Summary
हम तीन नमूने परीक्षण की तैयारी और कैसे वे अनुकूलन और तूफान सूक्ष्मदर्शी के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन. इन उदाहरणों का प्रयोग हम कच्चे डेटा हासिल करने और फिर लगभग 30-50 एनएम संकल्प की कोशिकाओं में सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए यह प्रक्रिया करने के लिए दिखा.
Abstract
तूफान मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक से करने के लिए 10 गुना बेहतर संकल्प के साथ एक हाल ही में विकसित सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक है. छवि एक छवि अणु दर अणु को इमारत से सामान्य की तुलना में एक बहुत अलग तरह से प्राप्त कर लिया है लेकिन, जैसा कि उनकी छवि अधिग्रहण का अनुकूलन करने की कोशिश में उपयोगकर्ताओं के लिए कुछ महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं. इस प्रक्रिया में सहायता और तूफान हम 3 नमूने परीक्षण की तैयारी और 30-50 एनएम के बीच के विशिष्ट प्रस्तावों के साथ सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने और प्रसंस्करण तूफान की कार्यप्रणाली पेश कैसे काम करता है में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए. आज़ादी से उपलब्ध आंधी प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ परीक्षण के नमूने के संयोजन से यह छवि गुणवत्ता और संकल्प के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्राप्त करने के लिए संभव है. इन मीट्रिक का उपयोग करके यह तैयारी, डाई चुनाव, बफर की स्थिति, और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स नमूने के लिए, प्रकाशिकी से इमेजिंग प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए तो संभव है. हम एकऐसी छवि अधिग्रहण और घनत्व के दौरान नमूना चाल 'mislocalization' घटना में उत्पन्न समस्याओं से संबंधित जहां पार्श्व बहाव के रूप में गरीब छवि गुणवत्ता में परिणाम है कि कुछ सामान्य समस्याओं का lso शो उदाहरण हैं.
Introduction
हाल ही में ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक की एक सीमा आमतौर पर विवर्तन सीमा बाईपास और 100 एनएम या 1,2 बेहतर के संकल्प के साथ छवियों को उत्पन्न कर सकते हैं जो सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी या nanoscopy, के रूप में भेजा, विकसित किया गया है. 2008 में वर्ष की प्रकृति के तरीके पद्धति होने के रूप में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की घोषणा के बाद से, स्थानीयकरण आधारित सूक्ष्मदर्शी के विकास का एक बड़ा सौदा किया गया है. उदाहरण के लिए, बहु रंग अनुप्रयोगों 3-6, 3 डी implementations 7-12, और यहां तक कि सेल रहते अनुप्रयोगों 5,13-17 कर रहे हैं. इन प्रणालियों सेल जीव के हाथों में प्रकाशिकी प्रयोगशालाओं से बाहर का वाणिज्यीकरण किया जा रहा है और अब अपनी राह बना रहे हैं इसके अलावा, जैव चिकित्सा सवाल उनके उपयोग और आवेदन में एक और वृद्धि होने की संभावना है.
इस परिवार की एक शाखा एक छवि अणु दर अणु को इमारत से काम जो स्थानीयकरण आधारित विधियों है. मैंकेवल कुछ स्थानिक से पृथक अणुओं किसी एक समय में सक्रिय हैं तो ऐसा करने के लिए n आदेश, नमूना के भीतर फ्लोरोसेंट अणु के बहुमत बंद किया जाना चाहिए. इन अणुओं फिर तेजी पर और बंद कर रहे हैं और आबादी का एक महत्वपूर्ण हिस्सा उप विवर्तन परिशुद्धता के साथ आधारभूत संरचना को प्रतिबिम्बित करने के लिए imaged है कि इतने सारे छवियों ले रहे हैं. दृष्टिकोण की संख्या GSDIM 18, पाम 19, fPALM 20, तूफान 21 और RESOLFT 22 सहित प्रकाशित किया गया है. एक अणु का पता लगाने की स्थिति को मापने के एल्गोरिदम कि तो उदाहरण के लिए rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 palm3d और आंधी 27, गाऊसी फिटिंग 23 का उपयोग करते हुए 20 एनएम से बेहतर precisions साथ अणु की वास्तविक स्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल या एक उच्च अणु घनत्व है जो अन्य जैविक नमूने, जब इमेजिंग, यह फ्रेम के हजारों के कई लेने के लिए इसलिए जरूरी हैयह spatially अलग, निमिष छवि के क्रम लेबल अणुओं का एक महत्वपूर्ण अनुपात में संकेत.
Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) और अत्यधिक संबंधित dSTORM और GSDIM तरीकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों जैविक 21 के साथ काम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है जो स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प तरीकों, कर रहे हैं. वे के बाद से क्योंकि विशिष्टता और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित immunolabeling दृष्टिकोण के सापेक्ष सुविधा की कार्यप्रणाली विशेष रूप से आकर्षक बना देता है जो विभिन्न रंगों की एक संख्या 28-30 पर लागू होना दिखाया गया है. नतीजतन, स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प इमेजिंग में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है जो डाई एंटीबॉडी और डाई बायोमोलिक्यूल conjugates, की एक श्रृंखला के लिए आसान पहुँच उपलब्ध है. तूफान और समान दृष्टिकोण के सामान्य सिद्धांतों अपेक्षाकृत सरल हैं, और पहली नजर में हार्डवेयर और नमूना तैयार अपेक्षाकृत रणनीति लगते Whilstightforward, उच्च गुणवत्ता, artifact मुक्त, सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो इस प्रक्रिया में कदम की एक संख्या हैं.
सभी माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ के रूप प्रक्रिया 3 मुख्य चरण में सोचा जा सकता है: पहला, दूसरा नमूना तैयार करने, छवि अधिग्रहण और, तीसरे, छवि प्रसंस्करण और / या छवि विश्लेषण और व्याख्या. अतिरिक्त बिजली को हल करने और एक स्थानीयकरण आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर सुपर संकल्प छवियों पैदा करने की विधि कुछ नई समस्याओं और विचारों 31-33 परिचय. Immunolabeling, एक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी संयोजन इस्तेमाल किया जाता है, जहां विशेष रूप से अप्रत्यक्ष immunofluorescence जब प्रदर्शन नमूना तैयार करने के साथ शुरू, यह फ्लोरोसेंट डाई दूर ब्याज के अणु से ऊपर 20 एनएम के लिए हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. सूक्ष्मनलिकाएं के मामले में, यह 25 एनएम 28,30 की एक उम्मीद microtubule व्यास के साथ तुलना में 35-50 एनएम के व्यास में यह परिणाम है. इसके अलावा, लेबलिंग घनत्व चाहिए एमएक उच्च गुणवत्ता छवि 14 उत्पन्न करने के क्रम में Nyquist मापदंड EET. एक filamentous संरचना के साथ 20 एनएम की एक अनुमानित छवि संकल्प के लिए उदाहरण के लिए कम से कम हर 10 एनएम 27 एक डाई अणु होना चाहिए. , पर संतुलन - कई रंगों स्थानीयकरण आधारित डाई के समग्र प्रदर्शन में कम से कम चार महत्वपूर्ण मापदंड, घटना स्विचन प्रति अर्थात् पता चला फोटॉनों (उज्जवल बेहतर है प्रत्येक झपकी की चमक) का मिश्रण है दृष्टिकोण के लिए काम करने के लिए प्रकाशित किया गया है, जबकि बंद कर्तव्य चक्र (राज्य पर बनाम बंद में रंगों के विपरीत अनुपात - बंद अधिक आम तौर पर बेहतर है), अस्तित्व अंश (एक कम विरंजन दर बेहतर है) और चक्र स्विचन की संख्या (फ्लोरोफोरे प्रति झपकाए की संख्या - अधिक फ्लोरोफोरे प्रति 1 झपकी) अणु गिनती प्रयोजनों के लिए एक लाभ हो सकता है, उच्च संकल्प के लिए बेहतर है. स्थिति आगे किसी भी डाई के लिए इन गुणों अलग बफर की स्थिति में भिन्नता है और कर सकते हैं कि इस तथ्य से जटिल हैलेजर शक्ति 28,29 साथ. इसके अलावा, के रूप में अच्छी तरह से इन अद्वितीय तूफान विचार के रूप में, छवि गुणवत्ता निर्धारण शर्तों के संशोधन और शमन अभिकर्मकों के उपयोग से autofluorescence कम करके उदाहरण के लिए अधिक पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक के रूप में एक ही रास्ते में नमूना तैयार करने के अनुकूलन के द्वारा सुधार किया जा सकता है. इसके अलावा, गैर विशेष रूप से बाध्य fluorophores को न्यूनतम लेबल सांद्रता, ऊष्मायन बार और अवरुद्ध और धोने कदम का समायोजन करके किया जा सकता है, जो महत्वपूर्ण है.
