Summary
Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.
Abstract
Em 2001, pesquisadores da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, descreveu o isolamento de uma nova população de células-tronco adultas do tecido adiposo lipoaspirada que inicialmente denominado Células lipoaspirado ou células processados PLA. Desde então, essas células-tronco foram renomeados como células-tronco adiposo-derivadas ou ASC e passaram a se tornar um dos mais populares populações de células-tronco adultas nos campos da investigação em células estaminais e medicina regenerativa. Milhares de artigos agora descrever o uso de ASC em uma variedade de modelos animais regenerativos, incluindo a regeneração óssea, reparação de nervos periféricos e engenharia cardiovascular. Artigos recentes começaram a descrever a miríade de usos para ASC na clínica. O protocolo mostrado neste artigo descreve o procedimento básico para manualmente e enzimaticamente isolando ASC de grandes quantidades de lipoaspirates obtidos a partir de procedimentos cosméticos. Este protocolo pode ser facilmente escalado para cima ou para baixo para accommodcomeu o volume de lipoaspirado e pode ser adaptado para isolar as ASC de tecido adiposo obtidas por abdominoplasties e outros processos semelhantes.
Introduction
Em 2001, uma população putativo de células-tronco multipotentes do tecido adiposo foi descrito na revista Engenharia de Tecidos 1. Estas células receberam o nome Processado lipoaspirado ou PLA células devido à sua derivação de tecido lipoaspirado processado obtidos através de cirurgia estética. O método de isolamento descritas neste artigo foi baseado em estratégias enzimáticas existentes para o isolamento da fracção do estroma vascular (SVF) a partir de tecido adiposo 2. O SVF tem sido definida como uma população minimamente processados de glóbulos vermelhos, fibroblastos, células endoteliais, células musculares lisas, pericitos e pré-adipócitos que ainda têm que aderir a um substrato de cultura de tecidos 2, 3. O cultivo deste SVF ao longo do tempo é proposto eliminar muitos destes contaminantes populações de células e resultar em uma população de fibroblastos aderente. Estes fibroblastos, foram identificados na literatura durante os últimos 40 anos como sendo pré-adipócitos. No entanto, nosso grupo de pesquisa demonstrou que estas células possuíam mesodermal multipotency e rebatizou a população SVF aderente como células PLA. Estudos posteriores por inúmeros outros grupos de pesquisa foram adicionados a esse potencial, o que sugere tanto endodermal e potenciais ectodérmicas (para revisão ver 4). Desde essa altura, numerosos termos adicionais para estas células têm aparecido na literatura. A fim de fornecer algum tipo de consenso, o termo células-tronco adiposo-derivadas ou ASC foi adotada na ª conferência anual IFATS 2. Como tal, o termo ASC serão usados neste artigo.
O protocolo descrito neste artigo é um procedimento relativamente simples, que requer equipamento laboratorial padrão e utiliza reagentes simples, tais como solução salina tamponada com fosfo, reagentes de meios de cultura de tecido padrão e colagenase. Pode produzir grandes números de ASC, dependendo da quantidade do volume inicial do tecido adiposo e subsequente culture tempo. No entanto, o processamento de uma grande quantidade de tecido adiposo, tais podem apresentar alguns problemas físicos que possam ser mitigados para um grau usando este protocolo. Além disso, este protocolo requer estéreis a cultura de tecidos e capuzes de biossegurança aprovados, implicando o uso de uma unidade de cultura de tecidos aprovado. Este requisito também pode diminuir a utilidade da população ASC em aplicações clínicas, a menos que eles sejam isolados em boa prática de fabrico (BPF instalações)-aprovados concebidos para o isolamento e a expansão do material para uso clínico. Como alternativa, os sistemas automatizados que podem isolar ASC em um sistema fechado na sala de operação evitaria esta questão fundamental e permitir a utilização imediata de ASC, sem necessidade de posterior expansão in vitro. Até à data, há seis sistemas automáticos que estão disponíveis comercialmente para o isolamento de células a partir de tecido humano. Estes sistemas podem tornar possível isolar umnúmero significativo de ASC de grandes quantidades de tecido adiposo imediatamente após a sua colheita. Estes ASC poderia, então, ser reintroduzida no paciente para uma variedade de fins regenerativos sem o paciente ter que deixar a sala de cirurgia. Além deste protocolo descrevendo o isolamento Manual de ASC, um protocolo para isolamento automatizado de ASC usando o Sistema Celution também é dada em um artigo do companheiro.
