Summary
Los fermentadores se utilizan para aumentar el rendimiento de la cultura y la productividad de las células obtenidas por biotecnología. Después de revisar varios microbios o animales candidatos de cultivo de células en matraces de agitación, el siguiente paso lógico es incrementar la biomasa del cultivo seleccionado con el fermentador. Este video muestra la configuración y el funcionamiento de un sistema típico de biorreactor de sobremesa.
Abstract
Sistemas de fermentación se utilizan para proporcionar un entorno de crecimiento óptimo para muchos tipos diferentes de cultivos de células. La capacidad ofrecida por fermentadores para controlar cuidadosamente la temperatura, el pH y las concentraciones de oxígeno disuelto en particular, los hace esencial para el crecimiento a gran escala eficiente y la expresión de productos de fermentación. Este video describe brevemente las ventajas del fermentador en el frasco de agitación. También identificará los componentes clave de un sistema típico de la fermentación de sobremesa y dar instrucción básica sobre la configuración de la embarcación y la calibración de sus sondas. El espectador se familiariza con el proceso de esterilización y se muestra cómo inocular el medio de cultivo en el recipiente con la cultura. También se mostraron los conceptos básicos de manejo, muestreo, y la cosecha. También se debatirá sobre el análisis de datos simple y limpieza del sistema.
Introduction
La tecnología de fermentación básica es una extensión de la técnica de matraz de agitación simple para crecimiento de cultivos. Se desarrolló a partir del deseo de controlar los entornos de crecimiento de cultivos vivos de una manera más completa y cuantitativa. Agitar frascos cultivo discontinuo se limitan generalmente a control impreciso de temperatura. La uniformidad de la temperatura en un agitador incubados o sala caliente es muy variable, a veces se desviaba 5 ° C o más desde el punto de ajuste deseado. Desde el matraz de agitación normalmente se agita a una velocidad fija, el intercambio de la absorción de oxígeno y de gas es limitada. Una vez que el oxígeno ambiental disponible se agota, la mayoría de las culturas no se desarrollan. No hay control del pH en matraces de agitación. En muchos casos, si la cultura no está limitado por prima de alimentación, se convierte en ácido hasta el punto de detrimento de la cultura y la respiración se ralentiza dramáticamente. La mayoría de agitar matraz culturas también se ejecutan como un «lote», lo que significa que se alimentan sólo una vez en o cerca del principio de las culturas inoculation. Después de que se consume esta fuente de carbono inicial, la cultura deja de crecer. En algunos casos, su metabolismo puede cambiar y empezar a consumir otros metabolitos en el caldo de cultivo, a veces cambiando las características de la biomasa resultante o proteína. Frascos de agitación también suelen estar sujetos a la pérdida por evaporación de comunicación en ambientes de cultivo de verano, por lo general el 10% del volumen por 24 horas a 37 ° C. Esta pérdida cambia la densidad del cultivo y se prohíbe el funcionamiento a largo plazo del sistema. Finalmente, el usuario puede encontrar la formación de espuma de los medios de comunicación después de la agitación. La aparición de espuma en el espacio de cabeza por encima de la cultura limitará el intercambio de gases y un mayor crecimiento de la babilla.
