Summary
이 유기체의 접합 Parabiotic 공유 순환 시스템의 개발에 이르게한다. 이 프로토콜에서, 우리는 야생형 마우스와 구성 적 GFP 발현 마우스 사이 parabiotic 연결을 형성하는 수술 단계를 설명한다.
Abstract
Parabiosis 혈행의 공유를 허용하는 두 가지 생물의 연합 수술이다. 이 동물의 피부에 부착하면 염증 부위에서의 미세 혈관 형성을 촉진한다. Parabiotic 파트너는 순환 항원을 공유하고, 따라서 불리한 면역 반응의 무료입니다. 먼저 1864 년 1 폴 버트에 의해 설명, parabiosis 수술은 동물의 생존 2을 개선하기 위해 1933 년에 Bunster과 메이어에 의해 세련되었다. 현재 프로토콜에서 두 개의 마우스는 수술 Bunster과 메이어 기술의 변경 다음과 결합된다. 동물은 봉합 피부에 부담을 방지 확고한 지원을 허용하는 피부의 첨부 파일 다음에 팔꿈치와 무릎 관절을 통해 연결되어있다. 여기서, 우리는 세부 사항에서 야생형 (WT) 마우스에 마우스를 표현하는 유비쿼터스 GFP의 결합 parabiotic에 대해 설명합니다. 혈액 circulat 두 주 절차 후에, 한 쌍의 분리되고 GFP 양성 세포는 유세포 분석에 의해 검출 될 수있다WT 마우스의 이온. 혈액 키메라는 하나가 다른 하나의 동물에서 순환 세포의 기여를 조사 할 수있다.
Introduction
Parabiosis, 수술은이 유기체의 접합은, 제 공유 순환계를 연구하는 모델을 개발하는 방법으로 폴 버트에 의해 1864 년에 설명되고이 한 쥐의 피부와 근육 벽의 결합으로 구성 하였다. Parabiosis 염증 3의 사이트에있는 미세 혈관의 형성을 촉진하고 뇌하수체와 생식선뿐만 아니라 고혈압 4 신장의 역할 사이의 호르몬 통신 등의 생리 학적 연구에서 여러 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 그것은 또한, 혈관 신생 4.0, 조혈 줄기 세포 (6)의 이동, 및 림프구 매매 7뿐만 아니라 종양 전이 8,9에서 염증성 또는 줄기 세포 순환의 역할과 동역학에서 전구 세포의 모집 및 통합을 조사하기 위해 사용되어왔다 및 신경 퇴행성 질환 10.
parabiosis 거짓말의 한 가지 중요한 장점그의 제휴 동물 면역 반응을 유발하지 않고 세포의 이동과 혈관 신생을 허용, 일반적인 순환 항원을 공유 할 수 있습니다. 중요한 것은, 와이즈맨 등.이 남성과 여성의 생쥐 사이 parabiosis을 보여 주었다은 11 항체 안티 HY의 형성으로 이어질하지 않습니다.
폴 버트에 의해 설명 원래의 프로토콜에서 두 동물은 피부와 근육 벽 (1)의 연결을 통해 함께 합류했다. 그러나이 방법은, 동물에 상당한 부담을 야기 인해 상처의 감염에 높은 사망률의 결과. 그 이후 parabiosis 기술은 가장 지배적 인 1933 년 2 Bunster과 메이어에 의해 제안 된 프로토콜 인으로 여러 그룹에 의해 수정되었습니다. 그들의 방법은 동물에 대한 더 나은 지원 및 더 적은 고통을 허용, 견갑골의 관절, 체강, 피부의 결합 포함되어 있습니다. 동시에, 새로운 방법은 최소의 수술 치료와 유의 귀착cantly는 사망률을 감소. 여기에 설명 된 프로토콜은 덜 침습적이고 탄력이 합류 할 수 Bunster과 메이어 기술의 변형이다. 즉, 마우스는 팔꿈치, 무릎 관절뿐만 아니라 피부를 통해 연결된다. 따라서이 결합을 막고 피부의 확장과 적은 통증과 합병증의 원인이됩니다. 여기에서 우리는 마우스를 표현하는 구성 적 GFP에 야생형 (WT) 성인 마우스의 결합을 설명합니다. 우리는 수술 후 2 주 우리가 공유 순환계를 만드는이 수술의 효능을 입증 혈액 키메라 비율의 50 %를 달성 할 수 있음을 보여준다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 UCLA의 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 건강 가이드의 국립 연구소에 의해 수행되었다. 아래에 기술 된 절차의 지속 기간은 시작부터 끝까지 약 45-60 분이다.
