Summary
हम zebrafish भ्रूण में Mauthner न्यूरॉन्स और अन्य reticulospinal कोशिकाओं से पैच दबाना रिकॉर्डिंग के माध्यम से विद्युत गतिविधि रिकॉर्ड और नजर रखने के लिए एक अक्षुण्ण मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी की तैयारी विकसित किया है. इस प्रकार, हम एक विकासशील भ्रूण में महत्वपूर्ण न्यूरॉन्स से उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic धाराओं, वोल्टेज gated चैनल गतिविधि और कार्रवाई क्षमता को रिकॉर्ड करने में सक्षम हैं.
Abstract
Mauthner कोशिकाओं (एम कोशिकाओं) teleost मछली की पश्चमस्तिष्क में स्थित बड़े reticulospinal न्यूरॉन्स हैं. वे जीव एक खतरा मानते तब होती है जब सी शुरू करने या भागने की प्रतिक्रिया के रूप में जाना विशेषता व्यवहार में शामिल कुंजी न्यूरॉन्स हैं. एम सेल इसे बड़े पैमाने पर उत्तेजक की एक विस्तृत श्रृंखला, निरोधात्मक और neuromodulatory संकेतों 1 प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है जहां वयस्क सुनहरी में अध्ययन किया गया है. हम एक हड्डीवाला तैयारी में synaptic विकास के पहलुओं का अध्ययन करने के क्रम में भ्रूण zebrafish में एम सेल गतिविधि की जांच की गई है. 1990 के दशक में अली और उनके सहयोगियों ने सीएनएस काफी हद तक बरकरार 2,3,4 था जिसमें zebrafish भ्रूण में एम कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग पैच दबाना के लिए एक तैयारी का विकास किया. उस समय उद्देश्य एक अक्षुण्ण मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी की तैयारी के भीतर कार्यात्मक synaptic कनेक्शन को बनाए रखते हुए पश्चमस्तिष्क न्यूरॉन्स, रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स और ट्रंक कंकाल की मांसपेशी से synaptic गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए था.यह तैयारी अभी भी आज हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है. अंतर्निहित तंत्र विकास synaptic plasticity की जांच करने के लिए, हम उत्तेजक (AMPA और NMDA की मध्यस्थता) 5,6 और एम कोशिकाओं के विकास से निरोधात्मक (GABA और ग्लाइसिन) synaptic धाराओं रिकॉर्ड. महत्वपूर्ण बात है, इस अनोखी तैयारी हमें ध्यान से एक भ्रूण जीव में synaptic plasticity और न्यूरो विकास की जांच करने के लिए तैयार करने के लिए तैयारी से ही सेल (एम सेल) को वापस जाने के लिए अनुमति देता है. इस तैयारी द्वारा प्रदान लाभ 1) शामिल बरकरार, एम सेल पर कार्यात्मक synaptic कनेक्शन, 2) अपेक्षाकृत सस्ती तैयारी, आसानी से उपलब्ध भ्रूण की 3) एक बड़े आपूर्ति एक ही सेल प्रकार पर लौटने के लिए 4) की क्षमता (यानी एम हर तैयारी में सेल), एक व्यक्ति के सेल के स्तर पर synaptic विकास मछली से मछली की जांच की, और किया जा सकता है, ताकि 5) भ्रूण के पारदर्शी स्वभाव के कारण पूरी तैयारी की इमेजिंग.
Introduction
विकास तंत्रिका जीव विज्ञान में बकाया प्रश्नों में से एक synaptic परिपक्वता के दौरान synaptic plasticity घटना की भूमिका से संबंधित है. हमारे शोध synaptic विकास के संदर्भ में पशुओं के व्यवहार को समझने के लिए एक समग्र लक्ष्य के साथ synaptic विकास आबाद कि plasticity के तंत्र को समझने पर जोर देता है. यह करने के लिए आदेश में, हम 1990 के दशक में विकास अध्ययन के लिए काफी कर्षण फायदा हुआ है कि एक जीव (zebrafish, Danio rerio) में एक काफी हद तक बरकरार तैयारी विकसित की है.
zebrafish neurodevelopmental पढ़ाई के लिए कई विशिष्ट लाभ प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, अपने जीनोम अनुक्रम है और एक जीन गतिविधि और प्रोटीन अभिव्यक्ति चुप्पी को morpholino knockdowns और जस्ता उंगली nuclease knockouts प्रदर्शन कर सकते हैं. एक भी overexpression पढ़ाई प्रदर्शन कर सकते हैं और ट्रांसजेनिक लाइनों 7-9 का निर्माण किया जा सकता है. भ्रूण प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और प्रचुर मात्रा में हैं, औरभ्रूण की पारदर्शी प्रकृति अच्छी तरह इमेजिंग और ऑप्टो आनुवंशिक अध्ययन करने के लिए उधार देता है. इसके अतिरिक्त, व्यवहार विश्लेषण किया जा सकता है, और electrophysiological प्रयोगों एक विवो में सेलुलर समारोह की जांच करने की अनुमति है, काफी हद तक बरकरार जीवों में मांसपेशी फाइबर, रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स और पश्चमस्तिष्क न्यूरॉन्स पर कार्य शुरू किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात, हम तैयारी से तैयारी करने के लिए, सेल की नहीं सिर्फ एक ही कक्षा में synaptic गतिविधि की जांच, लेकिन न्यूरॉन्स की बहुत ही जोड़ी में सक्षम हैं. दूसरे शब्दों में, यह एक अपने विकास का अध्ययन करने के लिए, बगल में, एक ही न्यूरॉन में लौट सकते हैं जिसमें दुर्लभ हड्डीवाला तैयारी में से एक है.
