ハニービーモデルの老化、減速し加速し、逆に試験片を得た

Summary

ミツバチの労働者では、高齢化が社会的行動ではなく生活年齢に依存します。ここでは、非常に異なる加齢パターンを持つ労働者のタイプが取得され、細胞の老化を分析する方法を示しています。

Abstract

高度に社会的な動物の社会は密接に関連し、個人間の広大な寿命の違いを備えています。社会性昆虫の中では、ミツバチが寿命や老化における可塑性が社会的要因によって説明される方法を研究するための最良の確立されたモデルです。

ミツバチの労働者階級は、蜜や花粉を集めるひなを傾向がある看護師蜂、および飼料収穫機蜂が含まれています。以前の研究は、脳機能と飛行性能は看護師に比​​べて飼料収穫機でより急速に老化することを示している。飼料収穫機が看護業務に戻すしかし、脳機能は、回復することができます。加速され、逆に機能的な老化のようなパターンは、タンパク質存在量の変化に免疫機能に、変更された代謝資源のレベルにリンクされています。ビテロゲニン、ホルモン制御および細胞防御における適応機能を備えた卵黄タンパク質は、労働者に別の高齢化のダイナミクスを制御し、ネットワーク内の主要な調節要素として機能することができる。

ここでは、看護師や飼料収穫機の出現を監視し、かつ長寿命の看護師に、通常短命の飼料収穫機からの逆転を含め、操作する方法について説明します。当社の代表的な結果は、同様の暦年齢と個人は実験条件の下で飼料収穫機や看護師の蜂に分化する方法を示しています。我々は戻って看護師への飼料収穫機からの行動の逆転を検証する方法を例示している。最終我々は、細胞老化は、リポフスチンの蓄積は、老化の普遍的バイオマーカーを測定することによって評価することができる異なる方法を示している。

社会的な影響をリンクすることができるメカニズムを研究し、可塑性をエージングのために、このプロトコルは、関連するサンプル材料を取得するように設定され標準化されたツールを提供し、将来の研究の間のデータ比較可能性を改善する。

Introduction

高度に社会的な動物の複雑なコロニーの構造は、生殖カーストとの相互作用によって維持されており、様々な社会的なタスクの動作と、典型的には、非再生労働者のヘルパーカースト。別の労働者では、特定の生理学的適応は、個別のSIBケア行動を可能にし、また極端な寿命の違いにリンクされています。ミツバチとモルラットは社会性の加速、無視できるか^{、1〜3老化}逆転のパターンにリンクされているか調べるために最善の発達した動物モデルを表しています。

ミツバチコロニーでは、単一の産卵女王は、食品用のひな、飼料の傾向が数千人の労働者によって支援され、ガード、体温調節や衛生的な行動⁴に従事。これらの労働者の中で最も長い寿命と非常に短寿命の飼料収穫機、中間体と看護師の蜂、冬（diutinus）蜂です。個人は、しかし、恒久的にWO、あるにバインドされていませんrker型が、柔軟性のある行動個体発生を表示する：彼らは（「時間カースト」）を別の社会的なタスクの動作から変更してください。キャロウミツバチは、最終的には外部の採餌に変更されることがあり、看護師蜂を、傾向ひなに変更することができます。しかし、キャロウの巣のミツバチも最長寿命の冬のハチに変身することができ、かつ短命の飼料収穫機であっても、通常より長い寿命の看護師に戻すことができます。極端な（冬の蜂）と中間体（看護師の蜂）の寿命を持つ労働者が豊富なリソースとよく発達した食料生産および貯蔵器官を持っている- ^（1,5に概説されている）、短命飼料収穫機とは対照的である。しかし、個々の寿命の調節は、個々のリソースバランスの簡単な変更を超えていることは、ゼリーの生産^6、ホルモン制御^7、免疫などの非再生ワーカーカーストに多様な適応機能を備えてい卵黄タンパク質、研究によって示唆されている⁸および抗酸化防御^9。

Fパターン労働者の間で、嗅覚のために確立され、また他の脳や運動機能のためunctional下落（老化）、ミラーの寿命格差^10月13日 。長寿命の冬の蜂¹⁵で検出可能な減少（無視できる老化）の欠如とは対照的に、具体的には、採餌のわずか2週間後の学習機能の大幅な減少は、飼料収穫機¹⁴で同様の死亡率の進行と一致します。

