Summary
Vi har utviklet en intakt hjerne-ryggmargs forberedelse til å registrere og overvåke elektrisk aktivitet via patch clamp opptak fra Mauthner nevroner og andre reticulospinal celler i sebrafisk embryo. Dermed er vi i stand til å ta opp aktiviteten på kanalen spenningsstyrte eksitatoriske og hemmende synaptiske strømmer og aksjonspotensialer fra sentrale nevroner i en utvikling av embryo.
Abstract
Mauthner celler (M-celler) er store reticulospinal nevroner som ligger i hindbrain av teleost fish. De sentrale neuroner som er involvert i den karakteristiske oppførsel kjent som C-start eller unnslippe reaksjon som forekommer når organismen oppfatter en trussel. The M-cell er blitt grundig studert i voksen gullfisk, hvor det har vist seg å motta et bredt spekter av eksitatoriske, inhiberende og neuromodulatory signaler 1. Vi har undersøkt M-celle-aktivitet i embryoniske sebrafisk for å undersøke deler av synaptisk utvikling i et virveldyr preparat. På slutten av 1990-tallet Ali og kolleger utviklet en forberedelse til patch clamp opptak fra M-celler i sebrafisk embryo, der CNS var stort sett intakt 2,3,4. Målet den gang var å spille inn synaptiske aktivitet fra hindbrain nevroner, ryggmargs nevroner og bagasjerommet skjelettmuskulatur og samtidig opprettholde funksjonelle synaptiske forbindelser innenfor en intakt hjerne-ryggmargs forberedelse.Dette preparatet brukes fortsatt i vårt laboratorium i dag. For å undersøke mekanismene bak utviklings synaptisk plastisitet, registrerer vi eksitatoriske (AMPA og NMDA-mediert) 5,6 og hemmende (GABA og glysin) synaptiske strømmer fra utviklings M-celler. Viktigst av alt gir dette unike forberedelse oss å gå tilbake til den samme cellen (M-cell) fra forberedelse til forberedelse til å nøye undersøke synaptisk plastisitet og nevro-utvikling i en embryonale organisme. De fordeler som tilbys av dette preparatet omfatte 1) intakte, funksjonelle synaptiske forbindelser bort på M-celler, 2) relativt rimelige preparater, 3) en stor tilførsel av lett tilgjengelige embryoer 4) evnen til å gå tilbake til den samme celletype (for eksempel M- celle) i hver bearbeiding, slik at synaptisk utvikling på nivå med en enkelt celle kan undersøkes fra fisk til fisk, og 5) avbildning av hele preparater på grunn av den transparente natur av embryoene.
Introduction
En av de utestående spørsmålene i utviklings neurobiology gjelder rollen til synaptisk plastisitet fenomener under synaptiske modning. Vår forskning fokuserer på å forstå plastisitet mekanismene som ligger bak synaptic utvikling med et overordnet mål om å forstå dyrs atferd i sammenheng med synaptic utvikling. For å gjøre dette, har vi utviklet en stor grad intakt forberedelse i en organisme (sebrafisk, Danio rerio) som har fått betydelig trekkraft for utviklingsstudier i slutten av 1990.
Sebrafisk har flere klare fordeler for nevrologiske studier. For eksempel, er dens genom sekvensert og man kan utføre morfolino knockdowns og sink-finger nuklease knockouts til taushet genaktivitet og protein uttrykk. Man kan også utføre høyekspresjonsystemer studier og transgene linjer kan konstrueres 7-9. Embryoet er relativt enkle og rikelig å skaffe seg, ogden gjennomsiktige natur embryoet egner seg godt til bildebehandling og opto-genetiske studier. I tillegg kan atferdsanalyse skal utføres, og elektrofysiologiske eksperimenter kan skje på muskelfibre, ryggmargs nevroner og hindbrain nevroner i stor grad intakte organismer, tillater en å undersøke cellular funksjon in vivo. Viktigere, er vi i stand til å undersøke synaptisk aktivitet i ikke bare den samme klassen av celle, men i samme par av nerveceller, fra forberedelser til forberedelse. Med andre ord er dette et av de sjeldne virveldyr preparater der man kan gå tilbake til den samme neuron, in situ, for å studere utviklingen.