El sistema de fermentación básica está diseñado para hacer frente a todas estas limitaciones. El control cuidadoso de la temperatura se consigue en recipientes de fermentación por el uso de la agitación del impulsor y una camisa de calentamiento. Un sensor insertado en el recipiente y la retroalimentación de control de la calefacción y refrigeración de esta chaqueta generalmenteresultados en el control de temperatura de ± 0,1 ° C en torno a la consigna. Fermentadores de sobremesa generalmente proporcionan un control de pH mediante la adición de reactivo líquido a través de una bomba. El valor de pH se controla continuamente en un esfuerzo para mantener el óptimo entorno para el crecimiento celular. La correcta aireación se mantiene por el impulsor de mezcla antes mencionada o por la infusión de aire o gas de oxígeno suplementado directamente en la cultura. Con los cultivos sensibles al cizallamiento, el gas oxígeno complementado es el principal mecanismo para el mantenimiento del nivel de oxígeno en la cultura. La medición de oxígeno en solución se consigue normalmente por una sonda polarográfica que normalmente no está disponible para su uso en matraces de agitación. También es posible añadir de forma continua o periódicamente de alimentación al recipiente para mantener el crecimiento de una forma lineal o exponencial. El condensador de gas de salida proporciona una superficie fría para el vapor en el flujo de gas de escape para condensar, preservando así volumen de cultivo y la densidad. Además periódica de surfactante antiespumante es accionadapor una sonda de conductividad en la cultura, la reducción de la espuma en la superficie y permitiendo el intercambio de gases.
El buque, con todas las sondas, los accesorios, los impulsores, tuberías de recolección, y los tubos, se monta y se esteriliza en una autoclave estándar. Después de calibraciones sonda definitiva y la estabilización de entorno operativo, se añade la cultura de la embarcación. El sistema puede entonces ser utilizado para caracterizar la cultura de una manera que es más cuantitativa y precisa que con un método de frasco de agitación. El control estricto de la temperatura, pH, contenido de oxígeno, consumo de alimento, la evaporación de líquido, y niveles de espuma, todo ello contribuye a una mucho mayor biomasa y mejor rendimiento de proteína.
Protocol
- Comienza la operación con la instalación del vaso. Un fermentador convencional tiene los siguientes componentes que necesitan ser instalado (Figura 1):
- sonda de pH - para la medición de pH en el cultivo vivo. Calibrar la sonda antes de la instalación y esterilizar con el buque. Instale la sonda en la placa superior.
- PO 2 de la sonda - para la medición del contenido de oxígeno disuelto en el interior del buque durante la fermentación. Instalar en la placa superior.
- Tubería Harvest para el muestreo de la cultura. Instale este componente de altura ajustable en la placa superior.
- Burbujeador de gas - reside en la parte inferior del recipiente y proporciona la infusión de gas a la cultura. Enganche rociador hasta la fuente de gas en el fermentador y montar en la placa superior.
- Eje impulsor y el impulsor - el impulsor se mueve la cultura y es fundamental para mantener la uniformidad de la cultura en el vaso.
- Condensador de gas de escape - para detener la pérdida por evaporación en el recipiente por enfriamiento de la ruta del gas de escape.
- Líneas de la bomba de reactivos para el control de pH o adición de la alimentación.
- Limpiar el vaso y placa cabecera con agua y jabón. Se recomienda utilizar un cepillo suave para fregar el vaso y placa superior. Lejía o limpiadores con cloro no se pueden utilizar para limpiar el recipiente.
- Si el material no está termolábiles, añadirlo al recipiente limpio. Sólo añadir hasta que se alcance el volumen máximo de trabajo. En este caso, el volumen máximo de trabajo es 3,3 L para un recipiente de 5 L de volumen total.
- Monte la placa cabezal recipiente, asegurándose de que la junta tórica esté bien asentada.
- Instale el condensador de gas de escape.
- Instale la sonda antiespuma en su puerto 10 mm.
- Instale el tubo de la cosecha en su puerto 10 mm. Ponga un pedazo de tubería en la parte superior de la misma y fijarlo apagado.
- Instale la tubería y un filtro de 0,20 micras en la entrada de burbujeo y después fijar esto.
- Calibre la sonda de pH:
- Reúna 2 tampones de referencia en pequeños vasos, una botella de lavado, y un wa repuestovaso de precipitados SH.
- Enganche el pH de la sonda hasta el fermentador y gire el fermentador en.
- Desplácese hasta el parámetro pH y utilizar el botón de menú, desplácese hasta la opción 'Cal' y pulsar 'Enter'.