छवि अधिग्रहण के दूसरे चरण के लिए भी महत्वपूर्ण है. माइक्रोस्कोप पर इष्टतम सेटिंग्स डाई, बफर की स्थिति, लेबलिंग घनत्व, और नमूना प्रकार, कांच, कोशिकाओं या ऊतकों के नमूनों पर जैसे monolayers पर निर्भर करेगा. मुख्य कारणों कैमरा जोखिम समय, फ्रेम संख्या, रोशनी कोण (TIRF, हिलो, महामारी) और लेजर शक्ति हैं. लक्ष्य के रूप में जल्दी संभव के रूप में कई उज्ज्वल spatially अलग झपकाए जमा है. यदि पृष्ठभूमि मैंपुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म के रूप में सही रूप में पदों के स्थानीयकरण करने में सक्षम नहीं होगा, बहुत अधिक है या झपकाए, बहुत उज्जवल नहीं कर रहे हैं, दूसरे शब्दों में संकेत करने वाली शोर अनुपात गरीब है. के रूप में अच्छी तरह से मापा जा सकता है कि प्रत्येक अणु की स्थिति के साथ सटीकता यानी, स्थानीयकरण परिशुद्धता अधिकतम के रूप में, छवि गुणवत्ता भी localizations के एक उच्च संख्या पर निर्भर करता है. ब्याज के अणुओं की संख्या अपर्याप्त है imaged रहे हैं Nyquist मापदंड 14,27 मिले किया गया है नहीं होगा, या तो कारण गरीब लेबलिंग दक्षता, अत्यधिक photobleaching या एक अपर्याप्त फ्रेम नंबर करने के लिए, तो जिसके परिणामस्वरूप सुपर संकल्प छवि कबरा और टूटनेवाला हो जाएगा .
और अंत में, तीसरे चरण के लिए, इमेज प्रोसेसिंग, मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ तुलना में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यह डब्ल्यू पता करने के लिए भ्रमित किया जा सकता है कि में चुनाव के संदर्भ में एक फायदा है, और एक नुकसान यह है कि दोनों ही है जो स्वतंत्र रूप से और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एल्गोरिदम, की एक श्रृंखला हैhich उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त है. उदाहरण के लिए कच्चे डेटा स्थानिक अलग झपकाए अच्छी तरह से स्थान दिया गया है तो एक एकल अणु ढाले एल्गोरिथ्म आंधी 27 में उपलब्ध विरल फिटिंग एल्गोरिदम द्वारा उदाहरण के लिए, बेहद सटीक और कुशल हो सकता है, rapidSTORM 24,25, QuickPALM 26 सॉफ्टवेयर 12 palm3d और . कच्चे डेटा तो अधिक उपयुक्त हो सकता है जो एल्गोरिदम संकेतों अतिव्यापी का एक बहुत कुछ होता है DAOSTORM 34, 3 बी 35 और deconSTORM 36 में शामिल हैं. इसके अलावा, इन एल्गोरिदम ऐसे संकेत मायने रखता है, या झपकी प्रति फोटॉनों, साथ ही इस तरह के smoothed गाऊसी कार्यों के साथ visualizing के रूप में या सुपर संकल्प पिक्सेल आकार के हो सकते हैं, जहां पिक्सेल ग्रिड, साथ हिस्टोग्राम के रूप में विभिन्न अलग छवि प्रदर्शन विकल्प के रूप में विभिन्न मानदंडों के लिए थ्रेसहोल्ड होते उपयोगकर्ता द्वारा चयनित. इन विकल्पों में से सभी अंतिम छवि के स्वरूप को बदल और छवि व्याख्या और विश्लेषण के लिए निहितार्थ हैं.
27 और आम तौर पर पूरी चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) का माप लेने के लिए आदर्श संरचना प्रदानका एक रेशा संकल्प 37 के एक अनुभवजन्य अनुमान के रूप में दिया जाता है. यह स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में संकल्प फ्लोरोफोरे चमक, पृष्ठभूमि शोर और स्थानीयकरण घनत्व 27 के एक समारोह है और इन नमूना भर जरूरी स्थिर नहीं कर रहे हैं क्योंकि संकल्प नमूनों के बीच और एक ही नमूना भीतर छवियों के बीच होती है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. Actin filaments ऐसे mislocalizations के रूप में संभावित कलाकृतियों का प्रदर्शन और बहाव के लिए इस्तेमाल किया और वे आंधी के भीतर सॉफ्टवेयर सुविधाओं के साथ पहचाना जा सकता है कि कैसे कर रहे हैं. इसके अलावा, हम उपाय और सही बहाव दोनों को फ्लोरोसेंट मापकला मार्कर के उपयोग का वर्णन. और तीसरे, epidermal वृद्धि कारक (EGF) डाई conjugates के साथ कोशिकाओं के धुंधला हो जाना बताया गया है. कोशिका की सतह पर रिसेप्टर के अनुपात लगभग 50-150 n के उप विवर्तन आकार की संरचनाओं हैं जो vesicles, के माध्यम से endocytosis से होकर गुजरती है, क्योंकि EGF, सुपर संकल्प छवि के प्रदर्शन का एक उपयोगी सूचक प्रदान करता हैव्यास 27,38,39 में एम.
Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल के दौरान, सुझावों और सुझावों के कुछ चरणों का पालन पाए जाते हैं. "* 1" अंकन नोट 1 इसलिए इस पर विशेष कदम के लिए प्रासंगिक है, और कि इंगित करता है.
1. ग्लास का फ्लोरोसेंट dextran कोटिंग
- एक 8 कक्ष coverglass के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.01% पाली एल lysine समाधान के 200 μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए सेते हैं. कोई शेष तरल है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक विंदुक के साथ निकालें.
- एक 2 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान बनाने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार dextran-एलेक्सा 647 * 1 Reconstitute. इस से, एक 20 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए de-ionized पानी के 25 μl में 0.25 μl पतला.
- Dextran-एलेक्सा 647 समाधान के एक उच्च घनत्व कोटिंग बनाने के लिए de-ionized पानी के 200 μl के कुल में 20 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान के 20 μl पतला. एक मध्यम घनत्व समाधान के लिए de-ionized पानी (मूल शेयर समाधान से 1:10,000 कमजोर पड़ने) के 200 μl में 2 μl पतला. एक कम के लिएघनत्व समाधान de-ionized पानी (मूल शेयर समाधान से 1:100,000 कमजोर पड़ने) के 200 μl में 0.2 μl पतला.
- प्रत्येक अच्छी तरह से पतला dextran-एलेक्सा 647 के समाधान के 200 μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए सेते हैं. अब ऊष्मायन बार एक सघन dextran कोटिंग में हो सकता है जो इस्तेमाल किया जा सकता है. तीन बार निकालें और एच 2 ओ के साथ धोने * 2
नोट 1: अन्य dextran डाई conjugates इस्तेमाल किया जा सकता है. वांछित संयोजन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, तो unconjugated dextran भी रंगों को संयुग्मित किया जा सकता है.
नोट 2: प्रतिदीप्ति की एकरूपता में कमी आ सकती है, हालांकि एक ही dextran कक्षों सप्ताह की अवधि में reimaged जा सकता है. किसी भी बफर के अभाव में 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण की सिफारिश की है.
2. ग्लास पर फ्लोरोसेंट actin filaments
- चैंबर के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.01% पाली एल lysine समाधान के 200 μl जोड़ें और * 3 से 10 मिनट के लिए सेते हैं. फिर सेकोई तरल शेष है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक विंदुक के साथ चलते हैं.
- प्रत्येक कक्ष के लिए सामान्य actin बफर (निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठन) के 90 μl जोड़ें. (निर्माता के निर्देशों के अनुसार मेथनॉल के 1.5 मिलीलीटर में भंग जब 0.2 इकाइयों,) actin रेशा समाधान और 1 μl phalloidin-एलेक्सा 647 preformed 10 माइक्रोन के 10 μl जोड़ें और धीरे से ऊपर पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए. * 4 30 मिनट के लिए सेते हैं.
नोट 3: पाली एल lysine लेपित गिलास के लिए बाध्य कम filaments में चैम्बर परिणामों में रेशा समाधान की मात्रा बढ़ रही है.
4 नोट: 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 48 घंटे की ऊष्मायन बार अच्छे परिणाम के साथ परीक्षण किया गया है. एक कक्ष में यह अधिक से अधिक एक दिन के लिए ही नमूना उपयोग करने के लिए सिफारिश नहीं है तो बफर स्विचन को उजागर किया गया है एक बार actin रेशा छवि गुणवत्ता कमजोर होती जाती है.
3. मापकला मार्करों के रूप में microsphere फ्लोरोसेंट मोती
- एक इमेजिंग चेंबर में पतला मोती जोड़ें और * 5 से 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. समाधान निकालें और इमेजिंग के लिए पहले पीबीएस के साथ 3 बार धोएं.
5 नोट - कमजोर पड़ने और ऊष्मायन समय मोतियों की अलग घनत्व प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. 20.5 माइक्रोन प्रति 10 मोती एक्स 20.5 माइक्रोन क्षेत्र का दृश्य - यह प्रोटोकॉल आमतौर पर 3 के बीच में यह परिणाम है.
4. एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर सेल धुंधला
- Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में लगभग 80% confluency के लिए इमेजिंग कक्षों में संस्कृति HELA कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक.
- संस्कृति के माध्यम से निकालें और पीबीएस के साथ धो लो. फिर 10 मिनट के लिए 4% formaldehyde समाधान (4 मिलीग्राम 10% formaldehyde समाधान, 1 मिलीलीटर 10X पीबीएस, 5 मिलीलीटर पानी) के 500 μl जोड़ें. Formaldehyde निकालें और पीबीएस के साथ 3 बार धोएं. कोशिकाओं डी रहने के लिए अनुमति न देंRY और हमेशा उपयोग पीबीएस hypotonic तनाव से बचने के लिए समाधान बफर.
चेतावनी - formaldehyde अत्यंत विषैला होता है. उपयुक्त दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और लैब कोट पहना रहे हैं सुनिश्चित करें. Formaldehyde के निपटान के लिए स्थानीय दिशा निर्देशों की जाँच करें.
- एक 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्टॉक समाधान बनाने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार EGF-एलेक्सा 647 Reconstitute. (पीबीएस) में 0.1% BSA समाधान के 200 μl के लिए इस शेयर समाधान के 2 μl जोड़ें. कोशिकाओं से पीबीएस निकालें, EGF समाधान जोड़ने के लिए और 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- समाधान निकालें और 15 मिनट के लिए (पीबीएस) में 0.1% BSA के एक अवरुद्ध समाधान जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ 3 बार धोएं. इस निकालें और इमेजिंग के लिए पहले पीबीएस के साथ एक और 3 बार धोएं.
