Summary
פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.
Abstract
תאי מאוטנר (M-תאים) נוירונים reticulospinal גדולים הממוקמים במוח האחורי של דג חוליות. הם נוירונים מרכזיים מעורבים בהתנהגות אופיינית המכונה תגובת C-להתחיל או לברוח המתרחשת כאשר האורגניזם תופס את איום. M-התא נחקר בהרחבה בדג זהב המבוגר שבו הוכח לקבלת מגוון רחב של הגירוי, אותות מעכבים וneuromodulatory 1. אנחנו כבר בחינת פעילות M-תא בדג זברה עוברית כדי ללמוד היבטים של פיתוח הסינפטי בהכנת חוליות. בסוף 1990s עלי ועמיתיו פיתחו הכנה למהדק תיקון הקלטה מM-תאים בעוברי דג הזברה, שבו מערכת העצבים המרכזית היו 2,3,4 במידה רבה ללא פגע. המטרה באותו הזמן הייתה להקליט פעילות הסינפטית מתא עצב למוח האחורי, תאי עצב בחוט השדרה ושרירי שלד תא מטען, תוך שמירה על קשרים סינפטיים פונקציונליים בתוך הכנת כבל מוח השדרה בשלמותה.הכנה זו היא עדיין בשימוש במעבדה שלנו היום. כדי לבחון את הפלסטיות הסינפטית התפתחותיים הבסיסית מנגנונים, אנו רושמים מעוררים (בתיווך NMDA AMPA ו) 5,6 ו( GABA וגליצין) זרמים סינפטיים מעכבים מלפתח M-תאים. חשוב לציין, הכנה ייחודית זה מאפשרת לנו לחזור לאותו התא (M-תא) מהכנה להכנה לבחינת פלסטיות הסינפטית ונוירו התפתחות באורגניזם עוברי בזהירות. ההטבות הניתנות על ידי הכנה זו כוללות 1) ללא פגע, קשרים סינפטיים פונקציונליים על M-התא, 2) הכנות זולות יחסית, 3) היצע גדול של עוברים זמינים 4) את היכולת לחזור לאותו סוג התא (כלומר M- תא) בכל הכנה, כך שפיתוח הסינפטי ברמה של תא בודד יכול להיבחן מדג לדג, ו5) הדמיה של הכנות שלמות בשל האופי השקוף של העוברים.
Introduction
אחת השאלות הבולטות בנוירוביולוגיה התפתחותית נוגע לתפקידו של תופעות פלסטיות הסינפטית במהלך התבגרות הסינפטי. המחקר שלנו מתמקד בהבנת מנגנוני הפלסטיות העומדים בבסיס התפתחות סינפטיים עם מטרה כללית של הבנת התנהגות בעלי חיים בהקשר של פיתוח הסינפטי. על מנת לעשות זאת, פיתחנו הכנה שלמה ברובו באורגניזם (דג הזברה, Danio rerio) שצבר תאוצה רבה למחקרים התפתחותיים בסוף 1990s.
דג הזברה מציעה מספר יתרונות בולטים ללימודים התפתחותיות. למשל, הגנום שלו הוא רצף ואחד יכול לבצע knockdowns morpholino וטורנירי nuclease אבץ האצבע להשתיק את פעילות גן וביטוי חלבון. אפשר גם לבצע מחקרי ביטוי יתר וניתן לבנות קווים מהונדסים 7-9. הם עוברים בקלות יחסית ושפע לרכישה, והטבע השקוף של העובר משאיל את עצמו היטב להדמיה ומחקרי Opto-גנטי. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח התנהגות, ויכולים להתבצע ניסויים אלקטרו על סיבי שריר, תאי עצב בחוט השדרה ובמוח אחוריים נוירונים באורגניזמים שלמים ברובו, ומאפשרים לבחון את תפקוד תא בגוף חי. חשוב מכך, אנו יכולים לבחון את הפעילות הסינפטית ולא רק באותו הסוג של תא, אך באותו הזוג של נוירונים, מהכנה להכנה. במילים אחרות, זו אחת הכנות חוליות נדירות שבו אחד לא יכול לחזור לאותו תא עצב, באתרו, ללמוד את התפתחותה.
על מנת לשמור על מעגלים עצביים קיימא ככל האפשר, פיתחנו תכשיר שבו המוח האחורי ואת חוט השדרה נותרו ללא פגע, ואילו תיקון clamping מM-התאים. בהכנה זו, עיניים, הלסת והעור שכיסה את המוח בעדינות הוסרו והמוח האחורי הוא peeleד מnotochord, המאפשר גישה אל פני השטח הגחון של המוח האחורי. נוירונים reticulospinal נמצאים מיקרומטרים אחדים עמוקים ויחסית בקלות. ב48 הודעה hr הפריה (hpf; כמה קיצורים שמותיהם מופיעים בטבלה 1) התאים חשמליים קומפקטיים ואחד בנאמנות יכול להקליט פעילות הסינפטית (שניהם מעורר וזרמים מעכבים), זרמי מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מהם.