- Seleccione '2 'para 2 puntos de calibración.
- Lavar la punta de la sonda y sumergir en el tampón de referencia baja. El valor en el fermentador se estabilizará. Usando la teclas + y -, ajuste el valor mostrado para que coincida con el valor de la memoria intermedia de referencia de pH. Una vez que deje de parpadear, pulse "Enter".
- Lave la sonda fuera y la inserta en el segundo tampón de referencia. Deje que el valor se estabilice y después utilice el teclado para que el valor que se muestra coincide con el valor de referencia alto amortiguamiento. Presione 'Enter' para confirmar.
- Lave la punta de la sonda y desconéctela del fermentador. Ponga la tapa protectora en la conexión e instalar en la placa superior.
- Abra la punta pO2 sonda y comprobar para asegurarse de que noes suficiente electrolito para cubrir la punta. Si no es así, añadir un poco al depósito y cerrar una copia de seguridad.
- Instale la sonda de pO2 en la placa superior y asegúrese de que la tapa del autoclave se puso para proteger sus conexiones eléctricas. Se calibró después de la esterilización.
- Obtener una botella de alimentación de reactivo con un tubo de inmersión y el filtro de aire. Añadir tubería de la bomba al puerto de tubo de inmersión y conecte el otro extremo al puerto de entrada en el fermentador.
- Coloque la tubería en todos los puertos no utilizados luego pinza de la línea fuera.
- Instale un filtro de 0,45 micras en el condensador de gases de escape. Este filtro se asegura de que el buque no presurizar en el autoclave.
- Compruebe que todos los tubos que van por debajo del nivel de los medios de comunicación se sellan para evitar que el material salga a la luz.
- Ponga el recipiente en el autoclave durante 25 - 30 min a 121 ° C, por ciclo de líquido. Precaución: Cuando sale va a ser muy caliente.
- Instale el recipiente en la base del fermentador.
- Conecte el pHsondear cable.
- Conecte el cable de la sonda de pO2.
- Enganche el rociador hasta el rotámetro adición de gas.
- Añadir estérilmente 1 reactivo M NaOH a la botella con el tubo de inmersión e instale el cabezal de la bomba en la cabeza de la bomba de husillo base.
- Coloque el sensor de temperatura en el tubo protector en la placa superior. Asegúrese de que va todo el camino a la parte inferior de la vaina.
- Baje el brazo de agitación sobre el acoplamiento vasos impulsor.
- Asegúrese de que el fermentador está encendido.
- Verificar que el agua está disponible para el fermentador.
- Encienda el suministro de aire al fermentador.
- Desplácese hasta el parámetro de temperatura y ajustar la temperatura a 37 ° C. Pulse el botón "Enter" para iniciar el control de la temperatura. El recipiente se calienta en 15 minutos o menos.
- Girar el flujo de gas a 1 volumen del recipiente de los medios de comunicación por minuto o menos. Para esta configuración, el flujo de gas es 3 L / min. Las burbujas deben aparecer en la parte inferior.
- Desplácese hasta la agitación parameter y ajustado a 300 rpm. Presione 'Enter' para activar la agitación.
- Una vez que la temperatura ha llegado a 37 ° C, desplácese hasta el parámetro pH y ajustarlo a 6.8. Gire el control de pH pulsando el botón 'Enter'.
- Establezca la agitación a la velocidad máxima de 1000 rpm para la carrera.
- Asegúrese de que la sonda de pO2 está polarizado correctamente para mostrar los valores adecuados. Después de 2 horas, desplácese al parámetro de PO 2 y utilice el botón "Menú" para seleccionar la 'Función Calibrar "y seleccione la calibración de 1 punto.
- Después de 15 minutos, utilizar los cursores para ajustar el valor a 100 y pulsa 'Enter'. Esto calibrará PO 2.
- Desplácese a la agitación y se puso a 300 rpm.
