Summary
Мы описывают получение трех образцов и как они могут быть использованы для оптимизации и оценки эффективности работы STORM микроскопов. Используя эти примеры мы покажем, как получить исходные данные, а затем обработать его для получения изображений супер-разрешения в клетках примерно 30-50 резолюции нм.
Abstract
ШТОРМ это недавно разработанный метод микроскопии супер-разрешения с до 10 раз более высоким разрешением, чем стандартные методы флуоресцентной микроскопии. Однако, как образ приобрел в совсем другим способом, чем обычно, за счет наращивания графическое молекула-на-молекулу, есть некоторые серьезные проблемы для пользователей в попытке оптимизировать их получения изображений. Для того, чтобы помочь этому процессу и получить более глубокое представление о том, как STORM работает мы представляем подготовку 3 образцов и методологию приобретения и обработки STORM изображения супер-разрешения с типичными решениями между 30-50 нм. Объединив тестовые образцы с использованием свободно доступного программного обеспечения для обработки ливень можно получить большое количество информации о качестве и разрешении изображения. Используя эти показатели, то тогда можно оптимизировать процесс создания образа из оптики, чтобы пробоподготовки, выбор красителя, условия буфера и настройки захвата изображений. МыРБП показаны примеры некоторых распространенных проблем, которые приводят к плохому качеству изображения, таких как боковой дрейф, где образец движется во время приобретения и плотности изображений, связанных проблем, возникающих в «неправильной локализации" явления.
Introduction
Недавно были разработаны ряд методов оптической микроскопии, как правило, называют супер-разрешением микроскопии или Наноскопии, который может обойти дифракционный предел и генерировать изображение с разрешением 100 нм или более 1,2. С момента объявления о супер-разрешением микроскопии как метод Методы Природа года в 2008 году, имело большое развитие микроскопов локализации основе. Например, есть многоцветные приложения 3-6, 3D реализаций 7-12, и сотовые приложения даже живые 5,13-17. Кроме того, как эти системы на коммерческую основу и сейчас делают свой путь из оптической лаборатории в руки клеточных биологов есть, вероятно, будет дальнейшее увеличение их использования и применения в биомедицинских вопросов.
Одна ветвь этого семейства методы локализации основе, которые работают за счет наращивания графическое молекула-на-молекулу. Ян для того, чтобы сделать это, большинство флуоресцентных молекул в образце должен быть выключен, так что только несколько пространственно разделенных молекулы активны в любой момент времени. Эти молекулы затем быстро включается и выключается, и многие изображения взяты так, что значительная часть населения изображается для отражения структуры с точностью суб-дифракционного. Ряд подходов были опубликованы в том числе GSDIM 18 PALM 19 fPALM 20, гроза 21 и RESOLFT 22. Алгоритмы, которые измеряют положение обнаружения одной молекулы могут затем использоваться, чтобы найти фактическое положение молекулы с уточнений лучше, чем 20 нм с использованием Gaussian фитинг 23, например rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 и ливень 27. Когда визуализации клеток или других биологических образцов, которые имеют высокую плотность молекулы, поэтому необходимо принимать несколько тысяч кадровэто мигает, пространственно разделены, сигнал для того, чтобы изображение значительная часть меченых молекул.
Стохастический микроскопия оптическая реконструкция (STORM) и тесно связана dSTORM и методы GSDIM являются локализация Методы, основанные на супер-разрешения, которых была подтверждена работать с коммерчески доступных органических красителей 21. Они поскольку было показано, применимы к ряду различных красителей 28-30, что делает методика особенно привлекательна из-за специфики и относительной удобства хорошо известных иммунного подходов для выполнения флуоресцентной микроскопии. Следовательно, есть легкий доступ к целому ряду красителем антитела и красителя биомолекулы конъюгатов, которые имеют потенциал для использования в супер-разрешением изображения локализации основе. В то время как общие принципы STORM и аналогичных подходов относительно просты, и на первый взгляд аппаратного и пробоподготовка показаться относительно страightforward, есть ряд шагов в процессе, которые важны для достижения высокого качества, без артефактов, изображения супер-разрешения.
Как и во всех методов микроскопии процесс можно рассматривать в 3 основных этапа: сначала, пробоподготовка, во-вторых, получение изображений и, в-третьих, обработка изображений и / или анализа изображений и интерпретация. Дополнительный разрешающая способность и способ генерации изображений супер-разрешения на основе подхода, локализации на основе вводит некоторые новые проблемы и соображения 31-33. Начиная с подготовки образца, при выполнении иммунного, в частности непрямой иммунофлуоресценции, где используется первичный и вторичный комбинация антител, следует отметить, что флуоресцентный краситель может быть до 20 нм от представляющей интерес молекулы. В случае микротрубочек, что приводит к диаметров 35-50 нм по сравнению с ожидаемым диаметром микротрубочек от 25 нм 28,30. Кроме того, плотность маркировки должны мEET критерий Найквиста, чтобы генерировать высокое качество изображения 14. Например, для ожидаемого разрешения изображения 20 нм вдоль нитчатого структуры должно быть молекула красителя по крайней мере каждые 10 нм 27. В то время как многие красители были опубликованы на работу локализация на основе подходов общая производительность красителя представляет собой смесь по крайней мере четыре важных критериев, а именно, обнаруженных фотонов на переключение событие (яркость каждого мгновение - ярче, тем лучше), равновесия на -офф рабочий цикл (коэффициент контрастности красителей в с сравнении на состоянии - больше от, как правило, лучше), доля выживаемости (низкий уровень отбеливания, тем лучше) и количество циклов переключения (количество миганий в флуорофором - более лучше за большой размер, хотя 1 вспышка на флуорофором может быть преимуществом для молекул целей подсчета). Ситуация осложняется еще и тем, что эти свойства для любого данного красителя может варьироваться в разных условиях буферных ис лазерной мощности 28,29. Кроме того, так же как этих уникальных аспектов шторма, качество изображения может быть улучшена за счет оптимизации пробоподготовки таким же образом, как более традиционными методами флуоресцентной микроскопии, например путем минимизации аутофлюоресценция путем модификации условий фиксации и использование закалки реагентов. Кроме того, минимизация неспецифически связанных флуорофоры важно, что может быть сделано путем изменения концентрации этикеток, времени инкубации и блокировки и промывки.
Второй шаг получения изображения также имеет важное значение. Оптимальные параметры на микроскопе будет зависеть от красителя, буферных условий, плотности маркировки и типа образца, например монослоев на стекле, клеток или образцов ткани. Основные соображения время камера экспозиция, номер кадра, угол освещения (TIRF, HILO, EPI) и мощность лазера. Цель состоит в том, чтобы собрать как можно больше ярких пространственно разделенных мигает как можно быстрее. Если фон яс очень высокой или если мигает не очень яркие, иными словами отношение сигнал-шум плохое, алгоритм реконструкции не сможет локализовать позиции настолько точно. Как и максимизации точности локализации, т.е. точность, с каждой позиции молекулы могут быть измерены, качество изображения также зависит от большого числа локализаций. Если недостаточное количество молекул, представляющих интерес изображаются, либо из-за низкой эффективности маркировки, чрезмерной фотообесцвечивания или недостаточное количество кадров, то в результате супер-разрешение изображения будет точечная и прерывистым, как критерии Найквиста не были выполнены 14,27 .
