Summary
Vi har utvecklat en intakt hjärna-ryggmärg förberedelse för att spela in och övervaka elektriska aktiviteten via patch clamp inspelning från Mauthner nervceller och andra reticulospinal celler i zebrafisk embryon. Således har vi möjlighet att spela in retande och hämmande synaptiska strömmar, spänningsstyrda kanalverksamhet och aktionspotentialer från viktiga nervceller i ett växande embryo.
Abstract
Mauthner celler (M-celler) är stora reticulospinal neuron belägna i bakhjäman av teleost fisk. De är viktiga nervceller som är involverade i ett karakteristiskt beteende som kallas C-start eller flykt reaktion som uppstår när organismen uppfattar ett hot. M-cell har studerats ingående i vuxen guldfisk, där det har visat sig att ta emot ett stort urval av excitatoriska, hämmande och neuromodulatory signaler 1. Vi har undersökt M-cellaktivitet i embryonal zebrafisk för att studera aspekter av synaptisk utveckling i en vertebrat beredning. I slutet av 1990 Ali och kollegor utvecklat en förberedelse för patch clamp inspelning från M-celler i zebrafisk embryon, där CNS var i stort sett intakt 2,3,4. Målsättningen då var att spela in synaptisk aktivitet från hindbrain nervceller, ryggmärgs nervceller och bål skelettmuskel samtidigt som funktionella synapsförbindelser inom en intakt hjärna-ryggmärg förberedelse.Detta preparat används fortfarande i vårt laboratorium idag. För att undersöka mekanismerna bakom utvecklings synaptisk plasticitet, registrerar vi excitatoriska (AMPA och NMDA-medierad) 5,6 och hämmande (GABA-och glycin) synaptiska strömmar från utvecklings M-celler. Viktigt är detta unika preparat gör att vi kan återgå till samma cell (M-celler) från förberedelse till förberedelse för att noggrant undersöka synaptisk plasticitet och neuro-utveckling i en embryonal organism. De fördelar som detta preparat inkluderar 1) intakta, funktionella synapsförbindelser laddats in i M-celler, 2) relativt billiga preparat, 3) ett stort utbud av lättillgängliga embryon 4) förmåga att återgå till samma celltyp (dvs. M- cell) i alla förberedelser, så att synaptic utveckling på nivån för en enskild cell kan undersökas från fisk till fisk, och 5) avbildning av hela preparat på grund av den öppna karaktär av embryona.
Introduction
En av de utestående frågorna i utvecklings neurobiologi avser rollen av synaptisk plasticitet fenomen under synaptiska mognad. Vår forskning är inriktad på att förstå de plasticitet mekanismer som ligger bakom synaptiska utveckling med ett övergripande mål att förstå djurens beteende i samband med synaptiska utveckling. För att göra detta har vi utvecklat en stor del intakt beredning i en organism (zebrafisk, Danio rerio) som har fått stor dragkraft för utvecklingsstudier i slutet av 1990.
Den zebrafisk erbjuder flera olika fördelar för nervsystemets utveckling studier. Till exempel är dess genom sekvenserat och man kan utföra morfolinogrupper knockdowns och zink-finger nukleas knockouts för att tysta genernas aktivitet och proteinuttryck. Man kan också utföra överuttryck studier och transgena linjer kan byggas 7-9. Embryon är relativt enkel och riklig att förvärva ochden öppna karaktär av embryot lämpar sig väl för avbildning och opto-genetiska studier. Dessutom kan utföras beteendeanalys, och elektrofysiologiska experiment kan utföras på muskelfibrer, ryggmärgs neuroner och hindbrain neurons i stort sett intakta organismer, vilket tillåter en att undersöka cellulär funktion in vivo. Huvudsakligen har vi möjlighet att undersöka synaptisk aktivitet inte bara samma klass av cell, men i mycket samma par av nervceller, från förberedelse till förberedelse. Med andra ord är detta en av de sällsynta ryggradsdjur preparat där man kan gå tillbaka till samma neuron, på plats, för att studera dess utveckling.
