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Biology

मानव Lipoaspirates से वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के मैनुअल अलगाव

Published: September 26, 2013 doi: 10.3791/50585
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4, 3,5
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

2001 में, यूसीएलए में शोधकर्ताओं वयस्क स्टेम कोशिकाओं की आबादी के अलगाव, वसा ऊतकों से, वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं या ASCs करार का वर्णन किया. यह लेख collagenase का उपयोग कर एक पुस्तिका, enzymatic पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग lipoaspirates से ASCs के अलगाव की रूपरेखा.

Abstract

2001 में, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स, में शोधकर्ताओं वे शुरू में प्रसंस्कृत Lipoaspirate कोशिकाओं या पीएलए कोशिकाओं में कहा कि liposuctioned वसा ऊतकों से वयस्क स्टेम कोशिकाओं की नई आबादी के अलगाव का वर्णन किया. तब से, इन स्टेम कोशिकाओं वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं या ASCs के रूप में दिया गया है और स्टेम सेल अनुसंधान और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में सबसे लोकप्रिय वयस्क स्टेम सेल आबादी में से एक बन गया है. लेख के हजारों अब हड्डी उत्थान, परिधीय तंत्रिका मरम्मत और हृदय इंजीनियरिंग सहित, पुनर्योजी पशु मॉडल की एक किस्म में ASCs के उपयोग का वर्णन. हाल के लेख क्लिनिक में ASCs के लिए उपयोग करता है की असंख्य वर्णन करने के लिए शुरू कर दिया है. इस लेख में दिखाया प्रोटोकॉल को मैन्युअल और enzymatically कॉस्मेटिक प्रक्रियाओं से प्राप्त lipoaspirates की बड़ी मात्रा से ASCs अलग करने के लिए बुनियादी प्रक्रिया की रूपरेखा. इस प्रोटोकॉल आसानी से पहुंचा या accommod को नीचे किया जा सकता हैlipoaspirate की मात्रा खाया और abdominoplasties और अन्य इसी तरह की प्रक्रियाओं के माध्यम से प्राप्त वसा ऊतकों से ASCs अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

Introduction

2001 में, वसा ऊतकों से multipotent स्टेम कोशिकाओं की एक ख्यात आबादी पत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग 1 में वर्णित किया गया था. इन कोशिकाओं को कॉस्मेटिक सर्जरी के माध्यम से प्राप्त संसाधित lipoaspirate ऊतक से उनके व्युत्पत्ति के कारण नाम प्रसंस्कृत Lipoaspirate या पीएलए कोशिकाओं दिए गए थे. इस आलेख में वर्णित अलगाव विधि वसा ऊतकों 2 से stromal संवहनी अंश (SVF) के अलगाव के लिए मौजूदा एंजाइमी रणनीतियों पर आधारित था. SVF एक टिशू कल्चर सब्सट्रेट 2, 3 का पालन करना है कि अभी तक लाल रक्त कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, pericytes और पूर्व adipocytes की एक न्यूनतम प्रसंस्कृत आबादी के रूप में परिभाषित किया गया है. समय के साथ इस SVF के संवर्धन इन contaminating सेल आबादी में से कई को खत्म करने और एक पक्षपाती, तंतुप्रसू आबादी में परिणाम का प्रस्ताव है. ये fibroblasts पूर्व किया जा रहा है के रूप में पिछले 40 वर्षों के लिए साहित्य में पहचान की गई हैadipocytes. हालांकि, हमारे शोध समूह इन कोशिकाओं mesodermal multipotency के पास और पीएलए कोशिकाओं के रूप में पक्षपाती SVF जनसंख्या का नाम बदलकर कि प्रदर्शन किया. कई अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा बाद में अध्ययन (समीक्षा 4 देखने के लिए) endodermal और बहिर्जनस्तरीय क्षमता दोनों का सुझाव दे, इस क्षमता को जोड़ लिया है. उस समय के बाद, इन कोशिकाओं के लिए कई अतिरिक्त शर्तें साहित्य में दिखाई दिया है. आम सहमति के कुछ प्रकार प्रदान करने के लिए, अवधि वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं या ASCs 2 एन डी वार्षिक IFATS सम्मेलन में अपनाया गया था. जैसे, अवधि एएससी इस लेख में इस्तेमाल किया जाएगा.

इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है और इस तरह के phospho बफर खारा, मानक टिशू कल्चर मीडिया अभिकर्मकों और collagenase के रूप में सरल अभिकर्मकों का उपयोग करता है कि एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. यह वसा ऊतकों की मात्रा और बाद में सी शुरू करने की मात्रा पर निर्भर करता है ASCs की बड़ी संख्या का उत्पादन कर सकते हैंulture समय. हालांकि, वसा ऊतकों की इतनी बड़ी राशि के प्रसंस्करण इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक हद तक कम किया जा सकता है कि कुछ शारीरिक मुद्दों पेश कर सकते हैं. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल जिससे एक अनुमोदित टिशू कल्चर सुविधा के उपयोग की जरूरत महसूस बाँझ टिशू कल्चर सुविधाओं और अनुमोदित जैव सुरक्षा डाकू की आवश्यकता होती है. वे अच्छा विनिर्माण अभ्यास नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए अलगाव और सामग्री के विस्तार के लिए डिजाइन (जीएमपी) को मंजूरी दे दी सुविधाओं में अलग कर रहे हैं जब तक कि इस आवश्यकता को भी चिकित्सीय अनुप्रयोगों में ए एस सी आबादी की उपयोगिता कम कर सकते हैं. एक विकल्प के रूप में, ऑपरेशन थियेटर में एक बंद व्यवस्था में ASCs अलग कर सकते हैं कि स्वचालित प्रणाली इस महत्वपूर्ण मुद्दे से बचना होगा और बाद में इन विट्रो विस्तार के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना ASCs का तत्काल उपयोग के लिए अनुमति देते हैं. तिथि करने के लिए, मानव ऊतक से कोशिकाओं के अलगाव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं कि छह स्वचालित प्रणालियों रहे हैं. इन पद्धतियों यह संभव अलग करने के लिए कर सकते हैं एकतुरंत इसकी फसल निम्नलिखित वसा ऊतकों की बड़ी मात्रा से ASCs की महत्वपूर्ण संख्या. ये ASCs तो कभी ऑपरेटिंग कमरे छोड़ने के लिए रोगी बिना पुनर्योजी विभिन्न प्रयोजनों के लिए रोगी पुनः शुरू किया जा सकता है. ASCs का मार्गदर्शन अलगाव का वर्णन इस प्रोटोकॉल के अलावा, Celution प्रणाली का उपयोग कर ASCs के स्वचालित अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल भी एक साथी लेख में दी गई है.

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Protocol

यहाँ दिखाया प्रोटोकॉल enzymatic पाचन और अंतर centrifugation का उपयोग कॉस्मेटिक प्रक्रियाओं के माध्यम से प्राप्त lipoaspirates से ASCs का मार्गदर्शन अलगाव का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल पहले 2001 1, में पत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग में प्रकाशित किया गया था जहां परिणामस्वरूप कोशिकाओं क्योंकि lipoaspirates से उनके अलगाव की प्रसंस्कृत Lipoaspirate कोशिकाओं या पीएलए कोशिकाओं कहा जाता था. हालांकि, इस शब्द पीएलए सेल अब अवधि वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं या क्षेत्र नामकरण के मामले में अनुरूप के कुछ प्रकार देने के लिए ASCs के साथ प्रतिस्थापित किया गया है. इस प्रोटोकॉल के माध्यम से अलग कक्षों (समीक्षा के लिए 4 देखें) इन विट्रो और इन विवो दोनों में mesodermal क्षमता के अधिकारी कई द्वारा दिखाया गया है. इसके अलावा, ए एस सी की बहिर्जनस्तरीय और endodermal क्षमता भी 4 लगाया गया है. अलगाव तकनीक सरल और सीधा है और पूरा होने में लगभग एक घंटे की आवश्यकता है. परिणामस्वरूप सेलमानक टिशू कल्चर परिस्थितियों में सुसंस्कृत हैं. संस्कृति समय के साथ, ए एस सी आबादी अधिक, समरूप आसानी से विस्तार और संस्कृति में लंबे समय से अधिक अच्छा व्यवहार्यता बताते हैं कि तंतुप्रसू संबंधी कोशिकाओं के शामिल हो जाता है.