И, наконец, третий шаг, обработка изображений, особенно важно по сравнению со стандартными методами флуоресцентной микроскопии. Существует целый ряд свободно и коммерчески доступных алгоритмов, что является как преимуществом, с точки зрения выбора, так и недостатком, тем, что она может ввести в заблуждение, чтобы узнать шHICH является наиболее подходящим для использования. Если, например, необработанные данные уже хорошо разнесены пространственно отдельных мигает затем одиночных молекул алгоритм установки может быть очень точным и эффективным, например, путем подгонки разреженных алгоритмов, доступных в ливень 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 и 26 QuickPALM Software . Если исходные данные содержит много перекрывающихся сигналов затем алгоритмов, которые могут быть более подходящим включают DAOSTORM 34, 3B 35 и deconSTORM 36. Более того, эти алгоритмы содержат пороговые значения для различных критериев, таких как сигнальных отсчетов, или фотонов в мгновение, а также различных различных вариантов отображения изображений, таких как визуализация с сглаженными функций Гаусса или как гистограмм с пиксельными сетей, где размер пикселя супер-разрешение может быть , выбранный пользователем. Все эти варианты изменения внешнего вида конечного изображения и иметь последствия для интерпретации и анализа изображений.
27 и обычно на всю ширину половине максимума (FWHM)из нити дается как эмпирической оценки резолюции 37. Следует отметить, что разрешение варьируется между образцами и между изображениями в течение того же образца, потому что разрешение в локализации на основе супер-разрешением микроскопии является функцией флуорофора яркости, фоновый шум и плотности локализации 27, и они не обязательно постоянной на протяжении образца. Актиновые филаменты используются для демонстрации потенциальных артефакты, такие как mislocalizations и дрейфа и как они могут быть идентифицированы с функциями программного обеспечения в рамках ливня. Кроме того, мы описываем использование флуоресцентных координатных меток на обоих меры и правильной дрейфа. И, в-третьих, окрашивание клеток с эпидермальный фактор роста (EGF) конъюгатов-краситель описано. EGF представляет собой полезный индикатор производительности изображения сверхвысокого разрешения, потому что доля рецептора на поверхности клеток подвергается эндоцитоз через пузырьки, которые суб-дифракционные размера структуры примерно 50-150 пм в диаметре 27,38,39.
Protocol
Примечание: В этом протоколе, советы и рекомендации можно найти следующие определенные шаги. Обозначение "* 1" указывает, что примечание 1 имеет отношение к этой конкретной стадии, и так далее.
1. Люминесцентная Декстран покрытие стекла
- Добавить 200 мкл 0,01% поли-L-лизин решение в каждую лунку 8-камеры покровного стекла и инкубировать в течение 10 мин. Удалить с помощью пипетки, чтобы убедиться, что нет это жидкость, остающаяся.
- Восстановить декстран-Alexa 647 * 1 в соответствии с инструкциями производителя, чтобы создать 2 мг / мл маточного раствора. Исходя из этого, разбавить 0,25 мкл в 25 мкл деионизированной воды, чтобы создать решение с 20 мкг / мл.
- Для создания высокой плотности покрытия декстран-Alexa 647 разбавленного раствора 20 мкл 20 мкг / мл раствора в общей сложности 200 мкл деионизированной воды. Для решения средней плотности разбавить 2 мкл в 200 мкл деионизированной воды (1:10000 разбавления от оригинального исходного раствора). Для низкойРешение плотность разбавить 0,2 мкл в 200 мкл деионизированной воды (1:100000 разбавления от оригинального исходного раствора).
- Добавить 200 мкл разбавленных декстран-Alexa 647 решений в каждую лунку и инкубировать в течение 10 мин. Более длительные времена инкубации можно использовать что может привести к более плотной декстрана покрытием. Снять и вымыть с H 2 O три раза * 2
Примечание 1: Другие конъюгаты декстран-краситель может быть использован. Неконъюгированный декстран также могут быть конъюгированы с красителями при желании комбинации не являются коммерчески доступными.
Примечание 2: Те же декстран камеры могут быть reimaged в течение недель, хотя однородность флуоресценции может уменьшаться. Хранение при 4 ° С в отсутствие какого-либо буфера рекомендуется.
2. Люминесцентная нитей актина на стекле
- Добавить 200 мкл 0,01% поли-L-лизин решения каждую лунку камеры и инкубировать в течение 10 мин * 3. Редвигаться с помощью пипетки для того, чтобы жидкость не осталось.
- Добавить 90 мкл общего буфера актина (восстановленного в соответствии с инструкциями изготовителя) в каждую камеру. Добавить 10 мкл 10 мкМ предварительно сформированные решение нити актина и 1 мкл фаллоидином-Alexa 647 (0,2 единиц, при растворении в 1,5 мл метанола в соответствии с инструкциями изготовителя) и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы смешаться. Выдержите в течение 30 мин * 4.
Примечание 3: Увеличение объема раствора нитей в результатах камеры в меньшем количестве нитей связывающих к стеклу с покрытием поли-L-лизина.
Примечание 4: инкубационный времена до 48 часов при 4 ° С были испытаны с хорошими результатами. Качество актина накаливания изображения ухудшается, как только камера подверглась воздействию буфер переключения поэтому не рекомендуется использовать один и тот же образец для более одного дня.
3. Микросфер Флуоресцентные шарики как координатных меток
- Добавить разводненной бусы в камере изображений и ждать в течение 15 минут * 5. Снимите решение и промыть 3 раза с PBS до визуализации.
Примечание 5 - разведение и времени инкубации можно регулировать, чтобы получить различные плотности из бисера. Этот протокол обычно приводит к от 3 - 10 шариков на 20,5 мкм х 20,5 мкм поле-обзора.
4. Эпидермальный фактор роста клеток Окрашивание
- Культура HeLa клетки в изображений камер до приблизительно 80% слияния в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина раствора.
- Снимите культуральной среды и промыть PBS. Затем добавляют 500 мкл 4%-ного раствора формальдегида (4 мл 10% раствора формальдегида, 1 мл 10Х PBS, 5 мл воды) в течение 10 мин. Снимите формальдегид и промыть 3 раза с PBS. Не позволяют клеткам оставаться дры и всегда использовать PBS буферные растворы, чтобы избежать гипотонического стресса.
ВНИМАНИЕ - формальдегид является чрезвычайно токсичным. Убедитесь, что соответствующие перчатки, средства защиты глаз и халатах носят. Проверьте местные руководящие принципы для утилизации формальдегида.
- Восстановить EGF-Alexa 647 в соответствии с инструкциями изготовителя по созданию 50 мкг / мл маточного раствора. Добавить 2 мкл этого раствора к 200 мкл 0,1% раствора БСА (в PBS). Удалить PBS из клеток, добавьте EGF раствор и инкубируют в течение 30 мин.
- Удаление раствора и промыть 3 раза с PBS перед добавлением блокирующего раствора 0,1% БСА (в PBS) в течение 15 мин. Удалить эту и мыть еще 3 раза с PBS до визуализации.