柔軟な老化の分子指紋を識別するために、我々は^8,16,17のエージングタイプの遷移を監視し、操作を可能に確立された実験パラダイムに適応。暦年齢と高齢化に関する作業員型特異的社会的行動の影響を分離することができるサンプルの入手方法1の詳細を実験する。実験2が遅く老化ダイナミクスと看護婦の蜂へと加速した飼料収穫機の逆転を説明しています。実験3はanatomicaによる細胞老化の影響をプロービングするためのアプローチを提供しています細胞の老化（リポフスチン^）18のための確立されたバイオマーカーのL定量化。

Protocol

1。暦年齢から老化をデカップリング

このセクションでは、同じ暦年齢（「未婚年齢集団」）と、巣のミツバチのコホートを共有する識別された個人の集団で構成され、二重コホートコロニーのセットアップについて説明します。未婚年齢コホートの同じ高齢者は、最終的には別の高齢化ダイナミクスと異なる労働者のタイプに分離する - これらは加速機能低下で減速し、飼料収穫ミツバチと看護婦の蜂です。すべての手順は、1実験コロニーに記載されている。我々は、コロニーの効果が（二反復設計）のために制御することができるように複製する少なくとも二つのコロニーのための実験を​​行ったが、助言する。

1. ダブルコホートコロニーハイブボックスの準備：1、通常のハイブ蜂蜜を2食品の櫛を受けボックス、花粉と他の食品くし、および2の空の櫛を準備します。 3,000人以上と交配女王だけでなく、ドナー植民地を見つけることを確認してください巣のミツバチ。どちらも、（1.3）後で紹介します。
2. 同じような生活年齢を持つ個人の入手方法およびマーキング：出現しようとしている密封されたひなに櫛を収集します。 1複製のために3,000〜5,000キャップひなのセルの合計で櫛を集めることを期待しています。それぞれについて、母親の遺伝子型（ハイブ起源）の歪んだ分布を回避するために、少なくとも三つの異なるハイブ源からひなのバランスのとれた量を使用して複製します。
   1. 60〜70パーセントの相対湿度を34℃に設定したインキュベーター内ひな櫛を配置します。新興ひなを免れることはできないような方法で櫛を保管してください。
   2. ミツバチが2日間出てみようと胸郭（ 例えばユニPOSCA、三菱鉛筆株式会社）に小さなペンキタグでこれらのミツバチをマーク。ペンキマークは未婚年齢コホート（出現の日）のミツバチを特定できるようになり、その他の複製コロニーと区別するために。
3. 私のコホートが含まれて二重コホートコロニーをセットアップdentified、未婚年齢の蜂：日に若いミツバチがマークされているが、参照してください（（。議論ではセクション1と比較されたい）、そして前に準備したハイブボックスにこれらのマークされていないミツバチを追加ドナーコロニーからの約2,500〜3,000巣のミツバチを集めるステップ1.1）。後者の人々は、正体不明の巣のハチのコホートを構成する。
   1. 最初は女王ケージ（市販品）に限定される女王を追加します。働き蜂がゆっくりと女王を解放するために食用キャンディー（ 例えば Apifonda、SüdzuckerAG、マンハイム/オクセンフルト、ドイツ）でケージを封印。
   2. 未婚年齢集団を構成する新規に登場し、マークされたミツバチを追加します。これらのハチは、マークされた個人であり、以下のすべてのステップのためのフォーカスグループである。
4. 発症を採餌し、飼料収穫機のマーキングモニタリング：発症と未婚年齢コホートにおける看護師への飼料収穫機の移行動態を評価するために、採餌活動eの人口統計開発を監視各コロニーのために非常に先日。コロニーが設立された後の5日間（ 図1）のカウントを開始する。
   1. 一定時間で3×20分間の観察期間内の航空券（入場カウント）採餌から戻っハチの総数をカウントします。 （説明を参照）配向便の期間中にハチをカウントしないようにしてください。
   2. 入場数は（> 100入学カウント/日）を開始するために、かなりの採餌活動を示している場合には、飼料収穫機のマーキングを開始。そのためには、未婚年齢コホート（シングルマーク個人）の飼料収穫機は、最初の採餌便から復帰後第ペンキマークを受ける。この塗料マークは発症を採餌の日を指定し、後で各飼料収穫のための採餌年齢を識別することができます。
   3. ミツバチ十分な数のマークが付けられているまで毎日マーキングを繰り返します。これらのハチは、典型的には14日後に、熟成させた後にマーク飼料収穫の十分な数を推定するため、これ以上の5〜10％以上の回収率を期待する採餌。
5. サンプリング：すべての最初にマークされたミツバチが、同様の暦年齢を持っているので飼料収穫機が≥14日間採食しているときには、看護師や古い飼料収穫の年齢をマッチさせたグループは、同時に収集することができます。
   1. 単一のマークされた看護婦の蜂が巣箱内に収集され、看護行動（オープンひな細胞に置く頭と幼虫の摂食とクリーニング）によって識別されます。
   2. 毎日の採餌活動が始まる前に、二重マーク飼料収穫もハイブ内で収集されます。
   3. 十分な換気を提供するケージ（チューブ、箱）でミツバチを収集し、さらなる処理まで暗く保つ。代わりに、トランスクリプトーム、エピジェネティックやプロテオミクス研究のために、直接液体窒素中で凍結ミツバチスナップ。すべてのテストグループから個人のバランスの取れた数値を収集し、コロニーを複製する。