1. 외과 분야의 제조
- 깨끗한 동물 수술 방에서 절차를 수행합니다.
- 장비 : 이소 플루 란 기화기, 가열 패드 Gaymer T 펌프.
- 무균 도구 : 두 개의 곡선 포셉, 미세 가위, 바늘 홀더.
- 멸균 장갑은 전체 절차를 수행하는 동안 사용되어야한다.
2. 동물의 준비
- 같은 케이지에서 유사한 무게 및 크기의 동일한 유전 적 배경에서 두 남성 또는 여성 마우스, 배치하고 조화로운 공동 생활을 보장하기 위해 최소 2 주에 모니터링 할 수 있습니다. 여성 생쥐 인해 덜 공격적인 행동 선호된다.
- 동물을 마취이소 플루 란 기화기를 사용하여. 포지 인감 유도 챔버에 넣고 마우스는 이소 플루 란 기화기 (4-5 % 년 V / V)에 연결. 마취가 유도되면, 이소 플루 란 (1.5 ~ 2 %의 V / V)에 연결된 코 콘을 통해 절차를 통하여 마취 모피 면도 영역에 동물을 전송하고 유지한다. 눈의 건조를 방지하기 위해 Q-팁 안과 연고를 적용합니다.
- 앙와위에서 동물을 놓습니다. 철저 오른쪽이 약 1cm에 1cm 무릎 팔꿈치 위에서 시작에 배치 좌측 및 마우스의 오른쪽 측면에 배치 된 마우스의 좌측 면도.
- 무균 철저 알코올 잎사귀 뒤에 베타 딘 적신 물티슈 (2 배)을 닦아 면도 영역을 준비합니다. 살균 패드로 덮여 가열 패드에서 마우스를 놓습니다.
- 진통제의 경우, 각각 10 ㎎ / ㎏과 0.1 ㎎ / ㎏의 용량으로 복강 또는 피하 Carprofen 및 프레 놀핀을 관리 할 수 있습니다.
- 로, 다시 다시, 그들의 편에 동물을 배치위로 향하게 면도 영역을 djacent. 외과 영역의 오염을 방지하기 위해 작업에만 영역을 노출 멸균 드레이프와 마우스를 포함한다. 수술을 수행 할 때 무균 유지 작은 주름 구멍을 만듭니다. 우리는 녹화하는 동안 더 나은보기를 가질 주름 창이 큰했다.
3. Parabiosis
- 날카로운 가위를 사용하여 팔꿈치 위 0.5 cm 각 동물 시작하는 면도 측면에 무릎 관절 아래 0.5 cm (그림 1)에있는 모든 방법을 길이 방향 피부 절개를 수행합니다. 절개 후, 부드럽게 곡선 포셉 한 쌍의 피부를 개최하여 피하 근막으로부터 피부를 분리하고 무료 피부의 0.5 cm를 만드는 두 번째 쌍의 근막을 분리합니다. 전체 절개를 따라 이러한 분리를 수행합니다.
- 다른 오른쪽 주두에 동물의 왼쪽 주두를 부착하여 가입을 시작합니다. olecranons 및 무릎 관절은 모두 명확하게 구별 할 수있는 다음과 같은 일이다전자 피부 절개. 결합을 용이하게하기 위해, 먼저 마우스의 팔꿈치를 구부리고 주두 아래의 비 흡수성 3-0 봉합사의 바늘을 전달합니다. 마찬가지로, 두 번째 마우스의 팔꿈치를 구부리고 그 아래 같은 봉합을 전달합니다. 이중 수술 매듭으로 단단히 관절을 연결합니다.
- 동일한 절차에 따라 무릎 관절을 연결합니다.
- 조인트의 부착에 이어 연속 흡수성 5-0 Vicryl 봉합사가 무릎을 향해 팔꿈치으로부터 배쪽으로부터 시작이 동물의 피부를 연결한다. 피부 파열과 분리를 방지하기 위해 팔꿈치와 무릎 주변에있는 피부의 단단한 봉합 폐쇄를 수행합니다. 복부 피부 부착이 완료되면, 이중 수술 매듭을 수행합니다. 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓고 두 번 수술 매듭으로 끝나는 봉합 등쪽을 계속합니다. 봉합사의 연속성을 확인하고 개구의 부족을 확인한다.