5. Переключение Подготовка буфера
- Сделать исходный раствор фермента (А) с 10 мкл каталазы (20 мкг / мл), 20 мкл 1 М Трис гидрохлорид (2-carboxyelthyl) фосфин (4 мм), 2,5 мл глицерина (50%), 125 мкл1 М KCl (25 мМ), 100 мкл 1 М, рН 7,5 Трис-HCl (20 мМ), 5 мг глюкозооксидазы (1 мг / мл) и верхний до 5 мл с объемом diH20. Этого достаточно, чтобы сделать 100 х 50 мкл аликвоты, которые можно хранить при -20 ° С и использовали в течение 1 года.
- ) Сделать маточного раствора глюкозы (B) с 4 г глюкозы (100 мг / мл), 4 мл глицерина (10%) и 36 мл diH20. Этого достаточно, чтобы сделать 100 х 400 мкл аликвоты, которые могут быть сохранены на - 20 ° C и использовать в течение 1 года.
- Сделать восстановителем маточного раствора (С) с 113,6 мг MEA-HCl (1M) и 1 мл 2 DIH 0. Используйте свежие или сделать 10 х 100 мкл аликвоты, которые могут храниться при -20 ° С и использовать в течение 1 месяца (не замораживать аликвоты).
- Непосредственно перед визуализации, смешать фермента (А), глюкозы (B) и восстанавливающего агента (С) растворы вместе в соотношении 50 мкл, 400 мкл, 100 мкл и доводят до 1 мл с PBS * 6. Этот буфер теперь будет поглощать кислород и имеют восстановительную среду (100 мм MEA-HCl) * 7. Окончательное значение рН должно находиться в диапазоне 6,0 - 8,5 (регулировка обычно нет необходимости) * 8.
Примечание 6 - это буфер пригоден для использования с карбоцианиновых на основе красителей, таких как Cy5 и Alexa 647.
Примечание 7 - конечные концентрации фермента 50 мкг / мл (5 ед / мл) глюкозооксидазы и 1 мкг / мл (40-60 единиц / мл) каталазы. Ферментативная активность (единиц) задается поставщиков и может варьироваться. Вычисления для каталазы предположить, что 1 мкг / мл конечная концентрация 5,4 после стадии будет содержать 50 единиц фермента. Различные буферные композиции, включающие схожих компонентов, поглощающих кислород, можно найти 21,30,40. Для резюме буферных и красителей комбинаций смотрите ссылки 28,29. Глицерин и TCEP необходимы для длительного хранения при -20 ° С.
Примечание 8 - если томография нитей актина добавить 2 мМ MgCl 2 и 0,2 мМ АТР, чтобы помочь стабилизировать тон нитей.
6. Микроскоп Приобретение STORM данных (с использованием Alexa 647 краситель)
- Включите ШТОРМ / PALM микроскопа, предпочтительно по меньшей мере 3 ч до визуализации, чтобы тепловое равновесие будет достигнуто. Изображений до этого имеет повышенный шанс дрейфа.
- Вставьте изображения камеры в держатель образца столик микроскопа. Убедитесь, что образец твердо в держателе и плоская.
- Снимите PBS с изображения камеры, а затем заполнить до краев буфера переключения. Аккуратно положите покровное поверх камеры, чтобы убедиться, что нет никаких пузырей на всех, и что вся камера покрыта. Долить дополнительного буфера или PBS, если любые пузыри видны в противном случае буфер производительность может снижаться.
ВНИМАНИЕ - свести к минимуму шансы на боковой и осевой дрейфа образца по отношению к объектива рекомендуется, чтобы образец и буфер оставляют для уравновешиваниядо комнатной температуры в течение не менее 15 мин до визуализации.
- Найдите флуоресцентный интересующую структуру для включения в образ. Выберите нужный угол освещения, в данном случае, в TIRF или сильно наклоненную угол рекомендуется, так как это улучшает отношение сигнал-шум за счет минимизации из фокуса свет, что особенно выгодно для образцов клеток. Возьмите справочный дифракционной изображение структуры перед визуализации STORM.
- Увеличение лазерного возбуждения (с соответствующим длине волны возбуждения приблизительно 640 нм) до высокой мощности, что соответствует примерно 2 кВт / см 2 в то время как изображения с настройками камеры от 10 мс воздействия и временем цикла примерно на 50 Гц (кадров в секунду) . После того, как флуорофоры которые перешли в разбросанный мигающим рисунком (вероятно в 10 сек для большинства образцов) собрать 10.000 кадров * 9.
Примечание 9 - 10000 кадров подходит для образцов, описанных здесьно это может быть необходимо увеличить количество кадров до 50000 или более для других образцов.
7. Реконструкция Супер-разрешение изображений из необработанных данных (с использованием ливень)
- Откройте файл rainSTORM.m изнутри MATLAB и запустить (рис. 1А).
- В окне ливня (рис. 1В) выберите файл проанализировать изображение с помощью кнопки Обзор. Это должно быть. Файл TIF (ImageJ может быть использован для преобразования других типов файлов в TIF формате). Alter пикселей ширины, чтобы соответствовать исходные данные системы микроскопа, используемого для получения данных * 10. Оставьте остальные значения по умолчанию.
Примечание 10 - Типичный EMCCD камера имеет размер пикселя 16 мкм т.д. системе с объектива 100X размер пикселя на изображении будет 160 нм. На коммерческих систем размер пикселя обычно отображается в программном обеспечении. Размеры пикселей варьироваться между 100 нм и 160 нм для большинства микроскопов локализации.
- Нажмите кнопку 'обрабатывать изображения "и ждать, пока не появится предварительное изображение. Продолжительность обработки будет зависеть от размера файла, компьютерной спецификации и количества в пределах исходных данных * 11-кандидатов будет мигать.
Примечание 11 - 10000 кадров последовательности актина и данных EGF взял 23 сек и 25 сек для обработки соответственно с помощью ПК с процессором Intel Xeon E5420. Используя тот же компьютер без параллельного инструментов обработки в MATLAB, или с компьютером без многократного обработки основного, времена были 66 сек и 81 сек соответственно.
- Чтобы сформировать обновленный супер-разрешения изображения нажмите кнопку 'Открыть рецензента' и второй появится окно (рис. 1С). Нажмите кнопку "Настройка контрастности 'для того, чтобы изменить отображение изображений в соответствии с пожеланиями (рис. 1D). В некоторых случаях, где изображение очень темное максимальное значение должно быть уменьшено.
- Используйте измiewer окно (рис. 1С) для генерации полезных метрик качества изображения и повышения качества изображения супер-разрешения дальше. Задайте первые три параметра контроля качества для значений 4000, 0,1 и 0,8-2,0 соответственно * 12. Обновите отсчетов на стоимости фотонов, которые должны быть либо на основе калибровочного измерения фотон или с помощью фотонов кривой значения кривой калибровки, указанные производителем камеры для конкретного EM настройки усиления. Это очень важно для получения точной точность и измерений * 13 разрешения.
Примечание 12 - Графы Сигнальные отвергает мигает на основе критериев яркости. Чем выше значение, тем ярче мигает должно быть более широкое распространение как локализацией в конечном изображении. Это возможно, должны быть изменены в зависимости от фотонов выходе время красителя и экспозиции и чувствительности камеры. Толерантность отвергает мигает, если существует значительная ошибка между сигналом и оборудованная Гаусса т.е. гouble пики. PSF Сигма Диапазон отвергает мигает, если оборудованная ширина PSF лежит вне этого диапазона, то есть более узкий диапазон может быть использован, чтобы отклонить вне фокуса сигналы и большие агрегированные сгустки постоянной флуоресценции. Использование более широкий диапазон может привести к неправильной локализации артефактов, появляющихся в конечном изображении. На практике, рекомендуется для выполнения первоначальной контроль качества с помощью параметра среза точность локализации.