2。ハイブの人口統計の変更によって遅く加齢に伴って労働者に迅速な労働者の逆転</ pの>

このセクションが遅く、加齢に伴う労働者に促進老化（飼料収穫機）（看護師蜂）との労働者からの反転が行われている方法について説明します。飼料収穫機は、通常のひなのケアに携わる看護師のミツバチの不足が発生した場合、このような行動の逆転は、誘導される。復帰の手順は、単一のコロニーを分離する2つのじんましんに複製：看護師の蜂画分（「看護師由来」）、および飼料収穫機画分（「飼料収穫由来」）を持つ別の1と1ハイブを。成功した反転後、プラスチックの可能性症状と高齢化が反転すると元に戻り、労働者、継続的な飼料収穫、継続的な看護師の蜂や新入飼料収穫機で未婚年齢コホートで研究することができる。以前のように、一つの年齢層ではなく、正体不明の巣のミツバチの集団の識別されたハチは、実験的なフォーカスグループを構成している。

1. 準備：看護師とのじんましん（シングルマーク）と飼料収穫機（ダブルマーク）を複製、前のセクションで説明したように利用できるようになります。復帰が完了した後に十分な取得を確実にするために複製コロニーあたり500未満とマーク飼料収穫機での復帰を開始しないようにしてください。
   1. 反転後のテストグループを安全に識別のためには、元のハイブ全体飼料収穫機の人口は、復帰前にオフにマークされていることが重要です。以下の手順は、1つのレプリケートに記載されている。
   2. 復帰前日に、飼料収穫機由来のハイブの1の追加のハイブボックス（ステップ1.1参照）を準備します。クイーン、ドナーハイブから2ひな櫛の位置を確認します。実験コロニーへの転送前に、これらのとさかからすべての大人のハチを離れて磨く。一ケージ女王（ステップ1.3を参照）、1ひなコームは、オリジナルハイブボックスに女王とひな櫛に置き換えられます。女王とひなコムの他のセットは、新しいハイブボックスの次の日に使用されます。両方、オリジナルと新しいハイブがいることを確認することをお勧めしますための新しいひな櫛とエイリアンクイーンの同じような配分に分離飼料収穫機や看護師Sも同様に経験がハイブ合図（「ハイブ臭い」）を変更します。
2. 復帰：午前中だけ復帰する前に、飼料収穫機由来の割合を受け取る新しいボックスにケージ女王とひなコムを追加します。ピーク採餌時間が開始されるまで待ちます。そして、少なくとも100メートル離れて元の位置からマークされた飼料収穫機や看護師の蜂、元植民地を移動します。
   1. 元の場所に、ひなのみ女王と飼料収穫由来ハイブの新しいボックスを設定します。
   2. 飼料収穫機は脱臼オリジナルハイブボックスをオンのままにし、元の場所に戻って向かいます。飼料収穫機は巣のミツバチからの飼料収穫機の人口の分離を完了するために、次へを達成するために2時間を元の場所に戻ることができます。
   3. その後、分離を終了するために、オリジナルの、今 "看護師由来の「ハイブを閉鎖し、少なくとも3キロ離れて養蜂場に移す。
3. 成功社会的タスクのハイブの保守お ​​よび監視反転：健康、オープンひなのために定期的に実験的なじんましんを確認してください。
   1. コロニー操作後の最初の日の間に潜在的な病原体の負荷を軽減するために、無人、死んだひなを交換してください。
   2. コームを交換したとき、または復帰実験が完了したときに飼料収穫由来ハイブ内で成功し逆転を検証するには、（ 図2）、再びこれらを導入する前にひなの櫛の写真を撮る、と。以前に上限なしのひなと、オープン、ライブひなとの領域は飼料収穫由来コロニーでの看護活動の信頼性の高いマーカーである。
4. サンプリング：社会的な反転に伴う生理学的効果は3-8日飼料収穫機や看護後に検出することができる分離した。
   1. 我々は、すべての試験群、 すなわち逆戻り労働者と継続的な飼料収穫機（飼料収穫由来ハイブ）だけでなく、逆転が開始された8日後の継続看護師や、新たに採用さ飼料収穫機（看護師由来ハイブ）をサンプリング助言。
   2. コルステップ1.5で説明したようにセレクトサンプル。