नोट: आवश्यक है कि उपकरणों के निम्नलिखित टुकड़े इस लेख के अंत में सूचीबद्ध हैं. सभी कांच के बने पदार्थ, मीडिया और अभिकर्मकों autoclaving के माध्यम से निष्फल या 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से हटा दिया जाना चाहिए. सड़न रोकनेवाला टिशू कल्चर तकनीक हर समय का पालन किया जाना चाहिए. यह सुनिश्चित करने के लिए, जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखा सभी सामग्री एक 70% इथेनॉल के समाधान के साथ छिड़काव और साफ कागज तौलिये के साथ पोंछते द्वारा निष्फल होना चाहिए.

1. पिछले फसल के लिए, के बाद तैयार:

  1. Lipoaspirates की धुलाई के लिए बाँझ 1X phospho बफर खारा (पीबीएस). Lipoaspirate के हर 100 मिलीलीटर के लिए 1x पीबीएस के लगभग 1 एल तैयार करें. पीबीएस और सभी आटोक्लेवउपयोग से पहले कमरे के तापमान को शांत करने के लिए ओ. एक विकल्प के रूप में, एंटीबायोटिक / कवकनाशी के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा जा सकता है: 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2.50 ग्राम / मिलीलीटर Amphotericin बी पीबीएस ठंडा है.
  2. Lipoaspirate के enzymatic पाचन के लिए (क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से) बाँझ .075-.1% collagenase प्रकार आइए. शुद्ध किया यानी कच्चे बनाम - एकाग्रता collagenase की गुणवत्ता और स्रोत पर निर्भर करेगा. अन्य collagenase प्रकार (जैसे collagenase प्रकार द्वितीय या चतुर्थ) समान मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ एक 1000 मिलीलीटर निस्पंदन प्रणाली (चित्रा 1 ए) का उपयोग 1x पीबीएस और बाँझ फिल्टर में तैयार करें. हालांकि, एक बोतल शीर्ष फिल्टर के साथ लगे बाँझ कांच की बोतलें भी इस्तेमाल किया जा सकता है. तैयार है और कमरे के तापमान पर इस्तेमाल करते हैं. जब तक जरूरत collagenase समाधान 4 डिग्री सेल्सियस कम अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है. यह अपनी गतिविधि कम कर सकते हैं के रूप में collagenase समाधान फ्रीज नहीं है.
  3. Collagenase निष्क्रियता और ए एस सी आबादी के संवर्धन के लिए बाँझ नियंत्रण मध्यम (मुख्यमंत्री). मुख्यमंत्री के 500 एमएल के लिए, गठबंधन निम्नलिखित: 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (गर्मी निष्क्रिय), 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 आइयू पेनिसिलिन, 10,000 ग्राम / मिलीलीटर 500 मिलीलीटर DMEM (एल glutamine के साथ 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज,), स्ट्रेप्टोमाइसिन). एक विकल्प के रूप में, 5 एमएल Amphotericin बी (250 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी) को भी जोड़ा जा सकता है. गैर बाँझ अभिकर्मकों इस्तेमाल कर रहे हैं तो यह मीडिया की बाँझ निस्पंदन आवश्यक है. मध्यम गर्म करने के लिए उपयोग करने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 मिनट में सीएम रखें.
  4. अलगाव के लिए बाँझ कांच के बने पदार्थ और Plasticware. एक 1000 मिलीलीटर कांच बीकर आटोक्लेव और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, निम्न plasticware तैयार है: सड़न रोकनेवाला सीरम वैज्ञानिक pipettes (5 एमएल, 10 मिलीग्राम और 25 मिलीग्राम), 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों, और टिशू कल्चर का इलाज संस्कृति व्यंजन.

2. एल से ASCs का अलगावipoaspirates

अधिकांश lipoaspirates एक आकांक्षा कंटेनर (चित्रा 1 बी देखें) में एकत्र कर रहे हैं और तीन अलग परतों के शामिल हो सकते हैं: कारण परिपक्व adipocytes की सेल करने के लिए तेल की 1) एक ऊपरी परत, वसा ऊतकों के 2) एक मध्यम स्तर, और 3) एक नीचे, तरल infranatant खारा युक्त और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के रूप में सेल प्रकार contaminating. शीर्ष तेल की परत काफी मात्रा में मौजूद नहीं हो सकता है. अगर मौजूद है जिसके परिणामस्वरूप ए एस सी संस्कृति का तेल संदूषण संस्कृति की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं, यह aspirated किया जाना चाहिए. नीचे infranatant लाल रक्त कोशिकाओं के साथ ए एस सी संस्कृतियों के प्रदूषण को कम करने के लिए पूर्व प्रसंस्करण के लिए हटा दिया जाना चाहिए. यह तो धोया और enzymatically अपने सेलुलर, stromal संवहनी अंश (SVF) को आजाद कराने के लिए पचा किया जाएगा, जो बीच, वसा ऊतकों परत, छोड़ देंगे.

  1. Lipoaspirate धुलाई: टिशू कल्चर घंटे में lipoaspirate कंटेनर खोलेंई. और ध्यान से एक बाँझ 1 एल कांच बीकर में lipoaspirate छानना. वसा ऊतकों परत अच्छी तरह से (चित्रा 1 बी) अलग किया जाता है जब तक lipoaspirate परतों को अलग करने की अनुमति दें.
    1. एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एक बाँझ, कांच विंदुक और नीचे खारा infranatant का उपयोग कर तेल की परत (अगर मौजूद है) बंद महाप्राण. यह लाल रक्त कोशिकाओं और खारा contaminating के अधिक से अधिक बहुमत से निकाल देंगे.
    2. जिसके परिणामस्वरूप वसा ऊतकों परत की मात्रा का आकलन और एक बराबर मात्रा में बाँझ 1x पीबीएस जोड़ने. पीबीएस के साथ lipoaspirate मिश्रण करने के क्रम में आकांक्षा के लिए इस्तेमाल किया पिपेट साथ महाप्राण हिलाओ. दो परतों व्यवस्थित करने की अनुमति दें. ऊपर बताया गया है, 1x पीबीएस एंटीबायोटिक / antimycotics के साथ पूरक हो सकता है.
    3. एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग infranatant aspirate.
    4. कदम 2.1.2 में उल्लिखित के रूप में वसा ऊतकों अंश को धोने के लिए जारी. और 2.1.3. वसा की परत एक पीला / सोने के रंग है जब तक. महाप्राण वेंई गिलास बीकर में वसा ऊतकों अंश छोड़ने, एक आखिरी बार infranatant. Infranatant की पर्याप्त हटाने को सुनिश्चित करने, lipoaspirate परतों पिछले धोने के बाद और अंतिम आकांक्षा से पहले 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. Lipoaspirate के enzymatic पाचन: एक फिल्टर यूनिट में ऊपर उल्लिखित के रूप में बाँझ collagenase 1A समाधान तैयार करें. वसा अंश और बाँझ फिल्टर के बराबर एक मात्रा को तैयार है.
    1. Collagenase समाधान के निस्पंदन के बाद, ऊपरी फिल्टर यूनिट त्यागने ध्यान से collagenase समाधान में धोया वसा अंश डालना और कसकर बोतल बंद करें.
    2. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में collagenase / वसा मिश्रण रखें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाने. धीरे collagenase / वसा मिश्रण हर 5-10 मिनट चक्कर आने और नहाने के पानी में वापस जगह है. वसा ऊतकों परत एक "चिकनी" उपस्थिति (Figur पर ले जाना चाहिएई 1 बी) पाचन आय के रूप में. वसा ऊतकों परत अभी भी यह भीतर वसा की ठोस टुकड़े हो गया लगता है, तो अतिरिक्त पाचन बार (यानी 2 घंटा तक) का इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. ASCs का अलगाव: वापस जैव सुरक्षा कैबिनेट में जगह पचा collagenase / वसा मिश्रण. पूर्व कैबिनेट में वापस रखने के लिए 70% इथेनॉल के साथ फिल्टर यूनिट बाँझ करना न भूलें.
    1. पिपेट 25 एमएल बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में SVF युक्त infranatant की aliquots.
    2. प्रत्येक ट्यूब मुख्यमंत्री की 25 मिलीलीटर जोड़ें. मुख्यमंत्री 5 मिनट के लिए कैबिनेट में कमरे के तापमान पर incubating द्वारा collagenase निष्क्रिय करने की अनुमति दें.
    3. एक गोली के रूप में SVF एकत्र करने के लिए 1,200 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
    4. जैव सुरक्षा कैबिनेट में, प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला aspirate. (ऊपर तेल की परत को सुनिश्चित करने और किसी भी चल adipocytes इस सतह पर तैरनेवाला साथ aspirated हैं
    5. 30 मिलीलीटर मुख्यमंत्री का उपयोग कर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में SVF छर्रों का मिश्रण है और दो ​​नए 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के ऊपर समान रूप से विभाजित करते हैं. कदम 2.3.3 में के रूप में अपकेंद्रित्र. और (चित्रा में नहीं दिखाया गया है) दो SVF छर्रों से supernatants महाप्राण.
      वैकल्पिक: आरबीसी सेल वांछित है, एक आरबीसी lysis बफर (160 मिमी एनएच 4 सीएल) के 10 एमएल में प्रत्येक SVF गोली resuspend और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. कदम 2.3.3 में के रूप में अपकेंद्रित्र. और (चित्रा में नहीं दिखाया गया है) SVF छर्रों उपज के लिए supernatants महाप्राण.
    6. 5-10 मिलीलीटर मुख्यमंत्री (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में दो SVF छर्रों का मिश्रण.
    7. बड़ा ऊतक कणों बाहर फिल्टर करने के लिए, एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष पर रखा एक 100 माइक्रोन जाल फिल्टर पर resuspended SVF गोली पिपेट और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से फिल्टर करने के लिए अनुमति देते हैं.
    8. Resuspended की पिपेट aliquots(और फ़िल्टर्ड) ऊतक संस्कृति इलाज संस्कृति व्यंजन पर ASCs युक्त SVF गोली. मुख्यमंत्री का एक उचित मात्रा के साथ प्रत्येक पकवान पूरक.
    9. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस, मीडिया के परिवर्तन के बिना 5% सीओ 2 पर 3-4 दिनों के लिए मुख्यमंत्री में कोशिकाओं.

