Summary
Parabiotic unione di due organismi porta allo sviluppo di un sistema circolatorio condiviso. In questo protocollo, si descrivono i passaggi chirurgici per formare una connessione parabiotic tra un topo wild-type e una costitutiva GFP che esprimono mouse.
Abstract
Parabiosis è l'unione chirurgica di due organismi che permettono la condivisione della circolazione sanguigna. Allegando la pelle di due animali promuove la formazione di microcircolo nel sito di infiammazione. Partner Parabiotic condividere i loro antigeni circolanti e quindi sono privi di reazione immunitaria avversa. In primo luogo descritto da Paul Bert nel 1864 1, l'intervento parabiosis è stata affinata per Bunster e Meyer nel 1933 per migliorare la sopravvivenza degli animali 2. Nel protocollo corrente, due topi sono chirurgicamente uniti dopo una modifica della Bunster e tecnica Meyer. Gli animali sono collegati attraverso il gomito e del ginocchio seguita da attacco della pelle permettendo il supporto costante che impedisce sforzo sulla pelle suturata. Qui, descriviamo in dettaglio la parabiotic unione di un GFP onnipresente che esprime il mouse per una wild type (WT) del mouse. Due settimane dopo la procedura, la coppia viene separata e cellule positive GFP può essere rilevata mediante analisi citofluorimetrica nel cir sangueione del mouse WT. Il chimerismo sangue permette di esaminare il contributo delle cellule circolanti da un animale nell'altro.
Introduction
Parabiosis, la chirurgica unione di due organismi, è stato descritto nel 1864 da Paul Bert come un modo per sviluppare un modello per studiare sistemi circolatorio condivisi e consisteva l'unione della pelle e pareti muscolari dei due topi 1. Parabiosis promuove la formazione del microcircolo nel sito di infiammazione 3 e ha avuto diverse applicazioni in studi fisiologici, come la comunicazione ormonale tra l'ipofisi e gonadi nonché il ruolo del rene nell'ipertensione 4. È stato inoltre impiegato per investigare l'assunzione e integrazione di cellule progenitrici in neovascolarizzazione 5, migrazione di cellule staminali ematopoietiche 6, e linfociti tratta 7, così come il ruolo e cinetica di cellule infiammatorie circolanti o staminali nel tumore metastasi 8,9, e le malattie neurodegenerative 10.
Un vantaggio significativo di bugie parabiosisdal fatto che gli animali collaborato condividono antigeni circolanti comuni, consentendo la migrazione cellulare e la neovascolarizzazione senza innescare una reazione immunologica. Importante, Weissman et al. Hanno dimostrato che parabiosis tra topi maschio e femmina non porta alla formazione di anticorpi contro HY 11.
Nel protocollo originale descritto da Paul Bert due animali sono stati uniti insieme mediante collegamento della pelle e pareti muscolari 1. Questo metodo però, causato sforzo significativo per gli animali e provocato elevata mortalità a causa di infezione della ferita. Da allora la tecnica parabiosis è stato rivisto da diversi gruppi con il più predominante è il protocollo proposto da Bunster e Meyer nel 1933 2. Il loro metodo incluso giunzione delle articolazioni scapola, cavità del corpo, e la pelle, consentendo un migliore supporto e meno dolore per gli animali. Allo stesso tempo, il nuovo metodo ha comportato minima cura post-operatoria e significativamente ridotto la mortalità. Il protocollo qui descritto è una modifica della tecnica Bunster e Meyer che è meno invasiva e permette più salda adesione. Vale a dire, i topi sono collegati attraverso le articolazioni del gomito e ginocchio, come pure la pelle. Questo impedisce l'allungamento adesione della pelle e quindi provoca meno dolore e complicazioni. Qui si descrive l'unione di una wild type (WT) topo adulto per un GFP costitutiva esprime mouse. Abbiamo dimostrato che due settimane dopo l'intervento si possono raggiungere il 50% di chimerismo sangue dimostrare l'efficacia di questa procedura chirurgica per creare un sistema circolatorio condiviso.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida di cura degli animali e l'uso del comitato di UCLA e il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. La durata della procedura descritta di seguito è di circa 45-60 minuti dall'inizio alla fine.