For å opprettholde neuronal kretsanordning som levedyktig som mulig, har vi utviklet et preparat hvori hindbrain og ryggmargen ble etterlatt intakt, mens lappen klem fra M-celler. I dette preparatet, er det øynene, kjeven og huden overliggende hjernen forsiktig fjernet og hindbrain er Peeled bort fra ryggstreng, slik at tilgang til den ventrale overflaten av hindbrain. De reticulospinal nevroner ligger noen få mikrometer dyp og er relativt lett tilgjengelig. På 48 timer etter befruktning (HPF, noen forkortelser er oppført i tabell 1) cellene er elektrisk kompakt og man kan trofast opp synaptiske aktivitet (både stimulerende og hemmende strøm), spenningsstyrte strøm og aksjonspotensialer fra dem.
Våre funn har antydet at mange aspekter av synaptiske utvikling og modning oppstå i 24 timer før klekking, og derfor mye av vår oppmerksomhet er fokusert på organismer som spenner i alder fra 24 HPF til 72 HPF. Men ved høypassfilteret 72, M-celler er mindre elektrisk kompakte og er vanskelige å riktig plass klemme. Teknikken kan brukes til å registrere ikke bare fra M-celler, men også fra dets homologer, MiD2 cm og MiD3 cm. Teoretisk sett kan en også utføre dobbel opptak, fra en spinal ledningen neuron for eksempel en primær motor neuron og fra M-celler, men dette er vanskelig, og det kan hevdes at nytten av en slik vanskelig teknikk ikke kan være verdt den ekstraordinære krefter som er nødvendig.
Protocol
En. Forberedelse og Dissection
- Klargjør dissekere fatet foret med Sylgard. Opptak kamre fra WPI (Sarasota, Florida, USA, leverandører er listet i tabell 2) er brukt som dissekere retter (Figur 1). Kamrene er laget for å ta imot glassplater og små plastskiver benyttes som støpeformer for Sylgard. Skivene blir først festet til glide med fett og væske Sylgard tilsettes til sentrum av skiven. Den Sylgard vil herde over natten, og som det gjør det, den danner en liten, sirkulær seng på objektglass, som blir undersiden av dissekere fatet. Sleiden er plassert inn i opptakskammeret og tjener også som bunnen av kammeret til hvilken fremstillingen er festet (figur 1).
- Forbered løsningene som er oppført i tabell 3. Ekstracellulære løsninger bør stå ved romtemperatur mens intracellulære løsninger bør holdes sterile. Man kan også legge til LuCifer gul (0,1%) i den intracellulære løsning, slik at visualisering av M-cellemorfologi kan utføres ved slutten av forsøket. Dette tjener til å bekrefte celleidentitet (fig. 2).
- Hev villtype sebrafisk embryo i egg vann ved 28,5 ° C, og samle og scene ifølge Kimmel et al. 10. For disseksjoner, overføre embryo til dissekere rett som også fungerer som opptakskammeret. Anesthetize i 7-10 min i en bedøvelse salt-løsning (0,02% Tricaine; løsning 1, tabell 3) som tett tilnærmet fysiologisk saltvann. Man kan avgjøre om det er tilstrekkelig bedøves ved å undersøke responsen på en skånsom hale klemme.
- Pin embryoene gjennom ryggstreng og inn på Sylgard-lined tallerken med 0,001 "Tungsten (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) med 25X forstørrelse på en dissekere mikroskop (figur 1). Wolfram ledningen er lett å skjære itil små områder med fin dissecting saks.
- Juster forstørrelsen på dissekere omfang til 40-50X å utføre disseksjon. Når fosteret er festet til parabolen, kjeve, øyne og forhjerne blir fjernet ved hjelp av en fin pinsett (Dumont # 5).