הממצאים שלנו הראו כי היבטים רבים של התפתחות והתבגרות הסינפטי להתרחש בשעה 24 לפני הבקיעה, ועל אורגניזמים בטווח הגילים של 24 hpf 72 hpf לכן חלק גדול מתשומת הלב שלנו מתמקדת. עם זאת, על ידי 72 hpf, M-תאים פחות חשמלי קומפקטיים וקשה כראוי מהדק החלל. הטכניקה יכולה לשמש כדי להקליט לא רק מM-התאים, אלא גם מhomologs ס"מ MiD2 וסנטימטר MiD3. באופן תיאורטי, ניתן גם לבצע הקלטות כפולות, מspנוירון inal כבל כגון הנוירון מוטורי ראשוני ומM-התא, אבל זה קשה וזה ניתן לטעון כי היתרונות שנרכשו מטכניקה כזו קשה לא יכולים להיות שווה את המאמץ יוצא הדופן שנדרש.
Protocol
1. הכנה וDissection
- הכן הצלחת לנתח מרופדת בSylgard. תאי הקלטה מWPI (סרסוטה, פלורידה, ארה"ב; ספקים מפורטים בטבלה 2) המשמשים כלנתח מנות (איור 1). התאים נועדו להכיל שקופיות זכוכית ומנקי פלסטיק קטנים המשמשים כתבניות לSylgard. מנקי הם קבועים ראשון לשקופית עם גריז וSylgard הנוזלי יתווסף למרכז של מכונת הכביסה. Sylgard ירפא לילה וכפי שהוא עושה זאת, הוא יוצר מיטה קטנה, עגולה בשקופית הזכוכית, שהופכת לבסיס של המנה לנתח. השקופיות ממוקמת לתוך תא ההקלטה ומשמשת כבסיס של החדר שאליו ההכנה מודבקת (איור 1).
- הכן את הפתרונות מפורטים בטבלה 3. יש להשאיר פתרונות תאיים בטמפרטורת חדר תוך צריכים להישמר סטרילי פתרונות תאיים. אפשר גם להוסיף לוצהוב cifer (0.1%) לפתרון תאיים כך שההדמיה של מורפולוגיה M-תא יכולה להתבצע בסוף הניסוי. זה משמש כדי לאשר את זהות תא (איור 2).
- הרם עוברי דג הזברה סוג בר במי ביצה ב28.5 מעלות צלזיוס, ולאסוף ובמה על פי קימל et al. 10. ולניתוחים, העברה עובר לצלחת לנתח שמשמשת גם כחדר ההקלטה. הרדימי ל7-10 דקות בתמיסת מלח הרדמה (tricaine 0.02%; פתרון 1, לוח 3) המדמה מלח פיסיולוגי באופן הדוק. אפשר לקבוע אם הם מורדמים כראוי על ידי בחינת התגובה לקמצוץ זנב עדין.
- הצמד את העוברים דרך notochord ועל גבי הצלחת המרופדת Sylgard עם 0.001 "חוט טונגסטן (המדעית Instrument שירותים. Inc, Ringoes, ניו ג'רזי, ארה"ב) באמצעות הגדלה 25X במיקרוסקופ לנתח (איור 1). תיל טונגסטן הוא לחתוך בקלות בתוךלמקטעים קטנים עם מספריים לנתח בסדר.
- התאם את ההגדלה בהיקף לנתח 40-50X כדי לבצע את הנתיחה. ברגע שהעובר הוא מוצמד לצלחת, הלסת, עיניים והמוח הקדמי יוסרו באמצעות זוג נאה של מלקחיים (דומון # 5).
- המוח האחורי הוא קילף בעדינות מnotochord הבסיסי על ידי עובד בזהירות את המלקחיים בין notochord והמוח. המוח האחורי לאחר מכן התהפך בעדינות כך את פני השטח הגחון פונה כלפי מעלה. מיצוב זה מספק גישה טובה לM-התאים, שהם בדרך כלל בתוך 5-10 מיקרומטר של פני השטח הגחון בעוברים צעירים ו~ 20-50 מיקרומטר בזחלים מבוגרים (איור 2 א).
- להעביר בזהירות את ההכנה להתקנת ההקלטה שבו ניסוי מהדק תיקון יכול להתבצע. M-התאים הם דמיינו עם ניגודיות הפרעת Nomarski דיפרנציאלי (DIC), למרות שמצבים אחרים של הדמיה (כלומר ניגוד הופמן אפנון או הדמיה ניגודיות Dodt Gradient מעשויים לשמש גם Luigs ונוימן, גרמניה).
