarak diğer dizi yeni kovan kutusu için ertesi gün kullanılacaktır. Hem özgün ve yeni kovan emin olmak için tavsiye edilir yeni yavru taraklar ve yabancı kraliçelerin Benzer tahsisi ayrılmış yem ve hemşires eşit deneyimi kovan yardımlar ("kovanı koku") değişmiş olacaktır.
- Reversion: Sabah, hemen reversion önce, toplayıcı-türetilmiş bir kısmını alacak yeni kutusuna kafesli kraliçe ve kuluçka tarak ekleyin. Zirve toplayıcı zaman başlayana kadar bekleyin. Sonra en az 100 m uzakta orijinal konumundan işaretlenmiş silaj ve hemşire arılar ile orijinal koloni taşıyın.
- Özgün konumda, damızlık ve sadece kraliçe ile toplayıcı-türetilmiş kovan için yeni bir kutu kurmak.
- Silaj disloke orijinal kovan kutusunu bırakın ve özgün konumlarına geri başkanlık edecek. Silaj yuva arılar toplayıcı nüfusun ayrılmasını tamamlamak için bir sonraki ulaşmak için 2 saat boyunca özgün konumuna geri dönmek için izin verir.
- Ardından, ayrılık sona orijinali kapatmak, şimdi kovanı "hemşire-türetilmiş", ve en az 3 km uzaklıkta bir arılık aktarmak.
- Başarılı bir sosyal görev için kovan bakım ve izlemeters: Sağlıklı, açık damızlık düzenli deneysel kovanlarını kontrol edin.
- Koloni manipülasyonu sonrası ilk günlerinde potansiyel patojen yükünü azaltmak için gözetimsiz ve ölü yavru değiştirin.
- Dönme deney (Şekil 2) tamamlandığında taraklar değiştirilmesi veya zaman yine bu tanıtmadan önce yavru peteklerin fotoğraf çekmek, ve, toplayıcı-türetilmiş kovanı içinde başarılı tersine doğrulamak için. Önceden değişkenliklidir yavrularıyla ve açık, canlı damızlık Alanları toplayıcı-türetilmiş koloniler hemşirelik faaliyet güvenilir göstergeleridir.
- Örnekleme: Sosyal ters eşlik fizyolojik etkileri 3-8 gün silaj ve hemşireler sonra tespit edilebilir ayrıldı.
- Biz ters başlatılan 8 gün sonra tüm test grupları, yani geri döndü işçi ve devam silaj (toplayıcı-türetilmiş kovan), hem de sürekli hemşire ve yeni işe silaj (hemşire-türetilmiş kovan) örnekleme öneriyoruz.
- ColAdım 1.5 'de tarif edildiği gibi lect örnekleri.
3. Lipofusin Nicelik ile İşçi-tipi özel Hücresel Yaşlılık Desenler analiz
Lipofusin Hücresel yaşlanma evrensel biyomarkerdir. Içsel bir birikim ürünü olarak, lipofusin spesifik otofloresan (emisyon max = 530-650 nm) tespiti 18 için kullanılabilir.
- Diseksiyon ve sabitleme: hareketsiz kadar buz üzerinde soğutun arılar, kaldırmak ve istenilen doku örneği teşrih.
- 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon için, sabitleyici içerisine (pH 7.2 fosfat tamponlu tuzlu su, PBS içinde% 4 paraformaldehid) aktarın
- PBS içinde numuneleri 3 kez yıkayın.
- Doku işleme ve montaj: titreşimli bir bıçak mikrotom örneğin Leica VT 1000'ler (Leica Biosystems, Nussloch, Almanya) kullanılarak, örneğin, en fazla 40 um 'den kalınlıkta bölümlere doku örnekleri kesin.
- % 50 gliserol (PBS) içinde mikroskopik slaytlar üzerine bölümlerini monte edin. Uzun süreli depolama mühür kapağı oje ile kayıyor.
- Görüntü edinimi: Lipofusin algılamak için, λ = 514, 561nm veya uyarma için benzer lazer çizgiler sağlayan bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak önermek ve dedektör bant genişliği 570-650 nm'ye ayarlanmış.