इस प्रारंभिक संस्कृति अवधि के बाद, संस्कृति मीडिया aspirated जा सकता है और किसी भी contaminating लाल रक्त कोशिकाओं को धीरे बाँझ 1XPBS साथ धोने से हटाया. मुख्यमंत्री के साथ बदलें और जरूरत के रूप में संस्कृति को ASCs जारी है. टिशू कल्चर का इस्तेमाल किया पकवान और कैसे resuspended SVF गोली इन व्यंजनों के बीच विभाजित है के प्रकार के पारंपरिक टिशू कल्चर निम्नलिखित वांछित कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करेगा.

3. ए एस सी जनसंख्या की विशेषता: फ्लो और Multilineage भेदभाव

एक बार अलग, ए एस सी आबादी के लक्षण वर्णन किया जाना चाहिए. इस के लिए परंपरागत तरीके प्रवाह cyto शामिलmetry कोशिकाओं की कोशिका की सतह सीडी प्रतिजन प्रोफाइल चिह्नित करने के लिए और इन विट्रो भेदभाव में उनके multilineage भेदभाव क्षमता की पुष्टि करने के लिए. कई प्रजातियों ASCs में मूल्यांकन किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल multilineage mesodermal क्षमता 5 की पुष्टि के एक साधन के रूप में वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला, osteogenic और chondrogenic प्रजातियों की कोशिकाओं में ASCs के भेदभाव की रूपरेखा.

