Summary
التعايش الالتصاقي انضمام اثنين من الكائنات الحية يؤدي إلى تطوير نظام الدورة الدموية المشتركة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الخطوات الجراحية لتشكيل التعايش الالتصاقي اتصال بين الماوس من النوع البري والتأسيسية، معربا عن GFP الماوس.
Abstract
تعايش التصاقي هو اتحاد الجراحية اثنين من الكائنات السماح تقاسم الدورة الدموية. ربط الجلد من حيوانين يعزز تشكيل الأوعية الدموية الدقيقة في موقع الالتهاب. شركاء التعايش الالتصاقي مشاركة مستضدات المتداولة، وبالتالي خالية من رد فعل جهاز المناعة السلبية. وصف لأول مرة من قبل بول بيرت في عام 1864 1، وقد تم صقل الجراحة تعايش التصاقي بواسطة Bunster وماير في عام 1933 لتحسين البقاء على قيد الحياة الحيوانية 2. في البروتوكول الحالي، وانضم اثنين من الفئران جراحيا بعد تعديل Bunster وتقنية ماير. ترتبط الحيوانات من خلال مفاصل الكوع والركبة تليها مرفق من الجلد يمكن دعم قوي يحول دون الضغط على الجلد خياطة. هنا، نحن تصف بالتفصيل التعايش الالتصاقي الانضمام من كل مكان معربا عن GFP الماوس إلى البرية من نوع (WT) الماوس. بعد أسبوعين من الإجراء، يتم فصل زوج، ويمكن الكشف عن الخلايا GFP إيجابية من خلال تحليل تدفق cytometric في circulat الدمايون من الفأرة WT. والخيمرية الدم يسمح احد لدراسة إسهام الخلايا المنتشرة من حيوان واحد في الآخر.
Introduction
تعايش التصاقي، والانضمام إلى العمليات الجراحية في اثنين من الكائنات الحية، وكان أول وصف في عام 1864 من قبل بول بيرت باعتبارها وسيلة لتطوير نموذج لدراسة نظم الدورة الدموية المشتركة وتتألف من الانضمام للجلد والعضلات جدران اثنين من الفئران 1. تعايش التصاقي يعزز تشكيل الأوعية الدموية الدقيقة في موقع الالتهاب 3 وكان العديد من التطبيقات في الدراسات الفسيولوجية، مثل الاتصالات الهرمونية بين الغدة النخامية والغدد التناسلية وكذلك دور الكلى في ارتفاع ضغط الدم 4. واستخدمت كذلك للتحقيق في التوظيف ودمج الخلايا الاصلية في اتساع الأوعية الدموية 5، والهجرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم 6، والاتجار اللمفاويات 7، وكذلك دور وحركية تعميم الخلايا الالتهابية أو وقف في الورم ورم خبيث 8،9، ومرض الاعصاب 10.
واحدة ميزة كبيرة من الأكاذيب تعايش التصاقيفي أن الحيوانات شراكة تقاسم المستضدات الشائعة المتداولة، مما يسمح الهجرة الخلية واتساع الأوعية الدموية دون إحداث رد فعل مناعي. الأهم من ذلك، ويسمان وآخرون أظهرت أن تعايش التصاقي بين الفئران الذكور والإناث لا يؤدي إلى تشكيل الأجسام المضادة المضادة HY 11.
في البروتوكول الأصلي التي وصفها بول بيرت وانضم الحيوانات اثنين معا من خلال اتصال الجلد والعضلات الجدران 1. ولكن هذه الطريقة تسبب ضغطا كبيرا على الحيوانات وأسفرت عن ارتفاع معدل الوفيات بسبب إصابة الجرح. منذ ذلك الحين، تم تعديل أسلوب تعايش التصاقي من قبل عدة مجموعات مع أبرزها هو موضوع البروتوكول المقترح من قبل Bunster وماير في عام 1933 2. وشملت طريقتهم الانضمام للمفاصل الكتف، تجاويف الجسم، والجلد، والسماح أفضل الدعم وألم أقل للحيوانات. في نفس الوقت، أدت الطريقة الجديدة في مجال الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية والحد الأدنى من دلالةانخفضت معدلات وفيات آبير. بروتوكول الموصوفة هنا هو تعديل للتقنية Bunster وماير التي هي أقل الغازية ويسمح الانضمام أكثر ثباتا. وهي ترتبط الفئران من خلال مفاصل الكوع والركبة وكذلك الجلد. هذا الانضمام يمنع تمديد الجلد وبالتالي يسبب ألم أقل والمضاعفات. نحن هنا وصف انضمامه من نوع البرية (WT) الماوس الكبار إلى GFP التأسيسي معربا عن الماوس. وتبين لنا أن أسبوعين بعد الجراحة يمكن أن نحقق 50٪ من الخيمرية الدم مما يدل على فعالية هذا الإجراء الجراحي لإنشاء نظام الدورة الدموية المشتركة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان واستخدام UCLA والمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. مدة الإجراء هو موضح أدناه حوالي 45-60 دقيقة من البداية إلى النهاية.