5. बफर तैयारी स्विचिंग
- Catalase की 10 μl (20 माइक्रोग्राम / एमएल), 1 एम Tris (2 carboxyelthyl) phosphine हाइड्रोक्लोराइड (4 मिमी), 2.5 एमएल ग्लिसरीन (50%) का 20 μl, 125 μl के साथ एक एंजाइम शेयर समाधान (ए) बनाओ1 एम KCl (25 मिमी) की, 1 एम 7.5 पीएच Tris-एचसीएल (20 मिमी) के 100 μl, 5 ग्लूकोज oxidase (1 मिलीग्राम / एमएल) की मिलीग्राम और diH20 साथ 5 एमएल मात्रा को ऊपर ऊपर. यह -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो 100 x 50 μl aliquots, बनाने के लिए पर्याप्त है.
- ) 4 जी ग्लूकोज (100 मिलीग्राम / एमएल), 4 मिलीलीटर ग्लिसरीन (10%) और 36 मिलीलीटर diH20 साथ एक ग्लूकोज स्टॉक समाधान (बी) बनाते हैं. 20 डिग्री सेल्सियस और अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए इस्तेमाल किया - इस पर भंडारित किया जा सकता है जो 100 x 400 μl aliquots, बनाने के लिए पर्याप्त है.
- विदेश मंत्रालय एचसीएल (1M) के 113.6 मिलीग्राम और DIH 2 0 से 1 मिलीलीटर के साथ एक कम करने एजेंट शेयर समाधान (सी) बनाते हैं. ताजा प्रयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और अप करने के लिए 1 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो 10 x 100 μl aliquots, (aliquots फ्रिज में नहीं है) बनाते हैं.
- बस इमेजिंग के लिए पहले, एंजाइम (ए), ग्लूकोज (बी) और अनुपात 50 μl में एक साथ एजेंट (सी) शेयर समाधान को कम करने, 400 μl, 100 μl मिश्रण और * 6 पीबीएस के साथ 1 मिलीलीटर के लिए बनाते हैं. इस बफर अब ऑक्सीजन मांजना और एक कम करने के वातावरण (100 मिमी विदेश मंत्रालय होगाएचसीएल) * 7. अंतिम पीएच सीमा 6.0 में होना चाहिए - 8.5 (समायोजन सामान्य रूप से आवश्यक नहीं है) * 8.
6 नोट - यह बफर ऐसे Cy5 और एलेक्सा 647 के रूप में carbocyanine आधारित रंगों के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त है.
7 नोट - अंतिम एंजाइम सांद्रता ग्लूकोज oxidase के 50 माइक्रोग्राम / एमएल (5 इकाई / एमएल) और Catalase की 1 ग्राम / एमएल (40-60 इकाइयों / एमएल) कर रहे हैं. enzymatic गतिविधि (यूनिट) आपूर्तिकर्ताओं द्वारा दिया जाता है और भिन्न हो सकते हैं. Catalase के लिए गणना कदम 5.4 के बाद 1 ग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता एंजाइम की 50 इकाइयों में शामिल होंगे मान रही है. इसी तरह ऑक्सीजन सफाई घटक सहित विभिन्न बफर रचनाओं 21,30,40 पाया जा सकता है. बफर और डाई संयोजन की एक सारांश के लिए संदर्भ 28,29 देखें. ग्लिसरीन और TCEP -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए आवश्यक हैं
8 नोट - इमेजिंग actin filaments टी स्थिर करने में मदद करने के लिए 2 मिमी 2 MgCl और 0.2 मिमी एटीपी जोड़ने अगरवह फिलामेंट्स.
6. (एलेक्सा 647 डाई का उपयोग) तूफान डेटा के माइक्रोस्कोप अधिग्रहण
- एक थर्मल संतुलन पर पहुंच जाने की अनुमति के लिए तूफान / पाम माइक्रोस्कोप, इमेजिंग से पहले अधिमानतः कम से कम 3 घंटे पर स्विच करें. इस से पहले इमेजिंग बहाव का एक बढ़ा मौका है.
- खुर्दबीन मंच नमूना धारक में इमेजिंग कक्ष डालें. नमूना धारक में मजबूती है और फ्लैट है कि सुनिश्चित करें.
- इमेजिंग कक्ष से पीबीएस निकालें और फिर स्विचिंग बफर के साथ शीर्ष पर भरें. सावधानी से करें कि कोई बुलबुले में सब कुछ कर रहे हैं कि और पूरे चैम्बर कवर किया जाता है, जिससे चैंबर के शीर्ष पर एक coverslip जगह. किसी भी बुलबुले में देखा जाता है, तो अतिरिक्त बफर या पीबीएस के साथ शीर्ष अन्यथा प्रदर्शन अस्वीकार कर सकते हैं बफर.
चेतावनी - उद्देश्य लेंस के संबंध में नमूना के पार्श्व और अक्षीय बहाव की संभावना को कम करने के लिए यह नमूना और बफर संतुलित करने के लिए छोड़ दिया जाता है की सिफारिश की हैइमेजिंग के लिए पहले कम से कम 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर.
- Imaged किया जा करने के लिए ब्याज की एक फ्लोरोसेंट संरचना का पता लगा. इस सेल के नमूने के लिए विशेष रूप से लाभ की है जो बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश, कम से कम संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार के रूप में इस मामले में रोशनी के वांछित कोण, एक TIRF या अत्यधिक झुका कोण का चयन की सिफारिश की है. पूर्व तूफान इमेजिंग के लिए संरचना का एक संदर्भ विवर्तन सीमित छवि ले लो.
- लगभग 2 किलोवाट / 2 सेमी, इसी लिए एक उच्च शक्ति के लिए (लगभग 640 एनएम का एक उपयुक्त उत्तेजना तरंगदैर्ध्य) के साथ उत्तेजना लेजर बढ़ाएँ whilst के 10 मिसे जोखिम का कैमरा सेटिंग और लगभग 50 हर्ट्ज की एक समय चक्र के साथ इमेजिंग (फ्रेम प्रति सेकंड) . Fluorophores (सबसे नमूने के लिए शायद 10 सेकंड के भीतर) एक विरल निमिष पैटर्न में परिवर्तित किए जाने के बाद * 9 10,000 फ्रेम इकट्ठा.
9 नोट - 10,000 फ्रेम यहाँ वर्णित नमूनों के लिए उपयुक्त हैलेकिन यह अन्य नमूनों के लिए 50,000 या अधिक करने के लिए फ्रेम संख्या को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
7. कच्चे डेटा से सुपर संकल्प छवियों के पुनर्निर्माण (आंधी का प्रयोग करके)
- MATLAB के भीतर से rainSTORM.m फ़ाइल को खोलने और (चित्रा 1 ए) चलाते हैं.
- आंधी खिड़की (चित्रा 1 बी) में ब्राउज़ करें बटन का उपयोग कर विश्लेषण किया जा करने के लिए छवि फ़ाइल का चयन करें. यह एक. TIF फ़ाइल (ImageJ एक TIF स्वरूप में अन्य फ़ाइल प्रकार परिवर्तित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) होना चाहिए. * 10 डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप प्रणाली के कच्चे डेटा मिलान करने के लिए पिक्सेल चौड़ाई बदल. डिफ़ॉल्ट करने के लिए अन्य मूल्यों छोड़ दें.
10 नोट - छवि पर पिक्सेल आकार 160 एनएम हो जाएगा एक 100X उद्देश्य लेंस के साथ एक सिस्टम पर तो एक ठेठ EMCCD कैमरा 16 माइक्रोन का एक पिक्सेल आकार की है. वाणिज्यिक प्रणालियों पर पिक्सेल आकार आमतौर पर सॉफ्टवेयर के भीतर प्रदर्शित किया जाता है. पिक्सेल आकार सबसे स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी के लिए 100 एनएम और 160 एनएम के बीच बदलती हैं.
- 'प्रक्रिया छवियों' बटन दबाएँ और एक प्रारंभिक छवि प्रकट होने तक प्रतीक्षा करें. प्रसंस्करण की अवधि फ़ाइल आकार, कंप्यूटर विनिर्देश और * 11 कच्चे डेटा भीतर उम्मीदवार झपकाए की संख्या पर निर्भर करेगा.
नोट 11 - actin और EGF डेटा के 10,000 फ्रेम दृश्यों एक इंटेल Xeon E5420 सीपीयू के साथ एक पीसी का उपयोग क्रमश प्रक्रिया करने के लिए 23 सेकंड और 25 सेकंड लिया. Matlab में एक समानांतर प्रसंस्करण उपकरण बॉक्स के बिना ही कंप्यूटर का उपयोग, या एकाधिक कोर प्रसंस्करण के बिना एक कंप्यूटर के साथ, बार क्रमश: 66 सेकंड और 81 सेकंड थे.
- एक अद्यतन सुपर संकल्प छवि प्रेस 'ओपन समीक्षक' बटन उत्पन्न करने के लिए और एक दूसरी खिड़की (चित्रा 1C) दिखाई देगा. (चित्रा -1) के रूप में वांछित छवि प्रदर्शन बदलने के क्रम में 'विपरीत समायोजित' बटन दबाएँ. कुछ मामलों में, छवि बहुत अंधेरा है, जहां अधिकतम मूल्य कम किया जाना चाहिए.