ASCs की इन विट्रो बहु - वंश भेदभाव में

  1. ASCs की osteogenic भेदभाव प्रकार है: पिछले प्रेरण के लिए, osteogenic मध्यम (ओम) तैयार: DMEM के एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए (4.5 मिलीग्राम / छ ग्लूकोज) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन की 25.0 FBS (5.0% अंतिम एकाग्रता) की मिलीग्राम और 5.0 मिलीलीटर जोड़ने (10,000 / आइयू क्रमश: मिलीग्राम और 10,000 मिलीग्राम / एमएल अंतिम सांद्रता). Dexamethasone (0.1 माइक्रोन अंतिम), एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट (50.0 माइक्रोन अंतिम: यह करने के लिए, संकेत दिया अंतिम सांद्रता देने के लिए निम्नलिखित osteogenic प्रेरण एजेंट जोड़ना) और β-glycerophosphate (अंतिम 10.0 मिमी).
    1. पहले, प्रेरण फसल और लगभग 50% की एक confluency हासिल की है ताकि वांछित ऊतक संस्कृति डिश में सुसंस्कृत ASCs थाली करने के लिए. हर प्रयोगात्मक पकवान चढ़ाया लिए, एक गैर प्रेरित नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त पकवान थाली. मुख्यमंत्री में संस्कृति रातोंरात.
      नोट: 50% confluency कि प्रेरण के पाठ्यक्रम पर तब हो सकती निरंतर प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए सिफारिश की है
    2. प्रेरण के दिन, मध्यम हटाने और निम्नलिखित जोड़ें: नियंत्रण वेल्स को वांछित osteogenic प्रयोगात्मक कुओं और मुख्यमंत्री को ज्ञापन. इस्तेमाल किया मीडिया की मात्रा टिशू कल्चर डिश के आकार पर निर्भर करेगा. 12 अच्छी तरह से बर्तन के लिए, अच्छी तरह से प्रति मीडिया की 1.0 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त है. 6 अच्छी तरह से व्यंजनों के लिए, अच्छी तरह से प्रति मीडिया की 2.0 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त है. 100 मिमी व्यंजनों के लिए, पकवान प्रति मीडिया के 10.0 मिलीलीटर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    3. उचित माध्यम के परिवर्तन हर 3-4 के साथ 14 दिनों की एक न्यूनतम के लिए संस्कृति कोशिकाओंदिन. अत्यधिक osteogenic ए एस सी आबादी के रूप में जल्दी 7 दिनों प्रेरण के रूप में बाह्य खनिज बयान के लक्षण दिखा सकते हैं.
    4. Osteogenic भेदभाव (यानी बाह्य खनिज बयान) कैल्शियम फॉस्फेट के लिए एक वॉन Kossa histologic दाग का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है. यह दाग़ कोशिकी कैल्शियम फॉस्फेट (देखें चित्र 2) की उपस्थिति की पहचान एक काले भूरे रंग के वेग का उत्पादन होगा.
      वॉन Kossa अभिकर्मक के साथ दाग:
      1. नियंत्रण कक्षों से प्रयोगात्मक कोशिकाओं से ओम और मुख्यमंत्री निकालें
      2. 1x पीबीएस में तैयार 4.0% paraformaldehyde में 60 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें.
      3. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं.
      4. 30 मिनट के लिए अंधेरे में (पानी में तैयार) 2.0% चांदी नाइट्रेट के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
      5. चांदी नाइट्रेट निकालें, आसुत जल और हवा शुष्क कोशिकाओं के साथ दो बार धोने.
      6. सीएएल विकसित करने के लिए 60 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश में कोशिकाओं को बेनकाबcium फॉस्फेट वेग.
      7. 1XPBS साथ कोशिकाओं कई बार धोएं.
      8. अगर वांछित hematoxylin साथ सेल counterstain.
  1. ASCs की वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला भेदभाव: पिछले प्रेरण के लिए, के रूप में वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला मध्यम (AM) तैयार: (4.5 मिलीग्राम / छ ग्लूकोज) (10.0% अंतिम एकाग्रता) FBS की 50.0 मिलीलीटर जोड़ने DMEM के एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5.0 मिलीलीटर (10,000 / आइयू क्रमश: मिलीग्राम और 10,000 ग्राम / एमएल अंतिम सांद्रता). - इंडोमेथासिन (अंतिम 0.2 मिमी) और इंसुलिन (10.0 माइक्रोन अंतिम dexamethasone (1.0 माइक्रोन अंतिम), 3 Isobutyl-1-methylxanthine (अंतिम 0.5 मिमी IBMX): यह करने के लिए, संकेत दिया अंतिम सांद्रता देने के लिए निम्नलिखित वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला प्रेरण एजेंट जोड़ना ).
    1. पहले, प्रेरण फसल और लगभग 80% की एक confluency हासिल की है ताकि वांछित ऊतक संस्कृति डिश में सुसंस्कृत ASCs थाली करने के लिए. हर प्रयोगात्मक पकवान चढ़ाया के लिए, एक अतिरिक्त प्लेटएक गैर प्रेरित नियंत्रण के लिए अल पकवान. . संस्कृति रातोंरात मुख्यमंत्री में नोट: ASCs की वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला भेदभाव वृद्धि हुई confluency के साथ और अधिक कुशल होना प्रतीत होता है.
    2. प्रेरण के दिन, मध्यम हटाने और निम्नलिखित जोड़ें: नियंत्रण वेल्स को वांछित osteogenic प्रयोगात्मक कुओं और मुख्यमंत्री हूँ. इस्तेमाल किया मीडिया की मात्रा टिशू कल्चर डिश के आकार पर निर्भर करेगा. 12 अच्छी तरह से बर्तन के लिए, अच्छी तरह से प्रति मीडिया की 1.0.ml पर्याप्त है. 6 अच्छी तरह से व्यंजनों के लिए, अच्छी तरह से प्रति मीडिया की 2.0 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त है. 100 मिमी व्यंजनों के लिए, पकवान प्रति मीडिया के 10.0 मिलीलीटर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    3. संस्कृति उचित माध्यम के परिवर्तन हर 3-4 दिनों के साथ 14 दिनों की एक न्यूनतम के लिए कोशिकाओं. अत्यधिक वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला ए एस सी आबादी के रूप में जल्दी 7 दिनों प्रेरण के रूप में लिपिड रिक्तिका गठन के संकेत दिखा सकते हैं.
    4. वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला भेदभाव के दौर से गुजर ASCs आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना की जा सकती है कि कई लिपिड रिक्तिकाएं का विकास होगा. इसके अलावा, वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला भेदभाव हो सकता है(देखें चित्र 2) इन रिक्तिकाएं भीतर जमा करेंगे कि एक तेल लाल ओ histologic दाग का उपयोग कर पुष्टि की जा.
      तेल लाल ओ के साथ दाग:
      1. प्रयोगात्मक और नियंत्रण कक्षों से मीडिया निकालें और एक 10% औपचारिक कैल्शियम लगानेवाला का उपयोग कर 60 मिनट के लिए उन्हें ठीक. इस लगानेवाला तैयार करने के लिए निम्न गठबंधन: 2 CaCl के 1.0 ग्राम, 25.0 मिलीलीटर 16% paraformaldehyde (4.0% अंतिम) और 75.0 मिलीग्राम आसुत जल.
      2. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं.
      3. 70% इथेनॉल के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं को धो लें.
      4. तेल लाल ओ समाधान के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को सेते हैं. तेल लाल ओ समाधान तैयार करने के लिए, 50.0 मिलीलीटर 70% इथेनॉल में 2.0 ग्राम तेल लाल ओ पाउडर और 50.0 मिलीग्राम एसीटोन भंग.
      5. नल के पानी के साथ 70% इथेनॉल के साथ और फिर कोशिकाओं को धो लें.
      6. जल्द ही होने के कारण समय के साथ दाग की लुप्त होती धुंधला के बाद कोशिकाओं कल्पना.
  1. ASCs की Chondrogenic भेदभाव: Chondrogenic भेदभाव "micromass संस्कृति" के रूप में संदर्भित एक उच्च घनत्व संस्कृति तकनीक के माध्यम से हासिल की है. के रूप में निम्नानुसार पिछले संस्कृति को, Chondrogenic मध्यम (CHM) तैयार: DMEM के एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए (4.5 मिलीग्राम / छ ग्लूकोज) FBS (1% अंतिम एकाग्रता) के 5.0 मिलीलीटर और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5.0 मिलीलीटर (10,000 आइयू / एमएल जोड़ और 10,000 ग्राम / एमएल अंतिम सांद्रता, क्रमशः). एल ascorbic-2-फॉस्फेट (अंतिम 50.0 माइक्रोग्राम / एमएल), इंसुलिन (अंतिम 6.25 माइक्रोग्राम / एमएल), transferrin (अंतिम 6.25 माइक्रोग्राम / एमएल) और TGFβ1: यह करने के लिए, संकेत दिया अंतिम सांद्रता देने के लिए निम्नलिखित chondrogenic प्रेरण एजेंट जोड़ना (10.0 एनजी / एमएल).
    1. गोली कोशिकाओं के लिए 1,200 XG पर 5 मिनट के लिए ASCs और अपकेंद्रित्र हार्वेस्ट. सेल निलंबन का घनत्व निर्धारित करने के लिए कक्षों की गणना.
    2. Micromass छर्रों को तैयार करने के लिए, दो सेल निलंबन तैयार: 1 10 x 7 सेल के घनत्व पर CHM में तैयार एक प्रयोगात्मक निलंबनएस / मिलीलीटर और 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर मुख्यमंत्री में तैयार एक नियंत्रण निलंबन.
      1. एक बहु - अच्छी तरह से पकवान की व्यक्तिगत कुओं में सेलुलर निलंबन की 10.0 μl "बूंदों" रखें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए पालन करने की अनुमति
      2. धीरे CHM या मुख्यमंत्री या तो कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए सावधान होने के साथ चढ़ाया बूंदों उपरिशायी.
      3. संस्कृति के माध्यम में परिवर्तन हर 3-4 दिनों के साथ CHM या मुख्यमंत्री में अप करने के लिए 14 दिनों के लिए कोशिकाओं. CHM में संवर्धित कोशिकाओं एक आस monolayer में कोई कोशिकाओं लिए थोड़ा के साथ एक उच्च घनत्व micromass गोली फार्म के लिए इस समय के साथ गाढ़ा होगा. सुसंस्कृत नियंत्रण कक्षों इस संक्षेपण नहीं गुजरना होगा और कई एक monolayer के रूप में मिल जाएगा.
      4. उपास्थिजनन पुष्टि करने के लिए कमरे के तापमान पर (1x पीबीएस में तैयार) 4.0% paraformaldehyde में 15 मिनट के लिए छर्रों को ठीक. एक Alcian ब्लू histologic दाग का उपयोग सल्फेटकृत proteoglycans की उपस्थिति के लिए दाग.
        Alcian नीले रंग का उपयोग दाग:
        1. देहात धो लेंएक बार 1x पीबीएस में raformaldehyde तय छर्रों.
        2. उनके पीएच कम करने के लिए 5 मिनट के लिए 0.1 एन एचसीएल (पीएच 1.0) में छर्रों सेते हैं.
        3. एचसीएल निकालें और (0.1 एन एचसीएल, पीएच 1.0 में तैयार) 1% Alcian नीले अभिकर्मक जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
        4. Alcian नीले अभिकर्मक निकालें और अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए 0.1 एन एचसीएल (पीएच 1.0) के साथ छर्रों धो लो.
        5. नल के पानी का उपयोग करते हुए अतिरिक्त washes पृष्ठभूमि धुंधला कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
        6. एक विकल्प के रूप में, micromass छर्रों, काटा जा सकता है 10% formalin में रातोंरात तय, आयल में एम्बेडेड और वर्गों Alcian ब्लू के लिए दाग.

4. ASCs के प्रवाह cytometric विशेषता

कोशिका की सतह सीडी प्रतिजन प्रोफाइल की विशेषता पारंपरिक फ्लो के माध्यम से पूरा किया जा सकता है.

  1. फ्लो के लिए ASCs की तैयारी: पहलेविश्लेषण करने के लिए, निम्न में से शामिल एक फ्लो बफर (FCB) तैयार: 1.0% बीएसए, 2.0% FBS और 1x पीबीएस में तैयार 0.025% सैपोनिन.
    1. ASCs फसल और एक गोली के उत्पादन के लिए 1,200 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
    2. बाँझ 1XPBS में कोशिकाओं Resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती. निलंबन की सेल घनत्व निर्धारित करते हैं.
    3. गोली कुल और अपकेंद्रित्र 5 x 10 5 कोशिकाओं की aliquots में निलंबन को विभाजित.
    4. पीबीएस सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंडा 70% इथेनॉल के साथ एक अतिरिक्त -20 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक. यदि आवश्यक हो तो जब तक की जरूरत है, इन कोशिकाओं को एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में यह 70% इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता है.
    5. निर्धारण के बाद, ध्यान से इथेनॉल महाप्राण और धीरे FCB की एक अतिरिक्त के साथ गोली दो बार धोने. धोने के लिए:
      1. FCB की एक अतिरिक्त जोड़ें और धीरे गोली resuspend.
      2. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 1,200 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र एकSA गोली.
      3. ध्यान FCB सतह पर तैरनेवाला aspirate.
      4. दोहराएँ.
    6. FCB के 100 μl में प्रत्येक विभाज्य और resuspend से अंतिम FCB धोने पर तैरनेवाला निकालें. निर्माता का सुझाव दिया है कमजोर पड़ने का उपयोग कर वांछित fluorochrome संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं.
      नोट: fluorochrome संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, तो गैर संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है.
    7. (जैसे FITC, पीई) का इस्तेमाल किया प्रत्येक fluorochrome के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में निर्धारण से मिलान IgGs युक्त 100 मिलीलीटर FCB साथ कोशिकाओं के एक विभाज्य सेते हैं.
    8. एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में कोई एंटीबॉडी युक्त 100 मिलीलीटर FCB में एक विभाज्य सेते हैं.
    9. कदम 4.1.5 में विस्तृत रूप FCB साथ सेल के प्रत्येक विभाज्य दो बार धोएं. पिछले धोने के बाद, FCB की 100 मिलीलीटर में aliquots resuspend और प्रवाह विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना.
      नोट: गैर संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे थे: FCB निर्माता का सुझाव दिया है कमजोर पड़ने का उपयोग उचित fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पूरक के साथ इस धोने कदम 20 मिनट के लिए बर्फ पर aliquots सेते बाद. कदम 4.1.5 में उल्लिखित के रूप में दो बार धोएं.
  2. ASCs का विश्लेषण प्रवाह: प्रवाह विश्लेषण के लिए, 10,000 की घटनाओं का एक न्यूनतम गिना जाना चाहिए. बेदाग और निर्धारण मिलान नियंत्रण आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) द्वारा द्वार स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके लिए कदम 4.1.8 का कोई एंटीबॉडी नियंत्रण (यानी बेदाग) मलबे और मृत ASCs को खत्म करने के क्रम में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कदम 4.1.7 के निर्धारण से मिलान आईजीजी नियंत्रण. सकारात्मक प्रतिदीप्ति के क्षेत्रों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