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Protocol
O protocolo mostrado aqui descreve o isolamento Manual de ASC de lipoaspirates obtidos através de procedimentos cosméticos utilizando digestão enzimática e centrifugação diferencial. Este protocolo foi publicado na revista Engenharia de Tecidos, em 2001, 1, em que as células resultantes foram chamados células lipoaspirado ou células processados PLA por causa de seu isolamento a partir de lipoaspirates. No entanto, o termo célula PLA foi agora substituído pelo termo células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC para dar ao campo algum tipo de conformidade em termos de nomenclatura. As células isoladas por este protocolo foi mostrado por muitos possuem potencial mesodérmica, tanto in vitro como in vivo (para revisão veja-se 4). Além disso, os ectodérmicos e endodérmica potenciais da ASC Foram também explorados 4. A técnica de isolamento é simples e direta e requer cerca de uma hora para ser concluído. A célula resultantes são cultivadas sob condições de cultura de tecidos padrão. Com o tempo de cultura, torna-se ASC a população mais homogénea, constituída por células fibroblásticas que se expandem rapidamente e mostram boa viabilidade a longo termo em cultura.
Nota: Os seguintes equipamentos que são necessários estão listados no final deste artigo. Todos os vidros, meios e reagentes devem ser esterilizados por meio de autoclave ou filtrada através de filtros de 0,22 mM. Aseptic técnicas de cultura de tecidos devem ser seguidas em todos os momentos. Para garantir isso, todos os materiais colocados na cabine de segurança biológica deve ser esterilizada por pulverização com uma solução de etanol a 70% e esfregando com toalhas de papel limpas.
1. Antes da colheita, preparar os seguintes:
- Estéril 1X tampão fosfo salina (PBS) para a lavagem das lipoaspirates. Prepare a cerca de 1 L de 1x PBS para cada 100 ml de lipoaspirado. Autoclave a PBS e todosow-se arrefecer até à temperatura ambiente antes do uso. Como uma opção, antibiótico / antimicótico pode ser adicionado a uma concentração final de: 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 2,50 ng / ml de anfotericina B uma vez que o PBS foi arrefecida.
- Estéril 0,075-,1% colagenase tipo IA (de Clostridium histolyticum) para a digestão enzimática do lipoaspirado. A concentração irá depender da qualidade e origem da colagenase - isto é comparada em bruto purificado. Outros tipos de colagenase pode ser utilizado (por exemplo, colagenase tipo II ou IV), em concentrações semelhantes. Prepara-se por PBS 1x e filtro estéril usando um sistema de filtração de 1000 ml com um filtro de 0,22 um (figura 1A). No entanto, as garrafas de vidro estéril equipado com um filtro de topo de garrafa também pode ser usado. Preparar e utilizar a temperatura ambiente. Soluções de colagenase pode ser armazenada para a curto prazo, a 4 ° C até ser necessário. Não congelar a solução de colagenase, pois pode diminuir a sua actividade.
- Estéril Controlo Médio (MC) para a inactivação da colagenase e cultura da população ASC. Para 500 ml de CM, combinar o seguinte: 500 ml de DMEM (glucose 4,5 g / L, com L-glutamina), 50 ml de soro fetal de bovino (inactivado pelo calor), 5 ml penicilina / estreptomicina (10.000 UI de penicilina, 10.000 mg / ml estreptomicina). Como opção, podem também ser adicionados 5 ml de anfotericina B (250 ug / ml de anfotericina B). Filtração estéril dessa mídia é necessária se os reagentes não estéreis são usados. Coloque o CM num banho de 37 ° C a água 30 min antes do uso para aquecer o meio.
- Copos e utensílios de plástico estéril para isolamento. Autoclavar uma proveta de vidro de 1000 ml e deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente antes do uso. Além disso, têm a seguinte utensílios de plástico pronto: pipetas serológicas asséptica (5 ml, 10 ml e 25 ml), 50 ml de tubos de centrífuga, e de tecido tratado de cultura de placas de cultura.
2. O isolamento de ASCs de Lipoaspirates
A maioria lipoaspirates são recolhidos num recipiente de aspiração (ver Figura 1B) e pode ser constituído por três camadas distintas: 1) uma camada superior de óleo devido à lise de adipócitos maduros, 2) uma camada intermédia de tecido adiposo, e 3) um fundo, líquido infranadante contendo salina e contaminando os tipos de células, como as células vermelhas do sangue (hemácias). A camada de óleo no topo podem não estar presentes em quantidades significativas. Se estiver presente, ele deve ser aspirada como a contaminação de óleo de cultura ASC resultante poderia afectar a viabilidade da cultura. O infranadante inferior deve ser removida antes do processamento para minimizar a contaminação das culturas ASC com RBC. Isso vai deixar o meio, a camada de tecido adiposo, o que irá então ser lavada e digeridos enzimaticamente para libertar a sua fracção celular, estroma vascular (SVF).
- Lavar o lipoaspirado: Abra o recipiente lipoaspirado na cultura de tecidos hood e decantar cuidadosamente o lipoaspirado em um estéril 1 L copo de vidro. Permitir que as camadas lipoaspirado separar até que a camada de tecido adiposo é bem separados (Figura 1B).