För att upprätthålla neuronala kretsar så lönsamt som möjligt, har vi utvecklat en beredning där hindbrain och ryggmärgen lämnades intakt, medan patch fastspänning från M-cellerna. I denna beredning, är det ögonen, käken och huden överliggande hjärnan försiktigt bort och bakhjäman är Peeled från notochord, som ger tillgång till den ventrala yta hindbrain. De reticulospinal nervceller ligger några mikrometer djup och är relativt lättillgängliga. Vid 48 h efter befruktning (HPF, vissa förkortningar är listade i tabell 1) cellerna är elektriskt kompakt och en kan troget spela in synaptisk aktivitet (både excitatoriska och inhibitoriska strömmar), spänningskänsliga strömmar och aktionspotentialer från membranen.
Våra resultat har visat att många aspekter av synaptiska utveckling och mognad sker i 24 timmar före kläckning, och därmed mycket av vår uppmärksamhet är fokuserad på organismer i ålder från 24 HPF till 72 HPF. Emellertid vid 72 HPF, M-celler är mindre elektriskt kompakt och är svåra att korrekt utrymme klämma. Tekniken kan användas för att spela inte bara från M-celler, men också från dess homologer, MiD2 cm och MiD3 cm. Teoretiskt kan en också utföra dubbla inspelningar från ett spinal sladd neuron såsom en primär motorneuron och från M-cell, men det är svårt och det kan hävdas att förtjänsten från en sådan svår teknik inte kan vara värt den extra ansträngning som krävs.
Protocol
1. Förberedelse och Dissection
- Förbered dissekera skålen fodrad med Sylgard. Inspelning kammare från WPI (Sarasota, Florida, USA, leverantörer är listade i tabell 2) används som dissekera rätter (Figur 1). Kamrarna är utformade för att rymma glas och små plastbrickor används som formar för Sylgard. Brickorna är först fäst vid sliden med fett och vätska Sylgard sättes till centrum i brickan. Den Sylgard härdar över natten och som det gör så bildar det en liten, rund säng på glasskiva, som blir basen i dissekera skålen. Objektglaset placeras i registreringskammare och tjänar som den undre delen av kammaren till vilket preparatet är fäst (fig 1).
- Förbered de lösningar som anges i tabell 3. Cellulära lösningar bör stå i rumstemperatur medan intracellulära lösningarna bör hållas sterila. Man kan också lägga till LuCifer gul (0,1%) till den intracellulära lösningen så att visualisering av M-cellmorfologi kan utföras vid slutet av experimentet. Detta tjänar till att bekräfta cellidentitet (figur 2).
- Höj vildtyp zebrafisk embryon i ägg vatten vid 28,5 ° C, och samla in och stadium enligt Kimmel et al. 10. För dissektioner, överföra embryon till dissekera skålen som också fungerar som inspelningen kammaren. Bedöva för 7-10 min i en anesthetizing saltlösning (0,02% tricaine, lösning 1, tabell 3) som nära approximerar fysiologisk saltlösning. Man kan avgöra om de är tillräckligt sövd genom att undersöka svar på en mild svans nypa.
- Nåla embryon genom notochord och på Sylgard-fodrade skål med 0,001 "volfram tråd (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) med 25X förstoring på en dissekera mikroskop (Figur 1). Den volfram tråd är lätt att skära itill små segment med fina dissekera sax.
- Justera förstoringen på dissekera omfattning till 40-50X för att utföra dissekering. När embryot fästs på skålen, käken, ögon och framhjärnan avlägsnas med hjälp av en fin pincett (Dumont # 5).
- Bakhjäman försiktigt dras bort från den underliggande notokord genom att noggrant arbeta tången mellan notokord och hjärnan. Bakhjäman är sedan försiktigt vänds så att den ventrala ytan vänd uppåt. Denna placering ger god tillgång till M-celler, som är vanligt inom 5-10 um i den ventrala ytan hos unga embryon och ~ 20-50 nm i äldre larver (Figur 2A).