यथासंभव व्यवहार्य neuronal circuitry बनाए रखने के क्रम में, हम, पश्चमस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी अक्षुण्ण छोड़ दिया गया है जिसमें एक तैयारी विकसित एम कोशिकाओं से पैच clamping है. इस तैयारी में, मस्तिष्क overlaying आंखों, जबड़े और त्वचा धीरे हटा दिया और पश्चमस्तिष्क पील हैदूर पृष्ठरज्जु से विकास, पश्चमस्तिष्क के उदर की सतह के लिए उपयोग की अनुमति. reticulospinal न्यूरॉन्स कुछ micrometers गहरी स्थित है और अपेक्षाकृत आसानी से सुलभ हैं. 48 घंटा बाद निषेचन (HPF, कुछ संक्षिप्त रूपों 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं) कोशिकाओं विद्युत कॉम्पैक्ट हैं और एक ईमानदारी, (उत्तेजक और निरोधात्मक धाराओं दोनों) उनमें से वोल्टेज gated धाराओं और कार्रवाई क्षमता synaptic गतिविधि रिकॉर्ड कर सकते हैं.
हमारा निष्कर्ष synaptic विकास और परिपक्वता के कई पहलुओं से पहले अंडे सेने के लिए 24 घंटे में होते सुझाव दिया है कि, और हमारे ध्यान में इसलिए ज्यादा 72 HPF को 24 HPF से उम्र में लेकर जीवों पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, 72 HPF द्वारा, एम कोशिकाओं को कम विद्युत कॉम्पैक्ट हैं और ठीक से अंतरिक्ष दबाना मुश्किल हो जाता है. तकनीक एम कोशिकाओं से, बल्कि अपनी homologs, MiD2 सेमी और MiD3 सेमी से न केवल रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सैद्धांतिक रूप से, एक भी एक सपा से, डबल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन कर सकते हैंinal कॉर्ड इस तरह के एक प्राथमिक मोटर न्यूरॉन के रूप में और एम सेल से न्यूरॉन, लेकिन यह मुश्किल है और यह एक ऐसी मुश्किल तकनीक से प्राप्त लाभ के लिए आवश्यक है कि असाधारण प्रयास के लायक नहीं हो सकता है कि तर्क दिया जा सकता है.
Protocol
1. तैयारी और विच्छेदन
- Sylgard से अटे विदारक पकवान तैयार करें. थोक मूल्य सूचकांक (Sarasota, फ्लोरिडा, संयुक्त राज्य अमेरिका, आपूर्तिकर्ता 2 तालिका में सूचीबद्ध हैं) से रिकॉर्डिंग कक्षों (चित्रा 1) व्यंजन विदारक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. कक्षों गिलास स्लाइड को समायोजित करने के लिए तैयार कर रहे हैं और छोटे प्लास्टिक वाशर Sylgard के लिए नए नए साँचे के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. वाशर पहले तेल और तरल Sylgard वॉशर के केंद्र में जोड़ा जाता है के साथ स्लाइड के लिए तय कर रहे हैं. Sylgard रात भर ठीक हो जाएगा और यह ऐसा करता है, के रूप में यह विदारक पकवान का आधार बन जाता है जो कांच स्लाइड, पर एक छोटे, परिपत्र बिस्तर रूपों. स्लाइड रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा गया है और तैयारी चिपका है जो करने के लिए चैम्बर (चित्रा 1) के आधार के रूप में कार्य करता है.
- 3 तालिका में सूचीबद्ध समाधान तैयार करें. Intracellular समाधान बाँझ रखा जाना चाहिए, जबकि कोशिकी समाधान कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाना चाहिए. एक भी लू जोड़ सकते हैंएम सेल आकारिकी की कि दृश्य प्रयोग के अंत में किया जा सकता है ताकि intracellular समाधान के लिए cifer पीला (0.1%). यह सेल पहचान (चित्रा 2) की पुष्टि करने के लिए कार्य करता है.
- 28.5 डिग्री सेल्सियस पर अंडे पानी में जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण उठाएँ, और किमेल एट अल. 10 के अनुसार इकट्ठा करने और मंच. Dissections के लिए, यह भी रिकार्डिंग कक्ष के रूप में कार्य करता है कि विदारक पकवान भ्रूण स्थानांतरण. बारीकी से शारीरिक खारा का अनुमान लगाती है कि, एक anesthetizing नमक समाधान (समाधान 1, 3 टेबल 0.02% tricaine) में 7-10 मिनट के लिए anesthetize. वे पर्याप्त रूप से एक सज्जन पूंछ चुटकी के जवाब का परीक्षण करके anesthetized हैं अगर एक निर्धारित कर सकते हैं.
- पृष्ठदंड के माध्यम से और 0,001 "एक विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) पर 25x बढ़ाई का उपयोग टंगस्टन तार (वैज्ञानिक उपकरण सेवाएँ. इंक, Ringoes, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमरीका). टंगस्टन तार आसानी से कट जाता है साथ Sylgard लाइन पकवान पर भ्रूण पिन मेंठीक विदारक कैंची के साथ छोटे क्षेत्रों के लिए.
- विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए 40 50X विदारक गुंजाइश पर बढ़ाई समायोजित करें. भ्रूण पकवान, जबड़ा, आंख और अग्रमस्तिष्क पर टिकी है एक बार संदंश की एक अच्छी जोड़ी (Dumont # 5) का उपयोग कर हटा रहे हैं.
- पश्चमस्तिष्क धीरे ध्यान से पृष्ठरज्जु और मस्तिष्क के बीच संदंश काम करके दूर अंतर्निहित पृष्ठरज्जु से खुली है. उदर सतह तक चेहरे इतना है कि पश्चमस्तिष्क फिर धीरे खत्म कर दिया है. इस स्थिति से पुराने लार्वा में 20-50 माइक्रोन (2A चित्रा) युवा भ्रूण में उदर सतह के 5-10 माइक्रोन के भीतर आमतौर पर कर रहे हैं और ~ जो एम कोशिकाओं, के लिए अच्छी पहुँच प्रदान करता है.