1. إعداد حقل الجراحية
- تنفيذ الإجراء في غرفة الجراحة الحيوانية نظيفة.
- المعدات: isoflurane ومبخر، Gaymer T مضخة مع سادة التدفئة.
- أدوات معقمة: اثنين ملقط المنحني، مقص غرامة، حامل الإبرة.
- يجب استخدام القفازات المعقمة أثناء إجراء بأكمله.
2. إعداد الحيوانات
- وضع اثنين من الفئران الذكور أو الإناث، من نفس الخلفية الوراثية، من وزن وحجم مماثل في نفس القفص ومراقبة لمدة أسبوعين على الأقل لضمان التعايش المتناغم. ويفضل إناث الفئران بسبب سلوكهم أقل عدوانية.
- تخدير الحيوانات قبلباستخدام المرذاذ isoflurane و. توصيل مكان الفئران في غرفة التعريفي POSI الختم إلى المرذاذ isoflurane و(4-5٪ ت / ت). مرة واحدة هو فعل التخدير، ونقل الحيوان إلى منطقة الحلاقة الفراء والحفاظ على التخدير في جميع أنحاء الداخلي من خلال مخروط الأنف متصلة isoflurane و(1.5-2٪ ت / ت). تطبيق مرهم للعين مع Q-تلميح لمنع جفاف العين.
- وضع الحيوان على موقف ضعيف. بدقة حلق الجانب الأيسر من الفأرة وضعت على اليسار وعلى الجانب الأيمن من الفأرة وضعت على الحق ابتداء من الساعة حوالي 1 سم فوق الكوع الى 1 سم تحت الركبة.
- إعداد جو معقم و مطهر المناطق حلق بواسطة المسح بدقة (2-3X) مع مناديل غارقة بتدين تليها مناديل الكحول. وضع الفئران على وسادة ساخنة بواسطة وسادة عقيمة تغطيتها.
- لتسكين وإدارة كاربروفين والبوبرينورفين تحت الجلد أو الغشاء البريتونى بجرعة 10 ملغ / كغ و 0.1 ملغم / كغم على التوالي.
- وضع الحيوانات في جانبهم، والعودة إلى الوراء، معdjacent المناطق حلق مواجهة. لتجنب أي تلوث المنطقة الجراحية، وتغطية الفئران مع ثنى العقيمة تعريض منطقة العملية فقط. إنشاء فتح الستارة الصغيرة للبقاء معقمة عند إجراء الجراحة. التي قطعناها على أنفسنا نافذة الستارة الكبيرة لديها رؤية أفضل خلال تصوير بالفيديو.
3. تعايش التصاقي
- باستخدام مقص حاد، وإجراء شقوق الجلد طولية على الجانبين حلق كل حيوان في البداية 0.5 سم فوق الكوع على طول الطريق إلى 0.5 سم تحت مفصل الركبة (الشكل 1). بعد شق، فصل بلطف الجلد من اللفافة تحت الجلد من خلال عقد الجلد مع زوج من ملقط المنحني وفصل اللفافة مع الزوج الثاني لخلق 0.5 سم من الجلد الحرة. تنفيذ هذا الفصل على طول شق بأكمله.
- بدء الانضمام عن طريق ربط الزج الأيسر من حيوان واحد إلى الزج حق الآخر. كلا olecranons ومفاصل الركبة بشكل واضح ال تمييزها التاليه شق الجلد. لتسهيل الانضمام، ثني الكوع من الفأرة الأولى وتمرير الإبرة من غير قابل للامتصاص 3-0 خياطة تحت الزج. وبالمثل، ثني الكوع من الفأرة الثانية وتمرير نفس خياطة تحته. نعلق المفاصل بإحكام بواسطة عقدة جراحية مزدوجة.
- ربط مفاصل الركبة باتباع نفس الإجراء.
- بعد الحجز على المفاصل، وربط الجلد من الحيوانات اثنين مع استمرار امتصاص 5-0 VICRYL خياطة بدءا البطني من الكوع نحو الركبة. لمنع تمزق الجلد وفصل إجراء إغلاق خياطة ضيق من الجلد في المنطقة المحيطة المرفقين والركبتين. مرة واحدة وقد تم الانتهاء المرفق الجلد البطني، إجراء العمليات الجراحية عقدة مزدوجة. وضع الفئران في وضعية الانبطاح ومواصلة ظهريا خياطة تنتهي مع عقدة جراحية مزدوجة. التحقق من استمرارية خياطة والتأكد من عدم وجود فتحات.