- Lipofusin daha iyi tanımlanması için, ikinci bir kanal içerir ve kısa dalga boyu spektrumları bir eşzamanlı tarama yapmak (uyarım = 405 nm, emisyon = 410-450 nm). Uzun dalga boyu kanal nedeniyle autofluorescent trakea ve diğer non-taneli yapılara, granül Lipofusin hem de ortaya, ama aynı zamanda belirsiz "arka plan" olacak. Ikinci, daha kısa dalga boyu kanal sadece spesifik otoflüoresanı ortaya, ama değil lipofusin olacaktır. Bu durumda, kimlik lipofusin tesislerinin olabilir, sadece bir tanesi lipofusin özel floresan ile granüller ortaya ile, her iki kanal sinyalleri karşılaştırarak tated.
- Yüksek çözünürlüklü görüntülerin elde 40X büyütme veya daha yüksek, ve 1.25 veya daha yüksek, tercihen bir sayısal açıklığa sahip bir objektif kullanın. Tarama görüntü yaklaşık 100 x 100 x 10 mm boyutlarında 3 ile yığınlar. Her birey ve doku örneği, birden çok görüntü yığınlarının tarafından temsil edilmelidir.
- Teknik varyasyonu neden içi bireysel ve bireyler arası farklılıkları azaltmak için, her zaman lazer güç ve dedektör hassasiyeti sabit tutmak.
- Gün için günlük teknik varyasyonlar tarafından yanlılığı azaltmak için çeşitli tarama oturumları her tüm test grupları eşit örnek numaraları tarayın.
- Görüntü işleme: mikroskobik görüntü yığınlarının gelişmiş işleme izin modülleri ile yazılım paketleri kullanın, örneğin ImageJ (Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
- 3D görüntü yığınlarının her biri için en fazla 2 boyutlu çıkıntı oluşturur.
- Yüksek frekans gürültüyü azaltmak için, ve lipofusin granül boyutları ile yapıları korumak için bir miktar çekirdek büyüklüğüne sahip bir Gauss filtre uygulama.
- Lipofusin kimlik (adım 3.2) kolaylaştırmak için her iki renk kanallarını birleştirme.
- Görüntü analizleri: sayısallaştırma adımları gerçekleştirmeden denek grubu kimliğini test kör olacak emin olun.
- Tüm görüntüler için, ilk olarak, ilgili yapıları kapsar ve diğer görüntüleri ROI'ler benzer boyutlara sahip çıkar (ROI) bir bölge seçin.
- Sonra her ROI temsil lipofusin granüllerinin istediğiniz numarayı seçin. Bir ROI içinde lipofusin granülleri seçerken, aşağıdaki kuralların uygulanması öznel önyargı azaltacaktır.
- İlk Granu seçmek için tutarlı bir konum seçinle. Bu durum, örneğin, bir ROI en sol kenar ve kenarına en yakın olan granül her zaman ilk seçim olacaktır olabilir.
- Birbiri ardına, granüller önceki seçime (sonraki komşu) en yakın olduğu seçilir.
- Sonraki komşusu seçerken, sadece bir önceki seçimden doğru arama, örneğin, sadece bir yöne doğru hareket ettirin. Bu kural seçim yoğun dolu granüller arada kümeleri hakimdir önler.
- Seçme işlemi tamamlandığında, söz konusu granül alan ana hatlarını ve ölçülerek, her lipofusin parçacık boyutunu değerlendirmek. Farklı test grupları bireyleri karşılaştırmak uygun istatistiksel testler kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol bölüm 1 ve deney grupları hızlandırılmış niteliklerini incelemek için elde edilebilir nasıl 2 ayrıntı, yavaşladı ve tek bir yaş grubu ile koloniler yaşlanma tersine. (Şekil 1, bölüm 1 karşılaştırma) 6 koloni için silaj sayıları ("giriş sayar") değerlendirilir, normal ontogenezini eşlik işçi-tipi farklılaşmasını izlemek için. Grafikler bireylerin daha 10 gün eski önce silaj devlete hemşire gelen önemli değişiklik, tipik olarak gözlenen olmadığını göstermektedir. Toplayıcı sayıları işaretli değişkenlik Farklı koloniler arasındaki başlangıcını toplayıcı zamanlaması açısından gözlendi ve her bir koloni içinde belirgin bir gün-gün varyasyon olarak. Apart gibi farklı damızlık yük gibi koloni belirli demografik faktörler, gelen, çok değişkenlik hava koşulları (Şekil 1'de kırmızı ile işaretli zaman noktaları) değiştirerek açıklanmıştır. Toplayıcı dinamikleri yakından izlenmesi dolayısıyla dur işaretleme ve toplama çabalarını optimize etmek için tavsiye edilirDenemeyi ing.