- Hindbrain er forsiktig skrelles bort fra den underliggende notochord ved forsiktig arbeider pinsett mellom ryggstreng og hjernen. Hindbrain blir deretter forsiktig snudd slik at den ventrale overflaten vender opp. Denne posisjoneringen gir god tilgang til de M-celler, som er vanligvis i løpet av 5 til 10 mikrometer i den ventrale overflaten hos unge embryoer og ~ 20 til 50 mikrometer i eldre larver (Fig. 2A).
- Bevege preparatet forsiktig til opptaks oppsett der lappen klemmen eksperiment kan utføres. M-celler er visualisert med Nomarski Differential Interference Kontrast (DIC), selv om andre former for bildediagnostikk (dvs. Hoffman module kontrast eller Dodt Gradient kontrast bildebehandling fraLuigs og Neumann, Tyskland) kan også anvendes.
2. Patch Clamp Recording (Whole celle-modus)
- Alle opptak er utført i hele cellen patch clamp modus 11. Opptak kamrene er plassert på et mikroskop scenen i en elektrooppsett. Våre etapper er faste og oppreist patch clamp mikroskop er boltet til en bevegelig mikroskop plattform eller et mikroskop oversetter.
- Patch klemme pipetter er trukket på en horisontal avtrekker (P-97; Sutter Instruments Co) fra tynnvegget, borsilikatglass hentet fra WPI. Pipettespissen diameter er av størrelsesorden 0,2 til 0,4 mikrometer i det brann polering til en jevn kant, og den koniske skaft er ~ 4 mm i lengde.
- Fest pipetten til forsterkeren head-scenen i elektrooppsett. Det er viktig å holde hode-fasen på omtrent 45 ° vinkel i forhold til den horisontale akse, da dette sikrer en inngangsvinkel for den pipette som er egnet for dannelse av høy motstand tetnings ut mot Mauthner cellen.
- Like før vi går i badekaret løsning, påfør en liten mengde positivt press til pipetten til å redusere sjansen for tilskitning spissen. Når du tar opp mEPSCs, bade løsninger omfatter en mikrometer TTX å blokkere aksjonspotensialer, 5 mikrometer stryknin å blokkere glysin reseptorer og 10 mikrometer bicuculline eller 100 mikrometer Picrotoxin å blokkere GABA A-reseptorer. Når du tar opp mIPSCs, bade løsninger omfatter en mikrometer TTX, kynurenic syre og enten bicuculline eller stryknin avhengig av reseptor aktivitet av interesse.
- Approach M-celle med en liten mengde positivt trykk i pipetten. Det positive trykket presser forsiktig cellen fra side til side, og ved plassering umiddelbart over cellen, danner en liten fordypning på cellemembranen. La pipetten på plass i et par sekunder for å rense forsiktig celleoverflaten, slik at en sterk forsegling mellom pipette og membranen kan bli dannet. Frigjøring av overtrykk i pipettengjør det mulig for tetningen å bli igangsatt, og en liten mengde av negativt trykk kombinert med negative potensialer pipettes resulterer i GigaΩ tetninger danner i løpet av få sekunder.
- Endre holdepotensial på forsterkeren til -60 mV. Revne cellemembranen med en serie av korte pulser av sug. Umiddelbart spille membran potensialer og minimere kapasitans gjenstander. Kompensere celle kapasitans (C m) og tilgang (serie) motstand (R a) med 70-85%. R a skal overvåkes rutinemessig, hvert 30. sekund til et minutt, og hvis det er en endring på 20% eller mer, avbryte forsøket.
- Når eksperimentet er slutt og nok data har blitt hentet inn, er forberedelsene ofret ved å fjerne hindbrain med en pinsett. På dette punktet, kan begynne dataanalyse.
Representative Results
I dette manuskriptet presenterer vi en metode for patch-clamp opptak i den hel-celle-modus fra reticulospinal nevroner i sebrafisk, spesielt med fokus på M-celle. Selvfølgelig er det også mulig å ta opp i andre patch clamp modi, for eksempel celle-tilknyttet, innsiden ut og utvendig ut. Den type data som man kan få er ikke begrenset til det vi har presentert her, men vi prøver å gi et eksempel på både synaptiske aktivitet (stimulerende og hemmende) i spennings-klemme-modus samt aksjonspotensialer i strømtang. Som organismen aldre og M-celler utvikle mer omfattende og forseggjorte dendritter, er evnen til tilstrekkelig spenning klemme og plass klemme cellen kompromittert og strømtang-modus blir opptaket av valget.