- ध्यान से पैच दबाना प्रयोग किया जा सकता है, जहां रिकॉर्डिंग सेटअप करने के लिए तैयार करने के लिए कदम. एम कोशिकाओं, Nomarski अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) के साथ कल्पना कर रहे हैं, हालांकि इमेजिंग के अन्य साधनों (यानी हॉफमैन मॉडुलन विपरीत या Dodt ढाल कंट्रास्ट इमेजिंग सेLuigs और न्यूमन, जर्मनी) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. पैच दबाना रिकॉर्डिंग (पूरे सेल मोड)
- सभी रिकॉर्डिंग पूरे सेल पैच दबाना मोड 11 में प्रदर्शन कर रहे हैं. रिकॉर्डिंग कक्षों एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप में एक खुर्दबीन मंच पर रखा जाता है. हमारे चरणों तय कर रहे हैं और ईमानदार पैच दबाना माइक्रोस्कोप एक चल खुर्दबीन मंच या एक माइक्रोस्कोप अनुवादक को बंद कर लिया है.
- थोक मूल्य सूचकांक से प्राप्त पतली दीवारों, borosilicate ग्लास से, पैच दबाना pipettes एक क्षैतिज खींचने (Sutter उपकरण कं पी -97) पर खींच रहे हैं. पिपेट टिप व्यास एक चिकनी किनारे करने के लिए आग चमकाने के बाद 0.2-0.4 मीटर के आदेश पर कर रहे हैं, और टांग घटना लंबाई में ~ 4 मिमी है.
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप में एम्पलीफायर सिर चरण के लिए पिपेट देते हैं. यह इस उच्च प्रतिरोध सील के गठन के लिए उपयुक्त है कि पिपेट के लिए एक प्रवेश कोण सुनिश्चित रूप में क्षैतिज अक्ष में मोटे तौर पर 45 डिग्री के कोण पर सिर अवस्था रखने के लिए महत्वपूर्ण हैMauthner सेल पर है.
- बस स्नान समाधान में प्रवेश करने से पहले, टिप dirtying की संभावना को कम करने के लिए पिपेट को सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू होते हैं. MEPSCs जब रिकॉर्डिंग, स्नान समाधान ग्लाइसिन रिसेप्टर्स और 10 माइक्रोन bicuculline या GABA एक रिसेप्टर्स ब्लॉक के लिए 100 माइक्रोन picrotoxin ब्लॉक करने के लिए कार्रवाई की क्षमता, 5 माइक्रोन बच्छनाग ब्लॉक करने के लिए 1 माइक्रोन TTX शामिल हैं. MIPSCs जब रिकॉर्डिंग, स्नान समाधान 1 माइक्रोन TTX, kynurenic एसिड और ब्याज की रिसेप्टर गतिविधि के आधार पर bicuculline या बच्छनाग या तो शामिल हैं.
- पिपेट में सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि के साथ एम सेल दृष्टिकोण. सकारात्मक दबाव धीरे पक्ष की ओर से सेल धक्का और कक्ष पर तुरंत तैनात जब कोशिका झिल्ली पर एक छोटे से डिंपल रूपों. पिपेट और झिल्ली के बीच एक मजबूत मुहर का गठन किया जा सकता है, ताकि धीरे कोशिका की सतह को साफ करने के लिए कुछ सेकंड के लिए जगह में पिपेट छोड़ दें. पिपेट में सकारात्मक दबाव जारीसील शुरू किया जा करने के लिए और नकारात्मक पिपेट क्षमता के साथ मिलकर नकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि के कुछ ही सेकंड के भीतर बनाने GigaΩ जवानों में परिणाम देता है.
- -60 एम वी एम्पलीफायर पर होल्डिंग क्षमता बदलें. सक्शन की कमी दालों की एक श्रृंखला के साथ सेल झिल्ली टूटना. इसके तत्काल बाद झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड और समाई कलाकृतियों को कम. 70-85% द्वारा सेल समाई (सी एम) और एक्सेस (श्रृंखला) प्रतिरोध (आर ए) क्षतिपूर्ति. आर एक नियमित, एक मिनट के लिए हर 30 सेकंड पर नजर रखी, और 20% या उससे अधिक की एक परिवर्तन होता है, तो प्रयोग का गर्भपात किया जाना चाहिए.
- प्रयोग समाप्त हो गया है और पर्याप्त डेटा का अधिग्रहण किया गया है, तैयारी संदंश की एक जोड़ी के साथ पश्चमस्तिष्क निकाल कर बलिदान किया है. इस बिंदु पर, डेटा विश्लेषण शुरू कर सकते हैं.
Representative Results
इस पांडुलिपि में हम विशेष रूप से एम सेल पर ध्यान केंद्रित, zebrafish में reticulospinal न्यूरॉन्स से पूरे सेल मोड में पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक तरीका मौजूद है. बेशक, यह इस तरह के बाहर के बाहर सेल संलग्न, अंदर बाहर और के रूप में अन्य पैच दबाना मोड में दर्ज करने के लिए भी संभव है. एक प्राप्त कर सकते हैं कि डेटा के प्रकार हम यहां प्रस्तुत किया है क्या तक ही सीमित है, लेकिन हम दोनों synaptic वोल्टेज दबाना मोड में गतिविधि (उत्तेजक और निरोधात्मक) के साथ ही वर्तमान दबाना में कार्रवाई क्षमता का एक उदाहरण प्रदान करने की कोशिश नहीं कर रहा है. जीव उम्र और एम कोशिकाओं को और अधिक व्यापक और विस्तृत डेन्ड्राइट का विकास, पर्याप्त रूप से सेल दबाना दबाना और अंतरिक्ष वोल्टेज क्षमता के साथ छेड़छाड़ की और वर्तमान दबाना मोड चुनाव की रिकॉर्डिंग हो जाता है.