- Aspirar para fora da camada de óleo (se presente), utilizando uma agulha estéril, pipetas de vidro e o infranadante salina inferior usando uma pipeta de 10 ml serológico. Isto irá remover a maior parte dos contaminantes de células vermelhas do sangue e soro fisiológico.
- Avaliar o volume da camada de tecido adiposo resultante estéril e adicionar 1x PBS a um volume igual. Agita-se a aspirar com a pipeta usada para aspiração, a fim de misturar o lipoaspirado com o PBS. Permitir que as duas camadas para resolver. Como observado acima, o 1x PBS pode ser suplementado com antibióticos / antimicóticos.
- Aspirar o infranadante usando uma pipeta de 10 ml sorológica.
- Continuar a lavagem da fracção de tecido adiposo como descrito nas etapas 2.1.2. e 2.1.3. até que a camada de tecido adiposo não tem uma cor amarelo / ouro. ª Aspirare infranadante uma última vez, deixando a fracção de tecido adiposo no copo de vidro. Para assegurar a remoção adequada da infranadante, permitir que as camadas lipoaspirado de se contentar com 5 minutos após a última lavagem e antes da aspiração final.
- A digestão enzimática da lipoaspirado: Preparar a solução de colagenase 1A esterilizado, conforme descrito acima em uma unidade de filtro. Prepara-se uma quantidade igual a da fracção adiposo e filtro estéril.
- Após a filtração da solução de colagenase, descartar da unidade de filtro superior, verter cuidadosamente a fracção adiposo lavado na solução de colagenase e firmemente a fechar a garrafa.
- Coloque a mistura de colagenase / adiposo em um banho de água a 37 C ° e digestão a 37 ° C durante 30 min. Agite suavemente a mistura de colagenase / adiposo cada 5-10 min e coloque de volta na água do banho. A camada de tecido adiposo deve assumir uma aparência "mais suave" (Figure 1B), como a digestão prossegue. Tempos de digestão adicionais (isto é, até 2 horas) pode ser utilizada, se a camada de tecido adiposo ainda parece ter pedaços sólidos de gordura dentro dele.
- Isolamento de ASC: Coloque a mistura de colagenase / adiposo digerido de volta para a cabine de segurança biológica. Certifique-se de esterilizar a unidade de filtro com etanol 70% antes de colocar de volta no armário.
- Pipetar 25 ml de partes alíquotas do infranadante contendo o SVF em tubos de centrífuga de 50 ml estéreis.
- Adicionar 25 ml de CM de cada tubo. Permitir que o CM para inactivar o colagenase por incubação à temperatura ambiente no gabinete durante 5 min.
- Centrifugar por 10 minutos a 1.200 xg para recolher o SVF como uma pelota.
- No armário de biossegurança, aspirar o sobrenadante de cada tubo. Garantir a camada de óleo superior e quaisquer adipócitos flutuantes são aspirados com este sobrenadante (
- Combina-se as pelotas de SVF num tubo de centrífuga usando 30 ml de CM e dividir igualmente ao longo de dois novos tubos de centrífuga de 50 ml. Centrifugar como no passo 2.3.3. e aspirar os sobrenadantes dos dois granulados SVF (não mostrados na Figura).
Opcional: Se lise é desejada, ressuspender cada pellet SVF em 10 ml de um tampão de lise de RBC (160 mM NH 4 Cl) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar como no passo 2.3.3. e aspirar os sobrenadantes para se obterem as pelotas de SVF (não mostrados na Figura).- Combinar as duas pastilhas SVF em um novo tubo de centrifugação utilizando 5-10 ml de CM (Figura 1B).
- Para filtrar as partículas de tecido maiores, pipetar o sedimento ressuspenso SVF para um filtro de malha de 100 um colocado em cima de um novo tubo de 50 ml de centrífuga e deixa-se filtrar por fluxo de gravidade.
- Alíquotas de pipeta da ressuspensas(E filtrada) pellet SVF contendo as ASC no tecido da cultura tratados placas de cultura. Suplemento cada prato com um volume adequado de CM.
- Cultura das células em CM durante 3-4 dias a 37 ° C, 5% de CO 2, sem mudança de meios de comunicação.
- Combina-se as pelotas de SVF num tubo de centrífuga usando 30 ml de CM e dividir igualmente ao longo de dois novos tubos de centrífuga de 50 ml. Centrifugar como no passo 2.3.3. e aspirar os sobrenadantes dos dois granulados SVF (não mostrados na Figura).
Após este período inicial da cultura, o meio de cultura pode ser aspirado e quaisquer contaminantes de células vermelhas do sangue removidas suavemente por lavagem com 1XPBS estéreis. Substituir com CM e continuar a cultura das ASC conforme necessário. O tipo de cultura de tecido utilizado e prato como o sedimento ressuspenso SVF está dividido entre estes pratos irá depender do número de células desejadas na sequência de cultura de tecidos convencionais.