- Flytta försiktigt förberedelserna för inspelningen setup där kan utföras patch clamp experiment. M-cellerna visualiseras med Nomarski Differential interferenskontrast (DIC), även om andra former av avbildning (dvs. Hoffman module kontrast eller Dodt Gradient Contrast Imaging frånLuigs och Neumann, Tyskland) kan också användas.
2. Patch Clamp inspelning (Whole Cell-läge)
- Alla inspelningar utförs i hela cell patch clamp läge 11. Inspelning kammare placeras på ett mikroskop skede i en elektro setup. Våra scener är fasta och upprätt patch clamp mikroskop är bultad till ett rörligt mikroskop plattform eller ett mikroskop översättare.
- Patch clamp-pipetter dras på en horisontell avdragare (P-97, Sutter Instruments Co) från tunnväggiga borosilikatglas erhållits från WPI. Pipettspetsen diametrar är i storleksordningen 0,2 till 0,4 | im efter brand polering till en slät kant, och skaftets avsmalning är ~ 4 mm i längd.
- Fäst pipetten till förstärkaren huvudet-scenen i elektrofysiologi installationen. Det är viktigt att hålla huvudet-scenen på ungefär 45 ° vinkel till den horisontella axeln eftersom det garanterar en ingångsvinkel för pipetten som är lämpliga för bildning av hög resistans tätnings har laddats in i Mauthner cellen.
- Just före inträdet i badlösningen, applicera en liten mängd av positivt tryck på pipetten för att minska risken för nedsmutsning spetsen. Vid inspelning mEPSCs, bad lösningar inkluderar 1 mikroM TTX att blockera aktionspotentialer, 5 mikroM stryknin för att blockera glycinreceptorer och 10 mikroM bikukullin eller 100 ^ M pikrotoxin att blockera GABA A-receptorer. Vid inspelning mIPSCs, bad lösningar inkluderar 1 mikroM TTX, kynurensyra och antingen bikukullin eller stryknin beroende på receptoraktivitet av intresse.
- Närma M-cell med en liten mängd av positivt tryck i pipetten. Den övertrycket pressar försiktigt cellen från sida till sida och när den befinner sig omedelbart över cellen, bildar en liten grop på cellmembranet. Lämna pipetten på plats under några sekunder för att försiktigt rengöra cellytan så att en stark tätning mellan pipetten och membranet kan bildas. Frigörande av positivt tryck i pipettentillåter tätningen ska initieras och en liten mängd av negativt tryck i kombination med negativa pipettspetsar potentialer leder GigaΩ tätningar bildar inom några få sekunder.
- Ändra innehavet potential på förstärkaren till -60 mV. Ruptur cellmembranet med en serie av korta pulser av sugning. Omedelbart spela membranpotentialer och minimera kapacitans artefakter. Kompensera cell kapacitans (C m) och TV (serier) resistans (R) med 70-85%. Ra bör rutinmässigt övervakas, varje 30 sekund till en minut, och om det sker en ändring av 20% eller mer, avbryta försöket.
- När experimentet har avslutats och tillräckligt med data har förvärvat är preparatet avlivades genom avlägsnande av hindbrain med en pincett. Vid denna punkt, kan dataanalys börja.
Representative Results
I detta manuskript presenterar vi en metod för patch-clamp inspelning i hela celler läge från reticulospinal nervceller i zebrafisk, med särskilt fokus på M-cellen. Naturligtvis är det också möjligt att spela in på andra patch clamp transportslag såsom cell-anslutna, inifrån och ut och utanför ut. Den typ av data som man kan få är inte begränsat till det som vi har presenterat här, men vi försöker att ge ett exempel på både synaptisk aktivitet (retande och hämmande) i spänning-clamp läge samt aktionspotentialer i strömtång. När organismen åldrar och M-cellerna utveckla mer omfattande och genomarbetade dendriter, är förmågan att på ett adekvat spänning klämma och utrymme klämma cellen äventyras och den strömtång läget blir inspelnings val.