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Representative Results

प्रोटोकॉल रूपरेखा ऊपर एक बड़ी मात्रा lipoaspirate नमूना से एक SVF के अलगाव के लिए एक पुस्तिका, एंजाइमी विधि का वर्णन करता है. इस SVF भीतर एएससी सहित कई सेल आबादी, कर रहे हैं. कई अध्ययनों से मानक टिशू कल्चर शर्तों के तहत इस SVF संवर्धन ए एस सी प्रकार का मुख्य रूप से बना होने की संभावना एक पक्षपाती fibroblast आबादी के लिए चयन होगा कि प्रस्ताव. इस के अनुरूप, हम सभ्य SVF छर्रों प्रमुख contaminating कोशिकाओं प्रकार, अर्थात् लाल रक्त कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और endothelial वंश 1 की कोशिकाओं का अनिवार्य रूप से मुक्त हो जाते हैं कि, प्रवाह cytometry और immunofluorescence का उपयोग कर, पता चला है. परिणामस्वरूप ए एस सी आबादी (चित्रा 2) अपेक्षाकृत उपस्थिति में समरूप और fibroblast कोशिकाओं की तरह शामिल है. इन पक्षपाती ASCs मानक टिशू कल्चर परिस्थितियों में संस्कृति में अच्छी तरह से विकसित और कई आणविक और कोशिका बी के लिए उन्हें उपयुक्त समय 1 दोहरीकरण एक मध्यम आबादी प्रदर्शनvivo में इन विट्रो और पुनर्योजी पढ़ाई में iology पढ़ाई. हालांकि, अलग SVF के heterogenous प्रकृति के प्रकाश में, ए एस सी आबादी का सत्यापन आवश्यक है. कई अध्ययनों से इन विट्रो और इन विवो 5-9 में दोनों इन कोशिकाओं की पहचान का एक संभावित साधन के रूप में सुसंस्कृत ASCs की सीडी प्रतिजनी प्रोफाइल चिह्नित करने के लिए आदेश में फ्लो का इस्तेमाल किया है. तालिका 1 इन अध्ययनों से कई से परिणाम का सार. इन सीडी एंटीजन से कुछ की अभिव्यक्ति विवादास्पद बना हुआ है, यह आम तौर पर सभ्य ASCs CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 और सकारात्मक CD140a हैं कि सहमति व्यक्त की है. CD34 जैसे विशिष्ट hematopoietic मार्करों की अभिव्यक्ति इस समय अनसुलझे रहता है, हालांकि इस तरह के CD31 और CD45 के रूप में कई hematopoietic सीडी एंटीजन का अभाव, ASCs की mesodermal मूल के अनुरूप है. हाल ही में, ए एस सी प्रतिजनी प्रोफाइल, प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित रूप में, विशिष्ट subpop के लिए चयन किया गया हैulations बढ़ाया भेदभाव क्षमताओं के साथ ASCs उत्पादन की उम्मीद में 10-12.

Mesodermal, बहिर्जनस्तरीय और endodermal प्रजातियों में उनके भेदभाव में परिभाषित संस्कृति शर्तों के परिणाम का उपयोग ए एस सी आबादी के लिए इन विट्रो प्रेरण में सत्यापन का सबसे लोकप्रिय साधन के रूप में, चित्रा (2) (समीक्षा के लिए 4 देखें). इन विट्रो त्रिकोणीय रोगाणु परत संभावित osteogenic में पुनर्योजी मॉडल प्रणालियों, भेदभाव की एक विस्तृत विविधता के लिए ASCs के उपयोग में हुई है, जबकि वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला और chondrogenic कोशिकाओं ए एस सी की पहचान और उसके multipotency पुष्टि करने के लिए पर्याप्त है. हमारे हाथ में, तेल लाल ओ 5 का उपयोग दाग कि उज्ज्वल लिपिड रिक्तिकाएं युक्त कोशिकाओं में ASCs परिणाम की वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला भेदभाव. Osteogenic भेदभाव alkaline फॉस्फेट पॉजिटिव कोशिकाओं में परिणाम और एक कैल्शियम फॉस्फेट वॉन Kossa दाग 5 का उपयोग दाग कि बाह्य खनिज का संचय.उच्च घनत्व micromass परिस्थितियों में Chondrogenic भेदभाव (एक Alcian ब्लू दाग का उपयोग कर पाया) सल्फेटकृत proteoglycans होते हैं और कोलेजन टाइप 2 5 व्यक्त कि छर्रों का उत्पादन. कंकाल की मांसपेशी और चिकनी मांसपेशियों भेदभाव दोनों कंकाल मांसपेशियों मायोसिन और MyoD1 और चिकनी पेशी actin 5, 13, 14 के लिए धुंधला ASCs के साथ देखा जा सकता है. बहिर्जनस्तरीय वंश में भेदभाव प्रेरित ASCs और NeuN, एक neuronal प्रतिलेखन कारक 5 की कि सहित कई neuronal मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा एक neuronal तरह आकारिकी की धारणा के माध्यम से सुझाव दिया है. अंत में, कोशिकाओं में स्थापित स्थितियों 15 परिणामों के आधार पर एक यकृत / endodermal वंश की ओर ASCs की प्रेरण कि अभिव्यक्ति अल्फा भ्रूणप्रोटीन, जिगर hepatocytes के एक प्रसिद्ध मार्कर. एक साथ पिछले 10 वर्षों में प्रकाशित कई अन्य लोगों के साथ इन मार्कर, दृढ़ता एएससी आसानी से बनाए रखा जा सकता है कि एक pluripotent स्टेम सेल की आबादी है और पता चलता है किइन विट्रो में प्रचारित किया और तीन भ्रूण रोगाणु प्रजातियों की कोशिकाओं की ओर प्रेरित किया. Vivo में उनके पुनर्योजी क्षमता (समीक्षा के लिए 4 देखें) के लिए युग्मित, ए एस सी एक पुनर्योजी शोध वैज्ञानिक या चिकित्सक के उपकरणों के लिए एक शक्तिशाली इसके अलावा हो सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Lipoaspirate नमूनों से मानव ASCs के मैनुअल, एंजाइमी अलगाव. अलगाव के लिए ए तैयारी: पिछले अलगाव के लिए निम्न घटकों तैयार किया जाना चाहिए: 1) () कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस 1X, autoclaving के माध्यम से निष्फल, 2) 1x पीबीएस में तैयार और निष्फल .075-0.1% collagenase आइए प्रकार का समाधान 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर यूनिट का उपयोग निस्पंदन के माध्यम से, के रूप में की 3) ए एस सी आबादी के बाद संस्कृति के लिए नियंत्रण मध्यम (मुख्यमंत्री). बी अलगावसीएस: lipoaspirates से stromal संवहनी अंश (SVF) के अलगाव के लिए एक कदम दर कदम गाइड दिखाया गया है. कदम बाँझ 1x पीबीएस के साथ lipoaspirate की धुलाई में शामिल हैं, collagenase प्रकार आइए, centrifugation द्वारा SVF का संग्रह है, और SVF निस्पंदन का उपयोग पाचन. SVF के बाद के संवर्धन ए एस सी आबादी वाले पक्षपाती fibroblast आबादी में परिणाम होगा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. पक्षपाती ए एस सी आबादी की बहु वंश भेदभाव की क्षमता. संवर्धित SVF कोशिकाओं पक्षपाती, तंतुप्रसू ASCs की एक अपेक्षाकृत समरूप जनसंख्या में परिणाम. वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला, osteogenic, chondrogenic, कंकाल myogenic और चिकनी myogenic प्रजातियों की कोशिकाओं में परिभाषित शर्तों के परिणाम के तहत ए एस सी आबादी की प्रेरण.इसके अलावा, ASCs भी NeuN, एक न्यूरॉन्स के मार्कर और अल्फा भ्रूणप्रोटीन (एएफपी) endodermal / यकृत सेल वंश की स्थापना की एक मार्कर व्यक्त बहिर्जनस्तरीय वंश की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है. कुछ ऊतक विज्ञान और Immunofluorescent छवियों पहले प्रकाशित परिणामों 1,5,6,7,8,9 से ले रहे हैं. एक साथ histologic, immunohistologic या फ्लोरोसेंट दाग के साथ भेदभाव वंश, दिखाया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल
सकारात्मक अभिव्यक्ति नकारात्मक अभिव्यक्ति
CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e,
CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, सीD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, एचएलए एबीसी, stro-1 		CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146,
एचएलए डीआर, SMA, ABCG2
ASCs की प्रस्तावित फेनोटाइप
(दो या अधिक पढ़ाई के बीच आम) 		CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a,
एचएलए एबीसी, stro-1 		CD11a, CD11b, CD11c, CD14,
CD31, CD45, CD106, CD144
ASCs में विवादास्पद मार्करों
(कई अध्ययनों से अधिक अंतर परिणाम) 		CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, एचएलए डीआर
स्ट्रोमल CEडालूँगा मार्करों CD29, CD44, CD73, CD90, CD166
hematopoietic मार्करों CD31, CD34, CD45, ABCG2
बोल्ड में दिखाया गया है 2 या अधिक पढ़ाई के बीच आम में मार्कर
SMA = चिकनी पेशी actin
एचएलए = मानव ल्युकोसैट प्रतिजन
ABCG2 = बहु - दवा ट्रांसपोर्टर प्रोटीन G2

