Summary
Parabiotic sammanfogning av två organismer leder till utveckling av en gemensam cirkulationssystemet. I detta protokoll beskriver vi de kirurgiska stegen att bilda en parabiotic anslutning mellan en vildtyp mus och en konstitutiv GFP-uttryckande mus.
Abstract
Parabiosis är en kirurgisk förening av två organismer som tillåter delning av blodcirkulationen. Fastsättning av huden hos två djur som gynnar bildning av mikrovaskulaturen vid platsen för inflammation. Parabiotic partners dela sina cirkulerande antigen och därmed fria från skadliga immunreaktionen. Först beskrivs av Paul Bert 1864 1, var parabiosis kirurgi förfinas genom Bunster och Meyer 1933 för att förbättra djurens överlevnad 2. I det nuvarande protokollet, är två möss kirurgiskt anslöt efter en modifiering av Bunster och Meyer teknik. Djur är anslutna via armbågs-och knäledsartros, följt av fastsättning av huden vilket gör starkt stöd som förhindrar påfrestning på sys huden. Häri beskriver vi i detalj parabiotic sammanfogning av en allmänt förekommande GFP-uttryckande mus till en vildtyp (WT)-mus. Två veckor efter ingreppet, är paret separeras och GFP-positiva celler kan detekteras genom flödescytometrisk analys i blodet cirkulerarion av WT mus. Blod chimerism gör att man kan undersöka bidraget från de cirkulerande celler från ett djur i den andra.
Introduction
Parabiosis, kirurgisk sammanfogning av två organismer, beskrevs första gången 1864 av Paul Bert som ett sätt att utveckla en modell för att studera gemensamma cirkulationssystem och bestod av sammanfogningen av huden och muskulösa väggar av två råttor 1. Parabiosis främjar bildandet av mikrocirkulation vid platsen för inflammation 3 och har haft flera tillämpningar inom fysiologiska studier, till exempel hormonella kommunikationen mellan hypofysen och gonader samt rollen av njuren i hypertoni 4. Det har vidare används för att undersöka rekrytering och integrering av progenitorceller i kärlnybildning 5, migrering av hematopoetiska stamceller 6, och lymfocyter människohandel 7, samt den roll och kinetik av cirkulerande inflammatoriska eller stamceller i tumormetastasisen 8,9, och neurodegenerativa sjukdomar 10.
En signifikant fördel med parabiosis liesi att de blev partner djuren har gemensamma cirkulerande antigener, vilket gör att cellmigration och kärlnybildning utan att utlösa en immunologisk reaktion. Viktigt Weissman et al. Har visat att parabiosis mellan manliga och kvinnliga möss inte leder till bildning av anti HY antikroppar 11.
I det ursprungliga protokollet som beskrivs av Paul Bert de två djuren samman genom anslutning av huden och muskelväggar 1. Denna metod dock orsakat betydande påfrestning för djuren och visade en hög mortalitet på grund av infektion i såret. Sedan dess parabiosis tekniken har reviderats av flera grupper med den mest dominerande är det protokoll som föreslagits av Bunster och Meyer 1933 2. Deras metod ingår sammanfogning av skulderbladet lederna, kroppshåligheter, och huden, vilket möjliggör bättre stöd och mindre smärta för djuren. Samtidigt, den nya metoden gav minimal postoperativ vård och betyligt minskad dödlighet. Protokollet som beskrivs häri är en modifiering av den Bunster och Meyer teknik som är mindre invasiv och tillåter fastare sammanfogning. Nämligen möss ansluten via armbågen och knäleder liksom huden. Denna sammanfogning förhindrar förlängning av huden och således orsakar mindre smärta och komplikationer. Här beskriver vi sammanfogning av en vild typ (WT) vuxen mus till en konstitutiv GFP-uttryckande mus. Vi visar att två veckor efter operationen kan vi uppnå 50% av blod chimerism visar effekten av detta kirurgiska ingrepp för att skapa ett gemensamt blodomlopp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga djurstudier utfördes enligt riktlinjerna i UCLA djuromsorg och använda kommitté och National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Varaktigheten av det förfarande som beskrivs nedan är ca 45-60 min från början till slut.
1. Beredning av kirurgiska området
- Utför proceduren i ett rent djur kirurgi rummet.
- Utrustning: isofluran Vaporizer, Gaymer T Pump med värmedyna.
- Sterila verktyg: två böjda pincett, fina sax, nål hållare.
- Sterila handskar måste användas under hela proceduren.
2. Beredning av djur
- Placera två manliga eller kvinnliga möss, från samma genetiska bakgrund, av samma vikt och storlek i samma bur och övervaka i minst två veckor för att säkerställa en harmonisk samlevnad. Honmöss är föredragna på grund av deras mindre aggressivt beteende.
- Bedöva djur medmed användning av en isofluran förångaren. Placera möss i en Posi-Seal induktionskammare ansluten till isofluran förångare (4-5% vol / vol). När anestesi induceras, överföra djuret till päls rakning området och upprätthålla anestesi under hela förfarandet genom en noskon ansluten till isofluran (1,5-2% v / v). Applicera oftalmologiska salva med en tops för att förhindra torra ögon.