Figur 3 visar representativa inspelningar av excitatoriska AMPA och NMDA-receptorströmmar erhållna från 48 HPF embryon i närvaro av TTX (1 uM) och farmakologiska medel tillblockera GABA-och glycin-receptorer. När M-cellerna är spänning fastklämd vid -60 mV, de synaptiska strömmar beror på aktivering av AMPA-receptorer (figur 3A). Insamling och analys av dessa händelser tillåter en att registrera parametrar såsom stigtid, falltid, amplitud och frekvens. AMPA-händelser har typiskt en snabb stigtid (från 20 till 80% stigtid på ~ 0,1 ms) och avklingningstiden (~ 0,5 ms), och uppvisar en genomsnittlig amplitud av ungefär 25 pA. När M-cellerna fastklämda vid +40 mV, de resulterande yttre strömmar beror på AMPA och NMDA-receptoraktivitet (figur 3C och 3D). NMDA-receptorströmmar uppvisar längre tidsförlopp än AMPA-receptorströmmar, och måste registreras på positiva potentialer eller Mg-fri lösning för att ta bort Mg block av NMDA-receptorer 2,6. Den genomsnittliga mEPSC visas i figur 3D representerar blandade AMPA och NMDA-strömmar som registrerats vid +40 mV.
Figur 4 visar representativa resultat vid inspelning mIPSCs från Mauthner celler. Dessa händelser inträffade i närvaro av TTX (1 M) och kynurensyra (1 mM) för att blockera AMPA och NMDA-receptorer. Dessa händelser uppvisar någorlunda snabb uppgång och avtagande kinetik av 48 HPF och är tillräckligt ofta för att förvärva många av dem under en 2-3 minuters inspelning 3. Fig. 5 visar verkningspotentialer som registrerats som en följd av insprutning av depolariserande ström in i cellen. M-celler i 48 HPF embryon eld vanligtvis en enda åtgärd potential (figur 5B), även om de ibland skjuta flera accesspunkter när injiceras med suprathreshold stimuli (Figur 5A).
| Förkortning | Fullständigt namn | |
| 1. | MPSC | Miniatyr postsynaptisk ström |
| 2. | mEPSC | Miniatyr excitatorisk postsynaptisk ström |
| 2 | mIPSC | Miniatyr hämmande postsynaptiska ström |
| 3. | MQ | Mega Ohm (enhet för motstånd, 10 6 Ohm) |
| 4. | GΩ | Giga Ohm (enhet för motstånd, 10 9 Ohm) |
| 4. | MOsm | Milli osmolär (enhet osmolaritet, 10 -3 osmol) |
| 4. | TTX | tetrodotoxin |
| 5. | ATP | adenosintrifosfat |
| 6. | GTP | guanosintrifosfat |
| 7. | GFP | Grönt fluorescerande protein |
Tabell 1.
| Company | Katalognummer | | |
| 1. | Dissekera skålen | Warner Instruments | 64-0291 |
| 2. | 0.001 "Tungsten Wire | Scientific Instrument Services Inc. | W406 |
| 2 | Dissekera mikroskop | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| 3. | Pipett Puller | Sutter Instrument Co | P-97 |
| 4. | Microforge | Narishige Grupp | MF-900 |
| 5. | Upprätt Patch clamp mikroskop | Leica Microsystems | DMLFSA |
| 6. | Mikromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| 7. | Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| 8. | Förstärkare | Molecular Devices | 200B |
| 9. | Förvärv programvara | Molecular Devices | pClamp9 |
| 10. | Axograph X | Axograph | Axograph X |
Tabell 2.
| Lösning Namn | Reagens och koncentration (mM) | |
| 1. | Dissekera lösning | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukos och 0,02% Tricaine |
| 2. | MPSC Extracellulär lösning | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukos och 0,001 TTX |
| 3. | MPSC Intracellulär lösningtion | 134 CsCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2-ATP, 0,4 Li-GTP |
| 4. | Action potential Extracellulär lösning | 137 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES och 10 Glukos (med 10 ^ M D-tubokurarin) |
| 5. | Action potential Intracellulär lösning | 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4 mg-ATP och 0,4 Li-GTP. |
Tabell 3. Samtliga extracellulära lösningar är anpassade till 290 mOsm och pH 7,8. Samtliga intracellulära lösningar är anpassade till 280 mOsm och pH 7,4.