3. Caracterização da População ASC: Citometria de Fluxo e multilinhagem Diferenciação
Uma vez isolados, a caracterização da população ASC deve ser realizada. As abordagens convencionais para este fim incluem cito fluxometria para caracterizar o perfil de antigénio CD superfície celular das células e na diferenciação in vitro para confirmar a sua capacidade de diferenciação em múltiplas. Enquanto múltiplas linhagens pode ser avaliada em ASC, este protocolo define a diferenciação de ASC em células do adipogênica, osteogênica e linhagens condrogênicas como um meio de confirmar potenciais mesodermal multilinhagem 5.
Na diferenciação in vitro multi-linhagem de ASC
- A diferenciação osteogénica de ASC: Antes da indução, preparar osteogénica Médio (OM) como segue: Para um frasco de 500 ml de meio DMEM (4,5 g / ml de glicose) adicionar 25,0 mL de SBF (5,0% de concentração final) e 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10000 IU / mL e 10000 mg / ml de concentração final, respectivamente). Para isso, adicione os seguintes agentes de indução osteogênicas para dar as concentrações finais indicadas: dexametasona (0,1 mM final), L-ácido ascórbico 2-fosfato (50,0 mM finais) E β-glicerofosfato (10,0 mM final).
- Antes da indução, colheita e as ASC prato de cultura para a cultura de tecidos prato desejado de modo a que uma confluência de aproximadamente 50% é atingido. Para cada prato experimental banhado, placa um prato adicional para um controle não-induzido. Overnight Cultura em CM.
Nota: 50% de confluência é recomendado, a fim de permitir a proliferação continuada que pode ocorrer durante o curso de indução - No dia da indução, remover o meio e adicionar o seguinte: OM aos poços experimentais osteogénicas desejados e CM para os poços de controlo. O volume do meio usado dependerá do tamanho da placa de cultura de tecidos. Para 12 pratos assim, 1,0 ml de meio por poço é suficiente. Para seis pratos assim, 2,0 ml de meio por poço é suficiente. Para placas de 100 mm, deve ser utilizada 10,0 ml de meio por caixa.
- Cultura das células por um período mínimo de 14 dias com as mudanças do meio apropriado a cada 3-4dias. Populações ASC altamente osteogênicas podem mostrar sinais de depósito mineral extracelular tão cedo como indução de 7 dias.
- Diferenciação osteogênica (ou seja, a deposição mineral extracelular) pode ser confirmada usando uma mancha histológica von Kossa para o fosfato de cálcio. Esta mancha irá produzir um precipitado preto-castanho identificar a presença de fosfato de cálcio extracelular (ver Figura 2).
Para manchar com o reagente von Kossa:- Remover o OM das células experimentais e o CM a partir das células de controlo
- Fixar as células por 60 min em 4,0% paraformaldeído preparado em 1x PBS.
- Lave as células duas vezes com PBS 1x.
- Incubar as células com 2,0% de nitrato de prata (preparado em água) no escuro durante 30 min.
- Retire o nitrato de prata, lavar duas vezes com água destilada e ar seco nas células.
- Expor as células à luz UV durante 60 minutos para desenvolver o calprecipitado de fosfato de cio.
- Lave as células várias vezes com 1XPBS.
- Contracorante a célula com hematoxilina, se desejar.
- Antes da indução, colheita e as ASC prato de cultura para a cultura de tecidos prato desejado de modo a que uma confluência de aproximadamente 50% é atingido. Para cada prato experimental banhado, placa um prato adicional para um controle não-induzido. Overnight Cultura em CM.
- Diferenciação adipogénica de ASC: Antes da indução, preparar adipogênica Médio (AM) como se segue: Para um frasco de 500 ml de meio DMEM (4,5 g / ml de glicose) adicione 50,0 ml de FBS (10,0% de concentração final) e 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10000 IU / mL e 10000 ng / ml concentração final, respectivamente). Para isso, adicionar os seguintes agentes de indução adipogênicos para dar as concentrações finais indicadas: dexametasona (1,0 uM final), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX - 0,5 mM finais), indometacina (0,2 mM final), insulina (10,0 uM definitivo ).
- Antes da indução, colheita e as ASC prato de cultura para a cultura de tecidos prato desejado de modo a que uma confluência de aproximadamente 80% é atingido. Para cada prato experimental banhado, placa uma adiçãoai prato para um controlo não induzidas. . Cultura durante a noite em CM Nota: diferenciação adipogênica de ASC parece ser mais eficiente com o aumento da confluência.
- No dia da indução, remover o meio e adicionar o seguinte: PM aos poços experimentais osteogénicas desejados e CM para os poços de controlo. O volume do meio usado dependerá do tamanho da placa de cultura de tecidos. Para 12 pratos bem, 1.0.ml de mídia por poço é suficiente. Para seis pratos assim, 2,0 ml de meio por poço é suficiente. Para placas de 100 mm, deve ser utilizada 10,0 ml de meio por caixa.