Geri hemşirelik görevlere kazarak gelen ters bireyoluş (bölüm 2) (adımları 2.2 ve 2.3) toplayıcı-türetilmiş koloniler içine konur yavru taraklar incelenerek onaylanmış olabilir. Üç suret Şekil 2A, C, ve E show kuluçka tarak toplayıcı-türetilmiş koloniler sokulmadan önce. Çıkarıldıktan sonra ilgili petekleri göstermek 2B, D ve F Rakamlar. Yeni şapkalı kuluçka, sağlıklı larva ve yavru hücrelerin etrafında artan polen depolama Yamalar eski silaj şimdi başarıyla hemşirelik görevleri de dahil olmak üzere, tipik bir yuva gerçekleştirilen olduğunu göstermektedir.
Lipofusin (bölüm 3) hücresel yaşlanma ve yüksek oranda korunan bir semptomdur ve hali hazırda çeşitli arı dokularda sonrası Deneysel analizler için değerlendirilebilir. 3'ün hipofarenks bezlerinde, granül boyutu (Şekil 3E) olarak ölçülmüştür lipofusin birikimi, Şekil tezat yaş eşleştirilmiş hemşirend toplayıcı arılar. Iki genç ve iki eski grup arasında kronolojik yaş farkı dışında uçuş ve yiyecek toplama faaliyetleri ile bu ≥ 17 gün geçirdikten sadece bir gruba (silaj), ≥ 17 gün oldu. Temsilci mikroskobik görüntüleri (Şekil 3A-D) show (Şekil 3D) toplayıcı fazla 17 gün sonra sadece eski arayıcıların grubu için lipofusin birikimini artıran değil (37-43 gün; Şekil 3B) benzer kronolojik yaşından büyük hemşire arılar için . Sabit ana faktör işçi-tipi (silaj, hemşireler) ve yaş farkı (Δage ≥ 17 gün) ile iki-faktörlü ANOVA işçi-tipi, yaş farkı ve her iki faktör arasındaki etkileşim (F tipi = 33.67, P için önemli etkileri ortaya <0.001; = 21.93 F Δage, p <0.001; F tipi x Δage = 22.07, p <0.001). Ancak, post-hoc testler tek önemli etkiler göstermiştirgenç toplayıcılar yaşlı silaj (yiyecek arama ≥ 17 gün) zıt olduğunda, ya da her ikisi hemşire grupları (; Şekil 3E PF 17d vs F 1d/N1d/N17d <0.001, Fisher LSD) için. Hiçbir fark kronolojik genç ve yaşlı hemşire grupları (; Şekil 3E P ile tüm testler> 0.5, Fisher'in LSD) dahil son üç gruplar arasında tespit edildi. Bu lipofusin birikim yerine sadece başına kronolojik yaş fonksiyonu olmaktan toplayıcı belirli faaliyetler (yaş toplayıcılık), bağlı olduğunu göstermektedir.
Şekil 1. Normal ontojenliği sırasında İşçi-tipi farklılaşma. Onlar kuruldu 5 gün sonra başlayan 6 farklı koloniler sayılır kazarak uçuşları dönen arayıcıların grafik görüntüler giriş sayısı (ayrıntılar için Protokol bölüm 1.4 karşılaştırın). NE gelen önemli geçiştek yaş grubu işaretlenmiş bireyler yaklaşık 10 gün eski iken st faaliyetlerini kazarak ilk gözlendi. Kümülatif giriş sayıları için farklı yamaçlarında silaj geçiş hemşire arı kolonileri dinamikleri arasında farklılık, ve iklimsel faktörler tarafından etkilendiğini göstermektedir. Örneğin, yağmur ve yiyecek aramadan az iki saat ile gün, giriş sayılarında artış tipik (kırmızı veri noktaları) dümdüz.
