Summary
طورنا في الدماغ الشوكي الحبل إعداد سليمة لتسجيل ورصد النشاط الكهربائي عبر التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية والخلايا ماوتنر الشبكي الأخرى في الأجنة الزرد. وبالتالي، نحن قادرون على تسجيل التيارات متشابك مثير والمثبطة، والنشاط قناة الجهد بوابات وإمكانات العمل من الخلايا العصبية الرئيسية في الجنين النامية.
Abstract
خلايا ماوتنر (الخلايا M) هي الخلايا العصبية الشبكي كبيرة تقع في الدماغ المؤخر من الأسماك مكتملة العظام. فهي الخلايا العصبية الرئيسية المشاركة في السلوك المميز المعروفة باسم C-بدء أو استجابة الهروب التي تحدث عندما يدرك الكائن الحي تهديدا. وقد تم في خلايا M درس على نطاق واسع في ذهبية الكبار حيث أنه ثبت للحصول على مجموعة واسعة من مثير، وإشارات المثبطة وneuromodulatory 1. لقد تم دراسة النشاط M-خلية في الزرد الجنينية من أجل دراسة جوانب التنمية متشابك في إعداد الفقاريات. في أواخر 1990s وضعت علي وزملاؤه استعدادا لالمشبك التصحيح التسجيل من M-الخلايا في الأجنة الزرد، الذي كان CNS 2،3،4 سليمة إلى حد كبير. كان الهدف في ذلك الوقت لتسجيل نشاط الخلايا العصبية من الدماغ المؤخر متشابك، الخلايا العصبية في النخاع الشوكي والجذع العضلات والهيكل العظمي مع الحفاظ على اتصالات متشابك وظيفية ضمن إعداد الحبل الشوكي والدماغ سليمة.لا يزال يستخدم هذا المستحضر في المختبر لدينا اليوم. لدراسة الآليات الكامنة اللدونة متشابك التنموية، نسجل مثير (أمبا وNMDA بوساطة) 5،6 والمثبطة (GABA والجلايسين) التيارات متشابك من تطوير M-الخلايا. الأهم من ذلك، هذا المستحضر الفريد يسمح لنا بالعودة إلى نفس الخلية (M-الخلية) من الإعداد إلى إعداد دراسة بعناية اللدونة متشابك والعصبية التنمية في كائن حي الجنينية. الفوائد التي يقدمها هذا المستحضر تشمل 1) سليمة، واتصالات متشابك وظيفية على خلايا M، 2) التحضيرات غير مكلفة نسبيا، 3) كميات كبيرة من الأجنة متاحة بسهولة 4) القدرة على العودة إلى نفس نوع الخلايا (أي M- الخلية) في كل إعداد، لذلك أن التنمية متشابك على مستوى خلية واحدة يمكن فحص من الأسماك لصيد السمك، و5) التصوير من الاستعدادات كاملة نظرا لطبيعة شفافة من الأجنة.
Introduction
واحدة من المسائل العالقة في بيولوجيا الأعصاب التنموية تتعلق دور الظواهر اللدونة متشابك خلال نضوج متشابك. تركز بحثنا على فهم آليات اللدونة التي تكمن وراء تطوير متشابك مع الهدف العام لفهم سلوك الحيوان في سياق التنمية متشابك. من أجل القيام بذلك، قمنا بتطوير إعداد سليمة إلى حد كبير في الكائن الحي (الزرد، دانيو rerio) التي اكتسبت قوة الجر كبيرة للدراسات التنموية في أواخر 1990s.
الزرد يوفر مزايا عدة متميزة للدراسات النمائية العصبية. على سبيل المثال، يتم تسلسل الجينوم واحدة يمكن أن تؤدي knockdowns morpholino وبالضربة القاضية الزنك الاصبع نوكلياز لإسكات نشاط الجينات والبروتينات التعبير. يمكن للمرء أيضا إجراء دراسات من overexpression وخطوط المعدلة وراثيا يمكن بناؤها 7-9. الأجنة هي سهلة نسبيا وفيرة للحصول على وطبيعة شفافة للجنين يفسح المجال بشكل جيد للتصوير والدراسات البصريات الوراثية. بالإضافة إلى ذلك، التحليل السلوكي يمكن أن يؤديها، ويمكن القيام التجارب الكهربية على ألياف العضلات، والخلايا العصبية في النخاع الشوكي والدماغ المؤخر الخلايا العصبية في الكائنات سليمة إلى حد كبير، مما يسمح احد لفحص وظيفة الخلوية في الجسم الحي. الأهم من ذلك، نحن قادرون على دراسة النشاط متشابك وليس فقط في نفس الفئة من الخلايا، ولكن في نفس الزوج من الخلايا العصبية، من الإعداد إلى إعداد. وبعبارة أخرى، وهذا هو واحد من الاستعدادات الفقارية النادرة التي يمكن للمرء أن يعود إلى نفس الخلايا العصبية، في الموقع، لدراسة تطورها.