- राजस्व का प्रयोग करेंउपयोगी छवि गुणवत्ता मैट्रिक्स पैदा करते हैं और आगे सुपर संकल्प छवि को निखारने के लिए iewer खिड़की (चित्रा 1C). क्रमश: 4000, 0.1 और 0.8-2.0 के मूल्यों * 12 के लिए पहले तीन गुणवत्ता नियंत्रण के मानकों सेट. या तो एक फोटान अंशांकन माप या एक विशेष EM लाभ की स्थापना के लिए कैमरा निर्माता द्वारा निर्दिष्ट फोटोन वक्र अंशांकन वक्र मूल्यों के प्रयोग पर आधारित होना चाहिए जो फोटॉन मूल्य, प्रति मायने रखता अद्यतन. यह सही सटीक और * 13 संकल्प माप प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
12 नोट - सिग्नल गिनता चमक मानदंडों के आधार पर झपकाए को खारिज कर दिया. मूल्य उज्जवल उच्च झपकी अंतिम छवि में एक स्थानीयकरण के रूप में स्वीकार बनने के लिए होना चाहिए. इस डाई और जोखिम समय और कैमरे की संवेदनशीलता का फोटॉन उत्पादन के आधार पर बदला जा करना पड़ सकता है. संकेत और फिट गाऊसी यानी डी के बीच महत्वपूर्ण वर्ग त्रुटि है सहिष्णुता झपकाए को खारिज कर दियाouble चोटियों. पीएसएफ के फिट चौड़ाई इस सीमा से बाहर निहित है अगर पीएसएफ सिग्मा रेंज झपकाए को खारिज कर दिया, यानी एक परिमित सीमा से बाहर का ध्यान केंद्रित संकेतों और निरंतर प्रतिदीप्ति की बड़ी एकत्रित चारों को अस्वीकार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक व्यापक रेंज का उपयोग कर अंतिम छवि में दिखने mislocalization कलाकृतियों में हो सकता है. अभ्यास में, यह स्थानीयकरण परिशुद्धता कटऑफ पैरामीटर का उपयोग प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन करने की सिफारिश की है.
13 नोट - संकल्प मेट्रिक्स पर अधिक के लिए संदर्भ 23,27 देखें. प्रत्येक द्वारा उत्पादित फोटॉनों की संख्या यह प्रत्येक स्थानीयकरण का स्थानीयकरण सटीक गणना करने के लिए और फलस्वरूप समग्र पूरी छवि के लिए सटीक अनुमानों मतलब निकाले संभव है झपकी जानने के द्वारा संक्षेप में. फोटॉन मूल्य 200 प्रति गिनती के एक लाभ की स्थापना के साथ एक Andor iXon ड्यू 897E का प्रयोग 9.04.
- मतलब स्थानीयकरण संक्षिप्त अनुकूलन के बीच tradeoff स्थानीयकरण सटीक कटौती (चित्रा 1C) को बदलअंतिम छवि में स्थानीयकरण संख्या खिलाफ आयन. 30-50 एनएम के मान डेटा की गुणवत्ता और नमूना के आधार पर सिफारिश की है. Histograms और info.txt फाइल में यह निर्णय (आंकड़े 1F और 1G) को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पुनर्निर्माण पैमाने कारक (चित्रा 1C) स्वतः मूल छवियों में पिक्सेल चौड़ाई 160 एनएम है यह सोचते हैं कि 32 एनएम के सुपर संकल्प पिक्सल उत्पन्न होगा, जो 5 है. कच्चे छवियों 100 एनएम के एक पिक्सेल आकार है, तो यह 20 एनएम का पिक्सल के साथ सुपर संकल्प छवियों का उत्पादन होगा. * 14 अंतिम छवि में छोटे सुपर संकल्प पिक्सल का उत्पादन करने के लिए पैमाने कारक बढ़ाएँ.
नोट 14 - स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी का संकल्प (एक सरल हिस्टोग्राम पुनर्निर्माण के पिक्सेल आकार अर्थात्) दृश्य के रूप में भी स्थानीयकरण परिशुद्धता के लिए आवश्यक समरेखण पर निर्भर करता है. अभ्यास में, पुनर्निर्माण पिक्सेल आकार आमतौर स्थानीयकरण से कम होना चाहिएप्रेसिजन (जानकारी पाठ फ़ाइल में सटीक मतलब अनुमान लगाएं मीट्रिक देख - 6.11 और 6.12 कदम). इस मामले में कारण पुनर्निर्माण पिक्सेल आकार करने के संकल्प के नुकसान 23,27 छोटा हो जाएगा. उदाहरण के लिए पंक्ति और चित्रा 4E के स्तंभ दिशा में सटीक मतलब अनुमान के 16.1 एनएम और 16.2 एनएम हैं. 16 एनएम के एक पिक्सेल आकार (160 एनएम का एक मूल पिक्सेल चौड़ाई के साथ 10 के पुनर्निर्माण के पैमाने कारक) इस डेटा कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
- उदाहरण के लिए, कच्चे डेटा के सबसेट के लिए पुनर्निर्माण को प्रतिबंधित करने की सीमा फ्रेम रेंज (चित्रा 1C) सुधारे [2001-INF] कच्चे डेटा की प्रारंभिक 2,000 फ्रेम बाहर होता.
- एक अद्यतन सुपर संकल्प छवि (चित्रा 1E) उत्पन्न करने के लिए 'भागो समीक्षक' बटन (चित्रा 1C) प्रेस.
- छवि गुणवत्ता मैट्रिक्स (चित्रा 1F) * 15 प्रदर्शित करने के लिए, 'देखें Histograms' बटन (चित्रा 1C) प्रेस. नोट 15 - कैमरे के फ्रेम संख्या और नीचे सही (चित्रा 1F) में थॉम्पसन स्थानीयकरण Precisions हिस्टोग्राम के खिलाफ स्वीकार localizations की संख्या चित्रण शीर्ष सही में ग्राफ स्थानीयकरण परिशुद्धता कटऑफ समीक्षा विकल्प को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक 50 एनएम कटऑफ का उपयोग कर अंतिम सुपर संकल्प छवि में शामिल किया जा रहा से भी बदतर परिशुद्धता के साथ सभी localizations बाहर होता.
- इस डेटा के सभी * 16 को बचाने के क्रम में समीक्षक (चित्रा 1C) में 'सेव छवि' बटन दबाएँ.
- 7.6 कदम है और अगर वांछित अलग समीक्षक मानकों के साथ बाद के चरणों को दोहराने के लिए डेटा का परीक्षण करने के बाद (जैसे Info.txt फ़ाइल और histograms) वापसी. कदम 7.11 में 'सेव छवि' दबाने पहले से बचाया डेटा लिख देगा.
- सामान्य तरीके से एक छवि उत्पन्न करने के लिए 7.9 - कदम 7.1 का पालन करें.
- समीक्षक (चित्रा 1C) में 'बॉक्स ट्रैकिंग' बटन दबाएँ और क्लिक करें और समीक्षा की छवि पर ब्याज की असंदिग्ध मार्कर या संरचना पर एक बॉक्स खींचें.
- एक नई छवि दिखाई देती है जब तक 'बॉक्सिंग पोजिशन' (उदाहरण के लिए आंकड़े 6B, 6C और 6F देखें) प्रदर्शित करेगा, जो रुको. अगर वांछित इस छवि को बचाने.
- ब्याज की वस्तु एक विश्वस्त मार्कर है तो सुधार बहाव 'उप द्वारा पीछा' सेट एंकर 'बटन पर क्लिक करके किया जा सकता हैपथ के बहाव 'बटन. अंत में 'भागो समीक्षक' फिर अब सभी localizations मापकला मार्कर पदों के हिसाब से सही किया होगा, जो एक नया तूफान छवि उत्पन्न करने के लिए क्लिक करें. मनका पदों अंतिम समीक्षा की छवि से नष्ट हो जाती हैं.
- अंतिम बहाव सही छवि के भीतर अन्य विश्वस्त मार्करों हैं, तो इन 'बॉक्स ट्रैकिंग' दबाकर हटाया जा सकता है, 'बॉक्सिंग हटाएँ' और फिर वांछित के रूप में 'भागो समीक्षक' के रूप में कई बार.
16 नोट - 3 और 5 के बीच फ़ाइलें (राशि छवि, STORMdataImage, STORMprocessed, जानकारी और hists) चयनित विकल्पों के आधार पर बचाया जा सकता है, चित्रा 1G देखें. तूफान संसाधित छवि संशोधित विपरीत और रंग नक्शे के साथ प्रदर्शित किया जाता है. STORMdataImage प्रत्येक पिक्सेल के ग्रे स्तर सुन्न के बराबर होती है, एक स्केल छवि हैयह भीतर की पहचान की गई जो localizations के एर.
8. बॉक्स ट्रैकिंग और बहाव सुधार (आंधी का प्रयोग करके)
Representative Results
Dextran
Dextran के एक सफल कोटिंग एक फ्लोरोसेंट monolayer का उत्पादन करना चाहिए. उच्च एकाग्रता में यह अपेक्षाकृत समान दिखाई देनी चाहिए. कम सांद्रता में यह (2A चित्रा) sparser दिखाई देगा. कई तूफान / पाम सूक्ष्मदर्शी TIRF को epifluorescence से रोशनी का कोण बदलने की क्षमता है. एक ठेठ EMCCD कैमरे पर 512 x 512 पिक्सल पर उदाहरण के लिए, एक पूर्ण फ्रेम कैमरा दृश्य का उपयोग करते हैं, तो एक भी रोशनी मनाया जाना चाहिए. किसी भी धारियों या बाहर का ध्यान केंद्रित क्षेत्रों रहे हैं, तो यह नमूना उद्देश्य लेंस पर ताजा तेल से नमूना धारक में reinserted किया जाना चाहिए कि संकेत कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से यह माइक्रोस्कोप के साथ एक समस्या का संकेत हो सकता.