- Cultura das células por um período mínimo de 14 dias com as mudanças do meio apropriado a cada 3-4 dias. Populações ASC Altamente adipogénicos pode mostrar sinais de formação de vacúolo lipídico já indução 7 dias.
- ASC submetidos a diferenciação adipogênica irá desenvolver múltiplas vacúolos lipídicos que podem ser facilmente visualizadas ao microscópio de luz. Além disso, a diferenciação pode adipogênicaser confirmado utilizando um histológica mancha Oil Red O que irá acumular dentro destes vacúolos (ver Figura 2).
Para manchar com Oil Red O:- Remova a mídia a partir de células experimentais e de controle e corrigi-los por 60 minutos usando um fixador de cálcio formal de 10%. Para preparar este fixador, combinar o seguinte: água 1,0 g de CaCl 2, 25,0 ml de 16% de paraformaldeído (4,0% final) e 75,0 ml de água destilada.
- Lave as células duas vezes com PBS 1x.
- Lave as células brevemente com etanol a 70%.
- Incubar as células à temperatura ambiente durante 5 min com a solução de Oil Red O. Para preparar a solução de Oil Red O, dissolver 2,0 g de óleo vermelho O pó em 50,0 ml de etanol a 70% e 50,0 ml de acetona.
- Lavar as células com etanol a 70% e, em seguida, com água da torneira.
- Visualize as células logo após a coloração devido ao desbotamento da mancha com o tempo.
- Diferenciação condrogênica da ASC: diferenciação condrogênica é conseguido através de uma técnica de cultura de alta densidade referido como "cultura micromassa". Antes da cultura, preparar condrogénica Médio (CHM) como segue: Para um frasco de 500 ml de meio DMEM (4,5 g / ml de glicose) adicionar 5,0 ml de FBS a 1% (concentração final) e 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10000 UI / ml e 10.000 ug / ml concentração final, respectivamente). Para isso, adicionar os seguintes agentes de indução condrogênicos para dar as concentrações finais indicadas: L-ascórbico-2-fosfato (50,0 ug / ml final), insulina (6,25 ng / ml final), transferrina (6,25 ug / ml final) e TGF-p1 (10,0 ng / ml).
- Colher as ASC e centrifugar durante 5 min a 1200 xg para sedimentar as células. Contar as células para determinar a densidade da suspensão de células.
- Para preparar os grânulos de micromassa, preparar duas suspensões de células: uma suspensão experimental preparada em ChM a uma densidade de 1 x 10 7 célulass / ml e uma suspensão de controle preparados em CM, a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml.
- Coloque 10,0 ul "gotículas" da suspensão celular em poços individuais de um prato de multi-poços. Deixa-se aderir durante 2-3 horas a 37 ° C.
- Delicadamente sobrepor as gotas revestida com ou ChM ou CM tomando cuidado para não dissociar as células.
- Cultura das células para até 14 dias em ChM ou CM com mudanças em meio a cada 3-4 dias. Células cultivadas em ChM condensa ao longo deste tempo para formar uma Micromass pellet de alta densidade, com pouca ou nenhuma célula em uma monocamada circundante. As células de controlo cultivadas não sofrerão esta condensação e muitos podem ser encontrados como uma monocamada.
- Para confirmar a condrogénese, fixar os peletes de 15 min em 4,0% de paraformaldeído (preparadas em PBS 1x), à temperatura ambiente. Mancha para a presença de proteoglicanos sulfatados usando um Alcian mancha histológica Azul.
Para corar com azul Alcian:- Lave o papelotas fixa-raformaldehyde uma vez em PBS 1x.
- Incubar as peletes em 0,1 N HCl (pH 1,0) durante 5 minutos para reduzir o pH.
- Remover o HCl e adicionar 1% de reagente azul Alcian (preparada em HCl 0,1 N, pH 1,0). Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Remover o reagente azul Alcian e lavar os sedimentos com 0,1 N HCl (pH 1,0) para remover o excesso de corante.
- Lavagens adicionais utilizando a água da torneira pode ser usado para reduzir a coloração de fundo.
- Como alternativa, as pelotas podem ser colhidas de micromassa, fixados durante a noite em 10% de formalina, embebidos em parafina e as secções coradas por azul Alcian.
4. Citometria de Fluxo Caracterização da ASC
Caracterização do perfil do antigénio de superfície celular de CD pode ser realizada por meio de citometria de fluxo convencional.
- Preparação do ASC para citometria de fluxo: Antesa análise, se preparar um tampão de citometria de fluxo (DCT) a seguinte composição: 1,0% de BSA, 2,0% de FBS e 0,025% de saponina preparado em PBS 1x.