Figur 1. Dissekera skålen och intakt bakhjäman-ryggmärgen förberedelser. (A) Analysera och inspelning maträtt som erhållits från WPI. En tunn bricka är noggrant förseglad på than glasskiva vid botten av skålen och Sylgard anbringas på brunnen. (B) 48 HPF bakhjäman-ryggmärgen beredning. Den ventrala ytan av hindbrain är vänd uppåt och M-cellen är placerad precis under ytan av vävnaden vid nivån för pilspetsen.
Figur 2. (A) Nomarski differential interferens kontrast bild av en M-cell som erhållits från en 2 dpf embryo strax efter kläckningen. Bilden togs efter inspelningen spontana excitatoriska synaptisk aktivitet från M-cellen. (B) Cellen fylldes med Lucifer gul under experimentet. Anpassad från 12 med tillåtelse.
Figur 3. (A) Spontana AMPA mEPSCs registrerades från en M-cell vid en anläggning potential -60 mV. (B) Genomsnittliga mEPSCs erhållna från inspelningen i (A). (C) Spontan AMPA och NMDA (pilspetsar) mEPSCs som spelats in från en M-cell vid en hållpotential av 40 mV. (D) Genomsnitt mEPSCs erhållna från inspelningen i (C). Glutamat mEPSCs registrerades i närvaro av TTX (1 | iM) för att blockera aktionspotentialer, stryknin (5 pM) och pikrotoxin (100 | iM) för att blockera glycin-och GABA-strömmar.
Figur 4. (A) Spontana mIPSCs som spelats in från en M-cell vid en anläggning potential -60 mV. (B) Genomsnittliga mEPSCs erhållna från inspelningen i (A). mIPSCs registrerades i närvaro av TTX (1 | iM) för att blockera aktionspotentialer, kynurensyra (1 mM) för att blockera glutamatreceptoraktivitet och bikukullin (10 ^ iM) för att blockera GABA-strömmar.
Figur 5. Action potentialer som spelats in från en M-cell. I denna cell en suprathreshold stimulus (0.48 nA) framkallade flera aktionspotentialer (A), men en stimulans till tröskel resulterar bara i produktionen av en aktionspotential (B). (C) Nuvarande protokoll för de spår som visas i A och B.
Discussion
Det protokoll som beskrivits ovan tillåter en patch clamp Resultat från de M-celler och dess homologer. Tekniken är utmanande och försiktighet bör iakttas på flera viktiga områden under hela förfarandet. Vi kommer nu att diskutera några av dessa områden och kommer att erbjuda användbara tips för att säkerställa framgång.
Konstruktion av skärande / inspelningen kammaren är en kritisk aspekt av experimentet. M-celler som är svåra att se om inte differentialinterferenskontrast används. Nomarski DIC fungerar bäst med rena täckglas, men vi har funnit att ett mycket tunt lager av Sylgard (~ 1-2 mm) inte kommer att snedvrida DIC i sådan utsträckning att det stör identifiering av M-celler. Därför använder vi en inspelning kammare som har ett tunt täckglas på botten, på vilken är placerad en liten plastbricka (~ 5 mm i diameter). Vi blandar Sylgard 184 i en petriskål och tillsätt försiktigt vätskan Sylgard till insidan av brickan med en Pasteur-pipett. Sylgard kan härdas vid rumstemperatur under ett par dagar eller kan värmas upp för snabb härdning. Brickan kan avlägsnas efter Sylgard har härdat, även om detta inte är nödvändigt. När dissektion / inspelningen kammaren har gjorts, kan den användas i flera veckor innan ett nytt Sylgard-fodrade glasskiva behövs.