- Con el botón "Menú", gire el 'Cascade' en 'on' en el menú de la agitación. Esto aumentará la velocidad de agitación en un esfuerzo para despedazar las burbujas de aire y forzar más oxígeno en la solución a medida que aumenta la demanda de crecimiento. Desplácese hasta el parámetro PO 2 y establezca el valor en 30. Pulse el botón "Enter" para iniciar PO 2.
- Inicie el paquete de software de control de la PC.
- Una vez que las sondas son calibradas, es estable agitación a 300 rpm, la temperatura es a 37 ° C y pH es cercano a 6,8, es el momento para inocular. El uso de alcohol, esterilice el puerto que se utilizará para la inoculación.
- Dibuje el inóculo en una jeringa y añadirlo al puerto esterilizado. Cierre el puerto.
- Marca el momento de la inoculación en un libro de registro.
- También es importante tomar una muestra a tiempo de esterilización. Esterilizar el extremo del tubo de tubo de la cosecha con alcohol.
- Abra la abrazadera que cubre el puerto de la cosecha y el uso de una jeringa para extraer una muestra. Esta primera muestra es generalmente descartado porque se ha sentado en la tubería.
- Usar otra jeringa para extraer otra muestra.
- Con un tercio de la jeringa, empuje el aire hacia atrás a través de la tubería para eliminar la mayor cantidad de volumen muertode la línea y la abrazadera de la línea de fuera.
- Determinar la densidad de las células y el pH y registrar los valores. Con los cultivos microbianos, es útil para registrar los valores cada hora. Interval es dependiente de la cultura.
- Metodología de cosecha depende de la intención para el cultivo después de que se complete el crecimiento. En este caso, muestra la cultura un tiempo final para recibir los valores de punto final para la densidad celular y la posible medición de pH o de peso celular húmedo. Abra la placa cabezal dispuesto de los contenidos en un "tanque de matar" designado con cloro u otros agentes antimicrobianos.
Representative Results
El biorreactor se puede ejecutar con o sin el software IRIS. Sin embargo, para la captura de datos, lo mejor es utilizar el software. Antes de la adición de las bacterias, los sensores de pH y oxígeno deben ser calibrados, el ajuste de la velocidad del impulsor y el ajuste de la temperatura. En la Figura 2, se presenta la salida de datos para un funcionamiento biorreactor. La temperatura se fijó a 30 ° C, la velocidad del impulsor a 200 rpm. Los parámetros pueden ser diferentes para cada experimento, pero antes de la adición de las bacterias, el sistema debe ser en estado de equilibrio. En la Figura 3, se muestra el cambio en la concentración de oxígeno con la adición del cultivo bacteriano. Los puntos de ajuste para este experimento son de 37 ° C, un agitador a 200 rpm, O 2 al 70%. A la hora 19:20, la bomba de alimentación proporciona el cultivo de siembra bacteriana a una DO de 0,1 provocando una caída inmediata en el nivel de O 2. El biorreactor responde a la cambiar el nivel de O 2 con un aumento en la velocidad de flujo de aire y el impulsor. Tél puso los puntos sobre los aumentos se establecen en la cascada (paso 35). El pH del reactor se controló en tiempo real, con el pH disminuyendo luego aumentando como se demuestra por la fluctuación de la línea de pH con el tiempo (Figura 4). Todo el funcionamiento se puede analizar y ajustar los parámetros para los experimentos posteriores.
Figura 1. Biorreactor de bancos de trabajo con todas las partes marcadas y conectados. Esta figura muestra el reactor de tanque agitado en el comienzo de una carrera. Las partes del reactor se etiquetan y se incluyen los sensores, impulsor, indicador de temperatura, botellas de alimentación y toma de muestras, la lumbrera de escape, manómetro, camisa de calentamiento, torre del condensador, y el panel de control.