- Colher as ASC e centrifugar as células durante 5 min a 1200 xg para produzir um sedimento.
- Ressuspender as células em estéril 1XPBS e contar as células usando um hemocitômetro. Determinar a densidade celular da suspensão.
- Divida a suspensão se em alíquotas de 5 x 10 5 células totais e de centrífuga para sedimentar.
- Retirar o sobrenadante de PBS e fixar as células durante 60 min a -20 ° C com um excesso de etanol gelado a 70%. Se necessário, estas células podem ser armazenados em etanol a 70% deste em um congelador de -20 ° C até ser necessário.
- Após a fixação, aspirar cuidadosamente o etanol e lavar cuidadosamente a pelete duas vezes com um excesso de FCB. Para lavar:
- Adicionar um excesso de FCB e ressuspender cuidadosamente o sedimento.
- Centrifugar por 5 min a 1200 xg para coletar as células de umsa pelota.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante FCB.
- Repetir.
- Retirar o sobrenadante final de lavagem FCB de cada aliquota e ressuspender em 100 ul de FCB. Adicionar o anticorpo primário conjugado com fluorocromo desejado usando diluição sugerido pelo fabricante. Incubar as células em gelo com o anticorpo durante 30 min.
Nota: Se os anticorpos primários conjugado com fluorocromo não estão disponíveis, podem ser utilizados anticorpos primários não conjugados. - Para cada fluorocromo utilizado (por exemplo, FITC, PE), incubar uma aliquota de células com 100 ml FCB contendo IgG do mesmo isotipo, como um controlo negativo.
- Incubar uma alíquota de 100 ml FCB não contendo anticorpos como um controle adicional.
- Lava-se cada aliquota de células duas vezes com FCB conforme descrito no passo 4.1.5. Após a última lavagem, ressuspender as alíquotas em 100 ml de FCB e prosseguir com a análise do fluxo.
Nota: Se foram utilizados os anticorpos primários não conjugados: Após este passo de lavagem incuba-se as aliquotas sobre gelo durante 20 min com FCB suplementado com o anticorpo secundário conjugado com fluorocromo apropriado usando diluição sugerido pelo fabricante. Lavar duas vezes, conforme descrito no passo 4.1.5.
- Análise de fluxo de ASC: Para a análise do fluxo, um mínimo de 10.000 eventos devem ser contados. Controles não coradas e do mesmo isotipo deve ser usado para definir portas de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). Por isso, os controlos sem anticorpos (isto é, não corados do passo 4.1.8) deve ser utilizado, a fim de eliminar os detritos e ASC mortas. Os controles de IgG do mesmo isotipo da etapa 4.1.7. deve ser utilizado para estabelecer as áreas de fluorescência positiva.
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Representative Results
O esboço protocolo acima descreve um método manual, enzimática para o isolamento de um SVF a partir de um grande volume de amostra lipoaspirado. Dentro deste SVF são populações de células numerosas, incluindo o ASC. Numerosos estudos propõem que este SVF cultura sob condições de cultura de tecidos padrão irá seleccionar uma população de fibroblastos aderentes susceptíveis de ser composto principalmente do tipo ASC. Consistente com isto, temos mostrado, utilizando citometria de fluxo e de imunofluorescência, que os aglomerados de SVF cultivadas tornado essencialmente livre dos principais contaminantes tipos de células, ou seja, os glóbulos vermelhos, células de músculo liso e células da linhagem endotelial 1. A população ASC resultante é relativamente homogénea em aparência e composta por células semelhantes a fibroblastos (Figura 2). Estes ASC aderentes crescem bem em cultura sob condições de cultura de tecidos normais e apresentam uma população moderada tempo 1 duplicação tornando-os adequados para inúmeras b molecular e celulariology estudos in vitro e estudos de regeneração in vivo. No entanto, tendo em conta a natureza heterogénea do SVF isolado, é necessário validação da população ASC. Numerosos estudos de citometria de fluxo, a fim de caracterizar o perfil antigénico de CD de ASC em cultura como um meio potencial de identificação dessas células, quer in vitro e in vivo 5-9. Tabela 1 resume os resultados de muitos destes estudos. Embora a expressão de alguns destes antígenos CD permanece controverso, é geralmente aceite que ASC cultivadas são CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 e CD140a positivo. A ausência de vários antigénios CD hematopoiéticas, tais como CD31 e CD45, está de acordo com a origem mesodérmica de ASC, embora a expressão de marcadores específicos, como hematopoiéticas CD34 permanece não resolvido neste momento. Recentemente, os perfis antigénicos ASC, como determinado por citometria de fluxo, foram utilizados para seleccionar para SubPop específicoulations 10-12, na esperança de produzir ASC com capacidade de diferenciação aprimorados.