1. Preparazione del campo operatorio
- Eseguire la procedura in una sala operatoria degli animali pulita.
- Equipaggiamento: isoflurano vaporizzatore, Gaymer Pompa T con il rilievo di riscaldamento.
- Strumenti sterili: due pinze, forbici curve sottili, porta aghi.
- Guanti sterili devono essere utilizzati durante l'intera procedura.
2. Preparazione degli animali
- Inserire due topi maschi o femmine, di stesso background genetico, di peso e di dimensioni simili nella stessa gabbia e monitorare per almeno due settimane per garantire la convivenza armoniosa. Topi femmina sono preferiti a causa del loro comportamento meno aggressivo.
- Anestetizzare gli animali dautilizzando un vaporizzatore isoflurano. Topi posto in una camera di induzione Posi-Seal collegati al vaporizzatore isoflurano (4-5% v / v). Una volta anestesia viene indotta, trasferire l'animale alla zona rasatura pelo e mantenere l'anestesia durante tutta la procedura attraverso un'ogiva collegato a isoflurano (1,5-2% v / v). Applicare una pomata oftalmica con un Q-tip per prevenire gli occhi asciutti.
- Posto l'animale in posizione supina. Radere accuratamente il lato sinistro del mouse posizionata a sinistra e destra del mouse posizionata a destra a partire da circa 1 cm sopra il gomito a 1 cm al di sotto del ginocchio.
- Asetticamente preparare le zone rasate dal fondo strofinando (2-3x) con salviettine Betadine intriso seguito da cotone imbevuto di alcol. Posizionare il mouse su un tappetino riscaldato coperto da un tampone sterile.
- Per analgesia, amministrare Carprofene e buprenorfina per via intraperitoneale o sottocutanea alla dose di 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, rispettivamente.
- Posizionare gli animali dalla loro parte, schiena contro schiena, con undjacent aree rasate rivolti verso l'alto. Per evitare qualsiasi contaminazione dell'area chirurgica, coprire i topi con un telino sterile esponendo solo la zona di operazione. Creare una piccola apertura telo di rimanere sterile quando si esegue l'intervento chirurgico. Abbiamo fatto la finestra drappo grande per avere una visione migliore durante la videoregistrazione.
3. Parabiosis
- Utilizzando una forbice tagliente, effettuare incisioni cutanee longitudinali ai lati rasato di ogni avviamento animale a 0.5 cm sopra il gomito fino a 0,5 cm al di sotto del ginocchio (Figura 1). Seguendo l'incisione, staccare delicatamente la pelle dalla fascia sottocutanea tenendo la pelle con un paio di pinze curve e separare la fascia con una seconda coppia di creare 0,5 cm pelle libera. Eseguire questa separazione lungo tutta l'incisione.
- Iniziare la giunzione collegando all'olecrano fianco di un animale a destra olecranon dell'altro. Entrambi olecranons e le articolazioni del ginocchio sono chiaramente distinguibili seguente the incisione cutanea. Per facilitare l'unione, piegare il gomito del primo mouse e passare l'ago della non assorbibile 3-0 sutura sotto all'olecrano. Analogamente, piegare il gomito del secondo mouse e passare la stessa sutura sotto di essa. Fissare i giunti saldamente da un doppio nodo chirurgico.
- Collegare le articolazioni del ginocchio seguendo la stessa procedura.
- Seguendo il fissaggio delle articolazioni, collegare la pelle dei due animali con un continuo 5-0 assorbibile Vicryl sutura ventrale partendo dal gomito verso il ginocchio. Per evitare la rottura della pelle e la separazione eseguire una sutura stretta della pelle nella zona intorno ai gomiti e le ginocchia. Una volta che l'allegato pelle ventrale è stata completata, eseguire un doppio nodo chirurgico. Posizionare il mouse in posizione prona e proseguire la dorsale sutura termina con un doppio nodo chirurgico. Verificare la continuità della sutura e confermare la mancanza di aperture.