2. הצמד תיקון הקלטה (מצב תא כולו)
- כל ההקלטות מתבצעות בכל המצב 11 מהדק תיקון תא. חדרי הקלטה מונחים על במה מיקרוסקופ בהתקנת אלקטרופיזיולוגיה. השלבים שלנו הם קבועים ומיקרוסקופ מהדק תיקון הזקוף הוא זינק לפלטפורמת מיקרוסקופ מטלטלין או מתורגמן מיקרוסקופ.
- טפטפות מהדק תיקון נמשכות על חולץ אופקי (P-97; סאטר מכשירים ושות) מזכוכית המתקבלת מWPI דק דופן, ורוסיליקט. קטרי קצה פיפטה הם בסדר הגודל של 0.2-0.4 מיקרומטר לאחר ליטוש אש לקצה חלק, ולהתחדד השוק הוא ~ 4 מ"מ האורך.
- צרף את פיפטה לראש הבמה המגבר בהתקנת אלקטרופיזיולוגיה. חשוב לשמור על הראש בשלב בערך 45 ° זווית הציר האופקי כמו זו מבטיחה זווית כניסה לפיפטה כי הוא מתאים להיווצרות של חותם עמידות גבוהים על גבי תא מאוטנר.
- רגע לפני שנכנס לפתרון האמבטיה, למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי לפיפטה כדי להפחית את הסיכוי למלכלך את הקצה. בעת הקלטת mEPSCs, פתרונות אמבטיה כוללים מיקרומטר TTX 1 לחסום פוטנציאלים לפעולה, 5 סטריכנין מיקרומטר לחסום קולטני גליצין וbicuculline מיקרומטר 10 או 100 picrotoxin מיקרומטר לחסום קולטני GABA. בעת הקלטת mIPSCs, פתרונות אמבטיה כוללים TTX 1 מיקרומטר, חומצת kynurenic וגם bicuculline או סטריכנין בהתאם לפעילות הקולטן של עניין.
- גישת M-התא עם כמות קטנה של לחץ חיובי בפיפטה. הלחץ החיובי בעדינות דוחף את התא מצד לצד וכשהוא מוצב באופן מיידי על פני התא, יוצר גומה קטנה בקרום התא. השאר את פיפטה במקום במשך כמה שניות כדי לנקות בעדינות את פני השטח של התא, כך שחותם חזק בין פיפטה והקרום יכול להיווצר. לשחרר את הלחץ החיובי בפיפטהמאפשר את החותם כדי להיות יזם וכמות קטנה של לחץ שלילי בשילוב עם פוטנציאל פיפטה שלילי נובעת בחותמות GigaΩ יוצרות תוך מספר שניות.
- שנה את פוטנציאל ההחזקה במגבר ל-60 mV. קרע של קרום התא עם סדרה של פולסים קצרים של יניקה. מייד להקליט פוטנציאלי קרום ולמזער חפצי קיבול. לפצות קיבול תא (מ 'ג) וגישה התנגדות (סדרה) (R) על ידי 70-85%. R צריך להיות במעקב באופן שיגרתי, בכל 30 שניות לדקה, ואם יש שינוי של 20% או יותר, לבטל את הניסוי.
- לאחר שהניסוי הסתיים ומספיק נתונים כבר נרכשו, ההכנה מוקרבת על ידי הסרת המוח האחורי עם זוג המלקחיים. בשלב זה, ניתוח נתונים יכול להתחיל.
Representative Results
בכתב היד הזה אנו מציגים שיטה להקלטת התיקון-clamp במצב כל התא מתאי עצב reticulospinal בדג זברה, תוך התמקדות בעיקר על M-התא. כמובן, אפשר גם להקליט במצבי מהדק תיקון אחרים כגון מצורף תא, מבפנים החוצה ומחוץ החוצה. סוג הנתונים שניתן לקבל לא רק את מה שהוצגנו כאן, אבל אנחנו מנסים לתת דוגמא של שתי הפעילות הסינפטית (המעוררות ומעכב) במצב המתח-clamp כמו גם פוטנציאל פעולה במהדק הנוכחי. עם הזדקנות האורגניזם וM-תאי דנדריטים לפתח יותר נרחבים ומשוכללים, יכולת מתח כראוי מהדק ומרחב מהדק את התא נפגעת ומצב המהדק הנוכחי הופך את ההקלטה של בחירה.