Şekil 2. Onlar bu kovanlardan çıkarıldıktan sonra onlar toplayıcı-türevli kurdeşen içine tanıtıldı ve öncesi davranış haline dönmesini doğrulanıyor. Silaj başarıyla hemşirelik görevleri intikal varsa test etmek için, biz yavru tarak karşılaştırıldı. Temsilcisi görüntüleri damızlık tarak göstermek giriş önce (A, C, E) vesırasıyla üç farklı toplayıcı-türetilmiş kurdeşen, çıkarıldıktan (B, D, F sonra). Önceki toplayıcı arılar tarafından yavru bakımı şapkalı yavrularıyla hücrelerinin artan sayıda gösterilir (B, D, F, D vaziyettedir siyah ok), açık hücrelerde larvaları (kırmızı ok) hayatta sürekli ve yakın polen artan depolama Kuluçka hücreleri (beyaz ok). Toplayıcı-türevli-koloniler başlangıçta hemşire kaynaklı koloni kuluçka eğilimi genellikle daha az etkili olduğunu unutmayın. Bu toplayıcı türetilmiş-koloniler daha yüksek larva ölümlerine yol açabilir. B, D Resimlerde, K kuluçka tarak toplayıcı türetilmiş koloniler içine alındı 4 ve 7 gün sonra, 5 alınmıştır.
Şekil 3,. Lipofusin birikimi, hücre bir belirteçular yaşlanması, işçi-tip spesifik doku bozulma belirtisi olabilir. genç (A) hipofaringeal bezlerinin Temsilcisi mikroskobik görüntüleri ve eski hemşire arılar (B) yanı sıra, ≥ 1 gün (C) ile yaş-uyumlu silaj arılar, sırasıyla ≥ 17 gün yem deneyimi (A = 20 mikron çaplı bar). Lipofuskin granül boyutu ölçülmüş ve her bir yaş ve alt-tipi (E)-N = 5 kişiler için medyan ve kartiller olarak verilir. Aynı dönemde (istatistik sonuçlarını görmek için) hemşire arılar lipofusin değişikliklere yol değil ise, önemli lipofusin birikimine neden 17 gün boyunca yem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada daha önce açıklanan 8,16,17,19,20 yaklaşımları benimsemek, bal arıları ve esnek yaşlanmayı okuyan kolaylaştıracak tek bir iş akışına entegre. Amacımız, ilgili örnek materyal elde etmek için ayarlanmış bir standart araç ile bu alana acemi bilim adamları sağlamak ve farklı araştırma ekipleri arasında deneysel tekrarlanabilirlik geliştirmektir. Bizim prosedürleri basitleştirilmiş ve (örneğin 8 karşılaştırmak) önceki açıklamalarında olduğu gibi özel ekipman gerekmez iken, önlem bazı önlemler tavsiye edilir ve aşağıda toplanır.
Kronolojik yaşından itibaren yaşlanmaya ayırımı. A en kritik yönü toplayıcı davranışları (2. işaretleme) ilk onayı sırasında silaj arıların sahte kimlik kaçınmaktır. Silaj izlenir ("giriş sayar") veya işaretli edilecek, bu nedenle, kesinlikle oryantasyon uçuşları ile günlük dönemlerde önlemek yok. Bu dönemlerde ön-fora çokging sahne arıların ayrılmaya veya kovan girecek. Bu arılar olgun silaj tipik fizyolojik özelliklerini görüntülemek, ancak kolayca tanımlanabilir dairesel uçuş desenleri 21 ile kovan çevresinin mekansal harita kurmak yok.
En arılar 2 hafta ve üzeri yaş ile kazarak değiştirmek iken, sporadik toplayıcı (Şekil 1) çok genç yaşta zaten görülmektedir. Son derece küçülmüş silaj genelde hemşire aşamasından geçtikten olmadan toy yuva arıların doğrudan gelişir. Böyle bir anormal ontojenliği (buradaki 22 ve referanslar karşılaştırın) ile bireyler dahil değil, 10 gün veya daha az yaş kazarak başlamak bireylerin daha fazla analiz için kabul edilmez.
Daha erken silaj çıkartıldı önlemek için, biz sadece tek bir yaş grubu 17,23 oluşan klasik "tek kohort koloniler" kullanımı yapmazlar. Bunun yerine, kurarkenBiz işaretli tek yaş grubunda rastgele yuva arıları ("yuva arı kohort") ekleyin kolonileri (adımları 1.1 ve 1.3). Rasgele yuva arılar genellikle yaşlı oldukları için, son derece küçülmüş silaj 17 içine geliştirmek için çok genç arılar üzerindeki baskıyı azaltabilir. Gibi çift kohort koloniler, bu nedenle, daha iyi yavaş yavaş kazarak hemşireliğin ilerleyebilir bireyler ile doğal kovan demografik benzeyebilir.