Примечание 13 - для получения дополнительной информации метрик разрешения см. ссылки 23,27. Короче, зная число фотонов, производимых каждый мигать можно рассчитать точность локализации каждого локализации и, следовательно, вывести общая средняя точность оценки для всего изображения. Использование Андор IXON DU-897E с настройкой усиления 200 графов в Photon значения 9.04.
- Измените точность локализации отсечки (рис. 1С), чтобы компромисс между оптимизации средние конспект локализацииион против числа локализации в конечном изображении. Значения 30-50 нм рекомендуются в зависимости от качества данных и образцом. Обе гистограммы и Info.txt файлы могут быть использованы для обоснования этого решения (рис. 1F и 1G).
- Коэффициент масштабная реконструкция (рис. 1С) по умолчанию 5, который будет генерировать супер-разрешением пикселей 32 нм, предполагая, что ширина пикселя в оригинальных изображений составляет 160 нм. Если исходные изображения имеют размер пикселя 100 нм это будет создавать изображения супер-разрешения с пикселями 20 нм. Увеличение коэффициента масштабирования производить меньше пикселей супер-разрешения на конечном изображении * 14.
Примечание 14 - Решение локализации микроскопии зависит от требуемого сглаживания для визуализации (то есть, размера пикселя простой реконструкции гистограммы), а также точности локализации. На практике размер пикселя реконструкция как правило, должны быть меньше, чем локализацииточность (см. метрику Среднее оценка точности в информационном текстовом файле - шаги 6,11 & 6,12). В этом случае потеря разрешающей из-за реконструкции размера пикселя будет небольшим 23,27. Например средние точности оценки в строке и направлении столбцов Рисунок 4E являются 16,1 нм и 16,2 нм. Размер пиксела 16 нм был использован для визуализации этих данных (масштаб реконструкция фактор 10 с первоначальной ширины пикселя 160 нм).
- Изменить диапазон предел кадра (рис. 1С), чтобы ограничить реконструкции для подмножеств исходных данных, например [2001-инф] исключает начальные 2000 кадров необработанных данных.
- Нажмите кнопку "Запустить рецензент '(рис. 1С), чтобы сформировать обновленный супер-разрешение изображения (рис. 1д).
- Нажмите кнопку 'View гистограмм (рис. 1в), для отображения качества изображения метрики (Рисунок 1F) * 15. Примечание 15 - График в правом верхнем углу, изображающей количество принятых локализаций против числа камера кадров и гистограммы Томпсон Локализация уточнений в правом нижнем углу (рис. 1F) может использоваться для информирования опцию точность локализации отсечки обзора. Например, с помощью 50-нм отсечки бы исключить все локализаций с худшей точностью от того включены в окончательный супер-разрешением.
- Нажмите кнопку 'сохранить изображение' в рецензент (рис. 1в), чтобы спасти все эти данные * 16.
- После изучения данных (например Info.txt файл и гистограммы), перейдите к шагу 7.6 и повторите последующие шаги с различными параметрами рецензента при желании. Нажатие 'сохранить изображение' в шаге 7,11 перепишет ранее сохраненные данные.
- Выполните шаги 7,1 - 7,9 для создания изображения в обычном порядке.
- Нажмите кнопку 'Box Tracking' в рецензент (рис. 1в) и нажмите и перетащите окно на доверительное маркера или структуры интереса со отзывы изображения.
- Подождите, пока не появится новое изображение, которое будет отображаться, заключенным в рамки позиции »(см. рис 6В, 6С и 6F примеры). Сохраните это изображение при желании.
- Если объектом интереса является доверительное маркер затем дрейфовать коррекции может быть выполнена с помощью кнопки "Установить якорь», за которой следует «SubКнопка Drift тракта. Наконец нажмите снова 'Run рецензента' для создания нового STORM изображение, которое теперь будет иметь все локализации корректируется в соответствии с исходных точек позициями меток. Позиции шарик удаляются из окончательного отзывы изображения.
- Если есть другие опорные маркеры в пределах окончательного дрейфа исправлены изображения, они могут быть удалены путем нажатия 'Box Tracking', 'Удалить штучной упаковке ", а затем столько раз" Run рецензент' в соответствии с пожеланиями.
Примечание 16 - от 3 до 5 файлы могут быть сохранены в зависимости от выбранных опций (сумма образа, STORMdataImage, STORMprocessed, информационная и hists), см. рис 1G. STORM обработанное изображение отображается с измененными контрастных и цветных карт. STORMdataImage представляет собой полутоновое изображение, в котором уровень серого каждого пиксела равна онемениеэ локализаций, которые были определены в нем.
8. Коробка Отслеживание и коррекция дрейфа (используя ливень)
Representative Results
Декстран
Успешный покрытие декстрана должны производить флуоресцентный монослой. В высокой концентрации это должно появиться относительно однородным. При более низких концентрациях он появится редкой (рис. 2А). Многие ШТОРМ / PALM микроскопы имеют возможность изменять угол освещения от эпифлуоресцентной для TIRF. При использовании полный вид на кадр камеры, например, при 512 х 512 пикселей на типичного EMCCD камеры, равномерное освещение должны быть соблюдены. Если есть какие-либо полосы или из фокуса регионы это может указывать на то, что образец должен быть повторно вставлен держатель образца с свежим маслом на объектив. Кроме того это может указывать на проблемы с микроскопом.
При приобретении исходных данных супер-разрешения лазер изображений должна быть увеличена по мощности около 2 кВт / см 2. Там будет первоначальный выброс флуоресценции затем мигает как флуорофоры приводятся ввременных темных государств. При высокой плотности декстран, что мигает, вероятно, перекрываются, особенно вблизи начала захвата изображения (Video 1). При плотностях среднего и низкого эти мигает должны быть редкими, то есть пространственно разделены, и в центре внимания без очевидных фоне (см. кадров 2000, 5000 и 8000, рисунок 2А, Видео 2 и 3). Во время этой фазы захвата изображений, при постоянном лазерного излучения, количество миганий будет уменьшаться с течением времени (сравните кадр 2000 с рамкой 8000 в образце высокой плотности, фиг.2А). Основное различие между различными изображениями супер-разрешения различных декстрана концентрации (высокий, средний и низкий) является уменьшение количество локализаций (рис. 2А и 2В). Другими словами, концентрация флуоресцентными молекулами, количество миганий в исходных данных и число локализаций имеют пропорциональную зависимость. Эта связь,Однако, это не просто линейная как при очень высокой плотности молекулы программное обеспечение не сможет успешно локализовать молекулы (ср. красные и синие линии, рисунок 2в). Причина этого в том, что при высокой концентрации это не возможно для программного обеспечения для обработки, чтобы соответствовать позиции, используя Gaussian алгоритм подбора где мигает не являются редкими. Как мигает уменьшить через фазы сбора из-за фотообесцвечивания программное обеспечение может соответствовать все более и более из мигает, поскольку они становятся редкими (Фигуры 2А и 2С). Кроме того, молекулы отдельные краситель может мигать, и поэтому быть локализованы более одного раза 28,41,42.