चित्रा 3 (1 माइक्रोन) और औषधीय एजेंटों को TTX की उपस्थिति में 48 HPF भ्रूण से प्राप्त उत्तेजक AMPA और NMDA रिसेप्टर धाराओं के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग से पता चलता हैGABA और ग्लाइसिन रिसेप्टर्स ब्लॉक. एम कोशिकाओं -60 एम वी पर clamped वोल्टेज रहे हैं, synaptic धाराओं AMPA रिसेप्टर्स की सक्रियण (चित्रा 3) के कारण होते हैं. अधिग्रहण और इन घटनाओं का विश्लेषण एक ऐसी वृद्धि समय, क्षय समय, आयाम और आवृत्ति के रूप में मानकों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है. AMPA घटनाओं आम तौर पर एक तेजी से वृद्धि समय (~ 0.1 मिसे के 20-80% वृद्धि समय) और क्षय समय (~ 0.5 मिसे) है, और लगभग 25 पीए के एक औसत आयाम दिखा रहे हैं. एम कोशिकाओं +40 एम वी पर clamped रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप जावक धाराओं AMPA और NMDA रिसेप्टर गतिविधि (आंकड़े -3 सी और 3 डी) के कारण होते हैं. NMDA रिसेप्टर धाराओं AMPA रिसेप्टर धाराओं की तुलना में अब समय पाठ्यक्रमों प्रदर्शन, और 2,6 रिसेप्टर्स NMDA एमजी ब्लॉक दूर करने के लिए सकारात्मक क्षमता पर या मिलीग्राम मुक्त समाधान में दर्ज किया जाना चाहिए. चित्रा 3 डी में दिखाया औसत mEPSC 40 एम वी पर दर्ज की मिश्रित AMPA और NMDA धाराओं का प्रतिनिधित्व करता है.
फाईMauthner कोशिकाओं से mIPSCs जब रिकॉर्डिंग gure 4 प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. इन घटनाओं AMPA और NMDA रिसेप्टर्स ब्लॉक TTX की उपस्थिति (1 माइक्रोन) और kynurenic एसिड (1 मिमी) में हुई. इन घटनाओं में 48 HPF से काफी तेजी से वृद्धि और क्षय कैनेटीक्स प्रदर्शन और एक 2-3 मिनट की रिकॉर्डिंग पर 3 उनमें से कई के अधिग्रहण के लिए पर्याप्त लगातार कर रहे हैं. सेल में depolarizing वर्तमान इंजेक्शन लगाने का एक परिणाम के रूप में दर्ज 5 शो कार्रवाई क्षमता चित्रा. Suprathreshold उत्तेजनाओं (चित्रा 5A) के साथ इंजेक्शन जब वे कभी कभी कई APs आग हालांकि 48 HPF भ्रूण के एम कोशिकाओं आम तौर पर, एक भी कार्रवाई संभावित (चित्रा 5 ब) आग.
| संक्षिप्त | पूरा नाम | |
| 1. | MPSC | लघु postsynaptic वर्तमान |
| 2. | mEPSC | लघु उत्तेजक postsynaptic वर्तमान |
| 2 | mIPSC | लघु निरोधात्मक postsynaptic वर्तमान |
| 3. | MΩ | मेगा ओम (प्रतिरोध की इकाई; 10 6 ओम) |
| 4. | GΩ | Giga ओम (प्रतिरोध की इकाई; 10 9 ओम) |
| 4. | MOsm | मिल्ली osmolar (परासारिता की इकाई; 10 -3 osmoles) |
| 4. | TTX | tetrodotoxin |
| 5. | एटीपी | adenosine triphosphate |
| 6. | जीटीपी | ग्वानोसिन triphosphate |
| 7. | GFP | ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन |
तालिका 1.
| कंपनी | सूची संख्या | | |
| 1. | डिश विदारक | वार्नर उपकरण | 64-0291 |
| 2. | 0.001 "टंगस्टन तार | वैज्ञानिक उपकरण सेवा इंक | W406 |
| 2 | विदारक माइक्रोस्कोप | Leica माइक्रोसिस्टम्स | MZ9.5 |
| 3. | पिपेट डांड़ी | Sutter उपकरण कं | P-97 |
| 4. | Microforge | Narishige समूह | MF-900 |
| 5. | ईमानदार पैच दबाना माइक्रोस्कोप | Leica माइक्रोसिस्टम्स | DMLFSA |
| 6. | Micromanipulator | Siskiyou इंक | MX7500 |
| 7. | Digidata | आण्विक उपकरण | 1322A |
| 8. | प्रवर्धक | आण्विक उपकरण | 200B |
| 9. | अधिग्रहण सॉफ्टवेयर | आण्विक उपकरण | pClamp9 |
| 10. | Axograph एक्स | Axograph | Axograph एक्स |
तालिका 2.
| समाधान का नाम | अभिकर्मक और एकाग्रता (मिमी) | |
| 1. | समाधान विदारक | 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 2 CaCl, 1.2 2 MgCl, 10 HEPES, 10 ग्लूकोज और 0.02% tricaine |
| 2. | MPSC कोशिकी समाधान | 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 2 CaCl, 1.2 2 MgCl, 10 HEPES, 10 ग्लूकोज और 0.001 TTX |
| 3. | MPSC Intracellular समाधानtion | 134 CSCL, 2 2 MgCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 ना 2-एटीपी, 0.4 ली जीटीपी |
| 4. | संभावित कार्रवाई कोशिकी समाधान | 137 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 2 CaCl, 1.2 2 MgCl, 10 HEPES और (10 माइक्रोन डी tubocurarine साथ) 10 ग्लूकोज |
| 5. | संभावित कार्रवाई intracellular समाधान | 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-एटीपी और 0.4 ली जीटीपी. |
तालिका 3. सभी कोशिकी समाधान 290 mOsm और 7.8 पीएच को समायोजित कर रहे हैं. सभी intracellular समाधान 280 mOsm और 7.4 पीएच को समायोजित कर रहे हैं.