Fig. 3 viser representative opptak av eksitatoriske AMPA-og NMDA-reseptor-strømmer oppnådd fra 48 HPF embryoer i nærvær av TTX (1 mM) og farmakologiske midler for åblokkere GABA og glysin reseptorer. Når M-celler er klemt fast spenning på -60 mV, den synaptiske strøm er på grunn av aktivering av AMPA-reseptorer (figur 3A). Oppkjøp og analyse av disse hendelsene gjør det mulig å spille inn parametre som stige tid, forfall tid, amplitude og frekvens. AMPA-hendelser som typisk har en rask stigetid (20-80% stigetid på ~ 0,1 msek) og desintegrasjonstid (~ 0,5 msek), og oppviser en gjennomsnittlig amplitude på omtrent 25 pA. Når M-cellene er festet ved 40 mV, den resulterende ytre strøm er på grunn av AMPA-og NMDA-reseptor-aktivitet (figurene 3C og 3D). NMDA reseptor strømninger utviser lengre tid kurs enn AMPA reseptor strømninger, og trenger å bli tatt opp på positive potensialer eller i Mg-fri løsning for å fjerne Mg blokk av NMDA reseptorer 2,6. Den gjennomsnittlige mEPSC vist i Figur 3D representerer blandede AMPA og NMDA strømninger innspilt på 40 mV.
Figure 4 viser representative resultater når opptaket mIPSCs fra Mauthner celler. Disse hendelsene forekom i nærvær av TTX (1 mM) og kynurenic syre (1 mM) for å blokkere AMPA-og NMDA-reseptorer. Disse hendelsene oppviser relativt rask stigning og fallkinetikk ved høypassfilteret 48, og er ofte nok til å skaffe flere av dem over en 2-3 min opptaket 3.. Figur 5 viser aksjonspotensialer registrert som et resultat av injeksjon av depolariserende strøm inn i cellen. M-celler av 48 HPF embryoer vanligvis fyre av en enkelt handling potensial (Figur 5B), selv om de noen ganger fyre av flere aksesspunkter når injisert med suprathreshold stimuli (Figur 5A).
| Forkortelse | Fullt navn | |
| En. | mPSC | Miniatyr postsynaptiske strøm |
| 2. | mEPSC | Miniatyr eksitatoriske postsynaptiske strøm |
| 2 | mIPSC | Miniatyr hemmende postsynaptiske strøm |
| Tre. | MΩ | Mega Ohm (enhet av motstand; 10 6 Ohm) |
| 4. | GΩ | Giga Ohm (enhet av motstand; 10 9 Ohm) |
| 4. | MOsm | Milli osmolaritet (enhet av osmolaritet, 10 -3 osmoles) |
| 4. | TTX | tetrodotoxin |
| 5. | ATP | adenosin trifosfat |
| 6. | GTP | guanosine trifosfat |
| 7. | GFP | Grønt fluorescerende protein |
Tabell 1.
| Selskapet | Katalognummer | | |
| En. | Dissekere Dish | Warner Instruments | 64-0291 |
| 2. | 0,001 "Wolfram Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 |
| 2 | Dissekere mikroskop | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| Tre. | Pipette Puller | Sutter Instruments Co | P-97 |
| 4. | Microforge | Narishige Gruppen | MF-900 |
| 5. | Oppreist Patch klemme mikroskop | Leica Microsystems | DMLFSA |
| 6. | Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| 7. | Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| 8. | Forsterker | Molecular Devices | 200B |
| 9. | Oppkjøp programvare | Molecular Devices | pClamp9 |
| 10. | Axograph X | Axograph | Axograph X |
Tabell 2.
| Løsning Navn | Reagens og konsentrasjon (mM) | |
| En. | Dissekere løsning | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukose og 0,02% Tricaine |
| 2. | mPSC Ekstracellulær løsning | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukose og 0,001 TTX |
| Tre. | mPSC Intracellulær løsningersjon | 134 CsCl, 2 MgCl2 og 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2-ATP, 0.4 Li-GTP |
| 4. | Aksjonspotensial Ekstracellulær løsning | 137 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES og 10 Glukose (med 10 mM D-tubokurarin) |
| 5. | Aksjonspotensial Intracellulær løsning | 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-ATP og 0,4 Li-GTP. |
Tabell 3. Alle ekstracellulære løsninger blir justert til 290 mOsm, og pH 7,8. Alle intracellulære løsninger blir justert til 280 mOsm, og pH 7,4.