Общей проблемой при визуализации любого из этих образцов, но особенно декстран один высокой плотности, может быть наличие яркого, но несфокусированного флуоресцентного дымке который, кажется, быстро распространяя во время шторма изображений этапе приобретения. Это отличие от высокой контрастностью флуорофорами наповерхность стекла, которое можно увидеть мигающий (Фиг.3А, видео 5). Эти отдельные флуоресцентные молекулы могут быть предотвращены или удалены увеличение количества стадий промывки с PBS перед добавлением буфера переключения или добавлением свежего буфера переключения в камеру (рис. 3В, видео 6). Обработка и сравнивая данные из каждого результатов последовательность изображений в очень разных образах супер-разрешением, которые имеют снижение как числа локализаций и точности, с которой они могут быть установлены программного обеспечения для локализации мигает (рис. 3C, 3D, 3E и 3F).
Нитей актина
Готовые актиновые филаменты можно увидеть прилипла к поверхности стекла по дифракционной томографии (фиг.4А-4С). Если количество нитей оказывается очень низкой, то более длительное время инкубации могут быть использованы или уменьшение объема актинаРешение накаливания тоже помогает. Выбор одиночных относительно яркие нити (рис. 4D), а не запутанные объекты результатов в лучшее качество изображения. Во время фазы сбора, яркие в фокусе мигает следует рассматривать по (Видео 7) длины нити. Разреженный мигание следует рассматривать на этапе сбора и затем впоследствии в обрабатываемых данных должна быть тонкой непрерывной нити (фиг. 4E) и локализации на кадр должен постепенное снижение (рис. 4F), в отличие от фиг 3E.
Если мигает не является редким, или, если программное обеспечение не в состоянии локализовать молекулы, более тонкий артефакт, называемый неправильной локализации 32, может привести. Это происходит, когда средние программные позиция двух перекрывающихся молекул и локализация положение на полпути между ними. Свидетельством того, что у нас не было значительное число перекрывающихся BLIНКС и, следовательно, mislocalizations, что средние оценки точности должны быть одинаковыми в направлениях строк и столбцов, т.е. по горизонтали и вертикали; где есть mislocalizations они будут иметь место по всей длине нити, получают больше нормального мигать ( т.е. распространяться на большее количество пикселей), что, следовательно, были локализованы с меньшей точностью в одном из направлений. Проще всего это видно где есть один актиновых филаментов в области обработки изображений и он лежит горизонтально или вертикально. В этом случае, шторм микроскоп, достигнуто среднее точность 16 нм в обоих направлениях. Это приводит к точности предела, меры эффективного разрешения изображения примерно 34 нм. Эти показатели обеспечиваются ливень 27, однако, поскольку у нас есть волокнистый структуру одинаковым диаметром, 7 нм с очень малым фаллоидином-Alexa 647 этикетке можно взять меру FWHM оценить разрешение изображения. По дракрыло прямую линию через нити изображения сверхвысокого разрешения в ImageJ (Рисунок 4G), используя участок профиля функцию (рис. 4H), а затем выполняя Gaussian посадку (рис. 4I) ПШПВ рассчитывается как 43,2 нм. При попытке это измерение мы рекомендуем размер пикселя должен соответствовать или быть немного меньше, чем средняя оценка точности для изображения (см. info.txt файл Рисунок 1G). В этом случае 16 нм пикселей были использованы для восстановления изображения.
Две взаимосвязанные проблемы могут возникнуть с STORM, где мигающие флуорофоры стать неразреженных, т.е. отдельные молекулы в течение примерно 250 нм мгновение в то же время и, следовательно, сигналы перекрываются. Во-первых, в зависимости от алгоритма и критериев контроля качества, которые он использует, то мигает не может быть локализована на всех. Это приводит к образов супер-разрешения с нескольких или нет локализаций. Вторая проблемаmislocalizations происходит, когда два мигания произошло достаточно близко друг к другу, чтобы выглядеть как один миг. В этом случае положение в конечном изображении представляет собой среднее значение двух. Более подробно об этом см. ссылку 32. В обоих случаях это может произойти с образцами очень высокой плотности, недостаточной мощности лазера или с переключением проблемы буфера. Эта проблема проявляется, когда ряд нитей актина ветвления и / или пересекающих друг друга (рис. 5A-D, Video 9). Обрабатывая подмножества кадров, и сравнивая первый и последний 5000 кадров мы видим другую полученное изображение. В изображении супер-разрешением, используя первые 5000 кадров (рис. 5, в) мы видим, что есть много локализации в середине изображения, однако при использовании последних 5000 кадров, очень немногие из них являются очевидными, и мы остались с просто нити, хотя и несколько разрывными задолжать низким числом локализаций в мнимойе (рис. 5D). Если слишком высокая плотность мигание подозревается сравнение изображений с локализацией в данных кадра может убедительно показывают, что эта проблема имеет место, в течение первого множества кадров есть среднее число локализаций в кадре более чем 10 по сравнению с последним набором кадров, где это примерно 4 (рис. 5E). Для того чтобы минимизировать вероятность mislocalizations происходящих он идеально подходит, чтобы иметь как можно меньше локализации на кадр, как это возможно, хотя, если существует большое число молекул в быть отображены, то есть для образца высокой плотности, это требует, чтобы большое количество приобретения кадры приниматься приводит к другой проблеме в STORM микроскопии, который дрейф.
Боковой дрейф - нитей актина и координатных меток
Дрейф возникает, когда выборка перемещается по отношению к объективной линзы через фазы сбора данных. Это трудно или невозможно увидеть Даринаг фаза захвата изображений, особенно если это боковое а не осевой, или, если он не будучи специально измерена, как это обычно менее 50 нм в течение нескольких минут для относительно стабильных систем микроскопом. Тем не менее, в восстановленных изображений известных конструкций, таких как актиновых филаментов с хорошо определенной структурой, она может быть обнаружена в изображение, супер-разрешением. Первый признак того, что боковой дрейф может иметь место в том, что структура больше, чем ожидалось (6А, Video 8), например, с относительно большим по сравнению с FWHM предельных точность данных дождь, в данном случае 90 нм по сравнению с 67 нм. Однако, лучший способ для обнаружения дрейфа путем сравнения локализации как функции от времени, т.е. видеть, если локализации в более поздних кадров смещены по сравнению с теми, в начале кадров. Это хорошо видно в случае нитей актина, которые очень маленький, с равномерной структурой, когдаотображается с цветовым кодом с помощью коробки отслеживания функцию в ливень (рис. 6В и 6С).
Дрейф является хорошо узнаваемым проблема и существует ряд стратегий, которые могут быть использованы для минимизации его 19 или исправить это после приобретения либо с помощью координатных меток 21,43 или кросс-корреляции 44. Для того чтобы измерить дрейф и правильный для него, флуоресцентные шарики диаметром 100 нм могут быть использованы в качестве координатных меток (рис. 6d). Потому что они маленькие и яркие их позиция может быть точно измерить с помощью гауссовых подходящие алгоритмы, такие как дождь. В примере, где есть относительно тяжелый дрейф примерно 100 нм в течение 3 мин 10 сек, на этапе сбора (рис. 6е), функция отслеживания же коробка может быть использована для цветового кода и подтвердить, что произошло дрейф (рис. 6F ). Поскольку все четыре бусины в этом примере показать почти идентичный дрейф она ржно, чтобы выбрать один из них, в данном случае жгута 2, для использования в качестве ссылки и вычесть дрейф от других шариков (рис. 6 г). При добавлении координатных меток в биологическом образце интереса тогда становится возможным измерение и устранить любой дрейф где основная структура неизвестна или более чем переменная актиновых филаментов или флуоресцентного шарик.
