Summary
Parabiotic samenvoegen van twee organismen leidt tot de ontwikkeling van een gedeelde bloedsomloop. In dit protocol beschrijven we de chirurgische stappen om parabiotic verbinding tussen een wildtype muis en een constitutieve GFP-expressie muis vormen.
Abstract
Parabiose is een chirurgische vereniging van twee organismen waardoor delen van de bloedsomloop. Bevestiging van de huid van twee dieren bevordert vorming van microvasculatuur op de plaats van ontsteking. Parabiotic partners delen hun circulerende antigenen en dus vrij zijn van ongewenste immuunreactie. Voor het eerst beschreven door Paul Bert in 1864 1, werd de parabiose operatie verfijnd door Bunster en Meyer in 1933 naar dieroverleving 2 te verbeteren. In het huidige protocol, worden twee muizen operatief verbonden na een wijziging van de Bunster en Meyer techniek. Dieren worden aangesloten via de elleboog-en kniegewrichten, gevolgd door bevestiging van de huid waardoor stevige steun die stam voorkomt op de huid gehecht. Hierin beschrijven we in detail de parabiotic verbinden van een alomtegenwoordige GFP-expressie muis om een wild-type (WT) muizen. Twee weken na de ingreep, wordt het paar gescheiden en GFP positieve cellen kan worden gedetecteerd door flow cytometrische analyse in het bloion van de WT muizen. Het bloed chimerisme maakt het mogelijk om de bijdrage van de circulerende cellen van een dier van de andere onderzoeken.
Introduction
Parabiose, de chirurgische samenvoegen van twee organismen, werd eerst beschreven in 1864 door Paul Bert als een manier om een model van gedeelde bloedsomloop kunnen bestuderen en bestond uit het verbinden van de huid en spieren wanden van twee ratten 1. Parabiose bevordert vorming van capillairen in de plaats van ontsteking 3 en verscheidene toepassingen in fysiologische studies, zoals hormonale communicatie tussen de hypofyse en de geslachtsklieren en de rol van de nier hypertensie 4 hadden. Het is verder gebruikt om de rekrutering en integratie van progenitorcellen onderzoeken neovascularisatie 5, migratie van hematopoietische stamcellen 6 en lymfocyttransport 7, alsmede de rol en kinetiek van circulerende inflammatoire of stamcellen in tumormetastase 8,9, en neurodegeneratieve ziekten 10.
Een belangrijk voordeel van parabiose leugensin dat het een partnerschap dieren hebben gemeenschappelijke circulerende antigenen, waardoor cel migratie en neovascularisatie, zonder dat er een immunologische reactie. Belangrijk Weissman e.a.. Gebleken dat parabiose tussen mannelijke en vrouwelijke muizen leidt niet tot vorming van antilichamen anti HY 11.
In het oorspronkelijke protocol beschreven door Paul Bert werden de twee dieren elkaar verbonden door verbinding van de huid en spieren wanden 1. Deze werkwijze echter tot aanzienlijke belasting voor de dieren en resulteerde in hoge mortaliteit als gevolg van infectie van de wond. Sindsdien is de parabiose techniek is herzien door verschillende groepen met de meest overheersende zijnde de door Bunster en Meyer voorgesteld in 1933 2 protocol. Hun methode onder verbinding van de scapula gewrichten, lichaamsholten, en de huid, waardoor betere ondersteuning en minder pijn voor de dieren. Tegelijkertijd resultaat van de nieuwe werkwijze minimale postoperatieve zorg en significant verlaagde sterftecijfers. De hierin beschreven protocol is een modificatie van de Bunster en Meyer techniek die minder invasief en kan steviger verbinden. Namelijk worden muizen verbonden door de elleboog en kniegewrichten en de huid. De bundeling voorkomt verlenging van de huid en veroorzaakt dus minder pijn en complicaties. Hier beschrijven we de toetreding van een wild-type (WT) volwassen muis om een constitutief GFP-expressie muis. We zien dat twee weken na chirurgie bereiken we 50% bloed chimerisme aantonen van de effectiviteit van deze chirurgische procedure om een gedeelde bloedsomloop systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke studies werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van UCLA Animal Care en gebruik Comite en de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De duur van de hieronder beschreven procedure is ongeveer 45-60 minuten van begin tot eind.