सुपर संकल्प कच्चे डेटा प्राप्त जब इमेजिंग लेजर लगभग 2 किलोवाट / 2 सेमी तक सत्ता में वृद्धि की जानी चाहिए. Fluorophores में संचालित कर रहे हैं के रूप में निमिष द्वारा पीछा प्रतिदीप्ति का एक प्रारंभिक फट हो जाएगाअस्थायी अंधेरे राज्यों को. उच्च dextran पर झपकाए विशेष रूप से छवि अधिग्रहण की शुरुआत के पास, ओवरलैप की संभावना है घनत्व (वीडियो) 1. मध्यम और कम घनत्व में इन झपकाए यानी spatially अलग, विरल होना चाहिए, और कोई स्पष्ट पृष्ठभूमि के साथ ध्यान केंद्रित करने में (चित्रा 2A, वीडियो 2 और 3 फ्रेम 2,000, 5,000 और 8,000 देखें). इस छवि अधिग्रहण चरण के दौरान, निरंतर लेजर रोशनी में, झपकाए की संख्या (उच्च घनत्व नमूना, चित्रा 2A में फ्रेम 8000 के साथ सीमा 2,000 तुलना) समय के साथ कम हो जाएगा. विभिन्न dextran सांद्रता (उच्च, मध्यम और कम) की विभिन्न सुपर संकल्प छवियों के बीच मुख्य अंतर localizations के घटते संख्या (आंकड़े 2A और 2 बी) है. दूसरे शब्दों में, फ्लोरोसेंट अणु की एकाग्रता, कच्चे डेटा में झपकाए की संख्या और localizations की संख्या एक आनुपातिक रिश्ता है. इस संबंध,हालांकि, बहुत अधिक अणु में के रूप में (, चित्रा -2 लाल और नीले रंग की लाइनों की तुलना) सॉफ्टवेयर सफलतापूर्वक अणुओं स्थानीयकरण करने में असमर्थ है घनत्व एक सरल रेखीय नहीं है. इस के लिए कारण प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर झपकाए गैर विरल हैं जहां गाऊसी फिटिंग कलन विधि का उपयोग पदों को फिट करने के लिए उच्च एकाग्रता में यह संभव नहीं है कि है. झपकाए कारण वे (आंकड़े 2A और 2C) विरल होने के रूप में सॉफ्टवेयर अधिक से झपकाए के अधिक फिट कर सकते हैं photobleaching के लिए अधिग्रहण चरण के माध्यम से कमी के रूप में. इसके अलावा, व्यक्तिगत डाई अणु झपकी सकता है, और इसलिए अधिक 28,41,42 एक बार से स्थानीयकृत किया.
इन नमूनों के किसी भी है, लेकिन विशेष रूप से उच्च घनत्व dextran एक इमेजिंग जब एक आम समस्या है, तेजी से तूफान छवि अधिग्रहण चरण के दौरान diffusing प्रतीत होता है कि उज्ज्वल लेकिन अनफोकस्ड फ्लोरोसेंट धुन्ध की मौजूदगी हो सकती है. इस पर उच्च विपरीत fluorophores से अलग है(चित्रा 3 ए, वीडियो 5) निमिष देखा जा सकता है जो कांच की सतह,. ये अलग फ्लोरोसेंट अणु पूर्व स्विचिंग बफर जोड़ने के लिए पीबीएस के साथ धोने के कदम की संख्या को बढ़ाने के द्वारा या चैम्बर (चित्रा 3 बी, वीडियो 6) को ताजा स्विचिंग बफर जोड़ने से रोका या हटाया जा सकता है. प्रसंस्करण और localizations की संख्या और वे (आंकड़े -3 सी, 3 डी, 3E झपकाए स्थानीय बनाना सॉफ्टवेयर का लगाया जा सकता है जिसके साथ सटीक दोनों में कमी है जो बहुत अलग सुपर संकल्प छवियों में प्रत्येक छवि अनुक्रम परिणामों से डेटा की तुलना और 3F).
Actin filaments
Preformed actin filaments विवर्तन सीमित इमेजिंग (चित्रा -4 ए-4C) द्वारा कांच की सतह के लिए अटक देखा जा सकता है. तंतुओं की संख्या बहुत कम दिखाई देता है, तो एक लंबी ऊष्मायन समय इस्तेमाल किया या actin की मात्रा में कमी की जा सकती हैरेशा समाधान भी मदद करता है. बेहतर गुणवत्ता के चित्र में एक अपेक्षाकृत उज्ज्वल filaments (चित्रा 4D) के बजाय उलझ क्षेत्रों के परिणाम का चयन. अधिग्रहण के चरण के दौरान, उज्ज्वल में फोकस झपकाए रेशा की लम्बाई (वीडियो 7) के साथ देखा जाना चाहिए. विरल निमिष अधिग्रहण चरण के दौरान देखा जाना चाहिए और फिर बाद में संसाधित डेटा में एक पतली रेशा निरंतर (चित्रा 4E) होना चाहिए और फ्रेम प्रति localizations चाहिए चित्रा 3E में विपरीत एक क्रमिक गिरावट (चित्रा 4F),.
निमिष यदि गैर विरल है, या सॉफ्टवेयर अणुओं स्थानीयकरण करने में सक्षम नहीं किया जा रहा है, तो एक और अधिक सूक्ष्म विरूपण साक्ष्य, एक mislocalization 32 कहा जाता है, परिणाम कर सकते हैं. सॉफ्टवेयर मूविंग दो अतिव्यापी अणुओं की स्थिति और स्थानीयकरण उन दोनों के बीच की स्थिति के मध्य तरीका है जब यह पैदा होता है. BLI ओवरलैपिंग की एक महत्वपूर्ण संख्या वहाँ नहीं किया गया है कि एक संकेत हैnks, और फलस्वरूप mislocalizations, सटीक मतलब अनुमानों पंक्ति और स्तंभ दिशाओं, यानी क्षैतिज और खड़ी में ही होना चाहिए, mislocalizations रहे हैं जहां इन रेशा की लंबाई के साथ हुआ होगा, उत्पादन एक सामान्य पलक (से बड़ा यानी फलस्वरूप दिशाओं में कम शुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया गया है, जो होगा) अधिक पिक्सल में फैल गया. वहाँ इमेजिंग क्षेत्र में एक भी actin रेशा है और यह क्षैतिज या खड़ी झूठ बोल रहा है जहां यह सबसे अधिक आसानी से देखा जाता है. इस मामले में, तूफान माइक्रोस्कोप, दोनों दिशाओं में 16 एनएम के एक सटीक मतलब हासिल की. यह एक सटीक सीमा, लगभग 34 एनएम का प्रभावी छवि संकल्प का एक उपाय में यह परिणाम है. हम हम छवि का संकल्प अनुमान लगाने के लिए FWHM का एक उपाय ले जा सकते हैं बहुत छोटे phalloidin-एलेक्सा 647 लेबल के साथ एक समान व्यास, 7 एनएम के एक filamentous संरचना के रूप में इन मेट्रिक्स, तथापि, आंधी 27 द्वारा प्रदान की जाती हैं. नाटकीय रूप सेविंग साजिश प्रोफाइल सुविधा (चित्रा 4H) का उपयोग करते हुए और बाद में FWHM 43.2 एनएम के रूप में गणना की है एक गाऊसी फिट (चित्रा 4I) प्रदर्शन ImageJ (चित्रा 4 जी) में सुपर संकल्प छवि का फिलामेंट के माध्यम से एक सीधी रेखा,. इस माप का प्रयास करते समय हम पिक्सेल आकार (info.txt फ़ाइल चित्रा 1G देखें) मैच या छवि के लिए सटीक मतलब अनुमान से थोड़ा छोटा होना चाहिए कि सलाह देते हैं. इस मामले में, 16 एनएम पिक्सल एक छवि को फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
दो संबंधित समस्याओं निमिष fluorophores एक ही समय में लगभग 250 एनएम झपकी भीतर गैर विरल, यानी व्यक्तिगत अणुओं बन गया है और इसलिए संकेतों ओवरलैप जहां तूफान के साथ हो सकता है. पहले एल्गोरिथ्म और इसे इस्तेमाल करता गुणवत्ता नियंत्रण मापदंड के आधार पर, झपकाए सब पर स्थानीयकृत नहीं किया जा सकता है. यह कम या कोई localizations के साथ सुपर संकल्प छवियों में यह परिणाम है. की दूसरी समस्यादो झपकाए एक भी झपकी के रूप में प्रदर्शित करने के लिए एक दूसरे के लिए पर्याप्त करीब हुई जब mislocalizations होता है. इस मामले में अंतिम छवि में स्थिति दो की एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है. इस पर और अधिक विस्तार के संदर्भ में 32 देखें. दोनों ही मामलों में यह बहुत ही उच्च घनत्व के नमूने, अपर्याप्त लेजर शक्ति के साथ या बफर समस्याओं स्विचन साथ हो सकता है. Actin filaments के एक नंबर शाखाओं में बंटी और / या (आंकड़े 5 ए डी, वीडियो 9) एक दूसरे को पार कर रहे हैं जहां यह समस्या स्पष्ट है. फ्रेम के सबसेट प्रसंस्करण, और पहली और आखिरी 5,000 फ्रेम की तुलना करके हम एक अलग परिणामस्वरूप छवि देख सकते हैं. पहले 5,000 फ्रेम (चित्रा 5C) का उपयोग करते हुए सुपर संकल्प छवि में हम छवि के बीच में कई localizations पिछले 5000 फ्रेम का उपयोग करते समय हालांकि, इनमें से बहुत कुछ स्पष्ट कर रहे हैं और हम साथ छोड़ दिया जाता है, वहाँ देख सकते हैं कि बस filaments, imag में localizations की कम संख्या हेतु से कुछ हद तक टूटनेवाला यद्यपिई (चित्रा 5D). एक भी उच्च निमिष घनत्व संदिग्ध है फ्रेम डेटा प्रति स्थानीयकरण के साथ छवियों की तुलना दृढ़ता से यह समस्या उत्पन्न हो रही है सुझाव है कि कर सकते हैं, फ्रेम के पहले सेट के दौरान अंतिम सेट के साथ तुलना में 10 से अधिक के फ्रेम प्रति localizations के एक औसत संख्या है यह लगभग 4 (चित्रा 5E) है, जहां फ्रेम की. Imaged किया जा अणुओं की एक बड़ी संख्या में हैं, तो यानी एक उच्च घनत्व नमूना के लिए, यह जरूरी है, हालांकि यह संभव के रूप में सीमा के अनुसार कुछ localizations के लिए आदर्श है से होने वाली mislocalizations की संभावना कम करने के लिए है कि अधिग्रहण की एक बड़ी संख्या फ्रेम बहाव है जो तूफान माइक्रोस्कोपी में एक और समस्या के लिए अग्रणी लिया जाना.