चित्रा 1. पकवान और बरकरार पश्चमस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी की तैयारी विदारक. (ए) के थोक मूल्य सूचकांक से प्राप्त पकवान विदारक और रिकॉर्डिंग. एक पतली वॉशर ध्यान से टी पर बंद हैवह डिश के तल पर कांच स्लाइड और Sylgard अच्छी तरह से करने के लिए लागू किया जाता है. (बी) 48 HPF पश्चमस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी की तैयारी. पश्चमस्तिष्क के उदर सतह का सामना करना पड़ रहा है और एम सेल सिर्फ Arrowhead के स्तर पर ऊतक की सतह के नीचे स्थित है.
चित्रा 2. शीघ्र ही अंडे सेने के बाद एक 2 DPF भ्रूण से प्राप्त एक एम सेल (ए) Nomarski अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि. छवि एम सेल से सहज उत्तेजक synaptic गतिविधि रिकॉर्डिंग के बाद लिया गया था. (बी) सेल के दौरान पीले लूसिफ़ेर से भर गया प्रयोग. अनुमति के साथ 12 से अनुकूलित.
चित्रा 3. (ए) स्वतःस्फूर्त AMPA mEPSCs एक एम सेल से दर्ज -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर. (बी) (ए) में रिकॉर्डिंग से प्राप्त जवाब mEPSCs. (सी) स्वतःस्फूर्त AMPA और NMDA (तीर) 40 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर एक एम सेल से दर्ज mEPSCs. (डी) में रिकॉर्डिंग से प्राप्त जवाब mEPSCs (सी). ग्लूटामेट mEPSCs ग्लाइसिन और GABA धाराओं ब्लॉक करने के लिए TTX की उपस्थिति कार्रवाई क्षमता को ब्लॉक करने के लिए (1 माइक्रोन), बच्छनाग (5 माइक्रोन) और picrotoxin (100 माइक्रोन) में दर्ज किए गए.
चित्रा 4. (ए) -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर एक एम सेल से दर्ज उठना mIPSCs. (बी) (ए) में रिकॉर्डिंग से प्राप्त जवाब mEPSCs. mIPSCs GABA धाराओं ब्लॉक करने के लिए ग्लूटामेट रिसेप्टर गतिविधि और bicuculline (10 माइक्रोन) को ब्लॉक करने की कार्रवाई क्षमता, kynurenic एसिड (1 मिमी) ब्लॉक करने के लिए TTX की उपस्थिति (1 माइक्रोन) में दर्ज किए गए.
चित्रा 5. लड़ाई क्षमता इस विशेष सेल में एक suprathreshold उत्तेजना (0.48 एनए) कई कार्रवाई क्षमता (ए) हासिल. एक एम सेल से दर्ज की गई है, लेकिन सीमा के लिए एक प्रेरणा केवल एक एकल कार्रवाई संभावित (बी) के उत्पादन में यह परिणाम है. ए और बी में दिखाया निशान के लिए (सी) वर्तमान प्रोटोकॉल.
Discussion
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एक एम कोशिकाओं और अपने homologs से दबाना रिकॉर्ड पैच करने के लिए अनुमति देता है. तकनीक चुनौती दे रहा है और देखभाल प्रक्रिया के दौरान कई महत्वपूर्ण क्षेत्रों में लिया जाना चाहिए. अब हम इन क्षेत्रों में से कुछ पर चर्चा करेंगे और सफलता सुनिश्चित करने के लिए सहायक संकेत की पेशकश करेगा.
विदारक / रिकार्डिंग कक्ष के निर्माण के प्रयोग का एक महत्वपूर्ण पहलू है. एम कोशिकाओं अंतर हस्तक्षेप विपरीत प्रयोग किया जाता है जब तक देखना मुश्किल हो जाता है. Nomarski डीआईसी साफ कांच coverslips के साथ सबसे अच्छा काम करता है, लेकिन हम Sylgard (~ 1-2 मिमी) का एक बहुत पतली परत यह एम कोशिकाओं की पहचान के साथ हस्तक्षेप है कि इस हद तक डीआईसी बिगाड़ना नहीं होगा कि मिल गया है. इसलिए, हम एक छोटे से प्लास्टिक वॉशर (~ 5 मिमी व्यास) रखा गया है जिस पर तल पर एक पतली गिलास coverslip है कि एक रिकॉर्डिंग कक्ष का उपयोग करें. हम एक पेट्री डिश में 184 Sylgard मिश्रण और ध्यान से एक पाश्चर विंदुक के साथ वॉशर के अंदर करने के लिए तरल Sylgard जोड़ें. Sylgard दिनों की एक जोड़ी से अधिक कमरे के तापमान पर ठीक हो सकता है या तेजी से इलाज के लिए गर्म किया जा सकता. यह आवश्यक नहीं है, हालांकि वॉशर, Sylgard ठीक हो जाने के बाद हटाया जा सकता है. विच्छेदन / रिकार्डिंग कक्ष बनाया गया है एक बार एक ताजा Sylgard लाइन गिलास स्लाइड की जरूरत है, इससे पहले कि यह कई हफ्तों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रक्रिया में अगले कदम के प्रयोग (3 टेबल) के दिन प्रासंगिक समाधान के लिए सभी को बनाने के लिए है. एटीपी और जीटीपी लेकिन सब कुछ शामिल intracellular समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर अग्रिम में किया और 5 एमएल aliquots में जमा हो जाती है रिकॉर्डिंग के दिन एक विभाज्य कमरे के तापमान और ताजा एटीपी को thawed है और जीटीपी गयी है. समाधान 280 mOsm और 7.4 पीएच को समायोजित किया जाता है. हमारे हाथ में, हम पाते हैं कि अच्छा रिकॉर्डिंग में एक दैनिक आधार परिणामों पर ताजा एटीपी और जीटीपी के अलावा. सभी समाधान सफलता का सबसे अच्छा मौका के लिए बाँझ रखा जाना चाहिए.