- إدارة 0.5 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم تحت الجلد لكل فأر لمنع dehydration.
4. الانتعاش بعد العملية الجراحية
- إبقاء الحيوانات على لوحة ساخنة حتى الشفاء.
- بعد الانتعاش، وتوفير المسكنات كاربروفين والبوبرينورفين. تكرار الغشاء البريتونى أو تحت الجلد كل 24 ساعة و 12، على التوالي، لمدة 48 ساعة في نفس الجرعات الموصوفة أعلاه (الخطوة 2.5). مراقبة الحيوانات لعلامات الألم والضيق مثل الهز، والخمول، ومضغ الذيل، وتقوس الظهر، وعدم الاستمالة، الخ يوميا على مدى أسبوعين.
- وقائي، علاج الفئران مع سلفاميثوكسازول / ميثوبريم تعليق عن طريق الفم في زجاجة المياه الخاصة بهم 2 ملغ السلفا / مل +0.4 ملغ تقليم / مل لمدة 10 يوما لمنع العدوى البكتيرية.
- بيت كل زوج التعايش الالتصاقي في قفص نظيفة مع المواد الفراش متجانسة (مثل منشفة ورقية أو وسادة ماصة معقمة) لمنع تطلع المواد الفراش. عودة الحيوانات إلى الفراش شغل قفص عندما تكون قادرة على الحفاظ على الاستلقاء القصية مع رؤوسهم فوق. لتقليل الإجهادللوصول للغذاء في حين ضبط لوجود التعايش الالتصاقي، ضع الغذاء الكريات مبلل في الطابق القفص. توفير مواد التعشيش. في 1-2 أسابيع الفئران التعايش الالتصاقي لديها القدرة على تجول عادة على إقران جراحيا الصدارة وهند-أطرافه.
- الخيمرية الدم يحدث 10-14 أيام بعد الجراحة.
5. تأكيد والإجراءات عكسي
- بعد رسم أسبوعين الدم من الأوردة ذيل كل فأر لتحليل تدفق cytometric لتأكيد الخيمرية الدم (الشكل 3).
- تجهيز الدم لتحليل تدفق cytometric: تمييع 2-3 قطرات من الدم في 500 ميكرولتر من 10 ملي EDTA. إضافة 500 ميكرولتر من 2٪ ديكستران (المخفف في برنامج تلفزيوني)، تخلط جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نقل طاف في أنبوب جديد، وتدور في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني (أو عازلة أخرى) لتحليل تدفق cytometric.
- اعتمادا على التصميم التجريبي، ويمكن فصل الزوج على التعايش الالتصاقير نقاط وقت لاحق. في تجربتنا، وحرصنا على الحفاظ أزواج parabiosed لمدة تصل إلى 9 أشهر دون أي مضاعفات.
- تنفيذ الإجراء العكسي على سطح الجراحية المعقمة. تخدير الفئران عن طريق وضعها في غرفة تحريض متصلة المرذاذ isoflurane و(4-5٪) والحفاظ على التخدير مع 1.5-2٪ isoflurane و، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.2).
- إزالة الشعر من المنطقة المحيطة خياطة الأولية وإعداد جو معقم و مطهر المناطق حليق كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.3، 2.4).
- لتسكين وإدارة كاربروفين والبوبرينورفين تحت الجلد أو الغشاء البريتونى بجرعة 10 ملغ / كغ و 0.1 ملغم / كغم على التوالي.
- تغطية المنطقة الجراحية مع ثنى العقيمة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.6).
- باستخدام مقص حاد، وفصل الفئران من خلال شق طولي على طول الخيط الجانبي وفصل بلطف اللفافة التي شكلت حديثا بين اثنين من الفئران مع زوج من ملقط المنحني. للفصل بين المفاصل، وخفض عقدة من خياطةربطها. تقليم قبالة الجلد على طول شق لتحقيق حواف ناعمة وأعد الجلد مع امتصاص المستمر 5-0 المغلفة VICRYL خياطة.
- لمنع الجفاف، وإدارة 0.5 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم تحت الجلد لكل فأر. إبقاء الحيوانات على لوحة ساخنة حتى الشفاء.
- بعد الشفاء، كرر إدارة مسكن، كاربروفين (10 ملغ / كلغ) كل 24 ساعة والبوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) كل 12 ساعة لمدة 48 ساعة.