من أجل الحفاظ على الدوائر العصبية قابلة للحياة بقدر الإمكان، وضعنا في إعداد والتي تركت الحبل الشوكي والدماغ المؤخر سليمة، في حين لقط التصحيح من الخلايا M. في هذا الإعداد، يتم إزالة العيون، والفك والجلد تتراكب الدماغ بلطف والدماغ المؤخر هو peeleد بعيدا عن الحبل الظهري، مما يتيح الوصول إلى السطح البطني من الدماغ المؤخر. توجد الخلايا العصبية الشبكي بضعة ميكرومتر عميقة ويمكن الوصول إليها بسهولة نسبيا. في 48 ساعة آخر الإخصاب (HPF؛ يتم سرد بعض الاختصارات في الجدول 1) الخلايا المدمجة كهربائيا ويمكن للمرء أن يسجل بأمانة النشاط متشابك (وكلاهما مثير والمثبطة التيارات)، والتيارات الجهد بوابات وإمكانات العمل منها.
وقد اقترح النتائج التي توصلنا إليها أن العديد من جوانب التنمية متشابك والنضج تحدث في ساعة 24 قبل الفقس، وبالتالي يتركز جزء كبير من اهتمامنا على الكائنات الحية تتراوح أعمارهم من 24 إلى 72 HPF HPF. ومع ذلك، من خلال 72 HPF، M-الخلايا هي أقل إحكاما كهربائيا ويصعب بشكل صحيح المشبك الفضاء. تقنية يمكن استخدامها لتسجيل ليس فقط من الخلايا M، ولكن أيضا من لhomologs، MiD2 سم وMiD3 سم. نظريا، يمكن للمرء أيضا تنفيذ تسجيلات مزدوجة، من سالخلايا العصبية الحبل إينال مثل الخلايا العصبية الحركية الأولية ومن الخلايا M، ولكن هذا صعب ويمكن القول أن الفوائد المكتسبة من هذه التقنية صعبة قد لا يكون يستحق كل هذا الجهد الاستثنائي ما هو مطلوب.
Protocol
1. إعداد وتشريح
- إعداد طبق تشريح اصطف مع Sylgard. تستخدم في تشريح الأطباق (الشكل 1)؛ تسجيل من غرف WPI (مدرجة في الجدول 2 موردون ساراسوتا بولاية فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية). صممت الغرف لاستيعاب الشرائح الزجاجية وتستخدم غسالات بلاستيكية صغيرة كما قوالب لSylgard. يتم إصلاح غسالات الأولى إلى الشريحة مع الشحوم ويضاف Sylgard السائل إلى مركز للغسالة. سوف Sylgard علاج بين عشية وضحاها، وكما يفعل ذلك، وأنها تشكل سرير صغير، والتعميم على شريحة زجاجية، والذي يصبح قاعدة للطبق تشريح. يتم وضع شريحة في غرفة تسجيل وبمثابة قاعدة للغرفة التي يتم تثبيتها إعداد (الشكل 1).
- إعداد الحلول المدرجة في الجدول 3. ينبغي أن يترك حلول خارج الخلية في درجة حرارة الغرفة في حين يجب أن تبقى الحلول العقيمة داخل الخلايا. يمكن للمرء أيضا إضافة لوcifer الصفراء (0.1٪) إلى حل داخل الخلايا لذلك قد يتم تنفيذ هذا التصور من التشكل M-الخلية في نهاية التجربة. هذا يخدم لتأكيد هوية الخلية (الشكل 2).
- رفع نوع البرية الأجنة الزرد في الماء البيض في 28.5 درجة مئوية، وجمع والمرحلة وفقا لكيميل وآخرون 10. للتشريح، ونقل الأجنة إلى طبق تشريح الذي يشغل أيضا منصب غرفة تسجيل. تخدير لمدة 7-10 دقيقة في محلول الملح التخدير (0.02٪ تريكين؛ حل 1، الجدول 3) أن يقترب عن كثب المالحة الفسيولوجية. يمكن للمرء تحديد ما إذا كانت هي تخدير كاف عن طريق فحص استجابة لقرصة الذيل لطيف.
- دبوس الأجنة من خلال الحبل الظهري وعلى طبق Sylgard مبطنة مع 0.001 "سلك التنغستن (الآلات العلمية الخدمات. شركة Ringoes، NJ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام 25X التكبير على مجهر تشريح (الشكل 1). يتم قطع سلك التنغستن بسهولة فيإلى شرائح صغيرة مع مقص تشريح غرامة.
- ضبط التكبير على نطاق تشريح ل40-50X لأداء تشريح. بمجرد دبس الجنين إلى الطبق، والفك والعينين والدماغ الأمامي تتم إزالة باستخدام زوج من ملقط غرامة (دومون # 5).
- ومقشر الدماغ المؤخر بلطف بعيدا عن الحبل الظهري الأساسية من خلال العمل بعناية ملقط بين الحبل الظهري والدماغ. ثم يتم تشغيل الدماغ المؤخر بلطف أكثر من ذلك أن السطح البطني يواجه عقوبة تصل. يوفر هذا الموضع سهولة الوصول إلى خلايا M، والتي هي عادة في غضون 5-10 ميكرون من السطح البطني في الأجنة الشباب و~ 20-50 ميكرومتر في اليرقات الأكبر سنا (الشكل 2A).