Figura 2. La imagen en pantalla de sof biorreactortware al comienzo de la carrera. Al inicio de una carrera de tanque agitado, la temperatura se ajustó a 30 ° C (línea amarilla), la velocidad del rotor a 200 rpm (línea roja), pH 6,5 (línea verde), y PO 2 al 57,2% (línea azul). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. La imagen en pantalla del software biorreactor durante la carrera como el oxígeno disminuye. Cuando el cultivo está en fase de crecimiento activo, consume oxígeno y la cantidad de oxígeno en el reactor se redujo (línea azul). Al aumentar la velocidad del impulsor, más oxígeno se puede agregar a la cultura (línea roja). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 4. La imagen en pantalla del software de biorreactor que muestra el cambio de pH en el tiempo. El pH del cultivo se controla de forma continua y con el tiempo se disminuye a medida que se produce ácido láctico y luego aumenta a medida que la base se añade al biorreactor (línea azul). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Discussion
Biorreactores de tanque agitado son el estándar en la industria de la biotecnología y se han utilizado durante más de 40 años 1. El tanque agitado pequeña ha sido importante para la ampliación, a escala reducida, la optimización de la tensión, la caracterización y desarrollo de procesos. También puede tener un papel importante en el desarrollo de la medicina individualizada 2. El biorreactor pequeña escala es más similar a las condiciones in situ para el crecimiento celular, ya que se puede supervisar y optimizado a lo largo de una carrera. Muy a menudo, los experimentos iniciales se realizaron utilizando matraces de agitación, pero las condiciones en el biorreactor pequeña escala difieren significativamente de la de frasco de agitación. En un experimento, se encontró que las condiciones para el crecimiento óptimo de los E. coli y la producción de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) en el matraz de agitación no se traducen en el depósito de agitación (datos no publicados).
Otros métodos de las células que crecen en gran escala incluyen botellas de rodillos, sencillo usí mecedora biorreactores plataforma 3 y biorreactores más grandes de un solo uso con un volumen de trabajo de 50 a 5000 L. Cada método proporciona desafíos para ampliación, pero ha encontrado un lugar en la producción. El uso único de oscilación biorreactor plataforma es similar a la de tanque agitado, y proporciona un entorno regulado. Se diferencia de la de tanque agitado en que la mezcla se produce debido a un movimiento de balanceo generar ondas para evitar la sedimentación de células y proporcionar la oxigenación. La hidrodinámica para este método son diferentes de la de tanque agitado y el volumen máximo está limitado a 1,000 L. Las diferencias pueden afectar el crecimiento celular y la producción de productos. Otros sistemas de un solo uso se combinan el depósito de agitación con el reactor desechable para, proporcionar una plataforma con un mínimo de infraestructura y sobrecarga asociada, y la capacidad de alto rendimiento bioprocesamiento 4.
Los nuevos usuarios de biorreactores de sobremesa pueden tener problemas para determinar los puntos de ajuste iniciales de pH, pO 2 y temtemperatura, sin embargo, la investigación publicada se puede hacer referencia para esta información 5, 6, 7, 8, 9. Con cultivos bacterianos, en particular, se recomienda iniciar la agitación a la misma velocidad que el matraz agitador y la temperatura en el mismo punto de ajuste. Cultura de pH de matraces de agitación anteriores carreras también se puede utilizar como punto de partida. El ajuste del valor de pO2 es más difícil y se determina normalmente empíricamente. Sin embargo, a partir de 50% PO 2 es un punto de partida recomendado.
Disclosures
Autor A. Magno es un empleado de ATR Biotech que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.
Acknowledgments
Este proyecto se apoyó en parte por la Universidad Johns Hopkins, Oficina del Rector a través de la Iniciativa Científica Gateway.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Sigma | L3022 | |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G | |
| LB broth | Sigma | L3022 | |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 | |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R | |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 | |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 | |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 | |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 | |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 | |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 | |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 | |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 | |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
References
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