- Placera djuret på ryggläge. Grundligt raka vänster sida av musen placeras på vänster och höger sida av musen placeras på höger börjar vid ca 1 cm ovanför armbågen till 1 cm under knäet.
- Aseptiskt förbereda de rakade områdena genom att grundligt torka (2-3x) med Betadine indränkta servetter följt av desinfektionsservetter. Placera möss på en uppvärmd dyna täcks av en steril dyna.
- För smärtlindring, administrera Karprofen och Buprenorfin intraperitonealt eller subkutant i en dos på 10 mg / kg och 0,1 mg / kg respektive.
- Placera djur på deras sida, rygg mot rygg, med endjacent rakade områden med upp. För att undvika kontaminering av operationsområdet, täcker de möss med en steril duk exponerar endast operationsområdet. Skapa en liten drapera öppning för att hålla sterila när de utför operationen. Vi gjorde drapera fönstret stor för att ha en bättre visning under videofilmning.
3. Parabiosis
- Med hjälp av en vass sax, utföra longitudinella hudincisionerna till de rakade sidor av varje djur börjar på 0,5 cm ovanför armbågen hela vägen till 0,5 cm under knäleden (Figur 1). Efter snittet, försiktigt loss huden från den subkutana fascian genom att hålla huden upp med ett par böjda pincett och separera fascian med ett andra par för att skapa 0,5 cm av hud. Utför denna separation längs hela snittet.
- Börja sammanfogningen genom att fästa det vänstra olecranon av ett djur till höger olecranon av det andra. Både olecranons och knäleder är klart urskiljbara följande: ee hud snitt. För att underlätta att gå, böja armbågen i den första musen och passera nålen i den icke-absorber 3-0 sutur under olecranon. På samma sätt, böja armbågen i den andra musen och passera samma sutur under den. Bifoga skarvar tätt med en dubbel kirurgisk knut.
- Anslut knäled att följa samma förfarande.
- Efter fastsättning av lederna, anslut huden på två djur med en kontinuerlig absorber 5-0 Vicryl sutur börjar ventralt från armbågen mot knäet. För att förhindra att huden spricker och separation utför en tät sutur stängning av huden i området kring armbågar och knän. När den ventrala huden kvarstad har avslutats, utför en dubbel kirurgisk knut. Placera möss i liggande ställning och fortsätta suturen dorsalt slutade med en dubbel kirurgisk knut. Verifiera kontinuiteten av suturen och bekräfta avsaknaden av öppningar.
- Administrera 0,5 ml av 0,9% NaCl subkutant till varje mus för att förhindra dehydratidration.
4. Postoperativ återhämtning
- Håll djur på uppvärmd dyna till återhämtning.
- Efter återhämtning, ge analgetika carprofen och buprenorfin. Upprepa intraperitonealt eller subkutant var 24 och 12 timmar, respektive, för 48 timmar vid samma doser som beskrivits ovan (steg 2,5). Övervaka djur för tecken på smärta och ångest, såsom skakningar, slöhet, tugga på svansen, välvd rygg, brist på grooming, etc. dagligen i två veckor.
- Profylaktiskt behandla möss med sulfametoxazol / trimetoprim oral suspension i sin vattenflaska 2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml i 10 dagar för att förhindra bakterieinfektioner.
- Hus varje parabiotic par i en ren bur med monolitisk strö (t.ex. pappershandduk eller absorberande steril dyna) för att förhindra aspiration av strö. Återgå djuren till en sängkläder fyllda buren när de har möjlighet att bibehålla sternala VILA med huvudet uppåt. För att minimera belastningenatt nå för mat med anpassning till parabiotic existens, placera fuktade mat pellets på burgolvet. Ge bomaterial. I 1-2 veckor parabiotic möss har förmåga att pendla normalt kirurgiskt parade fram-och Hind-lemmar.
- Blod chimerism sker 10-14 dagar efter operationen.
5. Bekräftelse och Omvänd Procedure
- Efter två veckor dra blod från svansvenerna hos varje mus för flödes-cytometrisk analys för att bekräfta blod chimerism (Figur 3).
- Blod bearbetning för flödescytometrisk analys: späd 2-3 droppar av blod i 500 | il av 10 mM EDTA. Addera 500 pl av 2% dextran (spädd i PBS), blanda väl och inkubera vid 37 ° C under 30 min. Överför supernatanten i ett nytt rör, centrifugera vid 1200 rpm under 5 min och resuspendera pelleterade cellerna i PBS (eller annan buffert) och flödescytometrisk analys.
- Beroende på experimentell design, kan det parabiotic paret separeras ent senare tidpunkter. Enligt vår erfarenhet har vi upprätthållit parabiosed par i upp till 9 månader utan några komplikationer.