Figur 1. Dissekere fatet og intakt hindbrain-ryggmarg forberedelse. (A) dissekere og opptak fatet innhentet fra WPI. En tynn skive er nøye forseglet på tHan glass-slide i bunnen av skålen og Sylgard påføres brønnen. (B) 48 HPF hindbrain-ryggmarg preparat. Den ventrale overflate hindbrain vender opp og M-cell er lokalisert like under overflaten av vevet på nivå med pilspissen.
Figur 2. (A) kontrast Nomarski differensialinterferensbilde av en M-celler oppnådd fra en 2 dpf embryo like etter klekking. Bildet ble tatt etter opptak spontan eksitatorisk synaptisk aktivitet fra M-celle. (B) Cellen ble fylt med Lucifer gult løpet forsøket. Tilpasset fra 12 med tillatelse.
Figur 3. (A) Spontane AMPA mEPSCs registrert fra en M-celle ved et holdepotensial på -60 mV. (B) Gjennomsnittlig mEPSCs oppnådd fra opptaket i (A). (C) Spontan AMPA-og NMDA (pilhoder) mEPSCs tatt opp fra en M-celle om å holde potensial på +40 mV. (D) Gjennomsnittlig mEPSCs oppnådd fra opptaket i (C). Glutamat mEPSCs ble registrert i nærvær av TTX (1 uM) for å blokkere aksjonspotensialer, stryknin (5 uM) og Picrotoxin (100 uM) for å blokkere glysin og GABA-strømmer.
Figur 4. (A) Spontane mIPSCs tatt opp fra en M-celle ved en holdepotensial på -60 mV. (B) Gjennomsnittlig mEPSCs oppnådd fra opptaket i (A). mIPSCs ble registrert i nærvær av TTX (1 uM) for å blokkere aksjonspotensialer, kynurenic syre (1 mM) for å blokkere glutamat-reseptor-aktivitet og bicuculline (10 uM) for å blokkere GABA strømninger.
Figur 5. Aksjonspotensialer registrert fra en M-celle. I denne spesielle celle en suprathreshold stimulus (0.48 nA) fremkalte flere aksjonspotensialer (A), men en stimulus til terskelen bare resulterer i produksjonen av en enkelt aksjonspotensial (B). (C) Omløps protokoller for spor vist i A og B.
Discussion
Den protokoll som er beskrevet ovenfor gjør det mulig å lappe klemmen posten fra M-celler og dens homologer. Teknikken er utfordrende og omsorg bør tas på flere viktige områder gjennom hele prosedyren. Vi vil nå diskutere noen av disse områdene, og vil tilby nyttige tips for å sikre suksess.
Byggingen av dissekere / opptakskammeret er en kritisk del av forsøket. M-celler er vanskelig å se, med mindre kontrast differensialinterferens benyttes. Nomarski DIC virker best med rent glass dekkglass, men vi har funnet at et svært tynt lag av Sylgard (~ 1-2 mm) ikke vil forvrenge DIC i en slik grad at det forstyrrer identifikasjon av M-celler. Derfor bruker vi et opptak kammer som har en tynn glass dekkglass på bunnen hvorpå er plassert en liten plastskive (~ 5 mm diameter). Vi blande Sylgard 184 i en petriskål og tilsett forsiktig væsken Sylgard til innsiden av skiven med en Pasteur pipette. Sylgard kan bli herdet ved romtemperatur i løpet av et par dager, eller kan varmes opp for hurtig herding. Vaskemaskinen kan fjernes etter at Sylgard har herdet, selv om dette ikke er nødvendig. Etter disseksjon / opptakskammeret er gjort, kan den brukes i flere uker før en frisk Sylgard-foret glass-slide er nødvendig.