1. Bereiding van chirurgische Field
- Voer de procedure in een schone dier operatie kamer.
- Uitrusting: isofluraan Vaporizer, Gaymer T Pomp met verwarming pad.
- Steriele instrumenten: twee gebogen pincet, fijne schaar, naald houder.
- Steriele handschoenen moeten worden gebruikt tijdens de gehele procedure.
2. Voorbereiding van de dieren
- Plaats twee mannelijke of vrouwelijke muizen van dezelfde genetische achtergrond van vergelijkbaar gewicht en grootte in dezelfde kooi en monitor minstens twee weken harmonieuze samenleven garanderen. Vrouwelijke muizen hebben de voorkeur vanwege hun minder agressief gedrag.
- Verdoven dieren doormet een isofluraan vaporizer. Plaats muizen in een Posi-Seal inductie kamer verbonden met de verdamper isofluraan (4-5% v / v). Na anesthesie geïnduceerd Breng het dier de vacht scheren stippellijn onderhouden van de anesthesie tijdens de procedure via een neuskegel verbonden met isofluraan (1,5-2% v / v). Solliciteer oogzalf met een Q-tip om droge ogen te voorkomen.
- Plaats het dier op de rugligging. Grondig scheren linkerkant van de muis op de linker en de rechterkant van de muis geplaatst rechts vanaf ongeveer 1 cm boven de elleboog tot 1 cm onder de knie.
- Aseptisch bereiden de geschoren gebieden door het grondig af te vegen (2-3x) met Betadine doordrenkte doekjes gevolgd door alcohol doekjes. Leg de muizen op een verwarmd kussen bedekt met een steriel gaasje.
- Analgesie, beheren Carprofen en Buprenorfine intraperitoneaal of subcutaan in een dosis van 10 mg / kg en 0,1 mg / kg respectievelijk.
- Plaats dieren aan hun kant, rug aan rug, met eendjacent geschoren gebieden naar boven. Om verontreiniging van het chirurgische gebied te voorkomen, hebben betrekking op de muizen met een steriel laken bloot alleen het operatiegebied. Maak een klein laken opening naar steriel blijven bij het uitvoeren van de operatie. We maakten het laken venster groot om een beter zicht te hebben tijdens video-opnamen.
3. Parabiose
- Met een scherpe schaar Voer longitudinale incisies op de geschoren zijden van elk dier vanaf 0,5 cm boven de elleboog tot aan 0,5 cm onder het kniegewricht (figuur 1). Na de incisie, voorzichtig los de skin uit de subcutane fascia door die de huid met een paar gebogen pincet en scheiden de fascia met een tweede paar 0,5 cm vrije huid te creëren. Voer deze scheiding langs de gehele incisie.
- Begin met het verbindingsstuk door aan de linker olecranon van een dier rechts olecranon van de andere. Zowel olecranons en kniegewrichten zijn duidelijk te onderscheiden volgende the huidincisie. Ter vergemakkelijking van de toetreding, buig de elleboog van de eerste muis en laat de naald van de niet-absorbeerbare 3-0 hechtdraad onder de olecranon. Evenzo, buig de elleboog van de tweede muis en geef dezelfde hechtdraad eronder. Bevestig gewrichten strak door een dubbele chirurgische knoop.
- Sluit de kniegewrichten volgens dezelfde procedure.
- Na de bevestiging van de gewrichten, sluit de huid van de twee dieren met een doorlopende absorbeerbare 5-0 hechtdraad Vicryl vanaf ventraal van de elleboog naar de knie. Om breuk huid en ontmenging tegen voeren een strakke hechtdraad afsluiting van de huid in het gebied rond de ellebogen en knieën. Zodra de ventrale beslag huid is voltooid, voert u een dubbele chirurgische knoop. Leg de muizen in buikligging en blijven de hechtdraad dorsally eindigend met een dubbele chirurgische knoop. Controleer de continuïteit van de hechtdraad en bevestigen gebrek openingen.