Uzun süreli işçi özel uyarlamalar incelenecek olduğunda, saat kazarak dışında bütün test gruplarını toplamak. Bu uçuş yorucu, örneğin nedeniyle son lokomotor aktivitelere daha fazla akut metabolik ayarlamalar yanlılığı azaltmak için tavsiye edilir.
Silaj geri hemşire türetilmiş kovanı (> 3 km) uzaklaşmaya esastır özgün konumuna uçmuştu sonra hızlı işçilerin geri çevrilmesi. Kovanın demografisi değiştirerek yaşlanmayı yavaşlattı. Bu ön toplayıcı stage arılar ile işe sürülmekte kaçınmaktırsırasıyla feromon iletişim 24 üzerinden diğer arılar tarafından eski yeri,.
Ayrıca toplayıcı-türetilmiş kovana girmesini herhangi bir hemşire ya da diğer ön-toplayıcı bireyler önlemek için, aşağıdaki kurallara tutulması tavsiye ederiz: günlük oryantasyon uçuşları başlamadan önce (I) ayırma işlemi sonlandırın. (II) Sadece güçlü toplayıcı aktivite gözlemlenmiştir günlerde ters girişimi. (III) orijinal kovanı ilk translokasyon sırasında ve sonrasında, arıların gereksiz ajitasyon önlemek, özellikle kovanı açmayın.
Prensip olarak, bir hemşire-yoksun ortamda silaj sınırlandırmak fazla yapay kurulumları da reversion yol açabilir. Ancak, bu tür kurulumları sadece, böylece hemşire türetilmiş kolonilerden kontrol grupları ile doğrudan karşılaştırma engelleyen, toplayıcı-türetilmiş fraksiyonu deneyimleri diğer stresli ortamlar gibi bilgilendirici değeri sınırlıdır.
Farklı ihtiyarlık desenleri Onaylayanlipofusin en kolay algılanabilir bu doku olduğundan lipofusin ölçümü ile, hücresel yaşlanmanın bir belirteç. Burada görüntü ve yutak bezleri istatistiki veriler ile lipofusin değerlendirme örneklenmiştir. Bu, biz inanıyoruz, mikroskobik tespiti için doğru protokolleri kurma deneyimsiz gözlemci için önemlidir. Ancak, diğer dokuların aksine, yutak bezleri geçişi 25 Forager için hemşire sırasında önemli apoptoz ve nekrozu görüntüler yok. Bu tür süreçler son zamanlarda hemşirelik görevler (Şekil 3C, E) değişmişti genç silaj lipofusin artışlarını tespit olmamasına rağmen, ihtiyarlık marker birikimi ile etkileşime girebilir. Ancak, diğer arı dokularda yaşlanmayla tedbirleri değerlendirmek için, burada açıklanan mikroskopi tabanlı yöntemleri kolayca adapte edilebilir.
Alternatif akım-sitometri yaklaşımlar daha az zaman 26 alıcıdır. Mikroskopi tabanlı analizlerHücresel yaşlanma belirtileri farklı bölgelerde veya hatta tek organlar 27 içindeki hücreler için değerlendirilebilir ki avantajı var. Beyin ve hücresel yaşlanma 28 mekansal heterojenite ile diğer karmaşık organlarda çalışmalar için, biz bu nedenle mikroskopi temelli yaklaşımı öneriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz çekimler sırasında yardımcı tavsiye ve yardım için Osman Kaftanoğlu teşekkür ederim. Biz anlayışlı yorumlar için anonim eleştirmenlerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Norveç Araştırma Konseyi (180.504, 191.699, 213.976 ve hibe), Marie Curie/FP7 (proje ref. 238665), Yaşlanma (hibe NIA P01 AG22500) Ulusal Enstitüsü ve Pew Bağış Güven tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apifonda | Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany | ||
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Glycerol | Merck | 1.04094.1000 |
References
- Munch, D., Amdam, G. V. The curious case of aging plasticity in honey bees. FEBS Lett. 584, 2496-2503 (2010).