- لمنع العدوى البكتيرية علاج الفئران مع سلفاميثوكسازول / ميثوبريم تعليق عن طريق الفم (2 ملغ السلفا / مل +0.4 ملغ تقليم / مل) في زجاجة المياه الخاصة بهم لمدة 10 يوما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج المتوقعة للتعايش التصاقي اثنين من الكائنات هو مساهمة متساوية من نظام الدورة الدموية كل حيوان إلى الدورة الدموية شيوعا (الشكل 2). يمكن للمرء أن تحقق بسهولة موازنة ناجحة من دم الفئران WT وGFP إيجابية parabiosed عن طريق تحليل تدفق cytometric. هنا، تم الحصول على الدم الوريدي من ذيول كلا parabionts في 2 أسابيع بعد الجراحة، وكان مجزأة لخلايا الدم الطرفية (لاستبعاد الكريات الحمراء). تم تحليل للدم المستمدة مجزأة خلية جزء في وقت لاحق من قبل التدفق الخلوي لوجود GFP إيجابية وWT الخلايا. بما يتفق مع الدراسات السابقة، والدم من WT الماوس كشفت وجود الخيمرية، كما يتبين من ما يقرب من نصف الخلايا GFP إيجابية والنصف WT الدم (53٪ خلايا WT وخلايا GFP 47٪) (الشكل 3).
الشكل 1. Parabioالجراحة جهاز الأمن والمخابرات: موقع شق وحلق الجانبين الوحشي من الحيوانات تخدير وتتم شقوق طولية الجلد (منطقة خارف) من 0.5 سم فوق الكوع الى 0.5 سم تحت مفصل الركبة.
الشكل 2. التمثيل التخطيطي لطريقة تعايش التصاقي. أ) الانضمام للماوس WT (يسار) إلى ماوس GFP إيجابية (يمين). B) نحو أسبوعين بعد مرفق الجراحية، ويتم تشكيل الأوعية الدموية الدقيقة الجديد في الموقع حيث يتم توصيل الفئران اثنين السماح الانضمام من الدورة الدموية.
الرقم 3. الخيمرية الدم من الشركاء التعايش الالتصاقي. تحليل تدفق cytometric من عينة من الدم تم جمعها من الشريك التعايش الالتصاقي WT أسبوعين بعد انضمامه الجراحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تعايش التصاقي مناقشتها هنا يقدم الحد الأدنى من الصعوبات الفنية والنتائج في معدلات وفيات منخفضة. المرفق الركبة والكوع المفاصل هو تحسن كبير من Bunster وتقنية ماير. ومع ذلك، لا يزال الإجراء الغازية وبالتالي الحفاظ على ظروف معقمة طوال جراحة أمر حتمي. لمزيد من منع العدوى من موقع الجراحية، من المهم أن الحيوانات parabiosed الحصول على مزيج من المضادات الحيوية ويتم رصدها بانتظام. لضمان الدعم القوي ومنع الألم، ينبغي للخياطة يربط المرفقين والركبتين تحيط المفاصل بدلا من المرور عبر الأنسجة.
كبديل لاستنشاق isoflurane و، قد يكون ذلك حافزا التخدير مع استخدام الحقن داخل الصفاق الكيتامين / زيلازين أو أدوية التخدير الأخرى التي وافقت عليها اللجان المؤسسية. ميزة استخدام isoflurane وأنه يمكن أن تحدث بسرعة والتخدير بشكل ملحوظ تقليل صecovery الوقت. وعلاوة على ذلك، فإن مستوى التخدير يمكن تسيطر على وجه التحديد.
تعايش التصاقي، والذي يسمح الدورة الدموية من حيوانين لمزج وتتوازن، هو إجراء تجريبية قوية للدراسات الفسيولوجية. أنه يقدم العديد من المزايا لغيرها من تقنيات تستخدم عادة مثل زرع نخاع العظم أو حقن الخلايا. إجراءات تسليم خلية، في بعض الأحيان، وتوفير نافذة قصيرة لدراسة تأثير الخلايا المزروعة. بالإضافة إلى ذلك، كبت المناعة يزيد من خطر العدوى والمراضة والوفيات اللاحقة. ومع ذلك، يمكن للمرء أن تعايش التصاقي مع الحفاظ على الدورة الدموية خيالية لفترات طويلة من الزمن ودراسة العوامل المتداولة (خلايا، السيتوكينات، الخ) مستقلة عن أصلهم. هذا النظام يمكن أن تستخدم لتحديد دور تعميم الخلايا في التئام الجروح، وتشكيل الورم، والشيخوخة، وتجديد، واستجابة التهابية، ضمن أشياء أخرى كثيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر أدرين موسلي وLibuse Jerabek (ستانفورد) للحصول على المساعدة مع تقنية جراحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