- dehy을 방지하기 위해 피하 각 마우스에 0.9 % NaCl을 0.5 ㎖를 관리dration.
4. 수술 후 회복
- 복구 될 때까지 가열 패드에 동물이 오지 않게하십시오.
- 복구 후, 진통제 carprofen 및 부 프레 노르 핀을 제공합니다. (단계 2.5) 전술 한 바와 같은 용량에서 48 시간 동안 각각 복강 또는 피하 매 24 및 12 시간을 반복합니다. 이러한 흔들림 등의 통증과 고통의 흔적을 동물을 모니터링, 꼬리의 혼수, 씹는 등의 손질의 부족은 2 주 동안 매일, 다시 아치.
- 예방, 2 mg의 외상 치료 / ㎖ +0.4 mg의 세균 감염을 방지하기 위해 10 일 동안 / ㎖ 트림 자신의 물병 설파 / 트리 메소 경구 현탁액으로 쥐를 치료.
- 집 침구 소재의 구토물이기도를 막는 것을 방지하기 위해 모 놀리 식 침구 재료 (예를 들면 종이 타월이나 흡수성 살균 패드) 깨끗한 케이지의 각 parabiotic 쌍. 그들의 머리 위로와 흉골 드러 누움을 유지 할 수있을 때 침구 못 케이지에 동물을 반환합니다. 부담을 최소화하기 위해parabiotic 존재를 조절하면서 음식에 도달으로, 케이지 바닥에 적신 식품 알약을 배치합니다. 둥지 재료를 제공합니다. 1 ~ 2 주 parabiotic 마우스는 수술 쌍 앞과 뒷다리 - 사지에 일반적으로 ambulate하는 기능이 있습니다.
- 혈액 키메라는 수술 후 10~14일 발생합니다.
5. 확인 및 역방향 절차
- 2 주 혈액 키메라 (그림 3)을 확인하기 위해 유세포 분석을 위해 각 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취 한 후.
- 유세포 분석을위한 혈액 처리 : 10 mM의 EDTA 500 ㎕의 혈액 2 ~ 3 방울을 희석. (PBS에 희석) 2 % 덱스 트란의 500 μl를 추가, 철저하게 혼합하고, 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 5 분 동안 1,200 rpm에서 새로운 튜브, 스핀 뜨는을 전송하고 유세포 분석을 위해 PBS의 펠렛 세포 (또는 다른 버퍼)를 resuspend.
- 실험 설계에 따라 parabiotic 쌍은 분리 될 수있다나중에 포인트를 톤. 우리의 경험, 우리는 어떤 합병증없이 9 개월 parabiosed 쌍을 유지하고있다.
- 무균 수술 표면에 반대 절차를 수행합니다. (단계 2.2) 상술 한 바와 같이, 이소 플루 란 기화기 (4-5 %)에 접속하고 1.5-2 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지 유도 챔버에 배치하여 마우스를 마취.
- (2.3, 2.4 단계) 초기 봉합 주변 지역에서 머리를 제거하고 무균 전술 한 바와 같이 면도 영역을 준비합니다.
- 진통제의 경우, 각각 10 ㎎ / ㎏과 0.1 ㎎ / ㎏의 용량으로 복강 또는 피하 Carprofen 및 프레 놀핀을 관리 할 수 있습니다.
- (단계 2.6) 전술 한 바와 같이 멸균 드레이프로 수술 영역을 커버.
- 날카로운 가위를 사용하면, 측면 봉합을 따라 세로 절개를 통해 마우스를 분리하고 부드럽게 곡선 포셉 한 쌍의 두 생쥐 사이에 새로 형성된 근막을 분리합니다. 관절을 분리, 봉합사의 매듭을 잘라를 연결. 부드러운 가장자리를 달성하고 흡수 연속 5-0 코팅 Vicryl 봉합사로 피부를 다시 연결하는 절개를 따라 피부를 낸다.
- 탈수를 방지하기 위해 각 마우스에 0.9 % 염화나트륨 피하 0.5 ㎖를 관리 할 수 있습니다. 복구 될 때까지 가열 패드에 동물이 오지 않게하십시오.