3。リポフスチンの定量化によって労働者タイプ特異的細胞老化のパターンを分析する

リポフスチンは、細胞老化の普遍的なバイオマーカーである。真性累積生成物として、リポフスチンの特異的自己蛍光（発光_最大 = 530から650 nm）を¹⁸検出のために使用することができる。

1. 切開および固定：動かまで氷上チルミツバチが、削除して、所望の組織標本を解剖する。
   1. 4℃で一晩のインキュベーションのために、固定液中（pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水、PBS中4％パラホルムアルデヒド）を転送する
   2. PBS中のサンプル3回洗浄します。
2. 組織処理および取付け：振動刃ミクロトーム、 例えばライカバーモント1000S（ライカバイオシステムズ、ボック、ドイツ）を使用して、例えば、それ以上40μm以下の厚さのセクションに組織サンプルをカットします。
   1. 50％グリセロール（PBS）に、顕微鏡スライド上のセクションをマウントします。長期保存のためのシールカバーはマニキュアでスリップ。
3. 像取得：リポフスチンに検出するために、私たちはλ= 514、561nm又は励起ための同様のレーザラインを与えるレーザー走査焦点顕微鏡で使用することをお勧めし、検出器の帯域幅は570から650程度に設定して。
   1. リポフスチンのよりよい識別のために、第二のチャネルが含まれ、より短い波長のスペクトル（励起= 405nmで、発光= 410から450ナノメートル）での同時スキャンを実行する。より長い波長チャネルの両方、リポフスチン顆粒を明らかにするだけでなく、自家蛍光による気管および他の非グラニュラ構造への非特異的な「バックグラウンド」であろう。第二の、より短い波長チャネルは非特異的自己蛍光を明らかにではなく、リポフスチンう。このように、リポフスチン識別は設備などが可能いずれか一方だけがリポフスチン特定の蛍光を顆粒を明らかにして、両方のチャネルの信号を比較することでtated。
   2. 高解像度の画像を取得するために40Xの倍率以上、1.25以上、好ましくは開口数を有する対物レンズを使用する。スキャン画像は、約^{100×100×10〜3}の寸法のスタック。すべての個々の組織サンプルは、複数の画像スタックによって表されなければならない。
   3. 技術的変動に起因する個体内および個体間のばらつきを低減するために、常にレーザパワーと検出器の感度を一定に保つ。
   4. 日日々の技術的な変化によって偏りを減らすために、いくつかのスキャンの各セッションのすべてのテストグループの等しいサンプル数をスキャンします。
4. 画像処理：顕微鏡画像スタックの高度な処理を可能モジュールとソフトウェアパッケージを使用して、例えばImageJの（健康、ベセスダ、メリーランド州、米国の米国の国立研究所、gej.nih.gov / ijは/ "ターゲット=" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/）。
   1. 3次元画像スタックのそれぞれについて最大2D投影を生成する。
   2. 高周波ノイズを減衰させる、及びリポフスチン顆粒の寸法を有する構造を維持するために、適度なカーネルサイズを有するガウスフィルタを適用する。
   3. リポフスチンの識別を容易にするために、両方の色チャネルをマージする（ステップ3.2参照）。
5. 画像分析：定量化の手順を実行して、被験者がテストグループIDに盲目になることを確認してください。
   1. 全ての画像について、まず、関連する構造をカバーし、他の画像からのROIと同様の寸法を有し、関心領域（ROI）を選択します。
   2. その後、各ROIを表すリポフスチン顆粒の希望する番号を選択します。 ROI内のリポフスチン顆粒を選択する場合は、次の規則の適用は、主観的なバイアスを減らすことができます。
      1. 最初granuを選択するための一貫性のある場所を選択ル。これは、例えば、ROIの最左端とすることができ、縁部に最も近い顆粒は、常に最初の選択であろう。
      2. 続々は、顆粒は前の選択（次の隣）に最も近いものが選択される。
      3. 次の隣を選択する際に、唯一の前の選択から右の検索たとえば、一方向のみに移動する。この規則は、選択が高密度に充填された顆粒の時折のクラスタによって支配されることを防ぐことができます。
      4. 選択が完了すると、それぞれの顆粒領域を概説し、測定することにより、各リポフスチン粒子の大きさを評価する。別のテストグループの個人を比較するために、適切な統計的検定を使用してください。