- Somministrare 0,5 ml di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea per ogni mouse per evitare deidrodration.
4. Recupero post-operatorio
- Tenere animali sul pad riscaldato fino al recupero.
- Dopo il recupero, fornire analgesici carprofene e buprenorfina. Ripetere intraperitoneale o sottocutanea ogni hr 24 e 12, rispettivamente, per 48 ore alle stesse dosi descritte sopra (punto 2.5). Monitor animali per i segni di dolore e di angoscia, quali agitazione, letargia, masticazione di coda, inarcò la schiena, la mancanza di toelettatura, ecc giorno per due settimane.
- Profilassi, trattare i topi con sulfametossazolo / trimetoprim sospensione orale nella loro bottiglia d'acqua 2 mg sulfamidici / ml 0,4 mg / ml assetto per 10 giorni per prevenire le infezioni batteriche.
- Casa ciascuna coppia parabiotic in una gabbia pulita con lettiera monolitico (ad es tovagliolo di carta o tampone sterile assorbente) per evitare l'aspirazione di materiale di biancheria da letto. Ritorno agli animali di una gabbia piena di biancheria da letto quando sono in grado di mantenere decubito sternale con la loro testa. Per ridurre al minimo lo sforzodi raggiungere per il cibo durante la regolazione all'esistenza parabiotic, posizionare le palline di cibo inumiditi sul pavimento della gabbia. Fornire materiale di nidificazione. In 1-2 settimane i topi parabiotic hanno la capacità di deambulare normalmente chirurgicamente coppie anteriori e posteriori degli arti.
- Chimerismo sangue si verifica 10-14 giorni dopo l'intervento.
5. Conferma e procedura inversa
- Dopo due settimane il sangue fluisce dalle vene coda di ciascun topo per analisi citofluorimetrica per confermare chimerismo sangue (Figura 3).
- Trattamento del sangue per l'analisi di citometria di flusso: diluire 2-3 gocce di sangue in 500 ml di EDTA 10 mM. Aggiungere 500 ml di 2% destrano (diluito in PBS), mescolare bene e incubare a 37 ° C per 30 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, centrifugare a 1200 rpm per 5 min e risospendere le cellule pellet in PBS (tampone o altro) per analisi citofluorimetrica.
- A seconda del disegno sperimentale, la coppia parabiotic può essere separato unt momenti successivi. Nella nostra esperienza, abbiamo mantenuto le coppie parabiosed fino a 9 mesi senza complicazioni.
- Eseguire la procedura inversa su una superficie sterile chirurgica. Anestetizzare topi mettendoli in una camera di induzione collegato ad un vaporizzatore isoflurano (4-5%) e mantenere l'anestesia con isoflurano 1,5-2%, come descritto sopra (passo 2.2).
- Eliminare i peli dalla zona circostante la sutura iniziale e asettico preparare le zone rasate come descritto sopra (punti 2.3, 2.4).
- Per analgesia, amministrare Carprofene e buprenorfina per via intraperitoneale o sottocutanea alla dose di 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, rispettivamente.
- Coprire area chirurgica con un telino sterile come sopra descritto (punto 2.6).
- Usando forbici affilate, separare i topi attraverso un'incisione longitudinale lungo la sutura laterale e staccare leggermente la fascia di nuova formazione tra i due topi con un paio di pinze curve. Per separare le articolazioni, tagliare i nodi di suturache li collega. Tagliare la pelle lungo l'incisione per ottenere bordi lisci e riattaccare la pelle con una riassorbibile continuo 5-0 rivestita Vicryl sutura.
- Per prevenire la disidratazione, somministrare 0,5 ml di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea per ogni mouse. Tenere animali sul pad riscaldato fino al recupero.
- Dopo il recupero, ripetere la somministrazione di analgesici, carprofene (10 mg / kg) ogni 24 ore e buprenorfina (0,1 mg / kg) ogni 12 ore per 48 ore.
