Summary
Parabiotic unión de dos organismos conduce al desarrollo de un sistema circulatorio compartido. En este protocolo, se describen los pasos quirúrgicos para formar una conexión parabiotic entre un ratón de tipo salvaje y un ratón que expresa GFP constitutiva.
Abstract
Parabiosis es una unión quirúrgica de dos organismos que permiten el intercambio de la circulación sanguínea. Colocación de la piel de dos animales promueve la formación de la microvasculatura en el sitio de la inflamación. Socios parabiotic comparten sus antígenos circulantes y por lo tanto están libres de la reacción inmunitaria adversa. Descrita por primera vez por Paul Bert en 1864 1, la cirugía parabiosis fue refinado por Bunster y Meyer en 1933 para mejorar la supervivencia de los animales 2. En el protocolo actual, dos ratones se unen quirúrgicamente tras una modificación de la técnica de Bunster y Meyer. Los animales están conectados a través de la articulación del codo y de la rodilla, seguido de la unión de la piel permitiendo un apoyo firme que impide que la tensión en la piel suturada. En este documento, se describe en detalle el parabiotic unión de un GFP ubicua expresando ratón a una de tipo salvaje (WT) de ratón. Dos semanas después del procedimiento, el par se separa y células positivas para GFP se puede detectar por análisis de citometría de flujo en la sangre circulanteion del ratón PESO. El quimerismo de la sangre permite examinar la contribución de las células circulantes de un animal en el otro.
Introduction
Parabiosis, uniéndose a la cirugía de dos organismos, fue descrita por primera vez en 1864 por Paul Bert como una manera de desarrollar un modelo para estudiar los sistemas circulatorios compartidos y consistió en la unión de la piel y paredes musculares de dos ratas 1. Parabiosis promueve la formación de la microvasculatura en el sitio de la inflamación 3 y ha tenido varias aplicaciones en estudios fisiológicos, tales como la comunicación hormonal entre la glándula pituitaria y de las gónadas, así como la función del riñón en la hipertensión 4. Se ha empleado más para investigar la contratación y la integración de las células progenitoras de la neovascularización 5, la migración de las células madre hematopoyéticas 6, y el tráfico de linfocitos 7, así como el papel y la cinética de células inflamatorias circulantes y tallos en la metástasis tumoral 8,9, y enfermedad neurodegenerativa 10.
Una ventaja importante de las mentiras parabiosisen que los animales asociado comparten antígenos circulantes comunes, lo que permite la migración celular y la neovascularización sin desencadenar una reacción inmunológica. Es importante destacar que, Weissman et al. Han demostrado que parabiosis entre los ratones macho y hembra no conduce a la formación de anticuerpos anti HY anticuerpos 11.
En el protocolo original descrito por Paul Bert los dos animales se unen entre sí a través de la conexión de la piel y paredes musculares 1. Este método, sin embargo, causó una gran tensión a los animales y se tradujo en una alta mortalidad debido a la infección de la herida. Desde entonces la técnica parabiosis ha sido revisado por varios grupos con ser el más predominante el protocolo propuesto por Bunster y Meyer en 1933 2. Su método incluye la unión de las articulaciones de escápula, las cavidades del cuerpo, y la piel, lo que permite un mejor apoyo y menos dolor para los animales. Al mismo tiempo, el nuevo método dio como resultado en la atención y sig post-operatorio mínimodisminuyó significativamente las tasas de mortalidad. El protocolo descrito en el presente documento es una modificación de la técnica de Bunster y Meyer que es menos invasiva y permite más firme unión. A saber, los ratones se conectan a través de las articulaciones del codo y de la rodilla, así como la piel. Esto evita que unirse a la extensión de la piel y por lo tanto causa menos dolor y las complicaciones. Aquí se describe la unión de un tipo salvaje (WT) de ratón adulto a un GFP constitutiva expresando ratón. Mostramos que dos semanas después de la cirugía que pueden alcanzar 50% de quimerismo en la sangre que demuestra la eficacia de este procedimiento quirúrgico para crear un sistema circulatorio compartido.