Nästa steg i förfarandet är att ge alla relevanta lösningar på dagen för experimentet (tabell 3). Intracellulära lösningar som innehåller allt utom ATP och GTP görs i förväg och förvaras i 5 ml alikvoter vid -20 ° C. På dagen för inspelning av en alikvot tinades till rumstemperatur och färsk ATP och GTP tillsättes. Lösningen justeras till 280 mOsm och ett pH 7,4. I våra händer, finner vi att tillsats av färsk ATP och GTP dagligen resulterar i goda inspelningar. Alla lösningar måste hållas sterila för bästa chans att lyckas.
Intracellulära lösningar måste filtreras igenomha 0,22 m filter (Sigma) för att ta bort små partiklar och skräp som kan påverka inspelningen. För att göra detta drar vi först den intracellulära lösningen i en 1 ml spruta, anbringa filtret till änden av sprutan och tillsätt en plast pipettspets som värmdes och dras för att fin spets, till änden av filtret. Detta gör att vi kan tillämpa den filtrerade intracellulära lösningen direkt på insidan av glaset patch pipetter.
När lösningar framställs, kan embryot bedövas och dissekerades. Före dissektion, bör försiktighet iakttas för att adekvat bedöma åldern av organismen. Varje embryo inom ett kopplings åldrar på en något annorlunda kurs. Därför när man bedömer åldern av organismen är det viktigt att göra detta i enlighet med fastställda rutiner 10,13, med hjälp av fenotypiska ledtrådar såsom antalet somites, den övergripande formen på kroppen och tiden för ägg befruktning. Alla dissektioner utförs med en Dumont # 5 fint parpincett. Dessa måste vara skarp och i gott skick annars blir det mycket svårt att ta bort huden överliggande bakhjäman och alla bindväv på den ventrala yta hindbrain. Vi har ofta att slipa tången efter några veckors användning, och göra detta själva med en skärpning sten.
Till stift fisken till det tunna lagret av sylgard använder vi stift fashioned från fina volfram tråd 0.001 inches i diameter. Stiften är skurna med en gammal, mikro-dissektion sax under ett dissekera mikroskop, och är liten nog att passa rakt igenom notochord. Fästa embryona på någon annan plats inte immobilisera dem och gör dissektioner nästan omöjligt att utföra. När lära sig först för att utföra inspelningar, kan det vara svårt att identiteten på M-cellen från dess homologer (särskilt MiD2 cm som ligger i grann rhombomere - rhombomere 5). I vissa embryon dessa två par av celler verkar lika i storlek. Den otoliter provide ett bekvämt landmärke för att hjälpa till vid identifiering av M-celler. Vid 48 HPF M-cellerna är belägna alldeles intill otoliter, och även om de otoliter tas bort under dissektionen, lämnar de bakom en något skadad lateral region i bakhjäman, som fungerar som en markör för sitt ursprungliga läge. Transgen fisk som uttrycker GFP eller annan fluorescerande markör i M-celler, ger goda förberedelser för nya praktiker. I våra händer M-celler har ett membran kapacitans på ungefär 18 till 24 pF vid 48 HPF, medan de mindre homologer är närmare 12 till 14 pF. Celler med större yta har större membran kapacitansvärden (mätt i picofarad (PF)) jämfört med mindre celler. Således kan membran kapacitans användas som en grov indikator på cellstorlek, där större celler har större kapacitansvärden. Denna elektro kännetecken fungerar som en annan egenskap genom vilken M-cellen kan identifieras från dess homologer. Slutligen, ofta använder vi LuCifer gult i vår inspelning (intracellulära) lösningar, som gör det möjligt för oss att genomföra en fast identifiering av celltyp som undersöks med hjälp av fluorescens avbildning när inspelningarna är klara.