Det neste trinn i prosedyren er å gjøre opp alle de aktuelle løsningene på dagen av forsøket (tabell 3). Intracellulære oppløsninger inneholdende alt bortsett fra ATP og GTP er laget på forhånd og oppbevares i 5 ml alikvoter ved -20 ° C. På dagen for opptak av en alikvot er tint til romtemperatur og frisk ATP-og GTP tilsettes. Oppløsningen ble justert til 280 mOsm, og pH 7,4. I våre hender, finner vi at tilførsel av ferskt ATP og GTP på daglig basis resulterer i gode innspillinger. Alle løsningene må holdes sterile for den beste muligheten for suksess.
Intracellulære løsninger må filtreres througha 0,22 mikrometer filter (Sigma) for å fjerne små partikler og rusk som kan påvirke opptaket. For å gjøre dette, må vi først trekke den intracellulære løsning i en 1 ml sprøyte, feste filteret til enden av sprøyten og legge en plastpipettespiss som var oppvarmet og trukket til fine spiss, til enden av filteret. Dette gir oss muligheten til å bruke den filtrerte intracellulære løsningen direkte til innsiden av glasset patch pipetter.
Når oppløsninger fremstilles, kan embryoet bedøves og dissekert. Før disseksjon, bør man sørge for å tilstrekkelig vurdere en alder av organismen. Hvert embryo innenfor en clutch aldre på en litt annen pris. Derfor når man vurderer en alder av organismen, er det viktig å gjøre det i henhold til etablerte prosedyrer 10,13, ved hjelp av fenotypiske signaler som antall somites, den generelle formen av legemet, og tidspunktet for egg-befruktning. Alle disseksjoner er utført med en Dumont # 5 fint partang. Disse må være skarpe og i god stand ellers vil det være svært vanskelig å fjerne huden overliggende hindbrain og noen bindevev på ventral overflaten av hindbrain. Vi har ofte å skjerpe tang etter noen ukers bruk, og gjøre dette selv med en skjerping stein.
Slik fester fisken til det tynne laget av Sylgard, bruker vi pins fashioned fra fine Tungsten 0.001 inches i diameter. Pinnene er kuttet med en gammel, mikro-disseksjon saks i henhold til en dissekere mikroskop, og er små nok til å passe rett gjennom ryggstreng. Låsing embryoene på noe annet punkt ikke immobilisere dem og gjør disseksjoner nesten umulig å utføre. Når først lære å utføre opptakene, kan det være vanskelig å identitet M-celle fra sine homologer (spesielt MiD2 cm, som ligger i nabo rhombomere - rhombomere 5). I enkelte embryoer disse to par av celler synes lik i størrelse. Den otolitter probringe en praktisk landemerker for å hjelpe til i identifiseringen av M-celler. På 48 HPF de M-celler er plassert rett ved siden av otolitter, og selv om de otolitter er fjernet under disseksjon, etterlater de seg en litt skadet lateral regionen hindbrain, som fungerer som en markør for sin opprinnelige posisjon. Transgen fisk som uttrykker GFP eller noen andre fluoriserende fargestoff i M-celle, gi gode forberedelser til nye forskere. I våre hender de M-celler har en membran kapasitans på ca 18-24 pF på 48 HPF, mens de mindre homologer er nærmere 12-14 pF. Celler med større areal har større membran kapasitans verdier (målt i pico farads (PF)) sammenlignet med mindre celler. Således kan membranen kapasitans benyttes som en grov indikasjon på cellestørrelsen, hvor større celler har større kapasitansverdier. Denne elektro karakteristiske tjener som en annen egenskap som gjør det M-celle kan bli identifisert fra dens homologer. Til slutt, vi bruker ofte LuCifer gul i vår innspilling (intracellulære) løsninger, som tillater oss å gjennomføre en fast identifikasjon av celletype under etterforskning ved hjelp av fluorescens bildebehandling når opptakene er ferdig.