Como os mais populares meios de validação, em indução vitro da população ASC usando definidas condições de cultura resulta na sua diferenciação em mesodermal, de origem ectodérmica e endodérmica linhagens (para revisão ver 4) (Figura 2). Enquanto in vitro tri-germe potencial camada resultou no uso de ASC para uma ampla variedade de sistemas modelo de regeneração, a diferenciação em osteogénico, adipogénica e células condrogénicas é geralmente suficiente para identificar a ASC e confirmar a sua multipotency. Em nossas mãos, a diferenciação adipogênica de ASC resultados em células contendo vacúolos lipídicos brilhantes que mancham com Oil Red O 5. Resultados de diferenciação em células osteogénicas fosfatase alcalina positiva e da acumulação de minerais extracelular que mancha usando um fosfato de cálcio Von Kossa 5.Diferenciação condrogênica em condições micromassas de alta densidade produz pelotas que contêm proteoglicanos sulfatados (detectadas usando uma mancha de Alcian Blue) e expressam colágeno tipo 2 5. Tanto o músculo esquelético e diferenciação do músculo liso pode ser visto com a ASC para a coloração da miosina do músculo esquelético e MyoD1 e actina do músculo liso 5, 13, 14. A diferenciação na linhagem ectodérmica é sugerida através da assunção de uma morfologia neuronal-like por ASC induzida ea expressão de numerosos marcadores neuronais, incluindo o de NeuN, um fator de transcrição neuronal 5. Finalmente, a indução de ASC em relação a uma linhagem hepática / endodérmica com base nas condições estabelecidas 15 resulta em células que expressão de alfa-fetoproteína, um marcador conhecido de hepatócitos do fígado. Estes marcadores, juntamente com numerosos outros publicados nos últimos 10 anos, sugere fortemente que a ASC é uma população de células estaminais pluripotentes, que pode ser facilmente mantida epropagadas in vitro e induzida em relação a células de três linhagens germinativas. Juntamente com suas potencialidades regenerativas in vivo (para revisão ver 4), o ASC pode ser uma adição poderosa para as ferramentas de um cientista da pesquisa regenerativa ou clínico.
Figura 1. Manual, o isolamento enzimático de ASC humanos a partir de amostras lipoaspirado. A. Preparação de isolamento: Antes do isolamento dos componentes a seguir devem ser preparado: 1) 1x PBS (sem cálcio ou magnésio), esterilizado em autoclave, 2) uma solução de 0,075-0,1% colagenase tipo IA, preparado em PBS 1x e esterilizado através de filtração utilizando uma unidade de filtro de 0,22 um, 3) Controlo Médio (MC) para a subsequente cultura da população ASC. B. Isolamento de ASCs: Um passo-a-passo para o isolamento da fracção do estroma vascular (SVF) a partir lipoaspirates é mostrado. As etapas incluem a lavagem do lipoaspirado com estéril 1x PBS, a digestão com colagenase tipo IA, coleção do SVF por centrifugação, filtração e SVF. Cultura subseqüente do SVF irá resultar em uma população de fibroblastos aderente contendo a população ASC. Clique aqui para ver maior figura.
Figura 2. Multi-linhagem potencial de diferenciação das populações ASC aderente. Células SVF cultivadas resultar em uma população relativamente homogénea de aderentes, ASC fibroblásticas. Indução da população ASC sob condições definidas resulta em células do adipogênica, osteogênico, condrogênica, miogênica esquelético e linhagens miogênicas suaves.Além disso, as ASC também podem ser diferenciadas em células da linhagem de origem ectodérmica, expressando NeuN, um marcador de neurónios e de alfa-fetoproteína (AFP) um marcador estabelecido de endodérmica / hepática linhagem celular. Algumas das imagens de histologia e de imunofluorescência é feita a partir de resultados anteriormente publicados 1,5,6,7,8,9. Linhagem diferenciação, juntamente com o histológico, immunohistologic ou mancha fluorescente é mostrado. Clique aqui para ver maior figura.
| Perfil de expressão | ||
| expressão positiva | expressão negativa | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| proposto fenótipo de ASC (Comum entre dois ou mais estudos) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| marcadores controversos da ASC (Resultados diferenciais ao longo de vários estudos) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| estromal cemarcadores ll | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| marcadores hematopoiéticas | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| marcadores em comum entre dois ou mais estudos mostradas em negrito SMA = actina de músculo liso HLA = antígeno leucocitário humano ABCG2 = multi-droga G2 proteína transportadora | ||
Tabela 1. Perfis de expressão de superfície celular da ASC humanos.