तालिका 1. मानव ASCs की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति प्रोफाइल.

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Discussion

ASCs के अलगाव के लिए वसा ऊतकों कई रूपों में आ सकता है: सिरिंज निकासी या चूषण की सहायता lipoplasty (यानी liposuction) या तो के माध्यम से प्राप्त छोटे टुकड़े करने के लिए लकीर या lipoplasty के माध्यम से प्राप्त ऊतक की ठोस टुकड़े से. परस्पर विरोधी अध्ययन 16, 17 में प्रस्तुत किया गया है के रूप में अधिक SVF कोशिकाओं (और इस तरह ASCs) resected या aspirated वसा के नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है स्पष्ट नहीं है. यह वसा ऊतकों के रूप में या तो लंबे समय के रूप ऑपरेटर उनके अलगाव तकनीक में दक्ष है के रूप में SVF कोशिकाओं और ASCs के अलगाव के लिए उपयुक्त की तुलना में अधिक है कि संभव है. हालांकि, liposuction कि में लकीर पर एक फायदा धारण करता है यह कम आक्रामक है और काफी कम पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल की आवश्यकता है. Liposuction के प्रकार जैसे तकनीक, सहित, पिछले एक दशक में वृद्धि हुई है जबकि अल्ट्रासाउंड की मदद से, शक्ति की सहायता और लेजर liposuction सहायता 18, सबसे आम tumescent liposuction बनी हुई है,जिसमें वसा कम्पार्टमेंट 19 आकांक्षा पूर्व बाँझ खारा, anesthetics और vasoconstrictors की बड़ी मात्रा के साथ पानी भर गया है. तकनीक के चुनाव सर्जन से सर्जन के लिए भिन्न हो सकती हैं. निकासी के साधन के अनुसंधानकर्ता को महत्वहीन लग सकता है, तथापि, यह तकनीक एएससी संख्या और व्यवहार्यता पर एक प्रभाव हो सकता है कि एहसास करने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, बढ़ती liposuction वैक्यूम दबाव नकारात्मक SVF सेल उपज 20 प्रभावित कर सकता है. इसके अलावा, ए एस सी प्रसार में कम हो जाती है अल्ट्रासाउंड liposuction सहायता 17 पर मापा गया है.

भंडारण तापमान SVF व्यवहार्यता और अंतिम एएससी उपज पर प्रभाव पड़ सकता है लेकिन जैसा कि प्राप्त, महाप्राण जल्दी से कार्रवाई की जानी चाहिए. मात्सुमोतो एट अल. द्वारा अध्ययन महाप्राण अब से 24 घंटा 21 के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया गया है कि अगर ए एस सी उपज कम हो जाती है कि पता चला है. यदि आवश्यक हो, 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे का भंडारण किसी भी हानिकारक प्रभाव के बिना इस्तेमाल किया जा सकता हैइस भंडारण समय उस बिंदु से आगे बढ़ जाती है अगर ए एस सी आबादी के जीवविज्ञान गुण पर है लेकिन, फिर से, सेल व्यवहार्यता कम कर सकते हैं. lipoaspirate प्रसंस्करण में आसानी सीधे अपनी समग्र मात्रा से संबंधित है. सिरिंज निकासी के माध्यम से प्राप्त की छोटी मात्रा, प्रक्रिया को अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं. हालांकि, liposuction के माध्यम से प्राप्त की बड़ी मात्रा रेस्पायरेट्रस,, शारीरिक चुनौतियों पेश कर सकते हैं. महाप्राण मात्रा बड़ी है जब उदाहरण के लिए, यह धोया जा सकता है कि इतनी आकांक्षा कंटेनर से वसा के हस्तांतरण के रूप में सरल कुछ समस्याओं को प्रस्तुत कर सकते हैं. इस अनुच्छेद में उल्लिखित प्रोटोकॉल इन चुनौतियों में से कुछ को कम करने के लिए है.

कुल मिलाकर, इस आलेख में वर्णित एंजाइमी विधि का उपयोग lipoaspirates से ए एस सी आबादी के अलगाव के पिछले 10 वर्षों में काफी बदल नहीं किया गया है. Lipoaspirates से ASCs के अलगाव के अपने विवरण में बहुत ही अच्छे हैं कि PubMed के माध्यम से उपलब्ध कई प्रोटोकॉल रहे हैं. एमउनमें से ost मामूली संशोधनों के साथ एक बहुत ही इसी तरह प्रोटोकॉल रूपरेखा. असल में, lipoaspirate प्रदूषणों से धोया जाता है, ए एस सी आबादी युक्त, SVF और SVF रिलीज करने enzymatically पचा, centrifugation के माध्यम से इकट्ठा किया जाता है. सबसे बड़ी मात्रा lipoaspirates निर्वात कंटेनर के कुछ प्रकार में आने - जिनमें से विन्यास सर्जन से सर्जन के लिए भिन्न हो सकती हैं. ठीक से जैव सुरक्षा हुड में रखने से पहले साफ नहीं यदि कंटेनर ही प्रदूषण का एक स्रोत हो सकता है क्योंकि यह प्रोटोकॉल, धोने से पहले एक बड़े, बाँझ बीकर में महाप्राण को हटाने की सिफारिश की. परिपक्व adipocytes की सेल, एक मध्यम वसा की परत और खारा और लाल रक्त कोशिकाओं contaminating परत के नीचे से यह परिणाम है कि एक शीर्ष, तेल की परत: एक बार तबादला और गंभीरता से बसने की अनुमति दी, महाप्राण तीन परतों में अलग होगा. हम यह परिणामस्वरूप सेल संस्कृतियों (अप्रकाशित टिप्पणियों) को विषाक्त किया जा सकता है देखा है कि के रूप में तेल की परत हटा दिया जाना चाहिए. इसके अलावा इस आद्यकर्नल खारा और लाल रक्त कोशिकाओं की infranatant पूर्व ASCs संवर्धित कर रहे हैं एक बार लाल रक्त कोशिकाओं contaminating की संभावित संख्या को कम करने के क्रम में पहली धोने के लिए हटा दिया जाएगा सिफारिश की है कि. हालांकि, फ्रांसिस एट अल. द्वारा एक अध्ययन में इस infranatant भी ASCs 22 का एक स्रोत हो सकता है का सुझाव दिया है. एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग इस infranatant को दूर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान बनाता है. क्या रहता है तो आसानी से बाँझ पीबीएस का उपयोग कर धोया, या अगर वांछित, बाँझ पीबीएस संदूषण 23-25 ​​की संभावना कम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं और कवकनाशी के साथ पूरक हो सकता है कि वसा की परत है. धोने के बाद, वसा ऊतकों enzymatically collagenase आइए प्रकार की एक बाँझ समाधान का उपयोग पच जाता है. इस तरह इस वीडियो में दिखाया गया है Millipore इकाई के रूप में एक निस्पंदन इकाई का उपयोग aseptically धोया वसा ऊतकों 37 डिग्री सेल्सियस पर बाद में पानी में स्नान पाचन के लिए जोड़ा जा सकता है जो करने के लिए एक बंद कंटेनर में collagenase छानने का एक सुविधाजनक साधन जोड़ती