Intracellular समाधान throug फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिएहा 0.22 माइक्रोन फिल्टर (सिग्मा) रिकॉर्डिंग को प्रभावित कर सकता है कि छोटे कणों और मलबे को हटाने के लिए. ऐसा करने के लिए, हम पहले, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में intracellular समाधान आकर्षित सिरिंज के अंत करने के लिए फिल्टर प्रत्यय और गर्म था और फिल्टर का अंत करने के लिए, ठीक टिप के लिए खिंचाई की है कि एक प्लास्टिक विंदुक टिप जोड़ें. यह हमें कांच पैच pipettes के अंदर करने के लिए सीधे फ़िल्टर्ड intracellular समाधान लागू करने के लिए अनुमति देता है.
समाधान तैयार हो जाने के बाद भ्रूण anesthetized और विच्छेदित किया जा सकता है. विच्छेदन के लिए पहले, देखभाल पर्याप्त रूप से जीव की आयु का आकलन करने के लिए लिया जाना चाहिए. एक अलग दर पर एक क्लच उम्र के भीतर प्रत्येक भ्रूण. जीव की आयु का आकलन करते हैं, इसलिए यह इस तरह somites की संख्या, शरीर के समग्र आकार और अंडे निषेचन के समय के रूप में phenotypical cues का उपयोग करके स्थापित प्रक्रियाओं 10,13, के अनुसार ऐसा करने के लिए महत्वपूर्ण है. सभी dissections एक Dumont # 5 अच्छी जोड़ी के साथ प्रदर्शन कर रहे हैंसंदंश. ये तेज़ होने के लिए और अच्छा काम कर हालत में अन्यथा यह पश्चमस्तिष्क के उदर सतह पर पश्चमस्तिष्क और किसी भी संयोजी ऊतक overlaying त्वचा को दूर करने के लिए बहुत मुश्किल हो जाएगा की जरूरत है. हम अक्सर उपयोग के कुछ हफ्तों के बाद संदंश पैनापन, और एक sharpening पत्थर के साथ इस खुद को क्या करना है.
Sylgard की पतली परत के लिए मछली पिन करने के लिए, हम ठीक टंगस्टन तार व्यास में 0.001 इंच से फैशन पिन का उपयोग करें. पिंस एक विदारक खुर्दबीन के नीचे एक पुराने, सूक्ष्म विच्छेदन कैंची से काट, और सही पृष्ठरज्जु के माध्यम से फिट करने के लिए काफी छोटे हैं. किसी भी अन्य बिंदु पर भ्रूण लगाए उन्हें स्थिर करना और प्रदर्शन करने के लिए विच्छेदन लगभग असंभव बना देता है नहीं है. पहली रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए सीख है, जब वह अपने homologs से पहचान एम सेल करने के लिए मुश्किल हो सकता है (पड़ोसी rhombomere में स्थित है जो विशेष रूप से MiD2 सेमी - rhombomere 5). कुछ भ्रूण में कोशिकाओं के इन दो जोड़े आकार में समान दिखाई देते हैं. Otoliths समर्थकएम कोशिकाओं की पहचान करने में सहायता करने के लिए एक सुविधाजनक मील का पत्थर ख़बरदार. 48 पर एम कोशिकाओं सही अगले Otoliths स्थित हैं HPF, और Otoliths विच्छेदन के दौरान हटा रहे हैं, भले ही वे अपनी मूल स्थिति के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है जो पश्चमस्तिष्क के एक से थोड़ा क्षतिग्रस्त पार्श्व क्षेत्र, पीछे छोड़ दें. एम सेल में GFP या कुछ अन्य फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त कि ट्रांसजेनिक मछली, नई प्रयोगकर्ताओं के लिए उत्कृष्ट तैयारी प्रदान करते हैं. छोटे homologs पीएफ 12-14 के करीब हैं, जबकि हमारे हाथ में एम कोशिकाओं, 48 HPF में लगभग 18-24 पीएफ की एक झिल्ली समाई है. अधिक से अधिक सतह क्षेत्र के साथ कोशिकाओं छोटे कोशिकाओं के साथ तुलना में (पिको Farads (पीएफ) में मापा) बड़ा झिल्ली समाई मूल्य नहीं है. इस प्रकार, झिल्ली समाई बड़ा कोशिकाओं बड़ा समाई मूल्यों है जहां सेल आकार, की किसी न किसी सूचक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस electrophysiological विशेषता एम सेल अपने homologs से पहचाना जा सकता है जिसके द्वारा किसी अन्य संपत्ति के रूप में कार्य करता है. अंत में, हम अक्सर लू का उपयोगहमारे रिकॉर्डिंग हमें रिकॉर्डिंग पूरी हो चुकी है एक बार प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर जांच के तहत सेल प्रकार की एक फर्म पहचान का संचालन करने की अनुमति देता है (intracellular) समाधान, में पीला cifer.