- نقل بعناية تمهيدا لإعداد التسجيل الذي لا يمكن أن يؤديها التجربة المشبك التصحيح. وتصور للخلايا M مع Nomarski التفاضلية التدخل التباين (DIC)، على الرغم من غيرها من طرق التصوير (أي هوفمان تعديل التباين أو التدرج Dodt التصوير التباين منLuigs ونيومان، ألمانيا) يمكن أن تستخدم أيضا.
2. التصحيح المشبك تسجيل (وضع خلية الجامعة)
- يتم تنفيذ جميع التسجيلات في كل وضع المشبك التصحيح الخلية 11. توضع غرف على تسجيل مرحلة المجهر في الإعداد الكهربية. يتم إصلاحها المراحل لدينا وانسحب تستقيم المجهر المشبك التصحيح إلى منصة المجهر منقولة أو مترجمة المجهر.
- يتم سحبها ماصات التصحيح المشبك على ساحبة الأفقي (ف 97؛ سوتر الآلات شركة) من رقيقة الجدران والزجاج البورسليكات تم الحصول عليها من WPI. بأقطار ماصة غيض هي بناء على أمر من 0.2-0.4 ميكرومتر بعد تلميع النار إلى حافة على نحو سلس، وتفتق عرقوب هو ~ 4 ملم في الطول.
- إرفاق ماصة إلى مكبر للصوت وجها لمرحلة من مراحل الإعداد الكهربية. فمن المهم للحفاظ على مرحلة الرأس بنحو زاوية 45 درجة إلى المحور الأفقي وهذا يضمن زاوية دخول للماصة التي هي مناسبة لتشكيل عالية ختم المقاومةق على الخلية ماوتنر.
- فقط قبل الدخول إلى حل حمام، تنطبق على كمية صغيرة من الضغط الإيجابي إلى ماصة لتقليل فرصة توسخ طرف. عند تسجيل mEPSCs، وتشمل حلول حمام 1 ميكرومتر TTX لمنع إمكانات العمل، 5 ميكرومتر الإستركنين لمنع المستقبلات الجلايسين و 10 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر bicuculline بيكروتوكسين لمنع مستقبلات GABA. عند تسجيل mIPSCs، وتشمل حلول حمام 1 ميكرومتر TTX، حمض kynurenic وإما bicuculline أو الإستركنين اعتمادا على نشاط مستقبلات المصالح.
- نقترب من الخلايا M مع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي في ماصة. الضغط الإيجابي يدفع بلطف الخلية من جانب إلى آخر وعند وضعه على الفور فوق الخلية، يشكل نقرة صغيرة على غشاء الخلية. ترك ماصة في المكان لبضع ثوان لتنظيف بلطف سطح الخلية بحيث يمكن تشكيل ختم قوية بين ماصة والغشاء. الافراج عن الضغط الايجابي في ماصةيسمح للختم أن يبدأ وكمية صغيرة من الضغط السلبي إلى جانب إمكانات ماصة سلبية النتائج في تشكيل الأختام GigaΩ في غضون ثوان قليلة.
- تغيير محتمل عقد على مكبر للصوت ل-60 بالسيارات. تمزق غشاء الخلية مع سلسلة من نبضات قصيرة من الشفط. تسجيل على الفور إمكانات غشاء وتقليل الآثار السعة. تعويض السعة الخلية (C م) وصول (سلسلة) مقاومة (R أ) عن طريق 70-85٪. R وينبغي رصد روتيني، كل 30 ثانية إلى دقيقة، وإذا كان هناك تغيير 20٪ أو أكثر، إجهاض التجربة.
- بمجرد أن التجربة قد انتهت، وقد اكتسبت ما يكفي من البيانات، وإعداد ضحى عن طريق إزالة الدماغ المؤخر مع زوج من الملقط. عند هذه النقطة، يمكن أن تبدأ تحليل البيانات.
Representative Results
في هذا المخطوط فإننا نقدم وسيلة لتسجيل التصحيح، المشبك في وضع خلية كاملة من الخلايا العصبية الشبكي في الزرد، مع التركيز بصفة خاصة على خلايا M. بطبيعة الحال، فإنه من الممكن أيضا أن يسجل في وسائط أخرى مثل المشبك التصحيح الخلية المرفقة، من الداخل إلى الخارج والخارج بها. نوع البيانات التي يمكن للمرء أن الحصول على لا يقتصر على ما قدمناه هنا، لكننا نحاول أن نقدم مثالا على حد سواء النشاط متشابك (مثير والمثبطة) في وضع الجهد المشبك فضلا عن إمكانات العمل في المشبك الحالي. والذين تتراوح أعمارهم الحي والخلايا M تطوير التشعبات أكثر شمولا وتفصيلا، للخطر القدرة على الجهد كاف المشبك المشبك ومساحة الخلية ويصبح الوضع الحالي المشبك تسجيل في الاختيار.