איור 3 מציג הקלטות מייצג של זרמי קולטן מעוררים AMPA וNMDA המתקבלים מ48 עוברי hpf בנוכחות TTX (1 מיקרומטר) וסוכנים תרופתיים ללחסום קולטני GABA וגליצין. כאשר M-תאי מתח מהודק ב-60 mV, הזרמים סינפטיים הם עקב ההפעלה של קולטני AMPA (איור 3 א). רכישה וניתוח של אירועים אלה מאפשר להקליט פרמטרים כגון זמן עלייה, זמן דעיכה, משרעת ותדירות. בדרך כלל יש לי אירועי AMPA זמן עלייה מהירה (20-80% זמן עלייה של ~ אלפיות 0.1) וזמן דעיכה (~ אלפיות 0.5), ולהציג משרעת ממוצעת של כ 25 רשות. כאשר M-התאים הם הידקו ב+40 mV, הזרמים החוצה וכתוצאה מכך הם עקב הפעילות קולטני AMPA וNMDA (3C דמויות ו3D). זרמי הקולטן NMDA מפגינים קורסי זמן רבים יותר מאשר זרמי קולטן AMPA, וצריכים להיות מוקלט על פוטנציאל חיובי או בתמיסת Mg חינם כדי להסיר את חסימת Mg של NMDA קולטני 2,6. MEPSC הממוצע שמוצג באיור 3D מייצג זרמי AMPA וNMDA מעורבים נרשמו ב+40 mV.
Figure 4 מציג תוצאות נציג עת הקלטת mIPSCs מתאי מאוטנר. אירועים אלה התרחשו בנוכחותו של TTX (1 מיקרומטר) וחומצת kynurenic (1 מ"מ) כדי לחסום קולטני AMPA וNMDA. אירועים אלה תערוכת עלייה במהירות סבירה וקינטיקה עששת על ידי 48 hpf ותכופות מספיק כדי לרכוש רבים מהם על הקלטת דקות 2-3 3. איור 5 פוטנציאל פעולת תכניות המוקלטות כתוצאה מהזרקה הנוכחית depolarizing לתוך התא. M-תאים של 48 hpf עוברים בדרך כלל לפטר את פוטנציאל פעולה יחיד (איור 5), למרות שהם לפעמים לפטר את נקודתי גישה מרובות כאשר הוא מוזרק עם גירויי suprathreshold (איור 5 א).
| נוטריקון | שם מלא | |
| 1. | mPSC | הנוכחי postsynaptic מיניאטורי |
| 2. | mEPSC | הנוכחי postsynaptic מעורר מיניאטורי |
| 2 | mIPSC | הנוכחי postsynaptic מעכב מיניאטורי |
| 3. | MΩ | מגה אוהם (יחידה של התנגדות; 10 6 אוהם) |
| 4. | GΩ | גיגה אום (יחידה של התנגדות; 10 9 אוהם) |
| 4. | MOsM | מילי osmolar (יחידה של osmolarity; 10 -3 osmoles) |
| 4. | TTX | tetrodotoxin |
| 5. | ה-ATP | אדנוזין טריפוספט |
| 6. | GTP | אדנוזין guanosine |
| 7. | ה-GFP | חלבון פלואורסצנטי ירוק |
טבלת 1.
| חברה | מספר קטלוגי | | |
| 1. | צלחת לנתח | וורנר מכשירים | 64-0291 |
| 2. | 0.001 חוט טונגסטן " | מכשירים מדעיים שירותים בע"מ | W406 |
| 2 | מיקרוסקופ לנתח | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| 3. | פיפטה פולר | סאטר מכשירים ושות | P-97 |
| 4. | Microforge | קבוצת Narishige | MF-900 |
| 5. | מיקרוסקופ מהדק תיקון הזקוף | Leica Microsystems | DMLFSA |
| 6. | Micromanipulator | Siskiyou בע"מ | MX7500 |
| 7. | Digidata | התקנים מולקולריים | 1322A |
| 8. | מגבר | התקנים מולקולריים | 200B |
| 9. | תוכנת רכישה | התקנים מולקולריים | pClamp9 |
| 10. | Axograph X | Axograph | Axograph X |
טבלה 2.
| שם פתרון | מגיב וריכוז (מ"מ) | |
| 1. | ביתור פתרון | 134 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז וTricaine 0.02% |
| 2. | פתרון mPSC התאי | 134 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז ו0.001 TTX |
| 3. | solu mPSC תאייםtion | 134 CsCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2-ATP, 0.4 Li-GTP |
| 4. | פתרון תאי פוטנציאל פעולה | 137 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES ו10 גלוקוז (עם 10 D-tubocurarine מיקרומטר) |
| 5. | פתרון תאיים פוטנציאל פעולה | 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-ATP ו0.4 Li-GTP. |
לוח 3. כל הפתרונות תאיים מותאמים ל290 mOsm וpH 7.8. כל הפתרונות תאיים מותאמים ל280 mOsm וpH 7.4.