Pipettspetsen motstånd i intervallet 3,5-4,5 Mohm är den bästa kompromissen mellan spetsstorlek och låg tillgång motstånd, som vanligtvis sträcker sig från 8 till 15 Mohm. Detta är särskilt viktigt för händelser med snabb kinetik, ~ 0,1 msek (20-80%) stiger gånger och ~ 0,5 ms exponentiellt sönderfaller 12,14,15 (fig. 3A och 3B). Data förvärvas vid en digitalisering hastighet av 50-100 kHz och filtreras med ett lågpassfilter frekvens på 5-10 kHz. När det gäller patch pipetter, har vi funnit att de inte behöver vara brand-polerad för att få en inspelning, men anekdotiskt verkar det att erbjuda något bättre chans att få bra tätningar jämfört med opolerade pipetter. Eftersom pipettspetsarna är relativt stora, vi behöver inte lägga very mycket positivt tryck till pipetten innan den kommer in i lösningen. Det kräver övning besluta om lämplig mängd övertryck att gälla som ett överskott av trycket kommer att flytta cellen för mycket, och kommer att förhindra tätningsbildning. Det kan också skada synaptiska kontakter som cellen är svagt förskjuten från sin ursprungliga position. Å andra sidan, gör för lite tryck resulterar i smutsiga tips och inte rengöra ytan på cellen tillräckligt bra för att bilda goda tätningar. En gyllene medelväg är endast uppnås genom betydande praxis och erfarenheter. Seal bildning kan förbättras med tillämpningar av negativa spänningar på pipetten. Vi har normalt tätningar av 1,2-2 GΩ, som är utmärkt för genombrott in i hela cellen läge.
När farmakologiska medel måste appliceras på cellens cytoplasma inkluderar vi dem i den intracellulära lösningen före fyllning av pipetten. Försiktighet bör iakttas vid upprättandet av pipett lösningar för att undvika förlust av agentergenom att låta den binda till 0,22 ^ m filter. Därför vi välja intracellulära mediet först, och sedan försiktigt lägga det farmakologiska ämnet till den filtrerade lösningen. Applicering av föreningarna till det intracellulära utrymmet har sin egen unika uppsättning av utmaningar. Till exempel, tillsats av läkemedel till det intracellulära mediet minskar vanligtvis chanserna att bilda en GΩ tätning, men inte till den punkt där det är ett stort hinder för experimentet.
Man bör inse att tillämpning av farmakologiska medel på detta sätt tillåter inte försöksledaren för att spela in det mest lämpliga kontroller sedan medlet har omedelbar tillgång till cellen från början av hela cellen konfiguration. Därför, medan vi spela in data i hela denna typ av experiment, måste man vara medveten om att det näst bästa kontroll är den intracellulära tillämpning av en inaktiv form av medlet. I många fall sker detta i form av en värmeinaktivförening, en kodad peptid or en inaktiv isomer erhålls från leverantören.
Vi förvärvar data i form av synaptiska strömmar (mPSCs), spänningskänsliga strömmar och aktionspotentialer. Miniatyr strömmar kan analyseras med några utmärkta program (pCLAMP, Axograph, etc.), även om vi föredrar att använda Axograph X (John Clements). Axograph X fungerar på både Windows-och Macintosh-plattformar och kan användas för både insamling och analys av elektrofysiologiska data. mEPCs förvärvas med hjälp av en mall av försöksledaren val, som erhålls från inspelningen själv. Enskilda händelser kan analyseras för egenskaper som stigtid, amplitud, halv bredd och förfall tid etc. Vi exporterar tabellen av data till Kaleidagraph (Synergy Software) där vi kan producera siffror, inklusive kopior av händelse spår från Axograph X.