ويبين الشكل 3 تسجيلات ممثل مثير أمبا ومستقبلات NMDA التيارات الحصول عليها من الأجنة 48 HPF في وجود TTX (1 ميكرومتر) وكلاء الدوائية لمنع GABA ومستقبلات الجلايسين. عندما الخلايا M هي الجهد فرضت في -60 بالسيارات، هي نتيجة لتنشيط مستقبلات أمبا (الشكل 3A) التيارات متشابك. اقتناء وتحليل هذه الأحداث يسمح احد لتسجيل المعلمات مثل وقت الارتفاع، وقت الاضمحلال، والسعة والتردد. أحداث أمبا وعادة ما يكون الوقت الارتفاع السريع (20-80٪ زمن صعود 0.1 ميللي ثانية ~) وتسوس الوقت (~ 0.5 ميللي ثانية)، ويحمل في المتوسط ما يقرب من 25 السعة من السلطة الفلسطينية. عندما فرضت على الخلايا M في +40 بالسيارات، ومن المقرر أن أمبا وNMDA نشاط مستقبلات (أرقام 3C و 3D) التيارات الخارج الناتجة عن ذلك. NMDA مستقبلات التيارات يحمل الدورات وقتا أطول من أمبا مستقبلات التيارات، وتحتاج إلى أن تسجل في إمكانات إيجابية أو في حل الحرة المغنيسيوم لإزالة كتلة المغنيسيوم من NMDA مستقبلات 2،6. متوسط mEPSC هو مبين في الشكل 3D يمثل مختلطة أمبا وNMDA التيارات المسجلة في +40 بالسيارات.
فايجوري 4 تظهر نتائج ممثل عند تسجيل mIPSCs من خلايا ماوتنر. وقعت هذه الأحداث في وجود TTX (1 ميكرومتر) وحمض kynurenic (1 ملم) لمنع أمبا وNMDA المستقبلات. هذه الأحداث تظهر ارتفاع سرعة معقولة وحركية تسوس بنسبة 48 HPF ومتكررة بما يكفي للحصول على الكثير منهم أكثر من دقيقة تسجيل 3 2-3. الشكل 5 يظهر امكانات العمل المسجلة نتيجة للحقن إزالة إستقطاب الحالي في الخلية. M-48 HPF خلايا الأجنة عادة إطلاق إمكانات العمل واحد (الشكل 5B)، على الرغم من أنها في بعض الأحيان نقاط وصول متعددة اطلاق النار عندما تم حقنها مع المثيرات suprathreshold (الشكل 5A).
| الاختصار | الاسم الكامل | |
| 1. | MPSC | الحالي بعد المشبكي مصغرة |
| 2. | mEPSC | مصغرة الحالي بعد المشبكي مثير |
| 2 | mIPSC | مصغرة الحالي بعد المشبكي المثبط |
| 3. | MΩ | ميجا أوم (وحدة المقاومة، و 10 أوم 6) |
| 4. | GΩ | جيجا أوم (وحدة المقاومة؛ 10 9 أوم) |
| 4. | الميلي أسمول | ملي أسمولي (وحدة الأسمولية؛ 10 -3 osmoles) |
| 4. | TTX | سم الأسماك الرباعية الأسنان |
| 5. | ATP | الأدينوزين ثلاثي الفوسفات |
| 6. | GTP | غوانوزين ثلاثي الفوسفات |
| 7. | GFP | البروتين الفلوري الأخضر |
الجدول 1.
| شركة | عدد الكاتالوج | | |
| 1. | تشريح طبق | الآلات وارنر | 64-0291 |
| 2. | 0.001 "أسلاك التنجستن | العلمية الآلات شركة خدمات | W406 |
| 2 | المجهر تشريح | لايكا مايكروسيستمز | MZ9.5 |
| 3. | ماصة بولير | سوتر الآلات شركة | P-97 |
| 4. | Microforge | Narishige المجموعة | MF-900 |
| 5. | تستقيم المجهر تصحيح المشبك | لايكا مايكروسيستمز | DMLFSA |
| 6. | مياداة مجهرية | Siskiyou شركة | MX7500 |
| 7. | Digidata | الأجهزة الجزيئية | 1322A |
| 8. | مكبر الصوت | الأجهزة الجزيئية | 200B |
| 9. | برنامج الحصول على | الأجهزة الجزيئية | pClamp9 |
| 10. | مسجل المحاور X | مسجل المحاور | مسجل المحاور X |
الجدول 2.