- Dien 0,5 ml 0,9% NaCl subcutaan aan elke muis gedehydrateerde vorm voorkomendration.
4. Postoperatief herstel
- Houd dieren op verwarmd pad tot herstel.
- Na herstel, bieden pijnstillers carprofen en buprenorfine. Herhaal intraperitoneaal of subcutaan om 24 en 12 uur, respectievelijk, voor 48 uur bij dezelfde doseringen boven (stap 2.5) beschreven. Monitor dieren op tekenen van pijn en verdriet, zoals schudden, lethargie, kauwen van staart, gebogen rug, gebrek aan verzorging, enz. daags gedurende twee weken.
- Profylactisch behandelen muizen met Sulfamethoxazol / Trimethoprim orale suspensie in hun waterfles 2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml gedurende 10 dagen om bacteriële infecties te voorkomen.
- Huis elk parabiotic pair in een schone kooi met monolithische strooisel (bijv. papieren handdoek of een absorberend steriel gaasje) om aspiratie van strooisel voorkomen. De terugkeer van de dieren naar een beddengoed gevulde kooi wanneer ze in staat zijn om borstligging onderhouden met hun hoofd omhoog. Om de spanning te minimaliserenvan het bereiken van voedsel, terwijl de aanpassing aan parabiotic bestaan, plaatst de bevochtigde voedsel pellets op de kooi vloer. Zorg voor nestmateriaal. In 1-2 weken parabiotic muizen hebben het vermogen om normaal ambulate op chirurgisch gepaarde voor-en achterpoten-ledematen.
- Bloed chimerisme optreedt 10-14 dagen na de operatie.
5. Bevestiging en Reverse Procedure
- Na twee weken trekken bloed uit de staart aderen van elke muis voor flow-cytometrische analyse bloed chimerisme (figuur 3) bevestigen.
- Bloedverwerkende voor flowcytometrische analyse: verdun 2-3 druppels bloed in 500 ui 10 mM EDTA. Voeg 500 ul van 2% dextran (verdund in PBS), meng en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Breng het supernatant in een nieuwe buis centrifugeren op 1200 rpm gedurende 5 minuten en resuspendeer de gepelleteerde cellen in PBS (of een andere buffer) voor flowcytometrische analyse.
- Afhankelijk van de experimentele opzet, kan de parabiotic paar worden gescheiden eent latere tijdstippen. In onze ervaring, hebben we parabiosed paren constant tot maximaal 9 maanden zonder complicaties.
- Voer omgekeerde procedure op een steriele chirurgische oppervlak. Verdoven muizen door ze in een inductie kamer verbonden met een verdamper isofluraan (4-5%) en anesthesie te onderhouden met 1,5-2% isofluraan, zoals hierboven (stap 2.2) beschreven.
- Verwijder haar van de omgeving van het initiële hechting en aseptisch bereiden het geschoren gebied zoals hierboven beschreven (stap 2.3, 2.4).
- Analgesie, beheren Carprofen en Buprenorfine intraperitoneaal of subcutaan in een dosis van 10 mg / kg en 0,1 mg / kg, respectievelijk.
- Bedek operatiegebied met een steriel laken zoals hierboven (stap 2.6) beschreven.
- Met scherpe schaar, scheid de muizen via een longitudinale incisie langs de laterale hechting en voorzichtig los de nieuw gevormde fascia tussen de twee muizen met een paar gebogen pincet. Aan de gewrichten los, snijd de knopen van de hechtdraadze aansluit. Snij de huid langs de incisie om gladde randen bereiken en sluit de huid met een absorbeerbare continue 5-0 gecoate Vicryl hechtdraad.
- Om uitdroging te voorkomen, dienen 0,5 ml 0,9% NaCl subcutaan aan elke muis. Houd dieren op verwarmd pad tot herstel.