- 복구 후, 48 시간 동안 매 12 시간 진통 관리, carprofen (10 ㎎ / ㎏) 매 24 시간 및 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎎ / ㎏)를 반복합니다.
- 세균 감염이 10 일 동안 자신의 물병 설파 / 트리 메소 경구 현탁액 (2 밀리그램의 외상 치료 / ㎖ 0.4 밀리그램 / 밀리리터 트림)과 쥐를 치료 방지합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
두 생물의 parabiosis의 예상 결과는 일반적인 혈액 순환에 각 동물의 순환 시스템의 동일한 기여 (그림 2)입니다. 하나는 쉽게 유세포 분석에 의한 parabiosed WT와 GFP 긍정적 인 생쥐의 혈액의 성공적인 평형을 확인할 수 있습니다. 여기에, 정맥의 혈액은 수술 후에 2 주에 모두 parabionts의 꼬리에서 얻어진 것으로, (적혈구를 제외하는) 말초 혈액 세포에 대한 분획 하였다. 분별 조혈 유래 세포 분획은 후속 GFP 양성 및 WT 세포의 존재를 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 약 반 GFP 긍정적 인 반 WT 혈액 세포 (53 % WT 세포와 47 % GFP 세포) (그림 3)으로 표시된 바와 같이 이전의 연구와 일치, WT 마우스의 혈액은 키메라의 존재를 공개했다.
그림 1. ParabioSIS 수술 :. 절개 마취 된 동물의 측면을 면도하고 세로 피부 절개 무릎 관절 아래에 0.5 cm에 팔꿈치 위 0.5 cm에서 (점선의 인출 영역)을 수행한다.
그림 2. parabiosis 방법의 개략도.) GFP 긍정적 인 마우스 (오른쪽). B) 수술 부착 다음 약 2 주간, 새로운 미세 혈관이 두 개의 마우스가 결합 허용 연결되는 위치에 형성되는 WT 마우스 (왼쪽)의 결합 혈행.
그림 3. parabiotic 파트너의 혈액 키메라는. 수술에 합류 다음 WT parabiotic 파트너 2 주간부터 수집 된 혈액 샘플의 유세포 분석 흐름.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서 설명하는 parabiosis 방법은 낮은 사망률 최소한의 기술적 어려움과 결과를 제시한다. 무릎 및 팔꿈치 관절의 첨부 파일 Bunster과 메이어 기술의 상당한 개선이다. 그러나, 프로 시저 따라서 수술 내내 멸균 조건의 유지가 필수적이다 침습 남아있다. 상기 수술 부위의 감염을 방지하기 위해서는 parabiosed 동물 항생제의 조합을 수신하고 주기적으로 감시하는 것이 중요하다. 회사 지원을 보장하고 고통을 방지하기 위해, 팔꿈치와 무릎을 연결하는 봉합은 오히려 조직을 통과하는 것보다 관절을 둘러싸고해야합니다.
이소 플루 란 흡입에 대한 대안으로서, 마취 케타민 / 자일 라진 또는 기관위원회의 승인 다른 마취제의 복강 내 주사를 이용하여 유도 될 수있다. 이소 플루 란을 사용하는 장점은 급속 마취를 유도하고 크게 R을 줄일 수 있다는 것이다ecovery 시간. 또한, 마취의 수준을 정밀하게 제어 할 수있다.
두 동물의 순환 시스템이 뒤섞 및 평형 수 Parabiosis는 생리 학적 연구를위한 강력한 실험적인 절차입니다. 그런 골수 이식이나 세포 주입과 같은 다른 일반적으로 사용되는 기술로 여러 가지 장점을 제공합니다. 세포 전달 절차는 시간에, 이식 세포의 효과를 조사하기 위해 짧은 창을 제공한다. 또한, 면역 억제는 감염 이후의 병적 상태와 사망률의 위험을 증가시킵니다. 그러나 parabiosis으로 한 기원의 독립적 인 인자 (세포, 사이토 카인 등) 순환 시간과 연구의 오랜 기간 동안 키메라 순환을 유지 관리 할 수 있습니다. 이 시스템은 많은 사람 중에서 상처 치유, 종양 형성, 노화, 재생, 및 염증성 반응, 세포 순환의 역할을 결정하기 위하여 사용될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 수술 기법에 대한 지원은 Adriane 모슬리와 Libuse 위 Jerabek (스탠포드) 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