| اسم الحل | كاشف والتركيز (ملم) | |
| 1. | تشريح الحل | 134 كلوريد الصوديوم، و 2.9 بوكل، 2.1 و CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز و 0.02٪ تريكين |
| 2. | حل خارج الخلية MPSC | 134 كلوريد الصوديوم، و 2.9 بوكل، 2.1 و CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز و0.001 TTX |
| 3. | MPSC بين الخلايا المحاليلنشوئها | 134 CSCL، 2 MgCl 2، 10 HEPES، 10 EGTA، 4 نا 2-ATP، 0.4 يثيوم GTP |
| 4. | العمل حل خارج الخلية المحتملة | 137 كلوريد الصوديوم، و 2.9 بوكل، 2.1 و CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 10 HEPES و 10 الجلوكوز (مع 10 ميكرومتر D-توبوكورارين) |
| 5. | العمل حل بين الخلايا المحتملة | 130 بوكل، 2 كلوريد الصوديوم، 10 EGTA، 10 HEPES، 4Mg-ATP و 0.4 ليثيوم GTP. |
الجدول 3. تم تعديل جميع حلول خارج الخلية إلى 290 درجة الحموضة 7.8 الميلي أسمول و. تم تعديل جميع الحلول داخل الخلايا إلى 280 الميلي أسمول ودرجة الحموضة 7.4.
الشكل 1. تشريح طبق وإعداد الحبل الشوكي، الدماغ المؤخر سليمة. (A) تشريح وتسجيل طبق الحصول عليها من WPI. وختم بعناية غسالة رقيقة على رانه شريحة زجاجية في أسفل الطبق Sylgard ويتم تطبيقها على البئر. (B) 48 HPF الدماغ المؤخر الشوكي إعداد الحبل. يواجه السطح البطني من الدماغ المؤخر صعودا ويقع على الخلايا M فقط تحت سطح الأنسجة على مستوى رأس السهم.
الشكل 2. (أ) صورة التدخل Nomarski التفاضلية النقيض من الخلايا M تم الحصول عليها من جنين DPF 2 بعد وقت قصير من الفقس. لقد التقطت الصورة بعد تسجيل عفوية النشاط متشابك مثير من الخلايا M (B) وقد شغل الخليوي مع لوسيفر الصفراء خلال التجربة. مقتبس من 12 بإذن.
الرقم 3. (A) mEPSCs أمبا العفوي سجلت من الخلايا M في إمكانية عقد -60 بالسيارات. (B) mEPSCs متوسط تم الحصول عليها من التسجيل في (A) (C) وعفوية أمبا NMDA (السهام) mEPSCs سجلت من الخلايا M في إمكانية عقد +40 بالسيارات. (D) mEPSCs متوسط تم الحصول عليها من التسجيل في (C). وسجلت mEPSCs الغلوتامات في وجود TTX (1 ميكرومتر) لمنع إمكانات العمل، الإستركنين (5 ميكرومتر) وبيكروتوكسين (100 ميكرومتر) لمنع الجلايسين وGABA التيارات.
الشكل 4. (A) mIPSCs العفوي سجلت من الخلايا M في إمكانية عقد -60 بالسيارات. (B) mEPSCs متوسط تم الحصول عليها من التسجيل في (A). وسجلت mIPSCs في وجود TTX (1 ميكرومتر) لمنع إمكانات العمل، وحامض kynurenic (1 ملم) لمنع النشاط مستقبلات الغلوتامات وbicuculline (10 ميكرومتر) لمنع التيارات GABA.
الرقم 5. امكانات العمل المسجلة من الخلايا M. وفي هذا خلية معينة حافزا suprathreshold (0.48 غ) أثارت العديد من إمكانات العمل (A)، ولكن حافزا لعتبة النتائج فقط في إنتاج إمكانية عمل واحد (B). (C) البروتوكولات الحالية للآثار هو مبين في ألف وباء.
Discussion
بروتوكول الموصوفة أعلاه يسمح احد لتصحيح سجل المشبك من M-الخلايا وhomologs لها. والتقنية هي صعبة ويجب توخي الحذر في عدة مجالات رئيسية في جميع أنحاء الداخلي. ونحن الآن نناقش بعض هذه المناطق وسوف نقدم النصائح المفيدة لضمان النجاح.
بناء غرفة تشريح / تسجيل هي جانب أساسي من التجربة. والخلايا M من الصعب أن نرى ما لم يتم استخدام التدخل التفاضلية التباين. Nomarski مدينة دبي للإنترنت يعمل بشكل أفضل مع coverslips الزجاج نظيفة، ولكن وجدنا أن طبقة رقيقة جدا من Sylgard (~ 1-2 ملم) لن تشوه DIC إلى حد أنها تتعارض مع تحديد الخلايا M. وبالتالي، فإننا نستخدم غرفة تسجيل يحتوي على ساترة الزجاج رقيقة على الجزء السفلي الذي يوضع على غسالة صغيرة من البلاستيك (~ 5 مم). نحن مزيج Sylgard 184 في طبق بتري وإضافة بعناية Sylgard السائل إلى داخل غسالة مع ماصة باستور. وسيويمكن الشفاء من lgard في درجة حرارة الغرفة أكثر من بضعة أيام أو يمكن أن تكون ساخنة للعلاج السريع. قد تتم إزالة الغسالة بعد الشفاء من Sylgard، على الرغم من أن هذا ليس ضروريا. مرة واحدة أحرز غرفة التشريح / تسجيل، ويمكن استخدامه لعدة أسابيع قبل أن هناك حاجة إلى مبطنة Sylgard الزجاج الشرائح الطازجة.