- Buffenstein, R. Negligible senescence in the longest living rodent, the naked mole-rat: insights from a successfully aging species. J Comp Physiol B. 178, 439-445 (2008).
- Parker, J. D. What are social insects telling us about aging? Myrmecological News. 13, 103-110 (2010).
- Seeley, T. D. The Wisdom of the Hive. , Harvard University Press. (1995).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The regulatory anatomy of honeybee lifespan. J Theor Biol. 216, 209-228 (2002).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Hagen, A., Omholt, S. W.
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
- Amdam, G. V., et al. Social reversal of immunosenescence in honey bee workers. Exp Gerontol. 40, 939-947 (2005).
- Seehuus, S. C., Norberg, K., Gimsa, U., Krekling, T., Amdam, G. V. Reproductive protein protects functionally sterile honey bee workers from oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 962-967 (2006).
- Scheiner, R., Amdam, G. V. Impaired tactile learning is related to social role in honeybees. J Exp Biol. 212, 994-1002 (2009).
- Behrends, A., Scheiner, R., Baker, N., Amdam, G. V. Cognitive aging is linked to social role in honey bees (Apis mellifera. Exp Gerontol. 42, 1146-1153 (2007).
- Münch, D., Baker, N., Kreibich, C. D., Braten, A. T., Amdam, G. V. In the laboratory and during free-flight: old honey bees reveal learning and extinction deficits that mirror mammalian functional decline. PLoS One. 5, e13504 (2010).
- Vance, J. T., Williams, J. B., Elekonich, M. M., Roberts, S. P. The effects of age and behavioral development on honey bee (Apis mellifera) flight performance. J Exp Biol. 212, 2604-2611 (2009).
- Dukas, R. Mortality rates of honey bees in the wild. Insect Soc. 55, (2008).
- Behrends, A., Scheiner, R. Learning at old age: a study on winter bees. Front Behav Neurosci. 4, 15 (2010).
- Huang, Z. -Y., Robinson, G. E. Honeybee colony integration: Worker-worker interactions mediate hormonally regulated plasticity in division of labor. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 11726-11729 (1992).
- Huang, Z. Y., Robinson, G. E. Regulation of honey bee division of labor by colony age demography. Behavioral Ecology and Sociobiology. 39, 147-158 (1996).
- Double, K. L., et al. The comparative biology of neuromelanin and lipofuscin in the human brain. Cell Mol Life Sci. 65, 1669-1682 (2008).
- Fonseca, D. B., Brancato, C. L., Prior, A. E., Shelton, P. M., Sheehy, M. R. Death rates reflect accumulating brain damage in arthropods. Proc Biol Sci. 272, 1941-1947 (2005).
- Baker, N., Wolschin, F., Amdam, G. V. Age-related learning deficits can be reversible in honeybees Apis mellifera. Exp Gerontol. 47, 764-772 (2012).
- Capaldi, E. A., et al. Ontogeny of orientation flight in the honeybee revealed by harmonic radar. Nature. 403, 537-540 (2000).
- Marco Antonio, D. S., Guidugli-Lazzarini, K. R., do Nascimento, A. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. RNAi-mediated silencing of vitellogenin gene function turns honeybee (Apis mellifera) workers into extremely precocious foragers. Naturwissenschaften. 95, 953-961 (2008).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. -M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302, 296-299 (2003).
- Schmidt, J. O. Attraction of reproductive honey bee swarms to artificial nests by Nasonov pheromone. Journal of Chemical Ecology. 20, 1053-1056 (1994).
- De Moraes, R., Bowen, I. D. Modes of cell death in the hypopharyngeal gland of the honey bee (Apis mellifera L). Cell Biol Internat. 24, 737-743 (2000).
- Sheehy, M. R. A flow-cytometric method for quantification of neurolipofuscin and comparison with existing histological and biochemical approaches. Arch Gerontol Geriatr. 34, 233-248 (2002).
- Hsieh, Y. S., Hsu, C. Y. Honeybee trophocytes and fat cells as target cells for cellular senescence studies. Exp Gerontol. 46, 233-240 (2011).
- Wolschin, F., Munch, D., Amdam, G. V. Structural and proteomic analyses reveal regional brain differences during honeybee aging. J Exp Biol. 212, 4027-4032 (2009).