Pipettespissen motstander i størrelsesorden 3,5-4,5 MΩ er det beste kompromisset mellom spissen størrelse og lav tilgang motstand, som typisk varierer fra 8 til 15 MΩ. Dette er spesielt viktig for hendelser med raske kinetikk; ~ 0,1 msek (20-80%) stiger ganger og ~ 0,5 msek eksponentiell henfaller 12,14,15 (Tall 3A og 3B). Data blir ervervet ved en digitaliserings hastighet på 50 til 100 kHz, og filtrert med en lav pass frekvens på 5 til 10 KHz. Med hensyn til de patch pipetter, har vi funnet ut at de ikke trenger å være brann-polert for å få et opptak, men anekdotisk, ser det ut til å gi litt bedre sjanse for å få gode seler sammenlignet med upolert pipetter. Siden pipettespissene er relativt stor, legger vi ikke til very mye positivt press til pipetten før vi går i oppløsning. Det krever øvelse å avgjøre på riktig mengde positivt press for å gjelde som et overskudd av press vil flytte celle for mye, og vil hindre segl formasjon. Det kan også skade synaptiske kontakter som cellen er forsiktig fortrengt fra sin opprinnelige posisjon. På den annen side er for lite trykk resulterer i skitne tips og ikke blir ren overflaten av cellen godt nok til å danne gode forseglinger. En gyllen middelvei er bare oppnås ved betydelig praksis og erfaring. Seal dannelse kan være forbedret med anvendelser av negative spenninger til pipetten. Vi har vanligvis sel av 1,2-2 GΩ, som er utmerket for gjennombrudd i hele cellen modus.
Ved farmakologiske midler må brukes til celle cytoplasma, inkluderer vi dem i den intracellulære løsning før fylling av pipetten. Forsiktighet bør utvises ved utarbeidelsen av pipette løsninger for å unngå tap av agenteneved at den binder seg til 0,22 mikrometer filter. Derfor har vi filtrere den intracellulære medium først, og deretter tilsett forsiktig farmakologisk middel til den filtrerte oppløsning. Bruk av forbindelser til det intracellulære rommet har sine egne unike sett av utfordringer. For eksempel, reduserer tilsetning av stoffer til det intracellulære medium vanligvis er sjansene for å danne en GΩ tetning, men ikke til et punkt der det er en betydelig hindring for eksperimentet.
Man bør forstå at anvendelse av farmakologiske midler på denne måte ikke tillater experimenter til å ta opp den mest hensiktsmessige kontroll siden agenten har umiddelbar adgang til cellen fra starten av hele cellekonfigurasjonen. Derfor, mens vi ta opp data i hele denne type forsøk, må man være klar over at den nest beste kontroll er den intracellulære anvendelse av en inaktiv form av midlet. I mange tilfeller er dette skjer i form av en varme-inaktivert forbindelsen, et kodet peptid or en inaktiv isomer innhentet fra leverandøren.
Vi skaffe data i form av synaptiske strømmer (mPSCs), spenningsstyrte strøm og aksjonspotensialer. Miniatyr-strømmene kan bli analysert av noen få gode programmer (pClamp, Axograph, etc.), selv om vi foretrekker å bruke Axograph X (John Clements). Axograph X kjører på både Windows og Macintosh-plattformer, og kan brukes til både innhenting og tolkning av elektrofysiologiske data. mEPCs er ervervet ved hjelp av en mal av experimenter valg, erholdt fra opptaket i seg selv. Enkelthendelser kan analyseres for egenskaper som stige tid, amplitude, halv bredde og forfall tid, etc. Vi eksporterer regnearket av data til Kaleidagraph (Synergy Software) hvor vi kan produsere tall, inkludert kopier av hendelses spor fra Axograph X.