الخطوة التالية في هذا الإجراء هو لتعويض جميع الحلول ذات الصلة على يوم من التجربة (الجدول 3). مصنوعة حلول الخلايا التي تحتوي على كل شيء ولكن ATP وGTP مسبقا وحفظها في 5 مل aliquots في -20 درجة مئوية. في يوم تسجيل وإذابة قسامة إلى درجة حرارة الغرفة وATP الطازجة ويضاف GTP. يتم ضبط الحل ل280 الميلي أسمول ودرجة الحموضة 7.4. في أيدينا، نجد أن إضافة ATP الطازجة وGTP على النتائج يوميا في تسجيلات جيدة. تحتاج جميع الحلول لأن تبقى عقيمة للحصول على أفضل فرصة للنجاح.
يجب أن تتم تصفيته حلول الخلايا ماراها مرشح 0.22 ميكرون (سيغما) لإزالة الجزيئات الصغيرة والحطام التي قد تؤثر على التسجيل. للقيام بذلك، علينا أولا رسم الحل داخل الخلايا إلى حقنة 1 مل، يضعوا مرشح لنهاية حقنة وإضافة ماصة غيض من البلاستيك التي كانت ساخنة وسحبت لطرف ما يرام، إلى نهاية التصفية. وهذا يسمح لنا لتطبيق الحل داخل الخلايا تصفيتها مباشرة إلى داخل ماصات التصحيح الزجاج.
مرة واحدة يتم إعداد الحلول، الجنين يمكن تخدير وتشريح. قبل التشريح، وينبغي الحرص على تقييم كاف عمر الكائن الحي. كل جنين داخل الأعمار القابض بمعدل مختلفة قليلا. لذا عند تقييم عمر الكائن الحي من المهم أن تفعل ذلك وفقا للإجراءات المتبعة 10،13، باستخدام الإشارات phenotypical مثل عدد من somites، والشكل العام للجسم ووقت الإخصاب البيض. يتم تنفيذ كافة تشريح مع # 5 الزوج غرامة دومون منملقط. هذه تحتاج إلى أن تكون حادة وفي حالة عمل جيدة وإلا فإنه سيكون من الصعب جدا لإزالة الجلد تتراكب الدماغ المؤخر وأي النسيج الضام على السطح البطني من الدماغ المؤخر. لدينا كثير من الأحيان إلى شحذ ملقط بعد أسابيع قليلة من الاستخدام، والقيام بذلك بأنفسنا بحجر شحذ.
يعلقون الأسماك إلى طبقة رقيقة من sylgard، ونحن نستخدم دبابيس صنعت من سلك التنغستن غرامة 0.001 بوصة في القطر. يتم قطع المسامير مع قديمة، مقص تشريح الصغرى تحت المجهر تشريح، وصغيرة بما يكفي لتناسب الحق من خلال الحبل الظهري. تعلق الأجنة في أي نقطة أخرى لا لشل حركة لهم، ويجعل من المستحيل تقريبا تشريح لأداء. عندما تعلم أولا لإجراء التسجيلات، قد يكون من الصعب على هوية M-خلية من homologs لها (وخاصة سم MiD2 الذي يقع في قسيم معيني المجاورة - قسيم معيني 5). في بعض الأجنة تظهر هذه أزواج اثنين من خلايا مماثلة في الحجم. الموالية otolithsبنصيحة معلما مريحة للمساعدة في تحديد M-الخلايا. في 48 HPF توجد خلايا M بجوار otoliths، وعلى الرغم من أن تتم إزالة otoliths أثناء تشريح، فإنها تترك وراءها المنطقة الجانبية بأضرار طفيفة في الدماغ المؤخر، والتي هي بمثابة علامة للحصول على مواقعها الأصلية. الأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP أو بعض علامة فلوري أخرى في خلايا M، وتوفير الاستعدادات ممتازة لالمجربون جديدة. في أيدينا الخلايا M لديها السعة غشاء حوالي 18-24 الجبهة الوطنية في 48 HPF، في حين أن أصغر homologs هي أقرب إلى 12-14 الجبهة الوطنية. الخلايا مع مساحة سطح أكبر يكون أكبر القيم السعة الغشاء (قياسها في الفارادات بيكو (الجبهة الوطنية)) مقارنة مع الخلايا أصغر. وبالتالي، السعة غشاء يمكن استخدامه كمؤشر تقريبي لحجم الخلية، حيث يكون خلايا أكبر القيم السعة الكبيرة. يخدم هذه الخاصية الكهربية كعقار أخرى يمكن من خلالها التعرف على الخلايا M من homologs لها. أخيرا، نحن غالبا ما تستخدم لوcifer الصفراء في تسجيل لدينا (داخل الخلايا) الحلول، والذي يسمح لنا لإجراء تحديد شركة من نوع من الخلايا قيد التحقيق باستخدام التصوير مضان مرة واحدة تسجيلات كاملة.