Representative Results

試験群は加速し、減速し、単一の年齢層を有するコロニーの老化を逆の属性を研究するために得ることができるどのようなプロトコルのセクション1と2に詳細。我々は（ 図1、セクション1と比較されたい）6コロニーについて飼料収穫機のカウント（「入学カウント」）を評価し、正常な個体発生に伴う労働者タイプの分化を監視します。グラフは、個人が10日以上経過した前に、飼料収穫機状態に看護師からかなりの変化が典型的に観察されないことを示している。飼料収穫機数の著しい変動が異なるコロニーのうち採食開始のタイミングに関しては観察し、各コロニー内でマークされた日々の変動の通りであった。別にこのような異なるひな負荷などのコロニー特定人口統計学的要因から、多くの変動性は、気象条件（ 図1の赤でマークされた時点）を変えることによって説明される。採餌ダイナミクスの綿密なモニタリングは、したがって、DURマーキングと収集の努力を最適化することをお勧めします実験ING。

バック看護タスクへの採餌と逆に個体発生（第2）飼料収穫由来コロニー（ステップ2.2および2.3を参照）に導入されたひなの櫛を検査することによって検証することができます。 3回の反復のために図2A、C、Eの表示ひな櫛飼料収穫由来のコロニーへの導入の前にすると、 図2（b）、D、Fが除去された後、それぞれの櫛を示します。新しく頂いたひな、健康で幼虫とひな細胞の周りに増加花粉ストレージのパッチは、かつての飼料収穫機は今成功裏に看​​護タスクを含む、典型的な巣を実行していたことを示している。

リポフスチン（セクション3）は、細胞老化の高度に保存された症状であり、かつ容易に様々なハチの組織における実験後の分析のために評価することができる。 図3は、の下咽頭腺で、顆粒サイズ（ 図3E）として測定、リポフスチン蓄積を対比年齢の一致した看護師AND飼料収穫ミツバチ。二人の若いと2歳のグループの間の生活年齢の差は外での飛行や食料収集活動にこれらの≥17日間過ごしのみ1グループ（飼料収穫機）で、≥17日であった。代表顕微鏡像（ 図3A〜D）を表示する（ 図3D）採餌のではなく、同じような生活年齢の古い看護婦の蜂のための17以上の日後にのみ、それ以上の年齢の飼料収穫機のグループのためにリポフスチンの蓄積を増加させた（37-43日間、 図3B） 。固定主な要因ワーカー型（飼料収穫機、看護師）と、年齢差（Δage≥17日間）との2因子性ANOVAは、労働者型、年齢差と両因子間の相互作用（F _タイプ = 33.67、Pに対する有意な効果を明らかにした<0.001; = 21.93 _FΔage、P <0.001、F _型XΔage= 22.07、p <0.001）。しかし、事後テストは唯一の重要な効果を示した若い飼料収穫機、または両方の看護師グループに古い飼料収穫機（採餌の≥17日間）を対照的な（PF 17D対F _1d/N1d/N17d <0.001、フィッシャーのLSD、 図3E）とき。差は年代順に老いも若きナース·グループ（; 図3E P> 0.5ですべてのテスト、フィッシャーのLSD）など、後の3つのグループの間で検出されなかった。これはリポフスチンの蓄積がなく、唯一それ自体暦年齢の関数ではなく、飼料収穫具体的な活動（採餌年齢）に依存していることを示唆している。