איור 1. צלחת לנתח והכנת חוט השדרה למוח האחורי, ללא פגע. (א) בניתוח והקלטת מנה המתקבלת מWPI. מכונת כביסה דקה היא חתומה בזהירות על tהוא שקופיות זכוכית בתחתית הצלחת וSylgard מוחלים על הבאר. 48 hpf המוח האחורי-השדרה הכנת כבל (ב '). פני השטח הגחון של המוח האחורי פונים כלפי מעלה וM-התא ממוקם ממש מתחת לפני השטח של הרקמה ברמה של ראש החץ.
איור 2. (א) תמונת התערבות ההפרש לעומת זאת Nomarski של M-תא המתקבל מעובר 2 DPF זמן קצר לאחר הבקיעה. התמונה צולמה לאחר הקלטת פעילות הסינפטית מעוררת ספונטנית מM-התא. (ב) התא היה מלא בוציפר הצהוב במהלך הניסוי. מעובד מתוך 12 באישורו.
איור 3. () MEPSCs AMPA ספונטני שנרשם מM-תא בפוטנציאל החזקת -60 mV. (ב) mEPSCs הממוצע המתקבל מההקלטה ב (א). (C) ספונטני AMPA וNMDA (ראשי חץ) mEPSCs נרשם מM-תא בפוטנציאל החזקת mV +40. (ד ') mEPSCs הממוצע המתקבל מההקלטה ב (C). mEPSCs גלוטמט נרשם בנוכחותו של TTX (1 מיקרומטר) כדי לחסום את פוטנציאל פעולה, סטריכנין (5 מיקרומטר) וpicrotoxin (100 מיקרומטר) כדי לחסום זרמי גליצין וגאבא.
איור 4. () MIPSCs ספונטני שנרשם מM-תא בפוטנציאל החזקת -60 mV. (ב) mEPSCs הממוצע המתקבל מההקלטה ב (א). mIPSCs נרשם בנוכחותו של TTX (1 מיקרומטר) כדי לחסום את פוטנציאל פעולה, חומצת kynurenic (1 מ"מ) כדי לחסום את פעילות קולטן הגלוטמט וbicuculline (10 מיקרומטר) כדי לחסום זרמי GABA.
איור 5. פוטנציאלי פעולה שנרשמו מM-תא. בתא מסוים זה גירוי suprathreshold (0.48 NA) שהושרו כמה פוטנציאל פעולה (), אך גירוי לסף תוצאות רק בייצור של פוטנציאל פעולה יחיד (ב '). (ג) פרוטוקולים נוכחיים לעקבות שמוצגים בA ו-B.
Discussion
הפרוטוקול שתואר לעיל מאפשר תיקון שיא מהדק מM-התאים וhomologs שלה. הטכניקה היא מאתגרת ויש להיזהר בכמה תחומי מפתח לאורך כל ההליך. נדונונו עתה בחלק מהאזורים אלה ויציע עצות מועילות כדי להבטיח את ההצלחה.
בנייה של החדר לנתח / הקלטה היא היבט קריטי של הניסוי. M-התאים קשה לראות, אלא אם כן הוא משמש התערבות ההפרש לעומת זאת. Nomarski דסק"ש עובד הכי טוב עם coverslips זכוכית נקייה, אבל אנחנו מצאנו ששכבה דקה מאוד של Sylgard (~ 1-2 מ"מ) לא לעוות את דסק"ש במידה כזו שהוא מפריע לזיהוי של M-התאים. לכן, אנו משתמשים בחדר הקלטה שיש coverslip זכוכית דק בתחתית שעליו ממוקם מכונת כביסה קטנה מפלסטיק (~ קוטר 5 מ"מ). אנחנו מערבבים Sylgard 184 בצלחת פטרי ולהוסיף בזהירות Sylgard הנוזל לחלק הפנימי של מכונת הכביסה עם פיפטה פסטר. סאיlgard ניתן לרפא בטמפרטורת חדר במשך כמה ימים או יכול להיות מחומם לריפוי מהיר. מכונת הכביסה ניתן להסיר לאחר Sylgard ריפא, אם כי זה לא הכרחי. ברגע שהחדר לנתיחה / ההקלטה נעשה, ניתן להשתמש בו במשך כמה שבועות לפני שיש צורך בשקופית זכוכית המצופה Sylgard טרי.