المقاومة ماصة طرف في حدود 3.5-4.5 MΩ هي أفضل حل وسط بين حجم غيض والمقاومة وصول المنخفض الذي يتراوح عادة 8-15 MΩ. هذا مهم بشكل خاص للأحداث مع حركية سريعة؛ ~ 0.1 ميللي ثانية (20-80٪) ترتفع مرة و~ 0.5 ميللي ثانية يضمحل الأسي 12،14،15 (أرقام 3A 3B و). يتم الحصول على البيانات بمعدل 50-100 كيلو هرتز رقمنة وتصفيتها مع تردد الترددات المنخفضة من 5-10 كيلو هيرتز. فيما يتعلق ماصات التصحيح، وجدنا أنها لا تحتاج إلى أن تكون للحصول على تسجيل مصقول النار، ولكن الروايات المتناقلة، يبدو لتقديم فرصة أفضل قليلا من الحصول على الأختام جيدة مقارنة مع ماصات غير المصقول. منذ نصائح ماصة كبيرة نسبيا، ونحن لا تضيف النسخةذ الضغط الايجابي الى حد كبير الى ماصة قبل الدخول إلى الحل. سوف يستغرق الممارسة البت في كمية مناسبة من الضغط الايجابي لتطبيق مثل وجود فائض من الضغط تحريك الخلايا كثيرا، وسوف يمنع تشكيل الختم. كما قد يؤدي ذلك إلى تلف اتصالات متشابك باعتبارها الخلية والمشردين بلطف من موقعها الأصلي. من ناحية أخرى، ونتائج الضغط قليلا جدا في نصائح القذرة ولا تنظيف سطح الخلية جيدا بما فيه الكفاية لتشكيل الأختام جيدة. ويتحقق وسيط سعيدة إلا من خلال الممارسة والخبرة كبيرة. ويمكن تعزيز تشكيل ختم مع تطبيقات الفولتية السلبية إلى ماصة. لدينا عادة الأختام من 1.2-2 GΩ، والتي هي ممتازة لتحقيق اختراقات في وضع خلية كاملة.
عندما تحتاج وكلاء الدوائية ليتم تطبيقها على السيتوبلازم الخلية، ونحن تدرجها في الحل داخل الخلايا قبل ملء ماصة. ينبغي توخي الحذر عند إعداد الحلول ماصة لتجنب فقدان وكلاءمن خلال وجود ذلك ربط مرشح 0.22 ميكرون. وبالتالي، فإننا تحديد المتوسطة داخل الخلايا أولا، ثم إضافة بعناية وكيل الدوائية في حل تصفيتها. تطبيق المركبات إلى حجرة داخل الخلايا لديها مجموعة فريدة من التحديات. على سبيل المثال، إضافة إلى المخدرات داخل الخلايا المتوسطة عادة ما يقلل من فرص تشكيل ختم GΩ، ولكن ليس إلى درجة أنه يشكل عائقا رئيسيا أمام التجربة.
ينبغي للمرء أن يدرك أن تطبيق كلاء الدوائية في هذه الطريقة لا يسمح للمجرب لتسجيل تحكم أنسب منذ كيل لديه إمكانية الوصول الفوري إلى الخلية من بداية تكوين خلية كاملة. لذلك، في حين أننا تسجيل البيانات في جميع أنحاء هذا النوع من التجربة، يجب على المرء أن يكون على علم بأن أفضل التحكم التالي هو تطبيق الخلايا من شكل غير نشط من وكيل. في كثير من الحالات وهذا يأخذ شكل مركب الحرارة المعطل، الببتيد س تدافعتص آيزومور غير نشط تم الحصول عليها من المورد.
نحن الحصول على البيانات في شكل التيارات متشابك (mPSCs)، والتيارات الجهد بوابات وإمكانات العمل. ويمكن تحليل التيارات مصغرة من قبل عدد قليل من البرامج الممتازة (pClamp، مسجل المحاور، الخ)، وعلى الرغم من أننا نفضل استخدام مسجل المحاور X (جون كليمنتس). مسجل المحاور X يعمل على كل من ويندوز وماكنتوش المنابر ويمكن استخدامها على حد سواء اقتناء وتحليل البيانات الكهربية. يتم الحصول على mEPCs مع المعونة من قالب من اختيار المجرب، والحصول عليها من تسجيل نفسها. ويمكن تحليل الأحداث الفردية لخصائص مثل الوقت الارتفاع، والسعة، ونصف العرض وتسوس الوقت، وغيرها ونحن تصدير جدول البيانات إلى Kaleidagraph (التآزر البرمجيات) حيث أننا يمكن أن تنتج الأرقام، بما في ذلك نسخ من آثار الحدث من مسجل المحاور X.