इस्तेमाल किया collagenase के प्रकार collagenase आइए प्रकार 25, 24, 1 और अधिक प्रचलित हो प्रतीयमान के साथ समूह को समूह से अलग किया गया है. हालांकि, व्यावसायिक रूप collagenase के 11 से अधिक विभिन्न प्रकार के उपलब्ध, विशिष्ट ऊतकों के लिए पाचन समानताएं के साथ प्रत्येक रहे हैं. वसा ऊतकों के पाचन के लिए, ऐसे सिग्मा Aldrich के रूप में कंपनियों collagenase प्रकार मैं और द्वितीय की सलाह देते हैं और दोनों प्रकार अच्छी तरह से आज के साहित्य 1, 24-27 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. उनके मूल लेख में, Zuk एट अल. 0.075% 1 के एक एकाग्रता में गोजातीय स्रोतों से प्राप्त collagenase आइए प्रकार का उपयोग करें. हालांकि, collagenase आइए प्रकार के सबसे वाणिज्यिक स्रोतों अब anaerobic बैक्टीरिया क्लोस्ट्रीडियम histolyticum या ई. से प्राप्त कर रहे हैं कोली आनुवंशिक रूप से सी. के साथ संशोधित जीन histolyticum. कई कंपनियों ने कच्चे तेल से अमोनियम सल्फेट तेज़ी के माध्यम से तैयार करने के लिए उन collagenase आइए प्रकार की कई तैयारियाँ की पेशकश करते हैं.इस जौव लेख में उल्लिखित प्रोटोकॉल एक कच्चे प्रकार न केवल collagenase गतिविधियों में शामिल है कि आइए collagenase की तैयारी, लेकिन यह भी गैर विशिष्ट प्रोटीज, clostripain और tryptic enzymatic गतिविधियों का उपयोग करता है. इन अतिरिक्त एंजाइमों पाचन दक्षता 28 के लिए महत्वपूर्ण हैं, वहाँ कच्चे collagenase प्रकार आइए 28, 29 के साथ जुड़े बहुत परिवर्तनशीलता के लिए बहुत कुछ है कि रिपोर्ट उन लोगों के हैं और कुशल पाचन 23 प्राप्त करने के लिए 0.2% तक collagenase के उनके सांद्रता में वृद्धि. कच्चे तेल की collagenase आइए प्रकार का उपयोग करने वालों समूहों को भी एंजाइम के प्रदर्शन में सुधार और वसा मैट्रिक्स के भीतर कोशिकाओं की स्थिरता को बढ़ाने के लिए गोजातीय सीरम albumin (0.1-1.0% बीएसए) के साथ अपने पूरकता की सलाह देते हैं. इस अनुच्छेद में उल्लिखित प्रोटोकॉल पाचन क्षमता पर कोई प्रतिकूल प्रभाव के साथ पूरकता बिना collagenase का उपयोग करता है के रूप में हालांकि, यह आवश्यक नहीं किया जा सकता है.

एक अधिक परिभाषित collagenase COMP का उपयोग करने के लिए इच्छुक लोगों के लिएosition, proteases की एक सटीक मिश्रण के साथ साथ उच्च शुद्ध collagenase युक्त वाणिज्यिक स्रोतों अब उपलब्ध हैं. इन तैयारियों clostridial collagenase प्रकार मैं और द्वितीय उच्च गतिविधि के लिए और इस तरह के dispase और thermolysin के रूप में जाना जाता है तटस्थ प्रोटीज गतिविधियों, के साथ उनके गठबंधन को शुद्ध. Collagenase और thermolysin का उपयोग कुशल वसा पाचन Zachar एट अल. 27 द्वारा सूचित किया गया है. इस काम के साथ समझौते में, Pilgaard एट अल. 30 भी collagenase और thermolysin के कई मिश्रणों का उपयोग उत्कृष्ट पाचन दक्षता रिपोर्ट. हालांकि, वे collagenase और dispase की तैयारी का उपयोग कर बेहतर पाचन दक्षता का निरीक्षण करते हैं.

वसा ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव के लिए पाचन बार अध्ययन से अध्ययन करने के लिए भिन्न हो सकती हैं. कई प्रकाशित प्रोटोकॉल 1-2 घंटा 27, 30 के पाचन टाइम्स की सलाह देते हैं. हालांकि, यह अत्यधिक पाचन बार अंततः व्यवहार्य के रूप में की संख्या को प्रभावित कर सकता है एहसास करने के लिए महत्वपूर्ण हैसीएस और उनके स्टेम सेल phenotype. Pilgaard और उनके सहयोगियों ने 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा पाचन पाचन, पिछले 45 मिनट, पाचन के साथ, हर 15 मिनट 2 तक घंटा अधिकतम मनाया जा सिफारिश की है कि. Zachar एट अल के साथ, ऊतक पृथक्करण और ए एस सी कार्यक्षमता 30 के बीच बेहतरीन संतुलन देता है कि निर्धारित किया है वसा ऊतकों एक अधिक समरूप उपस्थिति 27 पर होने के बाद ही बंद कर दिया जा रहा है. हम इस सिफारिश के साथ सहमत हैं. हालांकि, यह .075-.1% पर सबसे collagenase आइए प्रकार की तैयारी 30-45 मिनट में lipoaspirates की बड़ी मात्रा को पचाने में सक्षम हैं और इन बार कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या को आजाद कराने के लिए पर्याप्त हैं कि कि हमारे अनुभव है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल 30 मिनट की एक पाचन समय की सिफारिश की. अधिक समय की आवश्यकता है, lipoaspirate की स्थिरता पर नजर रखी जानी चाहिए और lipoaspirate एक "मलाईदार" या "soupy" उपस्थिति (चित्रा 1) हो जाती है जब पाचन बंद कर दिया.

वें एक बारई पाचन जारी किया SVF के अलगाव बस centrifugation का प्रयोग निपुण है, पूरा हो गया है. हालांकि, आकांक्षा दबाव की तरह, centrifugation के भौतिक प्रभाव SVF व्यवहार्यता और संस्कृति के लिए उपलब्ध ASCs की संख्या पर असर पड़ सकता है. Kurita और उनके सहयोगियों ने 31 ने एक अध्ययन में 3,000 XG से अधिक गति एएससी को नुकसान पहुंचा सकता है दिखाया है. हालांकि, गति SVF की पर्याप्त pelleting सुनिश्चित करने के लिए काफी महत्वपूर्ण होना चाहिए. एक नियम के रूप में, यह एक सहित सबसे प्रोटोकॉल, 1,200-1,500 x जी की एक centrifugation गति की सलाह देते हैं. केयर संबंध विशिष्ट अपकेंद्रित्र रोटर पर निर्भर करता है के रूप में वे, केन्द्रापसारक बल (G में मापा) और (आरपीएम के रूप में मापा) centrifugation गति के बीच संबंध को समझने के लिए सुनिश्चित करें कि अनुसंधानकर्ता द्वारा लिया जाना चाहिए. हालांकि, एक नियम के रूप में, इस तरह के 1,200 XG के रूप में कम केंद्रत्यागी बलों,, अक्सर centrifugation गति के बराबर हैं और सुरक्षित रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है.

निम्नलिखित कताई, कई diतेल और "शराबी" सफेद adipocytes, एक मध्यम collagenase परत और एक सेल गोली के एक शीर्ष परत: stinct परतों अपकेंद्रित्र ट्यूब (चित्रा 1) में मनाया जाता है. ASCs युक्त, लाल रक्त कोशिकाओं की एक ऊपरी परत और एक कम सफेद SVF गोली: गोली ही दो अलग परतों हो सकता है. तेल सेल संस्कृति को विषाक्त किया जा सकता है और adipocytes वापस एक अधिक आदिम सेल प्रकार 32 को dedifferentiation करने में सक्षम होने के लिए दिखाया गया है के रूप में इस प्रोटोकॉल, तेल और adipocytes से सावधान आकांक्षा की सिफारिश की. हालांकि, इन adipocytes यदि चाहें तो इस बिंदु पर काटा जा सकता है. क्योंकि इन प्रदूषणों से, इस प्रोटोकॉल उनकी पर्याप्त हटाने को सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त धोने कदम की सिफारिश की. यह कदम भी शोधकर्ता छानने का काम के बाद आराम के लिए कई SVF छर्रों गठबंधन करने की अनुमति देता है. निस्पंदन कारण तांतव सामग्री के बड़े टुकड़े और पाचन निम्नलिखित सेलुलर समुच्चय की उपस्थिति के लिए आवश्यक होने की संभावना है. इन सामग्रियों को आसानी से हटा रहे हैं70 या 100 माइक्रोन जाल फिल्टर के माध्यम से सरल गुरुत्वाकर्षण आधारित निस्पंदन के माध्यम से. छानना के एक विभाज्य अगर वांछित nucleated कोशिकाओं की संख्या और ए एस सी पालन और विस्तार के लिए चढ़ाया शेष छानना गिनती करने के क्रम में लिया जा सकता है.