Эпидермального фактора роста
Наконец, ЭФР-окрашенных клеток HeLa может быть использован, чтобы дать реалистичный пример разрешение снимка в клетках (рис. 7A, видео 10). Эти клетки являются относительно просто изображения, как они должны иметь большинство EGF-флуоресценции в самолет в фокусе на поверхности клеток в непосредственной близости от покровного стекла. Менее ярким область в центре соответствует положению ядра. TIRF освещение может повысить качество изображения, устраняя из фокуса флуоресценцию исходя из частей клеток мembrane не в непосредственной близости от стекла (приблизительно 150 нм проникновения в клетки). Увеличенный в регионах, представляющих интерес в дифракционной изображения, как правило, нечеткие (фиг. 7В и 7С), однако в изображениях супер-разрешения должна быть смесь кластеров и случайных изолированных отдельных пикселей (рис. 7D-7F). Они будут представлять либо отдельные рецепторы EGF на поверхности клетки или возможного небольшим количеством неспецифического связывания. Кластеры будет примерно 100 нм в диаметре и, скорее всего, соответствуют, образующих ямы и пузырьки, пути, через который ЭФР является преимущественно вниз регулируется и эндоцитозу. Типичные средние оценки точности около 20 нм для этого типа образца с точностью предел около 45 нм. Следует отметить, что этот предел точности мерой эффективным разрешением не принимать во внимание размер этикетки, или любой дрейф, которая может быть измерена с координатных меток, но все еще Noticeable на "кометных хвостов" на кластеры или с помощью функции коробки отслеживания, как указано на рисунке 6 и описано в разделе протокола 8.
| Компонент | Конечная концентрация |
| Каталаза | 1 мкг / мл (50 единиц) |
| Глюкоза | 40 мг / мл |
| Глюкозооксидаза | 50 мкг / мл |
| Глицерин | 12.50% |
| KCl | 1,25 мм |
| MEA-HCl | 100 мм |
| ТСЕР | 200 мкМ |
| Трис | 1 мм |
Таблица 3. Буфер Переключение
| Типичные Настройки Приобретение | Значение |
| Размер пикселя (нм) 160 | |
| Экспозиция (мс) | 10 |
| Усиление | 200 |
| Размер кадра (в пикселях) | 128 х 128 |
| Время цикла (кадров в секунду) | 52.5 |
| Номер кадра | 10000 |
| 640 нм лазер плотность мощности (кВт / см 2) | 2 |
Таблица 4. Настройки Приобретение
Рисунок 1. STORM Реконструкция изображения Использование ливень. (А) Открытие ливень изнутри MATLAB. (В) ливень графический интерфейс пользователя (GUI). (С) ливень критик GUI. (D) Регулировка контрастности окно. (Е) STORM изображения после пересмотра и корректировки контрастности. (F) Егогистограмм качества изображения метрик. (G)-файлы, созданные после нажатия кнопку Сохранить изображение в рецензент GUI. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. (А) дифракционного предела (DL) изображения показывают различные концентрации декстрана до визуализации STORM. Супер-разрешение (SR) изображения реконструкций имеют размер в пикселях 25 нм. 10000 изображения были собраны с пиксель размером 128 х 128 кадра и отдельные кадры показаны из этой последовательности (2000, 5000, 8000). Приобретенные со временем 10 мс экспозиции на 52,5 кадров в секунду. Изображения имеют размер в пикселях 160 нм. Для ясности просмотре 0,1% пикселей насыщения повышение контрастности был применен с использованием ImageJ. Средняя точностьоценки 28 нм (высокий), 24 нм (средняя) и 16 нм (низкий) для различных декстрана изображений. Плотность локализации являются 724 за мкм 2 (высокой), 526 за мкм 2 (средняя) и 13 за мкм 2 (низкой). (B) График, показывающий в среднем три 10000 каркасных последовательностей каждой концентрации декстрана. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение. (С) график зависимости количества принятых локализаций на кадр с помощью подвижного 100 кадров в среднем. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Низкое качество Декстран данных. (А) Дифракция ограничено кадр из последовательности 15000 кадров STORM. Обратите внимание на диффузное флуоресцентный туман через изображения. Это вызвано fluoropho разрешением диффундирующих через среду. 128 х 128 пикселей размер кадра, 10 мс время экспозиции и приобрести на 52,5 кадров в секунду. (Б) То же, что (А) после буфера был изменен. Обратите внимание на улучшенный контраст как несвязанные флуорофоры были смыты. (С) реконструкция изображения супер-разрешение, соответствующее данным, собранным в (А). Идентичные размер, но с пикселями 25 нм. Средняя оценка точности составляет 35 нм. (D) реконструкция изображения супер-разрешение соответствующих данных, собранных в (B). Идентичные размер, но с пикселями 25 нм. Средняя оценка точности составляет 30 нм. (Е) график зависимости количества принятых локализаций на кадр, используя скользящий 100 кадров в среднем. Красная линия соответствует последовательности STORM (& C), где есть высокий фон. Синяя линия показывает данные, соответствующие (B & D), где фон является низким. (F) график, показывающий количество принятого локализации для изображений, соответствующих высоким (С) и низкой (D) справочные данные.HREF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 4. Типичные данные актина. (AC) дифракционной образы нитей актина перед добавлением буфера и изображений STORM переключения. Переменные длины волокон можно увидеть. Очень яркие нити часто несколько нитей запутанные вместе. Размер пикселя составляет 160 нм. (D) дифракционной изображение одного актиновых филаментов. (Е) STORM изображения (0,1% повышение контрастности применяется в ImageJ). Из последовательности кадров с 10000 пикселя размером кадра 128 х 128, 10 мс время экспозиции и приобрел на 52,5 кадров в секунду. Размер пикселя составляет 16 нм. Средняя оценка точности составляет 16 нм. (F) график зависимости количества принятого локализациис на кадр, используя скользящий 100 кадров в среднем. (G) увеличено области актина нити из (E) до Увеличение контрастности с профилем желтая линия, проведенной через. (H) Вид участок профиль от желтой линии, проведенной через актиновых филаментов. Созданный в ImageJ. (Я) Гаусса подходят профиля участка с помощью подгонки кривой инструмент в ImageJ. Стандартное отклонение, д, умножали на 2,35, чтобы получить измерение ПШПВ 43,2 нм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Mislocalized нитей актина. (А) Ограниченное дифракцией актина накаливания. 160 нм пикселей. (B) ШТОРМОВАЯ изображение актиновых филаментов, показанной в (А). Из последовательности 20000 кадров с 128 128 пикселей ФрамРазмер е, 10 мс время экспозиции и приобрести на 52,5 кадров в секунду. Размер STORM пиксель 16 нм. Все 20 000 кадров были обработаны. Средняя оценка точности составляет 17 нм. (C) В (В), но только с первых 5000 кадров в последовательности кадров, обработанных 20000. Среднее оценка точности составляет 18 нм. (D) В (В), но только с последних 5000 кадров в последовательности кадров, обработанных 20000. Средняя оценка точности составляет 17 нм. (Е) График локализаций в данных кадра от полной 128 128 пикселей зрения кадров.