أحد الجوانب أكثر صعوبة من التجربة هو تحديد ما إذا كان تم إجراء تسجيل جيدا بما فيه الكفاية لتوفير نظيفة،بيانات موثوقة. على سبيل المثال، قد تنشأ قضايا تحامل الفضاء عند تسجيل mPSCs من M-الخلايا التي تحتوي محاور عصبية كبيرة وعمليات شجيري واسعة النطاق. عندما الجهد لقط، يمكن للمرء التحكم عموما الجهد في غيض من ماصة جيدا إلى حد معقول (وخاصة إذا كانت المقاومة وصول (R أ) منخفضة)، ولكن قد لا يكون التحكم السليم للغشاء المحتملة في عمليات شجيري أو المحاور التي لا تزال بعيدة بعيدا عن غيض ماصة. أسلوب واحد من تحديد ما إذا كانت الخلية بشكل صحيح الفضاء فرضت هو إنتاج مؤامرة مبعثر من الوقت مقابل ارتفاع السعة من mPSCs تم تسجيلها. هناك ارتباط بين البيانات هو موح من عدم كفاية لقط الفضاء. وبعبارة أخرى، إذا كان المشبك الفضاء هو الفقراء ثم mPSCs التي تحدث بالقرب من ماصة سوف يكون أسرع الأوقات، وترتفع سعة أكبر من الأحداث التي تقع على مسافة بعيدة من ماصة. إذا كان ارتباط موجود، ثم البيانات هو إشكالية والتي لا يمكن استخدامها.
جانب آخرمن التسجيلات الكهربية التي تحتاج إلى معالجتها هي أن التيارات تسرب. هذا ينطبق بشكل خاص عند الجهد لقط خلية لتسجيل التيارات الجهد بوابات نا مثل + K + أو التيارات. عندما انحرفت غشاء المحتملة من الراحة، يمكن تسجيل تسرب التيارات جنبا إلى جنب مع النشاط الجهد بوابات. سوف تسرب التيارات (I L)، وهو مزيج من البوتاسيوم (I K) والصوديوم (I نا) وكلوريد (I الكلورين) الحالية من خلال قنوات غير الجهد بوابات تحجب النشاط من الفائدة ويجب أن تطرح من التسجيل. مكبر للصوت قادر على أداء هذه الوظيفة على الانترنت أثناء التسجيل عن طريق تشغيل ما يسمى عادة بروتوكول P / N. خلال بروتوكول P / N سيتم تشغيل مكبر للصوت عدة depolarizations صغيرة (أو hyperpolarizations) من الراحة وسوف يسجل تسرب الناتج الحالي الذي يحدث. من المهم أن تستخدم نبضات صغيرة بما يكفي أن لا تفعيل قنوات الجهد بوابات. التياروسجلت ليالي التي تحدث خلال هذه البقول وبلغ متوسط بحيث تسرب هذه التيارات يمكن تطرح من النشاط قناة الجهد بوابات.
أخيرا، يحتاج المرء أن يأخذ في الاعتبار احتمال تقاطع، والذي يحدث في طرف القطب بين الخلايا وحلول خارج الخلية. عادة تتكون داخل الخلايا وحلول خارج الخلية أيونات مختلفة، مع اختلاف الأنشطة والتنقلات. سوف الأيونات أكبر مع انخفاض التنقلات تقدم أكبر لحركة المقاومة أيون من أصغر وهذا يمكن أن يؤدي إلى فرق الجهد صغيرة ولكنها مهمة عند تقاطع الحلول. يجب أن تؤخذ هذه الإمكانات تقاطع في الاعتبار عند تحديد الفولتية المناسبة التي يمر بها الخلية.
تقنية المعروضة هنا هي واحدة يستخدمها مختبرنا لسنوات عديدة. ومع ذلك، هناك طرق بديلة للتسجيل من الخلايا M. وعلى الأخص، جوزيف Fetcho والزملاء وتطويرإد استعدادا الممتازة التي يمكن للمرء أن يسجل من الخلايا M-اليرقات الأكبر سنا (4-5 أيام من العمر) بطريقة أقل الغازية من المعروضة هنا، حيث اقترب من الخلايا M من السطح الظهري 16. وقد حاولنا تقنية مشابهة ولكن وجدت أنه من الأسهل الاقتراب من خلايا M من الجانب البطنية من الدماغ المؤخر، حيث الخلية هو أقرب إلى سطح الدماغ، وخصوصا في الأسماك الصغيرة (أي 24 HPF إلى 72 HPF). وعلاوة على ذلك، وهو نهج من السطح الظهري وعادة ما يتطلب استخدام خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامة فلوري في M-الخلية، والتي لديها القدرة على إدخال المتغيرات إضافية في التسجيل. هذه المسألة ليست موجودة عند استخدام نوع الأسماك البرية. ومع ذلك، مع تقنية المعروضة هنا، ونحن تقتصر على دراسة الحيوانات الأصغر سنا (24 إلى 72 HPF HPF). وبالتالي، كل نهج له فوائده والقيود.
اختبار t الطالب يمكن استخدامها للمقارنة بين مجموعتين من البيانات في حين أن تحليل فاريانم (أنوفا) يمكن استخدامها لمقارنة مجموعات متعددة. يجب الحرص على اختيار اختبار آخر مخصص المناسبة لحدودي مقابل البيانات غير حدودي.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) والمؤسسة الكندية للابتكار (CFI) لDWA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, 5, University of oregon Press. (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