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Protocol
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de cuidado de los animales y el uso comité de la UCLA y los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La duración del procedimiento que se describe a continuación es de aproximadamente 45 a 60 minutos de principio a fin.
1. Preparación de campo quirúrgico
- Realice el procedimiento en una sala de cirugía animal limpio.
- Equipamiento: isoflurano vaporizador, Gaymer Bomba T con almohadilla térmica.
- Herramientas estériles: dos pinzas curvas, tijeras finas, porta agujas.
- Guantes estériles se deben utilizar durante todo el procedimiento.
2. Preparación de los animales
- Coloque dos ratones machos o hembras, de mismo fondo genético, de peso y de tamaño similar en la misma jaula y controlar durante al menos dos semanas para asegurar la cohabitación armoniosa. Los ratones hembra que se prefieren debido a su comportamiento menos agresivo.
- Anestesiar animales porusando un vaporizador de isoflurano. Coloque los ratones en una cámara de inducción Posi-Seal conectados al vaporizador de isoflurano (4-5% v / v). Una vez que la anestesia se induce, transferir el animal a la zona de afeitado de la piel y mantener la anestesia durante todo el procedimiento a través de un cono de nariz conectado a isoflurano (1,5-2% v / v). Aplique una pomada oftálmica con un Q-tip para evitar que los ojos secos.
- Colocar el animal en posición supina. A fondo afeitar el lado izquierdo del ratón a la izquierda y el lado derecho del ratón colocado a la derecha a partir de aproximadamente 1 cm por encima del codo hasta 1 cm por debajo de la rodilla.
- Asépticamente preparar las áreas afeitadas limpiando a fondo (2-3x) con toallitas Betadine empapado seguido de toallitas con alcohol. Coloque el ratón sobre una almohadilla climatizada cubierta por una gasa estéril.
- Para la analgesia, carprofeno y administrar buprenorfina por vía intraperitoneal o por vía subcutánea a una dosis de 10 mg / kg y 0,1 mg / kg, respectivamente.
- Coloca los animales de su lado, de espaldas, con undjacent áreas afeitadas hacia arriba. Para evitar cualquier tipo de contaminación de la zona quirúrgica, cubra los ratones con un paño estéril exponiendo sólo el área de operación. Crear una pequeña abertura drapeado permanecer estéril cuando se realiza la cirugía. Hicimos la ventana cortina grande como para tener una mejor visión durante la grabación en vídeo.
3. Parabiosis
- Uso de una tijera afilada, realizar incisiones en la piel longitudinales a los lados afeitado de cada partida animal en 0,5 cm por encima del codo hasta el final a 0,5 cm por debajo de la articulación de la rodilla (Figura 1). Tras la incisión, separe suavemente la piel de la fascia subcutánea mediante la celebración de la piel con un par de pinzas curvas y separar la fascia con un segundo par de crear 0,5 cm de piel libre. Lleve a cabo esta separación a lo largo de toda la incisión.
- Comience la unión uniendo el olécranon izquierda de un animal a la olécranon derecho de la otra. Ambos olecranons y articulaciones de la rodilla son claramente distinguibles siguiente ªincisión en la piel e. Para facilitar la unión, doble el codo del primer ratón y pasar la aguja de la no absorbible 3-0 sutura bajo el olécranon. Del mismo modo, doblar el codo de la segunda ratón y pasar la misma sutura debajo de ella. Coloque las juntas firmemente por un nudo quirúrgico doble.
- Conectar las articulaciones de la rodilla siguiendo el mismo procedimiento.
- Después de la fijación de las articulaciones, conecte la piel de los dos animales con un absorbible 5-0 Vicryl sutura continua a partir ventralmente desde el codo hacia la rodilla. Para evitar la rotura de la piel y la separación realizar un cierre estanco de sutura de la piel en el área alrededor de los codos y las rodillas. Una vez que la fijación a la piel ventral ha sido completado, realizar un nudo quirúrgico doble. Coloque el ratón en la posición prona y continuar con el dorsal de sutura que termina con un nudo quirúrgico doble. Verificar la continuidad de la sutura y confirmar la falta de aberturas.