- Per prevenire le infezioni batteriche trattano topi con sospensione orale sulfametossazolo / trimetoprim (2 mg sulfamidici / ml 0,4 mg assetto / ml) nel loro bottiglia d'acqua per 10 giorni.
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Representative Results
Il risultato atteso di parabiosis di due organismi è il pari contributo di sistema circolatorio di ogni animale ad una circolazione sanguigna comune (Figura 2). Si può facilmente verificare l'equilibratura con successo il sangue del parabiosed WT e topi GFP positive con l'analisi di citometria di flusso. Qui, il sangue venoso è stato ottenuto dalle code di entrambi parabionts a 2 settimane dopo l'intervento chirurgico e stato frazionato per le cellule del sangue periferico (per escludere eritrociti). La frazione di cellule ematopoietiche derivate frazionata è stata successivamente analizzata mediante citometria di flusso per la presenza di cellule GFP positive e WT. Coerente con gli studi precedenti, sangue dal mouse WT rivelato presenza di chimerismo, come indicato da circa mezzo GFP cellule positive e mezzo WT sangue (53% di cellule WT e cellule GFP 47%) (Figura 3).
Figura 1. Parabiochirurgia sis:. sito Incision I lati laterali di animali anestetizzati vengono rasati e incisioni cutanee longitudinali vengono eseguite (area stravedeva) da 0,5 cm sopra il gomito a 0,5 cm al di sotto del ginocchio.
Figura 2. Rappresentazione schematica del metodo parabiosis. A) giunzione di un topo WT (sinistra) per un GFP topo positivo (destra). B) Circa due settimane dopo l'attacco chirurgico, nuovo microcircolo si forma nel punto in cui i due topi sono collegati permettendo giunzione della circolazione sanguigna.
Figura 3. Sangue chimerismo dei partner parabiotic. Analisi citofluorimetrica del campione di sangue prelevato dal partner parabiotic WT due settimane che seguono l'adesione chirurgico.
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Discussion
Il metodo parabiosis discusso qui presenta difficoltà tecniche minime e si traduce in tassi di mortalità bassi. Il fissaggio delle articolazioni del ginocchio e del gomito è un miglioramento significativo della Bunster e tecnica Meyer. Tuttavia, la procedura rimane così invasiva mantenimento di condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico è imperativo. Per prevenire ulteriori infezioni del sito chirurgico, è importante che gli animali parabiosed ricevono una combinazione di antibiotici e monitorare regolarmente. Per garantire un sostegno costante e prevenire il dolore, la sutura che collega i gomiti e le ginocchia devono circondare le articolazioni invece di passare attraverso il tessuto.
In alternativa alla inalazione isoflurano, anestesia può essere indotta con l'uso di iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina o altri anestetici approvati da comitati istituzionali. Il vantaggio di utilizzare isoflurano è che può rapidamente indurre anestesia e ridurre significativamente il rECUPERO tempo. Inoltre, il livello di anestesia può essere controllato con precisione.
Parabiosis, che consente ai sistemi circolatori da due animali si mescolano ed equilibrare, è un potente procedura sperimentale per studi fisiologici. Esso presenta diversi vantaggi ad altre tecniche comunemente usate come trapianto di midollo osseo o iniezione di cellule. Procedure di consegna delle cellule, a volte, forniscono una breve finestra per esaminare l'effetto delle cellule trapiantate. Inoltre, immunosoppressione aumenta il rischio di infezione e successiva morbilità e mortalità. Tuttavia, con parabiosis si può assicurare una circolazione chimerico per lunghi periodi di tempo e studio fattori (cellule, citochine, ecc) indipendentemente dalla loro origine circolanti. Questo sistema può essere utilizzato per determinare il ruolo delle cellule circolanti nella guarigione delle ferite, formazione di tumori, invecchiamento, rigenerazione, e la risposta infiammatoria, tra molti altri.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Adriane Mosley e Libuse Jerabek (Stanford) per l'assistenza con la tecnica chirurgica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
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