- Genomför omvänd procedur på en steril kirurgisk yta. Bedöva möss genom att placera dem i en induktionskammare som är kopplad till en isofluran förångare (4-5%) och upprätthålla anestesi med 1,5 till 2% isofluran, såsom beskrivs ovan (steg 2.2).
- Ta bort hår från området som omger den första suturen och aseptiskt framställa de rakade områden som beskrivits ovan (steg 2,3, 2,4).
- För smärtlindring, administrera Karprofen och Buprenorfin intraperitonealt eller subkutant i en dos av 10 mg / kg och 0,1 mg / kg, respektive.
- Täck operationsområdet med en steril duk, såsom beskrivits ovan (steg 2.6).
- Använda vass sax, separera mössen genom ett längsgående snitt längs den laterala suturen och försiktigt dra av den nybildade fascia mellan de två möss med ett par krökta pincett. För att separera lederna, skära knutar suturenförbinder dem. Klipp bort huden längs snittet för att uppnå jämna kanter och sätt tillbaka huden med ett absorber kontinuerlig 5-0 belagd Vicryl sutur.
- För att förhindra uttorkning, administrera 0,5 ml av 0,9% NaCl subkutant till varje mus. Håll djur på uppvärmd dyna till återhämtning.
- Efter återhämtning, upprepa analgetisk administrering karprofen (10 mg / kg) varje 24 h och buprenorfin (0,1 mg / kg) varje 12 h under 48 timmar.
- För att förhindra bakteriella infektioner behandla möss med sulfametoxazol / trimetoprim oral suspension (2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml) i sin vattenflaska i 10 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det förväntade resultatet av parabiosis av två organismer är ett lika stort bidrag varje djurs cirkulationssystem till en gemensam blodcirkulation (Figur 2). Man kan lätt verifiera lyckad ekvilibrering av blodet hos den parabiosed WT och GFP-positiva möss med flödescytometrisk analys. Här, var venblod erhölls från svansen på båda parabionts vid två veckor efter operationen och fraktionerades för perifera blodceller (för att utesluta erytrocyter). De fraktionerade hematopoetiska härledda cellfraktionen analyserades därefter genom flödescytometri med avseende på närvaron av GFP-positiva och WT-celler. I överensstämmelse med tidigare studier, blod från WT mus avslöjade närvaron av chimerism, såsom indikeras med cirka halv GFP-positiva och halv WT blodkroppar (53 vikt-% celler och 47% GFP-celler) (Figur 3).
Figur 1. Parabiosis kirurgi:. incisionsstället De laterala sidorna av bedövade djur är rakade och longitudinella hud snitt utförs (avgudade område) från 0,5 cm ovanför armbågen till 0,5 cm under knäleden.
Figur 2. Schematisk bild av parabiosis metoden. A) Att gå med i en WT-mus (vänster) till en GFP positiv mus (höger). B) Cirka två veckor efter kirurgisk fastsättning, är ny mikrocirkulation bildas på den plats där de två mössen ansluts låta gå av blodcirkulationen.
Figur 3. Blod chimerismen av parabiotic partners. Flödescytometrisk analys av blodprov som samlats in från WT parabiotic partnern två veckor efter kirurgisk gå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den parabiosis metoden diskuteras här innebär minimala tekniska svårigheter och leder till låga dödstal. Infästningen av knä-och armbågsleder är en signifikant förbättring av Bunster och Meyer teknik. Men förfarandet förblir invasiva därmed upprätthålla sterila förhållanden i hela operationen är absolut nödvändigt. För att ytterligare förhindra infektion i operationsområdet är det viktigt att de parabiosed djur får en kombination av antibiotika och kontrolleras regelbundet. För att garantera ett fast stöd och förhindra smärta, bör suturen ansluter armbågar och knän omge fogarna istället för att passera genom vävnaden.
Som ett alternativ till isofluran inandning får anestesi induceras med användning av intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin eller andra anestesimedel som godkänts av institutionella utskott. Fördelen med att använda isofluran är att den snabbt kan inducera anestesi och signifikant reducera recovery tid. Vidare kan nivån av anestesi styras exakt.
Parabiosis, som tillåter cirkulatoriska system från två djur till commingle och jämvikta, är ett kraftfullt experimentförfarande för fysiologiska studier. Den presenterar flera fördelar för andra vanligen använda tekniker såsom benmärgstransplantation eller cellinjektion. Förfaranden Cell leverans, ibland ge ett kort fönster för att undersöka effekten av transplanterade celler. Dessutom ökar immunsuppression risken för infektion och efterföljande morbiditet och mortalitet. Men med parabiosis en kan upprätthålla en chimär omlopp under långa tidsperioder och studie cirkulerande faktorer (celler, cytokiner, etc.) som är oberoende av deras ursprung. Detta system kan användas för att bestämma rollen av cirkulerande celler vid sårläkning, tumörbildning, åldrande, regeneration och inflammatoriskt svar, bland många andra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Adriane Mosley och Libuse Jerabek (Stanford) för att få hjälp med den kirurgiska tekniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