השלב הבא בהליך הוא להפוך את כל הפתרונות הרלוונטיים ביום של הניסוי (טבלת 3). פתרונות תאיים המכילים הכל, אבל ה-ATP וGTP נעשים מראש ולאחסן ב5 מיליליטר aliquots ב -20 ° C. ביום הקלטת aliquot מופשר לטמפרטורת חדר וATP הטרי וGTP הוא הוסיף. הפתרון מותאם ל280 mOsm וpH 7.4. בידיים שלנו, אנו מוצאים כי תוספת של ה-ATP הטרי וGTP על תוצאות בסיס יומיות בהקלטות טובות. כל הפתרונות צריכים להיות כל הזמן סטריליים לסיכוי הטוב ביותר של הצלחה.
פתרונות תאיים חייבים להיות מסוננים througחה מסנן מיקרומטר 0.22 (Sigma) כדי להסיר חלקיקים קטנים ופסולת שעשויה להשפיע על ההקלטה. כדי לעשות זאת, אנו מפנים הראשונים הפתרון תאיים לתוך מזרק 1 מיליליטר, להדביק את המסנן לסוף המזרק ולהוסיף טיפ פיפטה פלסטיק שהיה מחומם ומשך עד לקצה בסדר, בסופו של המסנן. זה מאפשר לנו ליישם את הפתרון תאיים המסונן ישירות לחלק הפנימי של טפטפות תיקון זכוכית.
ברגע שהפתרונים מוכנים, העובר יכול להיות מורדם וגזור. לפני הנתיחה, יש להקפיד על מנת להעריך את גיליו של האורגניזם במידה מספקת. כל עובר בגילי מצמד בקצב שונה במקצת. לכן כאשר מעריכים את גיליו של האורגניזם זה חשוב לעשות זאת על פי נהלים שנקבעו 10,13, על ידי שימוש ברמזי phenotypical כגון מספר somites, את הצורה הכללית של הגוף ואת הזמן של הפריית ביצית. כל הניתוחים מבוצעים עם # 5 זוג יפה של דומוןמלקחיים. אלה צריכים להיות חדים ובמצב עבודה טוב אחר זה יהיה קשה מאוד להסיר את העור שכיסה את המוח האחורי וכל רקמת חיבור על פני השטח הגחון של המוח האחורי. לעתים קרובות יש לנו לחדד את המלקחיים אחרי כמה שבועות של שימוש, ועושים לעצמנו את זה עם אבן השחזה.
כדי להצמיד את הדג בשכבה דקה של sylgard, אנו משתמשים בסיכות המעוצבות מחוט טונגסטן בסדר 0.001 סנטימטרים קוטר. הפינים לחתוך עם מספריים תחת מיקרוסקופ לנתח ישנים, מיקרו לנתיחה, והם קטנים מספיק כדי להתאים ישר דרך notochord. מצמיד את העוברים בכל נקודה אחרת לא לשתק אותם ועושה ניתוחים כמעט בלתי אפשריים לביצוע. כאשר לומד לראשונה לבצע הקלטות, זה יכול להיות קשה לזהות M-התא מhomologs שלה (במיוחד סנטימטר MiD2 הנמצא בrhombomere השכן - rhombomere 5). בחלק מהעוברים שני זוגות של תאים אלה נראים דומים בגודלם. Otoliths פרוvide ציון דרך נוחה כדי לסייע בזיהוי של M-תאים. ב48 HPF M-התאים ממוקמים ממש ליד otoliths, ולמרות שotoliths יוסרו במהלך הנתיחה, הם משאירים מאחור אזור פגום מעט לרוחב של המוח האחורי, המשמש כסמן למיקום המקורי שלהם. דג מהונדס המבטא GFP או כמה סמן פלואורסצנטי אחר בM-התא, לספק הכנות מצוינות לנסיינים חדשים. בידיים שלנו יש את M-תאי קיבול הממברנה של כ 18-24 pF ב48 hpf, בעוד homologs הקטן יותר קרובים יותר ל12-14 pF. יש תאים עם שטח פנים גדול יותר ערכים גדולים יותר קרום קיבול (נמדדו בFarads פיקו (PF)) בהשוואה לתאים קטנים יותר. לכן, קיבול קרום יכול לשמש כמדד גס של גודל תא, שבו יש תאים גדולים יותר ערכי קיבול גדולים יותר. מאפיין אלקטרו זה משמש כנכס אחר שבו M-התא ניתן לזהות מhomologs שלה. לבסוף, לעתים קרובות אנו משתמשים Lucifer הצהוב בהקלטה הפתרונות (תאיים), המאפשר לנו לנהל הזדהות איתנה של סוג התא תחת חקירה באמצעות דימות פלואורסצנטי פעם אחת ההקלטות הן מלאים שלנו.