Рисунок 6. Боковой дрейф. (A) STORM образ актиновых филаментов, восстановленного из последовательности 10000 кадров с размером пикселя кадра 64 х 64, 10 мс время в экспозиции и принято на 64,6 кадров в секунду. Размер STORM пиксель 32 нм. Средняя оценка точность32 нм. (В) STORM изображение отображается с помощью функции «шкатулку Tracking 'в ливень. Локализации отображаются с цветом, соответствующим числу кадров, когда они были приобретены, например, локализации от рано последовательности сбора голубые; локализации с конца в последовательности приобретения красные. Перемещенные цвета указывают, что дрейф произошло. (С) увеличено области (А) отображается с помощью функции Вставка слежения в ливень. Перемещенные цвета указывают дрейф произошло. (D) дифракционного предела изображение из четырех 100 нм флуоресцентных шариков, которые могут быть использованы в качестве координатных меток. Размер пикселя 160 нм. Числа 1-4 шоу обрезается и увеличенной бусы индивидуально. (E) Каждый шарик флуоресцентный соответствующий (D) реконструирован в ливень с последовательностью кадров с 10000 пикселя размером кадра 128 х 128, 10 мс время экспозиции и приобрел на 52,5 кадров в секунду. Размер STORM пиксель 5 нм. Средняя оценка точность 7 нм. (F) Бисер, соответствующие (D) и (E),отображается с помощью функции «шкатулку Tracking '. Перемещенные цвета указывают дрейф произошло. (G), используя шарик номер 2 в качестве эталона, бусы 1, 3 и 4 отображаются после функция "вычесть дрейфа 'используется в ливень. Сравнение с (Е) показывает, что боковой снос была исправлена. Размер STORM пиксель 5 нм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 7. Типичные данные EGF. (A) Дифракционная ограничено изображение части клетки HeLa сосредоточены на базальной клеточной поверхности. Желтые прямоугольники обозначают увеличено регионах, представляющих интерес, показанных на (B) & (С). (В) Увеличенный дифракции ограниченного образ от области вблизи края ячейки (коробка B). (С) Увеличенный дифракции ограниченного изображение из региона под ядра (коробка C). (D) STORM изображение, соответствующее (А). Из последовательности кадров с 10000 пикселя размером кадра 128 х 128, 10 мс время экспозиции и приобрел на 52,5 кадров в секунду. Размер STORM пиксель 25 нм. Средняя оценка точности составляет 21 нм. (E) ШТОРМОВАЯ изображение, соответствующее поле E (D). (F) Ясно изображение, соответствующее поле F (D). (G) Локализации на кадр данных (D). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
. Видео 1-4 Видео не соответствуют Рисунок 2А с различными концентрациями декстрана: 1 = высокое, 2 = средний, 3 = низкий, 4 = нет). 10000 кадров последовательности с 128 х 128 пикселей типоразмеров, приобретенных со временем 10 мс экспозиции на 52,5 кадров в секунду. Щелкните здесь для просмотра видео 1 ,load/50579/50579video2.mov "целевых =" _blank "> видео 2, видео 3 , видео 4
Видео 5-6. Видео соответствуют Рисунок 3 A & B. Видео 5 является предварительной стирки и видео 6 после мытья после несвязанные флуорофоры были удалены. 15000 кадров последовательности, используя пиксельный размер кадра 128 х 128, 10 мс время в экспозиции и приобрести на 52,5 кадров в секунду. Щелкните здесь для просмотра видео 5 , видео 6 .
Видео 7. Видео показывающее исходный последовательность кадров, который был обработан для формирования изображения шторма в рисунке 4E. 10000 кадров sequeсть с пиксельной размером кадра 128 х 128, 10 мс время в экспозиции и приобрести на 52,5 кадров в секунду. Щелкните здесь для просмотра видео 7 .
Видео 8. Видео показывающее исходный последовательность кадров, который был обработан для формирования изображения шторма в фиг.5В. 20000 последовательности кадров с пиксельной размером кадра 128 х 128, 10 мс время в экспозиции и приобрести на 52,5 кадров в секунду. Щелкните здесь для просмотра видео 8 .
Видео 9. Видео показывающее исходный последовательность кадров, который был обработан для формирования изображения шторма в фиг.6А. 10000 последовательности кадров с размером пикселя кадра 64 х 64, 10 мс время в экспозиции и принятым на 64,6 кадров в секунду. Клиск здесь, чтобы посмотреть видео 9.
Видео 10. Видео показывающее исходный последовательность кадров, который был обработан для формирования изображения шторма в рисунке 7D. 10000 последовательности кадров с пиксельной размером кадра 128 х 128, 10 мс время в экспозиции и приобрести на 52,5 кадров в секунду. Щелкните здесь для просмотра видео 10 .
Discussion
Мы покажем, с некоторыми простыми образцов и свободно-доступной программной обработки ливень, то можно оптимизировать STORM супер-разрешением изображения. Эти инструменты и методы обеспечит полезные отправные точки для новых пользователей и способы для опытных пользователей, чтобы увеличить уверенность в своих микроскопов и их использовать их для изучения биологических и клеточных структур с беспрецедентной детализацией. Используя комбинацию образцов с известными или хорошо понятных структур и алгоритма, которые могут производить целый ряд полезных метрик качества изображения, например, средних оценках точности, числа локализации и гистограмм, показывая можно улучшить качество изображения и иметь большую уверенность в процессе формирования изображения STORM. Существует не один размер не подходит всем подход к приобретению данных, поскольку есть целый ряд различных коммерческих и самодельных конфигураций микроскопа, который может использоваться. Кроме того, есть много пробоподготовки и изображения шаги приобретение которых может InfluEnce окончательное изображение поэтому имея программные средства и тестовые образцы имеет решающее значение для понимания и оптимизации STORM качество изображения.
Кроме того, эти протоколы могут предоставить полезные и менее неоднозначные способы устранения неполадок любые проблемы, которые могут возникнуть. Например декстран образец представляет собой очень полезный способ определить, есть ли смещение лазерного луча или неравномерность освещения образца. Если есть опасения, что буфер переключения не может быть рабочих очень простой визуальный тест, чтобы увидеть, есть ли 'мигает' поможет. Актиновые филаменты являются полезным способом измерения разрешение использования сравнений FWHM, а также выделяя дрейфа и неправильной локализации артефакты. Тем не менее, следует отметить, что, как локализации на основе методов супер-разрешения может быть флуорофором плотность чувствительны, несмотря на других способствующих факторов, таких как время экспозиции, частоте кадров, лазерных полномочий и пути снимок обработан, невозможно назначить Решение очастности микроскоп и предположим, что все изображения будут иметь эту резолюцию. Что можно, однако, для измерения различных аспектов резолюции, такие как среднее локализации уточнений, числа локализации и дрейф 27. Даже если фидуциальные маркеры не могут быть включены в каждом эксперименте, они могут, по крайней мере, быть использованы для характеристики системы микроскопа, его окружение и лучше понять оперативные соображения, такие как, как требуется много времени, чтобы достичь теплового равновесия после запуска. А также с поправкой на боковой дрейф, фидуциальные маркеры могут быть использованы для характеристики и правильным для осевого смещения, хотя это требует использования астигматического линзы и механизм обратной связи, чтобы исправить положение образца в то время как изображения приобретаются 43. Коммерческие системы супер-разрешения, как правило, включают в себя какую-то контроля устойчивости или блокировки фокуса механизма, который может быть более практичным решением для коррекции фокусировки дрейф.