- Administrar 0,5 ml de NaCl al 0,9% por vía subcutánea a cada ratón para evitar deshidratación.
4. La recuperación postoperatoria
- Mantener a los animales en el cojín calentado hasta su recuperación.
- Después de la recuperación, proporcionar analgésicos carprofeno y buprenorfina. Repita por vía intraperitoneal o por vía subcutánea cada 24 y 12 h, respectivamente, durante 48 horas a las mismas dosis descritas anteriormente (paso 2.5). Observar a los animales en busca de signos de dolor y angustia como temblores, letargia, la masticación de la cola, se arqueó hacia atrás, la falta de preparación, etc al día durante dos semanas.
- Profiláctica, el tratamiento de ratones con sulfametoxazol / trimetoprima suspensión oral en su botella de agua de 2 mg sulfa / ml 0.4 mg / ml recortar por 10 días para prevenir infecciones bacterianas.
- Casa cada par parabiotic en una jaula limpia con material de cama monolítica (por ejemplo, una toalla de papel o una almohadilla absorbente estéril) para prevenir la aspiración del material de cama. Volver a los animales a una jaula de cama rellenos cuando son capaces de mantener decúbito esternal con la cabeza erguida. Para reducir al mínimo la cepade llegar a los alimentos mientras se ajusta a la existencia parabiotic, colocar las bolitas de comida humedecida en el suelo de la jaula. Proporcionar material de nidificación. En 1-2 semanas los ratones parabiotic tienen la capacidad para caminar normalmente delanteras y traseras-extremidades pares quirúrgicamente.
- Quimerismo sangre ocurre 10-14 días después de la cirugía.
5. Confirmación y procedimiento inverso
- Después de dos semanas extraer la sangre de las venas de la cola de cada ratón para el análisis de citometría de flujo-para confirmar el quimerismo de la sangre (Figura 3).
- Procesado de la sangre para el análisis de citometría de flujo: diluir 2-3 gotas de sangre en 500 l de EDTA 10 mM. Añadir 500 l de 2% de dextrano (diluido en PBS), mezclar bien y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Transferir el sobrenadante en un nuevo tubo, centrifugar a 1200 rpm durante 5 min y resuspender las células sedimentadas en PBS (u otro tampón) para el análisis de citometría de flujo.
- Dependiendo del diseño experimental, el par parabiotic se puede separar unat puntos de tiempo posteriores. En nuestra experiencia, hemos mantenido pares parabiosed para hasta 9 meses sin ningún tipo de complicaciones.
- Realice el procedimiento de reversa en una superficie quirúrgico estéril. Anestesie ratones colocándolos en una cámara de inducción conectada a un vaporizador de isoflurano (4-5%) y mantener la anestesia con isoflurano 1,5-2%, como se describe anteriormente (paso 2.2).
- Retire el cabello del área que rodea la sutura inicial y preparar asépticamente las áreas afeitadas como se describe anteriormente (pasos 2.3, 2.4).
- Para la analgesia, carprofeno y administrar buprenorfina por vía intraperitoneal o por vía subcutánea a una dosis de 10 mg / kg y 0,1 mg / kg, respectivamente.
- Cubra el área quirúrgica con un paño estéril como se describió anteriormente (paso 2.6).
- Usando unas tijeras afiladas, separar los ratones a través de una incisión longitudinal a lo largo de la sutura lateral y separar suavemente la fascia recién formado entre los dos ratones con un par de pinzas curvas. Para separar las articulaciones, cortar los nudos de la suturaconectarlos. Se quita la piel a lo largo de la incisión para lograr bordes lisos y vuelva a colocar la piel con una continua absorbible 5-0 recubierto de sutura Vicryl.
- Para prevenir la deshidratación, administrar 0,5 ml de NaCl al 0,9% por vía subcutánea a cada ratón. Mantener a los animales en el cojín calentado hasta su recuperación.
- Después de la recuperación, repita la administración de analgésicos, carprofeno (10 mg / kg) cada 24 horas y la buprenorfina (0,1 mg / kg) cada 12 horas durante 48 horas.