התנגדויות קצה פיפטה בטווח של 3.5-4.5 MΩ הן הפשרה הטובה ביותר בין גודל קצה והתנגדות גישה נמוכה, אשר בדרך כלל נע 8-15 MΩ. הדבר חשוב במיוחד לאירועים עם קינטיקה מהירה; ~ 0.1 אלפיות שניות (20-80%) יעלו פעמים ו~ 0.5 מעריכי msec דועך 12,14,15 (3A ואיורים 3 ב). הנתונים שנרכשו בשיעור דיגיטציה של 50-100 קילוהרץ ומסונן עם תדר נמוך לעבור של 5-10 KHz. בהתייחס לטפטפות התיקון, מצאנו שהם לא צריכים להיות כדי להשיג הקלטת אש מלוטשת, אבל אנקדוטות, נראה להציע סיכוי מעט טוב יותר של קבלת חותמות טובות בהשוואה לטפטפות לא מלוטש. מאחר הטיפים פיפטה הם גדולים יחסית, אנחנו לא להוסיף verלחץ y הרבה חיובי לפיפטה לפני הכניסה לפתרון. זה לוקח בפועל יחליט על הכמות המתאימה של לחץ חיובי לחול עודף של לחץ יעברו לתא יותר מדי, וימנע היווצרות חותם. זה גם עלול לגרום נזק לקשרים סינפטיים כתא הוא עקור בעדינות ממקומו המקורי. מצד השני, תוצאות לחץ מעט מדי בטיפים מלוכלכים ולא הצליחו לנקות את פני השטח של התא מספיק טוב כדי ליצור חותמות טובות. שמח בינוני מושגת רק על ידי תרגול וניסיון משמעותיים. היווצרות Seal יכולה להיות משופרת עם יישומים של מתח השלילי לפיפטה. בדרך כלל יש לנו חותמות של 1.2-2 GΩ, שהם מעולים לפריצות דרך לכל מצב התא.
כאשר סוכנים תרופתיים צריכים להיות מיושמים על הציטופלסמה של התא, אנו לכלול אותם בפתרון תאיים לפני מילוי פיפטה. יש להקפיד בעת הכנת פתרונות פיפטה כדי למנוע אובדן של הסוכניםעל ידי בעלה לאגד את מסנן 0.22 מיקרומטר. לכן, אנו מסננים את המדיום תאיים ראשון, ולאחר מכן להוסיף בזהירות את הסוכן התרופתי לפתרון המסונן. יישום של תרכובות לתא תאיים יש סט ייחודי משלו של אתגרים. לדוגמא, תוספת של תרופות למדיום תאיים בדרך כלל מפחיתה את הסיכוי ליצירת חותם GΩ, אבל לא עד לנקודה שבה הוא מכשול עיקרי לניסוי.
אחד צריך להבין כי היישום של סוכנים תרופתיים באופן זה אינו מאפשר הנסיין כדי להקליט את השליטה המתאימה ביותר שכן יש סוכן גישה מיידית לתא מההתחלה של כל תצורת התא. לכן, בזמן שאנו רושמים נתונים ברחבי סוג זה של ניסוי, אחד חייב להיות מודע לכך שהשליטה הטובה הבאה היא היישום תאיים של צורה פעילה של הסוכן. במקרים רבים זה לוקח את הצורה של מתחם חום מומת, o פפטיד מקושקשתr האיזומר פעיל המתקבל מהספק.
אנו רוכשים את הנתונים בצורה של זרמים סינפטיים (mPSCs), זרמי מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה. זרמי מיניאטורות עשויים להיות מנותחים על ידי כמה תוכניות מצוינות (pClamp, Axograph, וכו '), אם כי אנו מעדיפים להשתמש Axograph X (ג'ון קלמנטס). Axograph X פועל על שני הפלטפורמות של Windows ו-Macintosh ויכול לשמש הן לרכישה והניתוח של נתונים אלקטרו. mEPCs נרכש בעזרת תבנית של הבחירה של הנסיין, המתקבלת מהרישום עצמו. אירועים בודדים ניתן לנתח למאפיינים כגון זמן עלייה, משרעת, חצי רוחב וריקבון זמן, וכו 'אנחנו לייצא את הגיליון האלקטרוני של נתונים לKaleidagraph (Synergy תוכנה) שבו אנחנו יכולים לייצר דמויות, כוללים עותקים של עקבות אירוע מAxograph X.