En av de mer svåraste aspekterna av experimentet är att avgöra om inspelningen utfördes tillräckligt väl för att tillhandahålla rena,tillförlitliga uppgifter. Exempelvis kan rymdkläm frågor uppstår vid inspelning mPSCs från M-celler som har stora axoner och omfattande dendritiska processer. När spänningskläm, kan man i allmänhet styra spänningen vid spetsen av pipetten någorlunda väl (i synnerhet om motståndet tillgång (Ra) är låg), men kanske inte har ordentlig kontroll av membranpotentialen i dendritiska processer eller axoner som är långt bort från pipettspetsen. En metod för att bestämma om cellen var på rätt plats fastspänd är att ta fram ett punktdiagram av stigtid vs amplituden av mPSCs som spelades in. En korrelation mellan data tyder på bristande utrymme fastspänning. Med andra ord, om utrymmet klämman är dålig då mPSCs som inträffar nära pipetten kommer att ha snabbare stiger tider och högre amplituder än händelser som inträffar en bit bort från pipetten. Om existerar en korrelation, då uppgifterna är problematiskt och kan inte användas.
En annan aspektav elektrofysiologiska inspelningar som måste åtgärdas är att läckströmmar. Detta är särskilt sant när spänningskläm en cell i syfte att spela in spänningskänsliga strömmar såsom Na + eller K +-strömmar. När membranpotentialen är avvikit från vila, kan läckströmmar spelas in tillsammans med spänningsstyrda aktivitet. Läckströmmar (I L), en kombination av kalium (I K), natrium (I Na) och klorid (I Cl) ström genom icke-spänningskänsliga kanaler kommer att skymma aktiviteten av intresse och måste subtraheras från inspelningen. Förstärkaren kan utföra denna funktion på nätet under inspelningen genom att köra det som vanligen kallas en P / N-protokollet. Under ett P / N-protokollet förstärkaren kommer att köra flera små depolarisationer (eller hyperpolarizations) från vila och kommer att spela in den resulterande läckström som uppstår. Det är viktigt att använda tillräckligt små pulser som inte aktiverar spänningskänsliga kanaler. Den nuvarandes som uppstår under dessa pulser registreras och medelvärdet så att dessa läckströmmar kan subtraheras från kanalaktivitetsspänningskänsliga.
Slutligen måste man ta hänsyn till den korsning potential, vilket sker vid spetsen av elektroden mellan den intracellulära och extracellulära lösningar. Intracellulära och extracellulära lösningar är vanligtvis består av olika joner, med olika aktiviteter och rörligheter. Större joner med lägre mobilitet kommer att erbjuda en högre resistivitet till jon rörelse än mindre, och detta kan resultera i en liten men signifikant potentialskillnad vid korsningen av lösningarna. Denna korsning potential måste beaktas vid fastställandet av lämpliga spänningar upplevs av cellen.
Tekniken som presenteras här är en som används av vårt labb i många år. Men det finns alternativa metoder för inspelning från M-cellen. Framför allt, Joseph Fetcho och kollegor har utvecklaed en utmärkt förberedelse där man kan spela in från M-cellerna i äldre larver (4-5 dagar gamla) i ett mindre invasivt sätt än presenteras här, där M-cellen är närmade från den dorsala ytan 16. Vi hade försökt en liknande teknik men fann det lättare att vända sig till M-cellen från den ventrala sidan av hindbrain, där cellen är närmare ytan av hjärnan, särskilt i ung fisk (dvs. 24 HPF till 72 HPF). Dessutom kan ett tillvägagångssätt från den dorsala ytan kräver vanligen användning av en transgen linje som uttrycker en fluorescerande markör i M-celler, som har potential att införa ytterligare variabler i inspelningen. Denna fråga är inte närvarande vid användning av vildtyp fisk. Men med den teknik som presenteras här, är vi begränsade till att studera yngre djur (24 HPF till 72 HPF). Således har varje metod sina fördelar och begränsningar.
Students t-test kan användas för att jämföra två grupper av data medan en analys av Variance (ANOVA) kan användas för att jämföra flera grupper. Man måste vara försiktig för att välja lämplig post-hoc test för parametriska vs icke-parametriska data.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) och det kanadensiska institutet för innovation (CFI) till DWA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, 5, University of oregon Press. (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