- Para prevenir las infecciones bacterianas tratar ratones con sulfametoxazol / trimetoprima suspensión oral (2 mg sulfa / ml 0.4 mg de modelo / ml) en su botella de agua durante 10 días.
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Representative Results
El resultado anticipado de parabiosis de dos organismos es la contribución igual de sistema circulatorio de cada animal a una circulación de la sangre común (Figura 2). Se puede verificar fácilmente el equilibrado exitoso de la sangre de la parabiosed WT y ratones GFP positivos por análisis de citometría de flujo. Aquí, la sangre venosa se obtuvo de las colas de ambos parabionts a las 2 semanas después de la cirugía y se fraccionó para las células de sangre periférica (para excluir eritrocitos). La fracción de células hematopoyéticas derivadas de fraccionado posteriormente se analizó mediante citometría de flujo para la presencia de células positivas para GFP y WT. De acuerdo con estudios anteriores, la sangre del ratón PESO reveló presencia de quimerismo, como se indica en aproximadamente media células positivas para GFP y medio WT de sangre (53% de células WT y 47% de células GFP) (Figura 3).
Figura 1. Parabiocirugía sis:. Incisión sitio Las caras laterales de los animales anestesiados se afeitan y las incisiones cutáneas longitudinales se realizan (área adoraba) de 0,5 cm por encima del codo hasta 0,5 cm por debajo de la articulación de la rodilla.
Figura 2. Representación esquemática del método parabiosis. A) La unión de un ratón WT (izquierda) a un ratón GFP positivo (a la derecha). B) Aproximadamente dos semanas después de la fijación quirúrgica, se forma nueva microvasculatura en la ubicación donde los dos ratones se conectan permitiendo unirse de la circulación de la sangre.
Figura 3. Quimerismo Sangre de socios parabiotic. Flujo análisis de citometría de muestra de sangre obtenida de la pareja parabiotic PESO dos semanas siguientes a unirse quirúrgica.
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Discussion
El método parabiosis discutido aquí presenta dificultades técnicas mínimas y los resultados de las tasas de mortalidad bajas. La unión de las articulaciones de rodilla y de codo es una mejora significativa de la Bunster y la técnica Meyer. Sin embargo, el procedimiento sigue siendo invasiva así el mantenimiento de las condiciones estériles durante toda la cirugía es imperativo. Para prevenir una infección del sitio quirúrgico, es importante que los animales parabiosed reciben una combinación de antibióticos y ser controlados regularmente. Para garantizar un apoyo firme y prevenir el dolor, la sutura que conecta los codos y las rodillas debe rodear las articulaciones en lugar de pasar a través del tejido.
Como una alternativa a la inhalación de isoflurano, la anestesia puede ser inducido con el uso de la inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina o otros fármacos anestésicos aprobados por los comités institucionales. La ventaja de utilizar isoflurano es que puede inducir rápidamente la anestesia y reducir significativamente la rECUPERACIÓN tiempo. Además, el nivel de anestesia puede ser controlada con precisión.
Parabiosis, que permite a los sistemas circulatorios de dos animales a mezclan y se equilibran, es un procedimiento experimental poderosa para los estudios fisiológicos. Se presenta varias ventajas con otras técnicas de uso común, tales como el trasplante de médula ósea o de la inyección de células. Procedimientos de entrega de la célula, a veces, ofrecen una ventana corta para examinar el efecto de las células trasplantadas. Además, la inmunosupresión aumenta el riesgo de infección y la posterior morbilidad y la mortalidad. Sin embargo, con parabiosis uno puede mantener una circulación quimérico durante largos períodos de tiempo y estudio de factores (células, citoquinas, etc) independientes de su origen circulantes. Este sistema se puede utilizar para determinar el papel de las células circulantes en la cicatrización de heridas, la formación de tumores, el envejecimiento, la regeneración, y la respuesta inflamatoria, entre muchos otros.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Adriane Mosley y Libuse Jerabek (Stanford) para obtener ayuda con la técnica quirúrgica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
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