En av de mer vanskelige sidene ved forsøket er å avgjøre om innspillingen ble utført godt nok til å gi rent,pålitelige data. For eksempel kan plassklem problemer oppstår når opptaket mPSCs fra M-celler som har store axoner og omfattende dendrittiske prosesser. Når klemspenningen, kan man generelt styre spenningen på spissen av pipetten rimelig godt (spesielt hvis adgangsmotstanden (R a) er lavt), men kan ikke ha god kontroll med membranpotensialet i dendrittiske prosesser eller aksoner som er langt bort fra pipettespissen. En metode for å bestemme om den celle var riktig plass fastspent, er å produsere et spredningsdiagram av stigningstiden vs amplituden av mPSCs som ble registrert. En korrelasjon mellom data tyder på utilstrekkelig plass klem. Med andre ord, hvis plassen klemmen er dårlig da mPSCs som forekommer i nærheten av pipetten får stige raskere tider og høyere amplituder enn hendelser skjer noen avstand fra pipetten. Hvis en korrelasjon eksisterer, så dataene er problematisk, og kan ikke brukes.
Et annet aspektav elektrofysiologiske opptak som må tas opp er at av lekkasjestrømmer. Dette gjelder spesielt når spenningen fastspenning i en celle for å registrere spenningsstyrte strømmer slik som Na + eller K + strøm. Når membranpotensialet er merkelig fra resten, kan lekkasjestrømmer registreres sammen med spenningsstyrte aktivitet. Lekkasje-strømmer (I V), en kombinasjon av kalium (I K), natrium (I Na) og klorid (Cl I) strøm gjennom ikke-spenningsstyrte kanaler vil ødelegge aktiviteten av interesse og må trekkes fra opptaket. Forsterkeren er i stand til å utføre denne funksjon på nettet under opptaket ved å kjøre det som vanligvis kalles et P / N-protokollen. Under en P / N protokollen forsterkeren vil kjøre flere små depolariseringer (eller hyperpolarizations) fra resten, og vil ta opp den resulterende lekkasje strøm som oppstår. Det er viktig å bruke små nok pulser som ikke aktiverer spenningsstyrte kanaler. Den nåværendes som forekommer i løpet av disse pulser er registrert og i gjennomsnitt, slik at disse lekkasjestrømmer kan bli subtrahert fra kanalen aktivitet spenningsstyrte.
Til slutt må man ta hensyn til koblingspotensial som opptrer ved spissen av elektroden mellom de intracellulære og ekstracellulære løsninger. Intracellulære og ekstracellulære løsninger er vanligvis sammensatt av ulike ioner, med ulike aktiviteter og mobilitet. Større ioner med lavere mobilitet vil tilby en større motstand til ion bevegelse enn små, og dette kan resultere i en liten, men betydelig potensial forskjell i krysset av løsningene. Denne koblingspotensial, må tas i betraktning ved bestemmelse av de riktige spenninger oppleves av cellen.
Teknikken som presenteres her er en som brukes av vår lab i mange år. Men, det finnes alternative metoder for opptak fra M-celle. Mest spesielt, Joseph Fetcho og kolleger har utvikleed en god forberedelse der man kan ta opp fra M-celler av eldre larver (4-5 dager gammel) i en mindre invasiv måte enn som presenteres her, hvor M-celle er kontaktet fra framsiden 16. Vi har forsøkt en lignende teknikk, men har funnet det lettere å nærme M-celle fra den ventrale side av hindbrain, hvor cellen er nærmere overflaten av hjernen, spesielt i unge fisk (dvs. 24 HPF til 72 HPF). Videre er en tilnærming av den dorsale overflaten krever vanligvis bruk av en transgen linje som uttrykker et fluorescerende merket i M-celle, som har potensiale til å innføre ytterligere variabler inn i opptaket. Dette problemet er ikke tilstede ved bruk av villtype fisk. Men med den teknikken som presenteres her, er vi begrenset til å studere yngre dyr (24 HPF til 72 HPF). Således har hver metode sine fordeler og begrensninger.
Student t-test kan brukes til å sammenligne to grupper av data, mens en analyse av Variance (ANOVA) kan brukes til å sammenligne flere grupper. Hensyn må tas for å velge riktig post-hoc test for parametrisk vs ikke-parametriske data.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) og den kanadiske Foundation for innovasjon (CFI) til DWA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, 5, University of oregon Press. (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