- Na herstel, herhaal pijnstillende administratie, carprofen (10 mg / kg) elke 24 uur en buprenorfine (0,1 mg / kg) om de 12 uur gedurende 48 uur.
- Om te voorkomen dat bacteriële infecties te behandelen muizen met Sulfamethoxazol / Trimethoprim suspensie voor oraal gebruik (2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml) in hun fles water gedurende 10 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verwachte uitkomst van parabiose twee organismen gelijke bijdrage van bloedsomloop elk dier een gemeenschappelijke bloedsomloop (fig. 2). Men kan gemakkelijk controleren of de succesvolle verevening van het bloed van de parabiosed WT en GFP positieve muizen door flowcytometrische analyse. Hier, veneus bloed werd verkregen van de staarten van beide parabionts 2 weken na de operatie en werd gefractioneerd op perifere bloedcellen (erytrocyten te sluiten). De gefractioneerde-hematopoietische cellen afgeleide fractie werd vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie voor de aanwezigheid van GFP positieve cellen WT. In overeenstemming met eerdere studies, bloed van de WT muizen toonde aanwezigheid van chimerisme, zoals aangegeven door ongeveer de helft GFP positieve halve WT bloedcellen (53% WT-cellen en 47% GFP-cellen) (Figuur 3).
Figuur 1. Parabiosis chirurgie. incisie ter zijkanten van verdoofde dieren worden geschoren en longitudinale incisies uitgevoerd (dol gebied) van 0,5 cm boven de elleboog tot 0,5 cm onder het kniegewricht.
Figuur 2. Schematische weergave van de parabiose methode. A) Samenvoegen van een WT muis (links) een GFP positieve muis (rechts). B) Ongeveer twee weken na chirurgische hechting wordt nieuwe capillairen gevormd op de plaats waar de twee muizen zijn verbonden zodat toetreden van de bloedcirculatie.
Figuur 3. Bloed chimerisme van parabiotic partners. Flowcytometrische analyse van bloedmonster verzameld uit de WT parabiotic partner twee weken na chirurgische toetreden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De parabiose methode die hier besproken presenteert minimale technische problemen en resulteert in lage sterftecijfers. De bevestiging van de knie en elleboog gewrichten is een aanzienlijke verbetering van de Bunster en Meyer techniek. De procedure blijft invasieve aldus handhaven van steriele omstandigheden tijdens de operatie is noodzakelijk. Voor infectie van de operatiewond verder te voorkomen, is het belangrijk dat de parabiosed dieren een combinatie van antibiotica en regelmatig worden gecontroleerd. Voor goede steun te verzekeren en pijn te voorkomen, moet de hechting aansluiten van de ellebogen en knieën de gewrichten omringen plaats die door het weefsel.
Als alternatief voor isofluraan inhalatie kan anesthesie geïnduceerd met behulp van intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine of andere anesthetica institutionele comites goedgekeurd. Het voordeel van isofluraan is dat het snel anesthesie induceren en aanzienlijk kunnen verminderen rerugvordering tijd. Bovendien kan het niveau van anesthesie precies.
Parabiose, waardoor circulatiesystemen van twee dieren vermengen en evenwicht, is een krachtige experimentele procedure voor fysiologische studies. Het biedt verschillende voordelen voor andere algemeen gebruikte technieken zoals beenmerg transplantatie of celinjectie. Cell leveringsprocedures soms een korte venster om het effect van getransplanteerde cellen te onderzoeken. Bovendien immunosuppressie verhoogt het risico op besmetting en verdere morbiditeit en mortaliteit. Echter, met parabiose kan een chimeer circulatie lange tijd en onderzoek circulerende factoren (cellen, cytokines, etc.) onafhankelijk van hun oorsprong behouden. Dit systeem kan worden gebruikt om de rol van circulerende cellen in wondgenezing, tumorvorming, veroudering, regeneratie en ontstekingsreactie, onder vele anderen bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Adriane Mosley en Libuse Jerabek (Stanford) bedanken voor hulp bij de chirurgische techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