बहाव पार्श्व - actin filaments और मापकला मार्करों
बहाव तब होता है जब डाटा अधिग्रहण चरण के माध्यम से उद्देश्य लेंस के संबंध में नमूना चाल. इस ड्यूरिन को देखने के लिए मुश्किल या असंभव हैजी छवि अधिग्रहण चरण, यह आम तौर पर अपेक्षाकृत स्थिर माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए कई मिनट के पाठ्यक्रम पर कम से कम 50 एनएम है के रूप में यह विशेष रूप से, मापा जा रहा है, जब तक यह नहीं बल्कि अक्षीय, या से पार्श्व है, खासकर अगर. हालांकि, इस तरह अच्छी तरह से परिभाषित संरचना के साथ actin filaments के रूप में जाना जाता संरचनाओं का खंगाला छवियों में, यह सुपर संकल्प छवियों में पता लगाया जा सकता है. पार्श्व बहाव हुआ हो सकता है कि पहला संकेत संरचना 67 एनएम के साथ तुलना में इस मामले में, आंधी से सटीक सीमा आंकड़ों के साथ तुलना में एक अपेक्षाकृत बड़े FWHM साथ उदाहरण के लिए (चित्रा 6A, वीडियो 8) 90 एनएम उम्मीद से भी बड़ा है. हालांकि, बहाव का पता लगाने के लिए एक बेहतर तरीका बाद फ्रेम में localizations जल्दी फ्रेम में उन लोगों के साथ तुलना में विस्थापित कर रहे हैं यानी अगर देख, समय के एक समारोह के रूप में localizations तुलना द्वारा है. यह स्पष्ट रूप से बहुत छोटा है और एक समान संरचना के हैं जो actin filaments, के मामले में देखा जा सकता है जबबॉक्स ट्रैकिंग सुविधा आंधी में (आंकड़े 6B और 6C) का उपयोग कर एक रंग कोड के साथ प्रदर्शन किया.
बहाव एक अच्छी तरह से पहचाना समस्या है और 19 उसे कम से कम या यह अधिग्रहण के बाद या तो असंदिग्ध मार्करों 21,43 या पार सहसंबंध 44 का उपयोग कर सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि रणनीति का एक नंबर रहे हैं. बहाव और इसके लिए सही उपाय करने के लिए, 100 एनएम व्यास का फ्लोरोसेंट मोती मापकला मार्कर (चित्रा 6D) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. वे छोटे और चमकदार होते हैं, क्योंकि उनकी स्थिति सही ऐसी आंधी के रूप में गाऊसी फिटिंग एल्गोरिदम का उपयोग कर उपाय किया जा सकता है. 3 मिनट 10 सेकंड के पाठ्यक्रम पर लगभग 100 एनएम का अपेक्षाकृत गंभीर बहाव है, जहां एक उदाहरण में, अधिग्रहण चरण (चित्रा 6E) के दौरान ही बॉक्स ट्रैकिंग सुविधा रंग कोड के लिए इस्तेमाल किया और चित्रा (6F कि बहाव हुई पुष्टि की जा सकती है ). इस उदाहरण में सभी चार मोती के पास समान बहाव को दिखाने के रूप में यह पी हैसंदर्भ के रूप में इस्तेमाल करते हैं और अन्य मोती (चित्रा 6G) से बहाव घटाना, इस मामले मनका 2 में उनमें से एक को चुनने के लिए ossible. यह तो आधारभूत संरचना अज्ञात या कहीं अधिक चर एक actin रेशा या एक फ्लोरोसेंट मनका से है, जहां किसी भी बहाव मापने के लिए और सही करने के लिए संभव हो जाता है ब्याज की एक जैविक नमूने के विश्वस्त मार्करों जोड़ कर.
एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर
अंत में, EGF से सना हुआ HELA कोशिकाओं कोशिकाओं (चित्रा 7A, वीडियो 10) में छवि संकल्प के लिए एक वास्तविक उदाहरण देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे coverglass के पास कोशिका की सतह पर विमान का ध्यान केंद्रित में EGF प्रतिदीप्ति का बहुमत होना चाहिए के रूप में इन कोशिकाओं की छवि को अपेक्षाकृत सरल हैं. कम चमकदार क्षेत्र केन्द्र में नाभिक की स्थिति से मेल खाती है. TIRF रोशनी सेल मीटर के कुछ हिस्सों से आने वाले बाहर के फोकस प्रतिदीप्ति को नष्ट करने से छवि गुणवत्ता बढ़ा सकते हैंembrane ग्लास (कोशिकाओं में लगभग 150 एनएम प्रवेश) के पास. विवर्तन सीमित छवि में हित के क्षेत्रों में तेजी से बढ़ी नहीं (आंकड़े 7B और 7C) आम तौर पर अस्पष्ट हैं, लेकिन सुपर संकल्प छवियों में एक मिश्रण होना चाहिए समूहों और सामयिक पृथक एकल पिक्सेल (आंकड़े 7D-7F) के. ये कोशिका की सतह या गैर विशिष्ट बंधन के संभावित एक छोटी राशि पर अलग EGF रिसेप्टर्स या तो का प्रतिनिधित्व करेंगे. समूहों व्यास में लगभग 100 एनएम और बनाने गड्ढ़े और vesicles, EGF मुख्य रूप से नीचे विनियमित और endocytosed है जो के माध्यम से मार्ग के अनुरूप होने की संभावना है जाएगा. विशिष्ट सटीक मतलब का अनुमान लगभग 45 एनएम के एक सटीक सीमा के साथ नमूना के इस प्रकार के करीब 20 एनएम हैं. यह प्रभावी संकल्प के इस सटीक सीमा उपाय मापकला मार्कर के साथ मापा जा सकता है जो खाता लेबल आकार, या किसी भी बहाव में नहीं ले करता है कि विख्यात है, लेकिन अभी भी notic है किया जाना चाहिएसमूहों या चित्रा 6 में उल्लिखित और प्रोटोकॉल धारा 8 में वर्णित के रूप में बॉक्स ट्रैकिंग सुविधा का उपयोग करने पर "धूमकेतु की पूंछ" द्वारा eable.