図1。正常な個体発生時の労働者タイプの分化。彼らが確立された後の5日に開始する6つのコロニーを数え採餌フライトから戻っ飼料収穫機のグラフ表示の入り口カウント（詳細は、議定書のセクション1.4を比較してください）。 NEからのかなりの移行未婚年齢コホートのマークされた個人が約10日齢頃採餌活動にSTが最初に観察された。累積入場回数のための様々な斜面は、飼料収穫機への移行看護師蜂のダイナミクスは、コロニー間で異なり、気候要因の影響を受けていることを示している。例えば、雨や採餌の2時間未満であった日に、入射数の増加は、典型的には、（赤のデータポイント）を平ら。

図2。これらは飼料収穫由来じんましんに導入される前に、それらはこれらの巣箱から取り出した後の行動の復帰を検証。飼料収穫機が正常に看護業務に戻っているかどうかをテストするために、我々はひなの櫛を比較した。代表的な画像を紹介（A、C、E）の前にひなの櫛を示し、三つの異なる飼料収穫由来蕁麻疹からの除去（B、D、F）の後であった。以前の飼料収穫機ミツバチによるひなのケアに蓋ひなを持つ細胞数の増加によって示されている（B、D、F、D内のイラスト黒い矢印）、気泡中の幼虫（赤い矢印）の生存を持続したため、終了する花粉の増加ストレージひな細胞（白矢印）。飼料収穫由来·コロニーは、最初は看護師に由来するコロニーよりひなの世話で、通常あまり効率的であることに注意してください。これは飼料収穫由来コロニーの高等幼虫の死亡率につながることができます。 B、D、F内の画像は、ひなのとさかが飼料収穫由来のコロニーに導入した5,4及び7日後に採取した。

図3。リポフスチンの蓄積、細胞のバイオマーカーウラル老化は、労働者タイプの特定の組織の劣化を示すことができます。（A）、老いも若きも、看護師の蜂（B）の中でだけでなく、年齢を一致させた飼料収穫機ミツバチにおける下咽頭腺の代表的な顕微鏡画像≥1日（C）と、それぞれ≥ 17日採餌経験（A = 20ミクロン中のスケールバー）。リポフスチンの蓄積は顆粒サイズとして測定し、各年齢およびワーカー型（E）のためにN = 5の個体のための中央値と四分位数として与えられる。同期間は、（統計結果を参照）看護師蜂におけるリポフスチンの変化には至らなかったものの、大幅なリポフスチン蓄積をもたらし17日間採餌。

Discussion

ここでは、前述の^{8,16,17,19,20に}近づく採用し、ミツバチに柔軟な老化を研究容易にする単一のワークフローに統合する。我々の目的は、関連するサンプル材料を得るために標準化された設定ツールを使用してこのフィールドの初心者である科学者を提供し、異なる研究チーム間の実験的再現性を改善することである。私たちの手順が簡略化されており、それ以前の説明（実施例⁸についての比較）のように特別な装置を必要としませんが、念のため、いくつかの対策が推奨され、以下に収集されます。