3.5-4.5 MΩ की रेंज में पिपेट टिप प्रतिरोधों आम तौर पर 8 से 15 MΩ के बीच है जो टिप आकार और कम उपयोग प्रतिरोध के बीच सबसे अच्छा समझौता कर रहे हैं. ~ 0.1 मिसे (20-80%) गुना वृद्धि और ~ 0.5 मिसे घातीय 12,14,15 decays (आंकड़े 3 ए और 3 बी) है, यह तेजी से कैनेटीक्स के साथ घटनाओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. डाटा 50-100 kHz के एक डिजिटलीकरण दर पर हासिल कर लिया और 5-10 kHz के एक कम पास आवृत्ति के साथ फ़िल्टर किया जाता है. पैच pipettes के संबंध में, हम वे आग पॉलिश एक रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए होने की जरूरत नहीं है कि मिल गया है, लेकिन anecdotally, यह unpolished pipettes के साथ तुलना में अच्छा जवानों प्राप्त करने का थोड़ा बेहतर मौका प्रदान करने के लिए प्रकट होता है. पिपेट सुझावों अपेक्षाकृत बड़े होते हैं, हम देखें जोड़ नहीं हैसमाधान में प्रवेश करने से पहले पिपेट करने Y ज्यादा सकारात्मक दबाव. यह दबाव की एक अतिरिक्त के रूप में लागू करने के लिए सकारात्मक दबाव की उचित राशि पर निर्णय लेने से अभ्यास भी ज्यादा सेल कदम होगा लेता है, और सील गठन को रोकने जाएगा. सेल धीरे अपने मूल स्थान से विस्थापित है के रूप में यह भी synaptic संपर्कों को नुकसान पहुंचा सकता है. दूसरी ओर, बहुत कम दबाव गंदा सुझावों में परिणाम और अच्छा जवानों के लिए फार्म काफी अच्छी तरह से कोशिका की सतह को साफ नहीं करता है. एक खुश माध्यम ही महत्वपूर्ण अभ्यास और अनुभव से उपलब्ध हो जाता है. सील गठन पिपेट को नकारात्मक voltages के आवेदन के साथ बढ़ाया जा सकता है. आम तौर पर हम पूरे सेल मोड में सफलताओं के लिए बहुत ही अच्छे हैं जो 1.2-2 GΩ के जवानों को दिया है.
औषधीय एजेंटों सेल cytoplasm के लिए लागू करने की आवश्यकता है, जब हम पिछले पिपेट भरने के लिए intracellular समाधान में उन्हें शामिल हैं. एजेंटों के नुकसान से बचने के लिए पिपेट समाधान तैयार करते समय ध्यान रखा जाना चाहिएयह 0.22 माइक्रोन फिल्टर करने के लिए बाध्य होने से. इसलिए, हम पहले intracellular मध्यम फिल्टर, और फिर ध्यान से फ़िल्टर्ड समाधान के लिए औषधीय एजेंट जोड़ें. Intracellular डिब्बे यौगिकों के आवेदन चुनौतियों का अपना अनूठा सेट है. उदाहरण के लिए, intracellular मध्यम करने के लिए दवाओं के अलावा आमतौर पर एक GΩ मुहर के गठन की संभावना को कम कर देता है, लेकिन बात करने के लिए यह प्रयोग करने के लिए एक प्रमुख बाधा है नहीं है.
एक इस तरह से औषधीय एजेंटों के उस आवेदन एजेंट पूरे सेल विन्यास के शुरू से ही सेल के लिए तत्काल पहुँच गया है क्योंकि प्रयोगकर्ता सबसे उपयुक्त नियंत्रण रिकॉर्ड करने की अनुमति नहीं है एहसास होना चाहिए. हम इस प्रकार के परीक्षण के दौरान डेटा रिकॉर्ड इसलिए, जब एक सबसे अच्छा अगले नियंत्रण एजेंट के एक निष्क्रिय फार्म के intracellular आवेदन है कि बारे में पता होना चाहिए. कई मामलों में यह एक गर्मी निष्क्रिय परिसर के फार्म, एक तले पेप्टाइड ओ लेता हैसप्लायर से प्राप्त एक निष्क्रिय isomer आर.
हम synaptic धाराओं (mPSCs), वोल्टेज gated धाराओं और कार्रवाई क्षमता के रूप में डेटा प्राप्त. हम Axograph एक्स (जॉन क्लेमेंट्स) का उपयोग करना पसंद करते हैं, हालांकि लघु धाराओं, कुछ उत्कृष्ट कार्यक्रम (pClamp, Axograph, आदि) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. Axograph एक्स दोनों Windows और Macintosh प्लेटफार्मों पर चलाता है और electrophysiological डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. mEPCs रिकॉर्डिंग से ही प्राप्त प्रयोगकर्ता की पसंद का एक टेम्पलेट, की सहायता से प्राप्त कर रहे हैं. व्यक्तिगत स्पर्धाओं हम Axograph एक्स से घटना निशान की प्रतियां सहित आंकड़े, उत्पादन कर सकते हैं, जहां Kaleidagraph (सिनर्जी सॉफ्टवेयर) के लिए डेटा का स्प्रेडशीट निर्यात ऐसी वृद्धि समय, आयाम, आधी चौड़ाई और क्षय समय, आदि के रूप में संपत्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है
प्रयोग के और अधिक कठिन पहलुओं में से एक, रिकॉर्डिंग साफ प्रदान करने के लिए काफी अच्छी तरह से प्रदर्शन किया गया था कि क्या निर्धारित हैविश्वसनीय आंकड़े. बड़े axons और व्यापक वृक्ष के समान प्रक्रियाओं है कि एम कोशिकाओं से mPSCs जब रिकॉर्डिंग उदाहरण के लिए, अंतरिक्ष clamping मुद्दों पैदा हो सकता है. जब वोल्टेज clamping, एक आम तौर पर (प्रवेश प्रतिरोध (नि. एक) कम है, खासकर अगर) काफी अच्छी तरह पिपेट की नोक पर वोल्टेज नियंत्रित कर सकते हैं, लेकिन अब तक कर रहे हैं कि वृक्ष के समान प्रक्रियाओं या axons में झिल्ली क्षमता के समुचित नियंत्रण नहीं हो सकता है दूर पिपेट टिप से. सेल ठीक से clamped अंतरिक्ष था, यह निर्धारित करने की एक विधि दर्ज किया गया है कि mPSCs के आयाम बनाम वृद्धि समय की एक तितर बितर साजिश का उत्पादन होता है. डेटा के बीच एक संबंध अपर्याप्त अंतरिक्ष क्लेम्पिंग का सूचक है. अंतरिक्ष दबाना गरीब है अगर दूसरे शब्दों में, तो पिपेट के करीब होती है कि mPSCs जल्दी दूर पिपेट से कुछ दूरी होने वाली घटनाओं से समय और अधिक से अधिक आयाम वृद्धि करनी होगी. एक संबंध मौजूद है, तो डेटा समस्याग्रस्त है और उपयोग नहीं किया जा सकता है.