Тамповторно альтернатив неспецифически покрытия стекло с декстрана, например, с использованием красителей, непосредственно или другие сопряженные молекулы, такие как вторичными антителами. Ограничение этих подходов является то, что число молекул, св занных с стеклом, не известно. Альтернативные нитевидные структуры, которые были использованы, включают микротрубочки 28 и ДНК 21. Тем не менее, сочетание очень небольшого размера и удобных коммерчески доступных реагентов сделать актина привлекательную альтернативу, в частности, расстояние разделения расходящихся или разветвленных нитей также может быть полезным измерение производительности системы 27.
Существует возможность для дальнейшего развития образцов, несмотря на недавний прогресс в этой области 28,29,46,47. В частности, многоцветные изображения представляет собой ряд проблем во всех 3-х основных аспектов изображений, образец маркировки, получения изображений (аппаратный) и программное обеспечение (для обработки изображений и выравнивания). Там уже былряд публикаций, посвященных этим аспектам 4-6, и поэтому очевидно, что соответствующие образцы для испытаний и методики имеют решающее значение для создания и надежно интерпретации этих типов изображений. Действительно, в последнее время было показано, что dSTORM могут быть использованы, чтобы взять два цветных изображений, и решить, очень симметричным характер порового комплекса ядерной и авторы предположили, что это было бы идеальным способом для оценки производительности хроматических аберраций поправок 45. Другой интересный подход является использование ДНК-оригами для создания nanoruler, что создает возможность позиционирования флуорофорами в определенных расстояниях суб-дифракционных кроме 46. Это обеспечивает способ оценки разрешение и сделать измерения расстояния. Тем не менее, конечная цель заключается в применении этих методов супер-разрешения для неидеализированному образцов, таких как клетки, которые являются сложные трехмерные структуры. В этом случае сочетание более глубокое понимание тон методика в сочетании с программными средствами, которые помогают пользователю в приобретении данных, ее обработки в соответствующих путей, а также предоставление показатели изображения, вероятно, будет окончательный ответ. 28,29,47,48
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем, финансирование от химической и биологической метрологии программы Национального управления измерения в Великобритании. Мы благодарим Себастьян ван де Линде, Миклош Эрдели и Эрик Rees для технических консультаций и предложений. Мы благодарим Миклош Эрдели, Эрик Риса и Макс Ряднов за полезные замечания и обсуждения этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
| 100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
| EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
| 640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
| LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
| ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
| Table 1. Materials & Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyde - 10 % solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Galbraith, C., Galbraith, J. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124, 1607-1611 (2011).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26, 285-314 (2010).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317, 1749-1753 (2007).
- Bates, M., Dempsey, G., Chen, K. H., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13, 99-107 (2012).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical journal. 99, 2686-2694 (2010).
- Baddeley, D., et al. 4D Super-Resolution Microscopy with Conventional Fluorophores and Single Wavelength Excitation in Optically Thick Cells and Tissues. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Jones, S., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5, 1047-1052 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Juette, M., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Meth. 5, 527-529 (2008).
- Vaziri, A., Tang, J., Shroff, H., Shank, C. Multilayer three-dimensional super resolution imaging of thick biological samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 20221-20226 (2008).
- York, A., Ghitani, A., Vaziri, A., Davidson, M., Shroff, H. Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM with genetically expressed probes. Nature Methods. 8, 327-333 (2011).
- Jones, S., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8, 499-505 (2011).
- Shroff, H., Galbraith, C., Galbraith, J., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5, 417-423 (2008).
- Hess, S., et al. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 17370-17375 (2007).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Klein, T., et al. Live-cell dSTORM with SNAP-tag fusion proteins. Nature Methods. 8, 7-9 (2011).
- Folling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nature Methods. 5, 943-945 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hofmann, M., Eggeling, C., Jakobs, S., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17565-17569 (2005).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Wolter, S., et al. Real-time computation of subdiffraction-resolution fluorescence images. Journal of Microscopy. 237, 12-22 (2010).
- Wolter, S., et al. rapidSTORM: accurate, fast open-source software for localization microscopy. Nat. Methods. 9, 1040-1041 (2012).
- Henriques, R., et al. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7, 339-340 (2010).
- Rees, E., et al. Blind Assessment of Localisation Microscope Image Resolution. Journal of Optical Nanoscopy. 1, 12 (2012).
- Dempsey, G., Vaughan, J., Chen, K., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1036 (2011).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature. 6, 991-1009 (2011).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-Resolution Fluorescence Imaging with Conventional Fluorescent Probes. Angewandte Chemie International Edition. 47, 6172-6176 (2008).
- Owen, D. M., Sauer, M., Gaus, K. Fluorescence localization microscopy: The transition from concept to biological research tool. Commun Integr Biol. 5, 345-349 (2012).
- van de Linde, S., Wolter, S., Heilemann, M., Sauer, M. The effect of photoswitching kinetics and labeling densities on super-resolution fluorescence imaging. Journal of biotechnology. 149, 260-266 (2010).
- Veatch, S., et al. Correlation Functions Quantify Super-Resolution Images and Estimate Apparent Clustering Due to Over-Counting. PLoS ONE. 7, e31457 (2012).
- Holden, S., Uphoff, S., Kapanidis, A. DAOSTORM: an algorithm for high- density super-resolution microscopy. Nature. 8, 279-280 (2011).
- Cox, S., et al. Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics. Nat Methods. 9, 195-200 (2012).
- Mukamel, E., Babcock, H., Zhuang, X. Statistical deconvolution for superresolution fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 102, 2391-2400 (2012).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13978-13983 (2012).
- Parkar, N. S., et al. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1301-1312 (2009).
- Clague, M. J., Urbe, S. The interface of receptor trafficking and signalling. J Cell Sci. 114, 3075-3081 (2001).
- van de Linde, S., Sauer, M., Heilemann, M. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of proteins in the mitochondrial inner membrane with photoswitchable fluorophores. Journal of Structural Biology. 164, 250-254 (2008).
- Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M., Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society. 127, 3801-3806 (2005).
- Heilemann, M., Mukherjee van S,, A,, Sauer, M. Super-Resolution Imaging with Small Organic Fluorophores. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6903-6908 (2009).
- Lee, S. H., et al. Using fixed fiduciary markers for stage drift correction. Opt Express. 20, 12177-12183 (2012).
- Mlodzianoski, M., et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Optics express. 19, 15009-15019 (2011).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, 570-575 (2012).
- Steinhauer, C., Jungmann, R., Sobey, T. L., Simmel, F. C., Tinnefeld, P. DNA origami as a nanoscopic ruler for super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 8870-8873 (2009).
- Laevsky, G. S., O'Connell, C. B. Comparative and practical aspects of localization-based super-resolution imaging. Current protocols in cytometry. Chapter 2, Unit2 20 (2013).
- Gould, T., Verkhusha, V., Hess, S. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nature. 4, 291-308 (2009).