暦年齢から老化を切り離す。A最も重要な側面は、採餌行動の最初の確認（マーキング2 ^回目 ）の間に飼料収穫ミツバチの誤識別を回避することである。そのため、飼料収穫機を監視し（「入学カウント」）またはマークする場合には、厳密にオリエンテーション便との日常の期間を避けます。これらの期間の間に多くの事前フォーラムパトンのステージ蜂は逸脱したりハイブを入力します。これらのハチは、成熟した飼料収穫機の代表的な生理学的特性を表示しますが、容易に識別円形の飛行パターン²¹によりハイブ周囲の空間マップを構築しないでください。

ほとんどのミツバチが2週間、高齢の年齢とともに採餌に変化している間、散発採餌（ 図1）非常に若い年齢で既に観測されている。非常に早熟な飼料収穫機は通常、看護婦の段階を通過したことなくキャロウ巣ミツバチから直接開発しています。このような異常な個体発生^（22およびその中の参考文献を比較）を持つ個人が含まれないように、10日以下の年齢とともに採餌始める個人はさらなる分析のために考慮されません。

さらに早熟飼料収穫機の過剰発現を回避するために、我々は、単一の年齢層^17,23に成る古典「一コホートコロニー」を利用していない。その代わりに、設定するとき我々はマークされた未婚年齢コホートにランダムネストミツバチ（「ネスト蜂コホート」）を追加したコロニーを（ステップ1.1および1.3を参照）。ランダム巣ミツバチは通常、古いので、それらは非常に早熟な飼料収穫機¹⁷へと発展して非常に若いミツバチへの圧力を減らすことができます。このような二重コホートコロニーは、それゆえ、より良いゆっくり採餌に看護から進行個人と自然ハイブ人口統計に似ていることがあります。

長期的な労働者の特定の適応を研究する際には、採食時間外にすべてのテストグループを収集します。これは、飛行を排出するなど、近年の自発活動に、より深刻な代謝調整の偏りを軽減することをお勧めします。

急速に労働者の逆転は飼料収穫機が戻って、それが看護師に由来するハイブ（> 3キロ）を離れて移動することが不可欠である元の場所に飛んだ後ハイブの人口統計を変更することにより、老化を遅くする 。これは、事前に採餌ステージミツバチが募集してに導かれることを避けるためであるそれぞれフェロモン通信²⁴を介して他の蜂によって、元の場所、。

さらに飼料収穫由来ハイブに入るの任意の看護師や他の事前採餌個人を防ぐために、我々は次の規則に合わせアドバイス：毎日オリエンテーション便を開始する前に、（I）分離操作を終了します。 （II）強いだけ採餌活動が観測された日に逆転を試みる。 （III）のオリジナルハイブの初期転中および後に、ミツバチの不必要な攪拌を避けるため、特にハイブを開けないでください。

原則的に、看護師が奪われた環境で飼料収穫機を閉じ込める以上の人工のセットアップはまた、復帰につながる可能性があります。しかし、そのような設定はこのように看護師に由来するコロニーからの対照群との直接比較を排除、飼料収穫由来分の経験、他のストレスの多い環境などの情報価値が限られている。

別の老化パターンの確認リポフスチンは、この組織の中で最も容易に検出可能であるため、リポフスチン、細胞老化のバイオマーカーの定量化によって。ここでは、画像や下咽頭腺の統計データとリポフスチン評価を例示した。これは、我々は信じている、顕微鏡検出のための正しいプロトコルを設定し、経験の浅い観測者を支援することが重要です。しかし、他の組織とは異なり、下咽頭腺は、遷移^25を飼料収穫するために、看護師の間に生じた重要なアポトーシスおよび壊死を表示するのです。このようなプロセスは、我々は最近、看護業務（ 図3C、E）から変わっていた若い飼料収穫機におけるリポフスチンのレベルの上昇を検出しなかったとしても、老化マーカーの蓄積と相互作用することができる。しかしながら、他のハチ組織における老化対策を評価するために、ここで説明する顕微鏡法に基づく方法を容易に適合させることができる。

別の方法として、フローサイトメトリーのアプローチはより少ない時間^26を消費^している。顕微鏡ベースの分析細胞の老化症状が異なる領域または単一の器官²⁷内の細胞について評価することができるという利点を有する。脳と細胞の老化²⁸における空間的不均一性とその他の複雑な器官での研究のために、我々は、したがって、顕微鏡ベースのアプローチをお勧めします。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000