एक और पहलूध्यान देने की जरूरत है कि electrophysiological रिकॉर्डिंग के रिसाव धाराओं की है. वोल्टेज ऐसे ना + या + K धाराओं के रूप में वोल्टेज gated धाराओं को दर्ज करने के क्रम में एक सेल clamping जब यह विशेष रूप से सच है. झिल्ली संभावित आराम से भटक जाता है, तो रिसाव धाराओं वोल्टेज gated गतिविधि के साथ दर्ज किया जा सकता है. रिसाव धाराओं (मैं एल), पोटेशियम का एक संयोजन (मैं कश्मीर), सोडियम (मैं ना) और गैर वोल्टेज gated चैनलों के माध्यम से क्लोराइड (मैं सीएल) मौजूदा ब्याज की गतिविधि अस्पष्ट होगा और रिकॉर्डिंग से घटाया जाना चाहिए. एम्पलीफायर आम तौर पर एक पी / एन प्रोटोकॉल कहा जाता है चलाकर रिकॉर्डिंग के दौरान ऑनलाइन इस समारोह में प्रदर्शन करने में सक्षम है. एक पी / एन प्रोटोकॉल के दौरान एम्पलीफायर आराम से कई छोटे depolarizations (या hyperpolarizations) चलेंगे और तब होता है कि जिसके परिणामस्वरूप रिसाव वर्तमान रिकॉर्ड होगा. यह वोल्टेज gated चैनलों को सक्रिय नहीं करते कि छोटे पर्याप्त दालों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमानइन दालों के दौरान हो कि दर्ज की गई और इन रिसाव धाराओं वोल्टेज gated चैनल गतिविधि से घटाया जा सकता है कि इतने औसत निकाला जाता है.
अन्त में, एक खाते में intracellular और बाह्य समाधान के बीच इलेक्ट्रोड की नोक पर होता है जो जंक्शन क्षमता, लेने की जरूरत है. Intracellular और बाह्य समाधान आम तौर पर भिन्न गतिविधियों और mobilities साथ, अलग आयनों से बना रहे हैं. कम mobilities साथ बड़ा आयनों छोटे लोगों की तुलना आयन आंदोलन करने के लिए एक बड़ा प्रतिरोधकता की पेशकश करेगा और इस समाधान के जंक्शन पर एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण संभावित अंतर में परिणाम कर सकते हैं. सेल द्वारा अनुभवी उपयुक्त voltages निर्धारित करते समय इस जंक्शन क्षमता को ध्यान में रखा जाना चाहिए.
यहाँ प्रस्तुत तकनीक कई वर्षों के लिए हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रयोग किया जाता है. हालांकि, एम सेल से रिकॉर्डिंग के वैकल्पिक तरीके हैं. सबसे विशेष रूप से, यूसुफ Fetcho और उनके सहयोगियों ने विकसित किया हैएड एक यहां, एम सेल पृष्ठीय सतह 16 से संपर्क किया है, जहां प्रस्तुत की तुलना में एक कम आक्रामक तरीके से (4-5 दिन पुराना) पुराने लार्वा के एम कोशिकाओं से रिकॉर्ड कर सकते हैं, जिसमें एक उत्कृष्ट तैयारी. हम एक ऐसी तकनीक की कोशिश की लेकिन यह आसान सेल विशेष रूप से युवा मछली (यानी 24 HPF HPF 72) में, मस्तिष्क की सतह के करीब है जहां पश्चमस्तिष्क, के उदर की ओर से एम सेल दृष्टिकोण करने के लिए मिला था. इसके अलावा, पृष्ठीय सतह से एक दृष्टिकोण आमतौर पर रिकॉर्डिंग में अतिरिक्त चर शुरू करने की क्षमता है जो एम सेल, में एक फ्लोरोसेंट टैग व्यक्त करता है कि एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग आवश्यक है. जंगली प्रकार मछली का उपयोग करते समय यह समस्या मौजूद नहीं है. हालांकि, यहां प्रस्तुत तकनीक के साथ, हम छोटे जानवरों (72 HPF को 24 HPF) का अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैं. इस प्रकार, प्रत्येक दृष्टिकोण अपने फायदे और सीमाएं हैं.
Varian के एक विश्लेषण, जबकि विद्यार्थी t-परीक्षण के आंकड़ों के दो समूहों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैCE (एनोवा) कई समूहों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. केयर गैर पैरामीट्रिक डेटा बनाम पैरामीट्रिक के लिए उपयुक्त बाद अस्थायी परीक्षण चुन लिया जाना चाहिए.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC और DWA के लिए अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
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