אחד ההיבטים הקשים יותר של הניסוי הוא לקבוע האם ההקלטה בוצעה מספיק טוב כדי לספק נקי,נתונים אמינים. לדוגמא, בעיות מהדק חלל עלולות להתעורר בעת הקלטת mPSCs מM-תאים שיש להם אקסונים גדולים ותהליכים דנדריטיים נרחבים. כאשר הידוק מתח, אפשר בדרך כלל לשלוט במתח בקצה פיפטה בצורה סבירה (במיוחד אם את התנגדות הגישה (R) היא נמוכה), אך ייתכן שלא תהיה בקרה נאותה של פוטנציאל הממברנה בתהליכים או אקסונים הדנדריטים, כי הם רחוקים הרחק בקצה פיפטה. אחת שיטות לקביעה אם התא היה כראוי השטח מהודק היא לייצר עלילת פיזור של זמן העלייה לעומת המשרעת של mPSCs שנרשמו. מתאם בין הנתונים המעידים על הידוק שטח לוקה בחסר. במילים אחרות, אם את מהדק החלל הוא עני אז mPSCs המתרחשים קרוב לפיפטה יהיה מהיר יותר לעלות פעמים ואמפליטודות גדולות יותר מאירועים המתרחשים במרחק מה מפיפטה. אם קשר אכן קיים, אז הנתונים הוא בעייתיים ולא ניתן להשתמש בם.
היבט נוסףשל קלטות אלקטרו שצריך להיות מטופל הוא זה של זרמי דליפה. הדבר נכון במיוחד כאשר מתח הידוק תא על מנת לרשום זרמי מתח מגודרת כמו Na + K + או זרמים. כאשר פוטנציאל הממברנה הוא סטה משאר, ניתן להקליט זרמי דליפה יחד עם פעילות תלוית מתח. זרמי דליפה (אני L), שילוב של אשלגן (אני K), נתרן (אני Na) וכלוריד הנוכחי (אני Cl) דרך הלא מתח מגודרת ערוצים יהיו לטשטש את פעילותו של עניין וזה חייבים להיות מופחת ההקלטה. המגבר הוא מסוגל לבצע את התפקיד הזה באינטרנט בזמן ההקלטה על ידי הפעלה מה שנקרא פרוטוקול P / N בדרך כלל. במהלך פרוטוקול P / N המגבר יפעל כמה depolarizations הקטן (או hyperpolarizations) ממנוחה וירשום הנוכחיים דליפה וכתוצאה מכך המתרחש. חשוב להשתמש מספיק פולסים קטנים שלא יפעילו ערוצי מתח מגודרת. הנוכחישל המתרחשים במהלך פולסים אלו נרשמים בממוצע, כך שיכולים להיות מופחתים זרמי דליפה אלה מפעילות ערוץ המתח מגודרת.
לבסוף, צריך לקחת בחשבון את פוטנציאל צומת, אשר מתרחש בקצה האלקטרודה בין תאית ופתרונות תאיים. פתרונות תאיים וחוץ תאיים מורכבים בדרך כלל של יונים שונים, עם פעילויות וmobilities שונים. יונים גדולים יותר עם mobilities הנמוך יציעו התנגדות גדולה יותר לתנועת יון מאשר קטן וזה יכול לגרום להבדל פוטנציאל קטן אך משמעותי בצומת של הפתרונות. פוטנציאל צומת זה חייב להילקח בחשבון בקביעת המתח המתאים חווה על ידי התא.
הטכניקה המוצגת כאן היא אחד בשימוש על ידי המעבדה שלנו במשך שנים רבות. עם זאת, ישנן שיטות חלופיות של הקלטה מM-התא. בעיקר, יוסף Fetcho ועמיתיו לפתחed הכנה מצוינת שבו אפשר להקליט מM-התאים של זחלים מבוגרים (בן 4-5 ימים) באופן פחות פולשני מכפי שהוצג כאן, שבו M-התא פנה מהמשטח הגבי 16. ניסיתי אנחנו טכניקה דומה אבל מצאנו את זה קל יותר להתקרב M-התא מהצד הגחוני של המוח האחורי, שבו התא קרוב יותר אל פני השטח של המוח, בעיקר בדגים צעירים (כלומר 24 hpf 72 hpf). יתר על כן, גישה מהמשטח הגבי דורשת בדרך כלל שימוש בקו מהונדס המבטא את תג ניאון M-התא, שבו יש את הפוטנציאל להציג את משתנים נוספים להקלטה. בעיה זו לא קיימת כאשר משתמשים בדגים מסוג בר. עם זאת, עם הטכניקה שהוצגה כאן, אנחנו מוגבלים ללימוד בעלי חיים צעירים (24 hpf 72 hpf). לכן, לכל גישה יש יתרונות ומגבלות שלה.
מבחן t של הסטודנט ניתן להשתמש כדי להשוות בין שתי קבוצות של נתונים תוך ניתוח של ריאןלסה"נ (אנובה) ניתן להשתמש כדי להשוות בין מספר קבוצות. יש להקפיד לבחור את מבחן post hoc-המתאים לפרמטרית לעומת נתונים שאינם פרמטרית.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC) והקרן הקנדית עבור חדשנות (CFI), כדי DWA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, 5, University of oregon Press. (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