| घटक | अंतिम एकाग्रता |
| Catalase | 1 ग्राम / एमएल (50 इकाइयों) |
| ग्लूकोज | 40 मिलीग्राम / मिलीलीटर |
| ग्लूकोज oxidase | 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर |
| तेल से निकाला हुआ एक सत्त्व | 12.50% |
| KCl | 1.25 मिमी |
| विदेश मंत्रालय एचसीएल | 100 मिमी |
| TCEP | 200 माइक्रोन |
| Tris | 1 मिमी |
तालिका 3. बफर स्विचिंग
| ठेठ अधिग्रहण सेटिंग्स | मूल्य |
| पिक्सेल आकार (एनएम) 160 | |
| एक्सपोजर समय (मिसे) | 10 |
| लाभ | 200 |
| फ्रेम आकार (पिक्सेल) | 128 X 128 |
| समय चक्र (एफपीएस) | 52.5 |
| फ्रेम संख्या | 10,000 |
| 640 एनएम लेजर शक्ति घनत्व (किलोवाट / 2 सेमी) | 2 |
तालिका 4. अधिग्रहण सेटिंग्स
चित्रा 1. आंधी का प्रयोग तूफान छवि पुनर्निर्माण. (ए) MATLAB भीतर से आंधी खोलना. (बी) आंधी ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई). (सी) आंधी समीक्षक जीयूआई. (डी) के विपरीत खिड़की को समायोजित करें. (ई) की समीक्षा और विपरीत समायोजन के बाद तूफान छवि. (एफ) उनकीछवि गुणवत्ता मैट्रिक्स की tograms. समीक्षक जीयूआई में छवि बटन को बचाने दबाने के बाद उत्पन्न (जी) फ़ाइलें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. (ए) विवर्तन सीमित (डीएल) छवियों dextran पूर्व तूफान इमेजिंग के विभिन्न सांद्रता दिखा. सुपर संकल्प (एसआर) छवि पुनर्निर्माण 25 एनएम के एक पिक्सेल आकार की है. 10,000 छवियों एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार और व्यक्तिगत फ्रेम (2,000, 5,000, 8,000) कि अनुक्रम से दिखाए जाते हैं के साथ एकत्र किए गए थे. प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर एक 10 मिसे जोखिम समय के साथ हासिल कर ली. छवियाँ 160 एनएम के एक पिक्सेल आकार की है. एक 0.1% पिक्सेल संतृप्ति विपरीत वृद्धि देखने की स्पष्टता के लिए ImageJ का उपयोग लागू किया गया था. सटीक मतलबअनुमान के 28 एनएम (उच्च), 24 एनएम (मध्यम) और विभिन्न dextran छवियों के लिए (कम) 16 एनएम हैं. स्थानीयकरण घनत्व माइक्रोन 2 (उच्च) प्रति 724 हैं, माइक्रोन 2 (मध्यम) प्रति 526 और (कम) 2 उम 13 प्रति. (बी) ग्राफ़ dextran के प्रत्येक एकाग्रता के तीन 10,000 फ्रेम दृश्यों के एक औसत दिखा. त्रुटि सलाखों के मानक विचलन दिखा. एक रोलिंग 100 फ्रेम औसत का उपयोग कर फ्रेम प्रति स्वीकार localizations की संख्या की साजिश रचने (सी) ग्राफ़. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. खराब गुणवत्ता Dextran डाटा. एक 15,000 फ्रेम तूफान अनुक्रम से (ए) विवर्तन सीमित फ्रेम. छवि भर में फैलाना फ्लोरोसेंट धुन्ध नोट. इस fluoropho के कारण होता है जोड़कर माध्यम से diffusing. 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल कर लिया. (बी) के बफर के बाद (ए) के रूप में ही बदल दिया गया था. अनबाउंड fluorophores धुल गया है के रूप में सुधार विपरीत नोट. (सी) (ए) में एकत्र आंकड़ों को इसी एक सुपर संकल्प छवि पुनर्निर्माण. समान छवि आकार लेकिन 25 एनएम का पिक्सल के साथ. सटीक मतलब अनुमान 35 एनएम है. (डी) (बी) में एकत्र आंकड़ों को इसी एक सुपर संकल्प छवि पुनर्निर्माण. समान छवि आकार लेकिन 25 एनएम का पिक्सल के साथ. सटीक मतलब अनुमान 30 एनएम है. (ई) ग्राफ एक रोलिंग 100 फ्रेम औसत का उपयोग, फ्रेम प्रति स्वीकार localizations की संख्या की साजिश रचने. लाल रेखा एक उच्च पृष्ठभूमि है, जहां तूफान अनुक्रम (ए और सी) से मेल खाती है. ब्लू लाइन पृष्ठभूमि कम है जहां (B & D), इसी को डेटा से पता चलता है. उच्च करने के लिए इसी छवियों के लिए स्वीकार कर लिया स्थानीयकरण संख्या दिखा (एफ) ग्राफ (सी) और कम (डी) पृष्ठभूमि डेटा.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. ठेठ एक्टिन डाटा. पूर्व बफर और तूफान इमेजिंग स्विचन के अलावा actin filaments के (एसी) विवर्तन सीमित छवियों. Filaments के चर लंबाई देखा जा सकता है. बहुत उज्ज्वल filaments अक्सर एक साथ उलझ कई filaments हैं. पिक्सेल आकार 160 एनएम है. (डी) एक एकल actin रेशा का एक विवर्तन सीमित छवि. (ई) तूफान छवि (ImageJ में लागू 0.1% विपरीत वृद्धि). एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल कर ली के साथ एक 10,000 फ्रेम अनुक्रम से. पिक्सेल आकार 16 एनएम है. सटीक मतलब अनुमान 16 एनएम है. (एफ) ग्राफ़ स्वीकार स्थानीयकरण की संख्या की साजिश रचनेएक रोलिंग 100 फ्रेम औसत का उपयोग कर फ्रेम प्रति है,. तैयार भर में एक पीले रंग की लाइन प्रोफाइल के साथ वृद्धि विपरीत करने के लिए पूर्व (ई) से actin रेशा के क्षेत्र में तेजी से बढ़ी (जी) ए. (एच) actin रेशा भर में तैयार पीली लाइन से एक भूखंड प्रोफाइल देखें. ImageJ में उत्पन्न. (मैं) ImageJ में वक्र ढाले उपकरण का उपयोग भूखंड प्रोफाइल की एक गाऊसी फिट. मानक विचलन, डी, 43.2 एनएम की एक FWHM माप पाने के लिए 2.35 से गुणा किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. Mislocalized actin filaments. (ए) विवर्तन सीमित actin रेशा. 160 एनएम पिक्सल. (ए) में दिखाया गया actin रेशा (बी) तूफान छवि. एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रैम के साथ एक 20,000 फ्रेम अनुक्रम सेई आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल कर लिया. तूफान पिक्सेल आकार 16 एनएम है. सभी 20,000 फ्रेम प्रोसेस किया गया. सटीक मतलब अनुमान 17 एनएम है. (बी) के रूप में, लेकिन प्रसंस्कृत 20,000 फ्रेम अनुक्रम के केवल पहले 5000 फ्रेम के साथ (सी). सटीक मतलब अनुमान 18 एनएम है. (डी) (बी) के रूप में, लेकिन प्रसंस्कृत 20,000 फ्रेम अनुक्रम के केवल अंतिम 5,000 फ्रेम के साथ. सटीक मतलब अनुमान 17 एनएम है. पूर्ण 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम देखने से फ्रेम डेटा प्रति localizations (ई) ग्राफ़.
चित्रा 6. बहाव पार्श्व. एक 64 x 64 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 64.6 तख्ते पर ले जाया साथ 10,000 फ्रेम अनुक्रम से खंगाला एक actin रेशा की (ए) तूफान छवि. तूफान पिक्सेल आकार 32 एनएम है. सटीक मतलब अनुमान है32 एनएम. (बी) एक तूफान छवि 'बॉक्स ट्रैकिंग' सुविधा आंधी में उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया. Localizations वे प्राप्त कर लिया गया जब की फ्रेम संख्या को इसी रंग के साथ प्रदर्शित कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, जल्दी अधिग्रहण अनुक्रम में से localizations नीले हैं; देर अधिग्रहण अनुक्रम में से localizations लाल कर रहे हैं. विस्थापित रंग बहाव आ गई है कि संकेत मिलता है. (सी) ए (ए) के क्षेत्र में तेजी से बढ़ी है बॉक्स ट्रैकिंग सुविधा आंधी में उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया. विस्थापित रंग बहाव आ गई है संकेत मिलता है. (डी) मापकला मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो चार 100 एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों की एक विवर्तन सीमित छवि,. पिक्सेल आकार 160 एनएम. संख्या 1-4 शो फसली और व्यक्तिगत रूप से मोती तेजी से बढ़ी है. (ई) एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल कर ली के साथ एक 10,000 फ्रेम अनुक्रम से आंधी में खंगाला (डी) के लिए इसी प्रत्येक फ्लोरोसेंट मनका. तूफान पिक्सेल आकार 5 एनएम है. सटीक मतलब अनुमान 7 एनएम है. (एफ) (डी) के लिए इसी मोती और (ई),'बॉक्स ट्रैकिंग' सुविधा का उपयोग कर प्रदर्शन किया. विस्थापित रंग बहाव आ गई है संकेत मिलता है. (जी) मनका संख्या 2 का उपयोग संदर्भ के रूप में, मोती 1, 3 और 4 'घटाना बहाव' सुविधा के बाद प्रदर्शित किए जाते हैं आंधी में प्रयोग किया जाता है. (ई) के साथ तुलना पार्श्व बहाव सही किया गया है कि पता चलता है. तूफान पिक्सेल आकार 5 एनएम है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 7. ठेठ EGF डाटा. बेसल सेल सतह पर केंद्रित एक हेला सेल के हिस्से के (ए) विवर्तन सीमित छवि. पीले बक्से (बी) में दिखाया हित के क्षेत्रों में तेजी से बढ़ी संकेत मिलता है और (ग). (बी) सेल (बॉक्स बी) के किनारे के पास क्षेत्र से विवर्तन सीमित छवि में तेजी से बढ़ी. (सी) सीमित विवर्तन में तेजी से बढ़ी नाभिक (बॉक्स सी) के तहत इस क्षेत्र से छवि. (डी) को इसी तूफान छवि (एक). एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल कर ली के साथ एक 10,000 फ्रेम अनुक्रम से. तूफान पिक्सेल आकार 25 एनएम है. सटीक मतलब अनुमान 21 एनएम है. (ई) ई (डी) बॉक्स को इसी तूफान छवि. (एफ) एफ (डी) बॉक्स को इसी तूफान छवि. (डी) से फ्रेम आंकड़ों के अनुसार (जी) localizations. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
. वीडियो 1-4 वीडियो बदलती dextran सांद्रता के साथ 2A चित्रा के अनुरूप: 1 = उच्च, 2 मध्यम 3 = कम, 4 = कोई नहीं). प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर एक 10 मिसे जोखिम समय के साथ प्राप्त 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, साथ 10,000 फ्रेम दृश्यों. वीडियो 1 देखने के लिए यहाँ क्लिक करें ,load/50579/50579video2.mov "लक्ष्य =" _blank "> वीडियो 2, 3 वीडियो , वीडियो 4
वीडियो 5-6. वीडियो 3 ए व बी वीडियो 5 चित्रा के अनुरूप अपार fluorophores हटा दिया गया है के बाद पूर्व धोने और वीडियो 6 के बाद धो रहा है. एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल उपयोग कर 15,000 फ्रेम दृश्यों. वीडियो 5 देखने के लिए क्लिक करें , वीडियो 6 .