संभव के रूप में कई लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए मेहनती प्रयासों के बावजूद, कोई एएससी तैयारी आरबीसी संदूषण के बिना पूरी तरह से हो जाएगा. हमारे मूल लेख में, हम 160 मिमी एनएच 4 सीएल के एक hypotonic समाधान में गोली के मेजबान के माध्यम से इन लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने का प्रस्ताव रखा. बाद में अलगाव लेख का बहुमत इस चरण होते हैं और देखभाल बाँझ पानी का उपयोग अगर लिया जाना चाहिए, हालांकि SVF कोशिकाओं उजागर कर रहे समय को कम करने के लिए, एनएच 4 सीएल आधारित समाधान या बाँझ पानी 22-24, 27, 33 के इस्तेमाल की सिफारिश hypotonic समाधान के लिए 27. लाल रक्त कोशिकाओं में एक गैर पक्षपाती सेल आबादी होते हैं और आसानी से एक रात में संस्कृति निम्नलिखित हटाया जा सकता है लेकिन, जैसा कि इस कदम आवश्यक नहीं हो सकताए एस सी आबादी. पर सबसे अच्छा वास्तविक इसके अलावा, जबकि इन लाल रक्त कोशिकाओं परिणामस्वरूप पक्षपाती कोशिकाओं (Zuk, अप्रकाशित टिप्पणियों) के प्रारंभिक विस्तार में सुधार करने के लिए दिखाई देते हैं. जैसे, इस प्रोटोकॉल आरबीसी सेल कदम समाप्त और प्रारंभिक ए एस सी संस्कृतियों संस्कृति के माध्यम से किसी भी बदलाव के बिना पहले 3-4 दिनों के लिए इन लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति में विस्तार करने के लिए अनुमति दी जानी है कि प्रस्ताव है. इस अवलोकन के लिए कारण रक्त कोशिकाओं contaminating से paracrine सिगनल के कुछ प्रकार के कारण हो सकता है या बस के कारण आरबीसी सेल कदम के बहिष्कार के साथ बेहतर व्यवहार्यता के लिए हो सकता है. इस के बाद, धीरे बाँझ 1x पीबीएस के साथ प्लेटें धोने से संस्कृति के माध्यम से aspirated जा सकता है और लाल रक्त कोशिकाओं के बहुमत हटा दिया. समय के साथ, किसी भी शेष लाल रक्त कोशिकाओं अंततः मर जाएगा और संस्कृति से निकाल दिया.

Zachar और Boquest द्वारा अध्ययन resuspended SVF गोली का 25-50% टिशू कल्चर के लिए प्लास्टिक की 23, 27 का पालन करता है कि अनुमान है. जिसके परिणामस्वरूप "बीतने 0" ए एस सी सी यूltures मूल में endothelial होने के लिए प्रस्तावित ASCs और अधिक अनियमित आकार कोशिकाओं माना छोटे, गोल कोशिकाओं के शामिल, विषम हैं. हमारा सहित कई समूहों द्वारा पढ़ाई ऐसी एसएमसी, hematopoietic कोशिकाओं और ए एस सी संस्कृतियों 1 में fibroblasts के रूप में सेल प्रकार contaminating के अभाव की पुष्टि की है, वहीं अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता. . दरअसल, Tallone एट अल बीतने 0 संस्कृतियों की विशेषता और चार अलग आबादी मनाया गया है: 1) छोटे, गोल, तेजी से renewing कोशिकाओं, 2) ए एस सी होने लगा धुरी के आकार तंतुप्रसू संबंधी कोशिकाओं, 3) धीरे - धीरे साथ बड़े कोशिकाओं नकल एक अधिक प्रतिबंधित संभावित (यानी पूर्व adipocytes) और पारित होने के 34 के साथ खो जाते हैं कि 4) आयातफलकी endothelial कोशिकाओं. बाद के अध्ययन दौर तेजी से renewing सेल आबादी उच्चतम multipotentiality पास दिखाया गया है और ठेठ स्टेम सेल मार्कर 35, 36 व्यक्त किया है. इसके अलावा, वे के कारण "spheroids" हो सकता है फार्मउनकी तेजी से प्रसार और अक्सर धुरी के आकार fibroblasts से घिरे हैं. जैसे, यह ऊपर प्रस्तावित धुरी आकार ए एस सी आबादी इन कोशिकाओं से उत्पन्न हो सकता है कि संभव है. इन बीतने के 0 ए एस सी संस्कृतियों के प्रारंभिक विस्तार के बाद, यह जिसके परिणामस्वरूप संस्कृतियों एक अधिक तंतुप्रसू, समरूप रचना संभालने के साथ, समय के साथ निरंतर संवर्धन एएससी के लिए चयन करता है कि माना जाता है. हालांकि, contaminating कोशिकाओं के अवशेष पूरी तरह से इसलिए, ए एस सी आबादी अभी भी विषम विचार किया जाना चाहिए, की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता.

इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल सस्ती, सरल है और सामान्य रूप से एक टिशू कल्चर सुविधा में नहीं मिली उपकरण के किसी भी टुकड़े की आवश्यकता नहीं है, यह एक ऐसी सुविधा की आवश्यकता का नुकसान होता है. कई अध्ययनों से पशु मॉडल के माध्यम से ASCs की translational आवेदनों की जांच की है और ए एस सी का उपयोग नैदानिक ​​अध्ययन प्रकट करने के लिए शुरू कर दिया है (समीक्षा के लिए देख 4

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Disclosures

इस पांडुलिपि के लेखक कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के प्रतिनिधियों और Cytori चिकित्सा विज्ञान के लिए लाइसेंस के स्वामित्व वाले एक पेटेंट पर सह आविष्कारक हैं.

Acknowledgments

लेखकों स्वीकार करना चाहते हैं और सहित वर्णित प्रोटोकॉल और ASCs के अपने अलगाव के विकास के लिए योगदान दिया है कि उन अतिरिक्त अनुसंधान कर्मियों धन्यवाद: डॉ. एच. पीटर लोरेन्ज, एमडी, डॉ. हिरोशी Muzuno, एमडी, डॉ. जैरी हुआंग, एमडी , डॉ. एडम Katz, एमडी, डॉ. विलियम Futrell, एमडी, डॉ. रोंग जांग, DDS, पीएचडी, डॉ. लारिसा रोड्रिगेज, एमडी, डॉ. Zeni अल्फोंसो, पीएचडी, और डॉ. जॉन फ्रेजर, पीएचडी. परिणाम प्रस्तुत NIAMS और NIDCR संस्थानों सहित स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान अनुसंधान द्वारा, भाग में, वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) Mediatech Cellgro 10-013-CV with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin Mediatech Cellgro 30-002-CI 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B Mediatech Cellgro 30-003-CF 250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline) Mediatech Cellgro 25-053-CI without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA Mediatech Cellgro 20-031-CV 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) Sigma C2674 crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated Gemini Bioproducts 100106 USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-104
25 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes Genesee Scientific 21-106
100 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-202
150 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-203
500 ml Stericup Filter Units Millipore SCGPU05RE PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers FisherBrand 22-363-549 100 μm nylon mesh
dexamethasone - water soluble Sigma D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate disodium salt Sigma G-9422 also known as glycerophosphate
insulin Sigma I-6634 made from bovine pancreas
indomethacin Sigma I-7378
apo-transferrin Sigma T-4382
TGFβ1 R&D Systems 240-B-002 recombinant human
Oil Red O Sigma O-0625
Alcian Blue Sigma A-5268
Silver nitrate Sigma S-0319
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 supplied as a 16 % stock
Name Company Catalog Number Comments
Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood Thermo Scientific ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge Hermle Labnet Z383 Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg
Water bath Fisher Scientific Isotemp S52602Q 5-10L capacity, capable of 37C
Automated Pipette Aids Drummond Pipette Aid XL 4-000-105
CO2 Incubator Thermo Scientific Forma 310 direct heat or water jacketed

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 79 वसा ऊतकों स्टेम सेल मानव सेल बायोलॉजी जीव विज्ञान (सामान्य) enzymatic पाचन collagenase सेल अलगाव stromal संवहनी अंश (SVF) वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल ASCs lipoaspirate liposuction
मानव Lipoaspirates से वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के मैनुअल अलगाव
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Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S.,… More

Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates. J. Vis. Exp. (79), e50585, doi:10.3791/50585 (2013).

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