वीडियो 7. वीडियो चित्रा 4E में तूफान छवि उत्पन्न करने के लिए संसाधित किया गया था कि कच्चे फ्रेम अनुक्रम दिखा. 10,000 फ्रेम sequeएक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल साथ nce. वीडियो 7 देखने के लिए यहां क्लिक करें .
वीडियो 8. वीडियो चित्रा 5B में तूफान छवि उत्पन्न करने के लिए संसाधित किया गया था कि कच्चे फ्रेम अनुक्रम दिखा. एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल कर ली के साथ 20,000 फ्रेम अनुक्रम. वीडियो 8 देखने के लिए यहां क्लिक करें .
वीडियो 9. वीडियो चित्रा 6A में तूफान छवि उत्पन्न करने के लिए संसाधित किया गया था कि कच्चे फ्रेम अनुक्रम दिखा. एक 64 x 64 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 64.6 तख्ते पर ले लिया. साथ 10,000 फ्रेम अनुक्रम Cliयहां सीके वीडियो 9 देखने के लिए.
वीडियो 10. चित्रा 7 दिन में तूफान छवि उत्पन्न करने के लिए संसाधित किया गया था कि कच्चे फ्रेम अनुक्रम दिखा वीडियो. एक 128 x 128 पिक्सेल फ्रेम आकार, एक 10 मिसे जोखिम समय और प्रति सेकंड 52.5 तख्ते पर हासिल कर ली के साथ 10,000 फ्रेम अनुक्रम. वीडियो 10 देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
हम कुछ सरल परीक्षण के नमूने और यह तूफान सुपर संकल्प इमेजिंग अनुकूलन करने के लिए संभव है आज़ादी से उपलब्ध संसाधन सॉफ्टवेयर आंधी के साथ दिखा. इन उपकरणों और तरीकों नए उपयोगकर्ताओं और उनके सूक्ष्मदर्शी में आत्मविश्वास और अभूतपूर्व विस्तार के साथ जैविक और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए उनमें से उनके उपयोग को बढ़ाने के लिए अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए तरीके के लिए उपयोगी शुरू अंक प्रदान करेगा. यह छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए और अधिक आत्मविश्वास के लिए संभव है दिखा ऐसी सटीक मतलब अनुमान है, स्थानीयकरण संख्या और हिस्टोग्राम के रूप में उपयोगी छवि गुणवत्ता मैट्रिक्स के एक नंबर, उत्पादन कर सकते हैं कि जाना जाता है या अच्छी तरह से समझ संरचनाओं और एक एल्गोरिथ्म के साथ नमूनों का एक संयोजन का उपयोग करके तूफान इमेजिंग प्रक्रिया में. कोई एक आकार इस्तेमाल किया जा सकता है कि विभिन्न व्यावसायिक और स्वयं बनाया खुर्दबीन विन्यास की एक संख्या के रूप में वहाँ डेटा प्राप्त करने के लिए सभी दृष्टिकोण फिट बैठता है. इसके अलावा, प्रभावित कर सकते हैं जो कई नमूना तैयार करने और छवि अधिग्रहण कदम उठाए हैंअंतिम छवि इसलिए सॉफ्टवेयर उपकरणों और परीक्षण के नमूने होने समझ और तूफान छवि गुणवत्ता के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण है खिलाडि़यों.
इसके अलावा इन प्रोटोकॉल उत्पन्न हो सकती है कि किसी भी समस्याओं के निवारण के लिए उपयोगी और कम अस्पष्ट तरीके प्रदान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए dextran नमूना किसी भी लेजर बीम misalignment या नमूना के असमान रोशनी अगर वहाँ की पहचान करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी तरीका है. स्विचिंग बफर किसी भी 'पलक' मदद मिलेगी अगर वहाँ देखने के लिए एक बहुत ही साधारण दृश्य परीक्षण काम नहीं किया जा सकता है कि वहाँ चिंता कर रहे हैं. Actin filaments FWHM का उपयोग तुलना के साथ ही बहाव और mislocalization कलाकृतियों को उजागर करने के संकल्प को मापने का एक उपयोगी तरीका है. हालांकि, यह स्थानीयकरण आधारित सुपर संकल्प तरीके के रूप में इस तरह के जोखिम बार, फ्रेम दर, लेजर शक्तियों और छवि संसाधित किया जाता है जिस तरह के रूप में अन्य कारकों का योगदान, के बावजूद, संवेदनशील fluorophore घनत्व हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, यह निर्दिष्ट करने के लिए असंभव है एक के लिए एक संकल्पविशेष माइक्रोस्कोप और सभी छवियों कि संकल्प होगा कि मान. क्या संभव है, हालांकि, इस तरह के मतलब स्थानीयकरण precisions, स्थानीयकरण संख्या के रूप में संकल्प के विभिन्न पहलुओं को मापने के लिए और 27 बहाव है. विश्वस्त मार्करों वे कर सकते हैं हर प्रयोग में शामिल नहीं किया जा सकता है, भले ही कम से कम, एक माइक्रोस्कोप प्रणाली, अपने पर्यावरण विशेषताएँ और बेहतर इस तरह के बहुत समय बाद शुरू थर्मल संतुलन तक पहुँचने के लिए आवश्यक है कि कैसे के रूप में परिचालन कारणों को समझने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. इस चित्र 43 का अधिग्रहण किया जा रहा है whilst नमूना स्थिति सही करने के लिए एक विदृष्टिक लेंस का इस्तेमाल करते हैं और एक प्रतिक्रिया तंत्र की आवश्यकता है के रूप में अच्छी तरह से पार्श्व बहाव के लिए संशोधन के रूप में, मापकला मार्करों, विशेषताएँ इस्तेमाल किया और अक्षीय बहाव के लिए सही किया जा सकता है. वाणिज्यिक सुपर संकल्प प्रणालियों आमतौर पर स्थिरता नियंत्रण या ध्यान की दिशा सही करने के लिए एक अधिक व्यावहारिक समाधान हो सकता है जो ध्यान केंद्रित ताला तंत्र, किसी प्रकार का शामिल होंगे.
वहाँ एकगैर विशेष रूप से इस तरह के रंगों सीधे या ऐसे माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में अन्य संयुग्म अणुओं का उपयोग कर के रूप में dextran, साथ ग्लास कोटिंग के लिए विकल्प फिर से. इन तरीकों की एक सीमा है कि कांच के लिए बाध्य अणुओं की संख्या ज्ञात नहीं है कि है. इस्तेमाल किया गया है कि वैकल्पिक filamentous संरचनाओं सूक्ष्मनलिकाएं 28 और डीएनए 21 में शामिल हैं. हालांकि, बहुत छोटे आकार और सुविधाजनक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों के संयोजन अपसारी या branched तंतुओं की जुदाई दूरी भी प्रणाली प्रदर्शन 27 का एक उपयोगी माप किया जा सकता है, खासकर के रूप में एक आकर्षक विकल्प actin बनाते हैं.
परीक्षण के नमूने के आगे विकास के लिए कमरे में इस क्षेत्र 28,29,46,47 में हाल की प्रगति के बावजूद, वहाँ है. विशेष रूप से, बहु रंग इमेजिंग एक इमेजिंग के सभी 3 मुख्य पहलुओं में चुनौतियों की संख्या, नमूना लेबलिंग, छवि अधिग्रहण (हार्डवेयर), और सॉफ्टवेयर (इमेज प्रोसेसिंग और संरेखण) प्रस्तुत करता है. एक कर दिया गया हैप्रकाशनों इन पहलुओं 4-6 संबोधित कर रहे हैं और यह उचित परीक्षण के नमूने और तरीकों छवियों के इन प्रकार के सृजन और मज़बूती से व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि इसलिए स्पष्ट है की एक संख्या. दरअसल, हाल ही में यह dSTORM के दो रंग के चित्र लेने, और हल, परमाणु ताकना परिसर के अत्यधिक सममित प्रकृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और लेखकों के लिए इस रंगीन विपथन सुधार 45 के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक आदर्श तरीका होगा कि सुझाव दिया है कि दिखाया गया था. एक और दिलचस्प दृष्टिकोण के अलावा 46 विशिष्ट उप विवर्तन दूरी पर स्थिति fluorophores की संभावना बनाता है जो एक nanoruler, बनाने के लिए डीएनए origami का इस्तेमाल होता है. इस संकल्प का आकलन करने और दूरी माप बनाने का एक तरीका प्रदान करता है. हालांकि, अंतिम लक्ष्य जटिल तीन आयामी संरचना हैं जो इस तरह की कोशिकाओं के रूप में गैर idealized नमूने, के लिए इन सुपर संकल्प तकनीक लागू करने के लिए है. इस मामले में, टी के और अधिक पूरी तरह से समझ का एक संयोजनवह डेटा प्राप्त उचित तरीके से यह प्रसंस्करण, और छवि मेट्रिक्स प्रदान करने में उपयोगकर्ता सहायता सॉफ्टवेयर है कि उपकरणों के साथ संयुक्त तकनीक अंतिम जवाब होने की संभावना है. 28,29,47,48
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम ब्रिटेन की राष्ट्रीय मापन कार्यालय के रासायनिक और जैविक मैट्रोलोजी कार्यक्रम से धन स्वीकार करते हैं. हम तकनीकी सलाह और सुझाव के लिए सेबस्टियन वैन डे लिंडे, मिक्लोस Erdélyi और एरिक रीस धन्यवाद. हम उपयोगी टिप्पणी और इस पांडुलिपि पर विचार विमर्श के लिए मिक्लोस Erdélyi, एरिक रीस और अधिकतम Ryadnov धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
| 100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
| EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
| 640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
| LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
| ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
| Table 1. Materials & Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyde - 10 % solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Table 2. Reagents | |||
References
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