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Discussion
O tecido adiposo para o isolamento de ASC pode vir de várias formas: desde peças sólidas de tecido obtidos por meio de ressecção ou lipoaspiração em pedaços menores obtidos, quer através de extração de seringa ou lipoaspiração assistida por sucção (ou seja, a lipoaspiração). Se mais células SVF (ASC) e, assim, pode ser obtido a partir de amostras de tecido adiposo ressecados ou aspirados está claro como estudos conflitantes foram apresentadas 16, 17. É possível que um ou outro tipo de tecido adiposo é mais do que apropriado para o isolamento de células SVF e ASC, enquanto o operador é proficiente na sua técnica de isolamento. No entanto, a lipoaspiração não segurar uma vantagem sobre a ressecção em que é menos invasiva e exige muito menos cuidados no pós-operatório. Enquanto os tipos de lipoaspiração têm aumentado ao longo da última década, incluindo técnicas, como assistida por ultra-som, poder-assistida e assistida por laser lipoaspiração 18, o mais comum continua a ser a lipoaspiração tumescente,no qual o compartimento de tecido adiposo é inundado com grandes quantidades de soro fisiológico estéril, anestésicos e vasoconstritores antes da aspiração 19. A escolha da técnica pode variar de cirurgião para cirurgião. No entanto, enquanto o meio de extracção pode não ser importante para a pesquisa, é importante perceber que a técnica pode ter um efeito sobre o número de ASC e viabilidade. Por exemplo, o aumento da pressão de vácuo lipoaspiração pode influenciar negativamente o rendimento celular SVF 20. Além disso, diminui a proliferação ASC foram medidos após a lipoaspiração assistida por ultra-som 17.
No entanto obtido, o aspirado deve ser processado rapidamente temperaturas de armazenamento pode afetar a viabilidade SVF e eventual rendimento ASC. Estudos por Matsumoto et al. Mostraram que o rendimento diminui se a ASC aspirado é armazenada à temperatura ambiente durante mais de 24 horas, 21. Se necessário, o armazenamento de 24 horas a 4 ° C, pode ser utilizado, sem qualquer efeito deletérios sobre as propriedades biológicas da população, mas a ASC, de novo, a viabilidade celular pode diminuir se este tempo de armazenamento é aumentada para além desse ponto. A facilidade de processamento de lipoaspirado está diretamente relacionada ao seu volume total. Volumes menores, obtidos através da extração da seringa, são relativamente fáceis de processar. No entanto, aspirados de maior volume, obtidos através de lipoaspiração, pode apresentar desafios físicos. Por exemplo, algo tão simples transferência da gordura a partir do recipiente de aspiração, de modo que ele pode ser lavado pode apresentar problemas quando o volume aspirado é grande. O protocolo descrito neste artigo destina-se a aliviar alguns destes desafios.
Em geral, o isolamento de populações de ASC lipoaspirates utilizando o método enzimático descrito neste artigo não se alterou significativamente ao longo dos últimos 10 anos. Existem inúmeros protocolos disponíveis através do PubMed que são excelentes em sua descrição do isolamento da ASC de lipoaspirates. Most deles descrever um protocolo semelhante, com pequenas modificações. Basicamente, o lipoaspirado é lavado de contaminantes, digerido enzimaticamente para liberar o SVF eo SVF, contendo a população ASC, é recolhida através de centrifugação. A maioria das grandes lipoaspirates volumes chegam em algum tipo de recipiente de vácuo - cuja configuração pode variar de cirurgião para cirurgião. Este protocolo recomenda a remoção do aspirado em um copo grande, estéril, antes da lavagem, uma vez que o próprio recipiente pode ser uma fonte de contaminação se não forem devidamente limpos antes de colocar na capa biossegurança. Uma vez transferido e deixou-se assentar por gravidade, o aspirado irá separar-se em três camadas: uma de topo, camada de óleo resultante da lise de adipócitos maduros, uma camada adiposa média e uma camada inferior de soro fisiológico e contaminando as células vermelhas do sangue. A camada de óleo deve ser removido como temos notado que pode ser tóxico para as culturas de células resultantes (observações não publicadas). Além disso, este protocol recomenda que o infranadante de hemácias salina e removido antes da primeira lavagem, a fim de diminuir o número potencial de contaminação de glóbulos vermelhos, uma vez as ASC são cultivadas. No entanto, um estudo realizado por Francis et al. Sugeriu que este infranadante pode também ser uma fonte de ASC 22. A utilização de uma pipeta de 10 ml serológico faz a remoção deste infranadante relativamente fácil. O que resta é a camada de tecido adiposo, que pode então ser facilmente lavadas usando PBS estéril, ou, se desejado, esterilizadas PBS suplementado com antibióticos e antimicóticos para diminuir a possibilidade de contaminação 23-25. Após a lavagem, o tecido adiposo é digerido enzimaticamente utilizando uma solução estéril de colagenase de tipo IA. A utilização de uma unidade de filtração, tais como a unidade Millipore mostrado neste vídeo combina um meio conveniente de filtrar assepticamente, a colagenase em um recipiente fechado para que o tecido adiposo lavado pode ser adicionado para subsequente digestão em banho-maria a 37 ° C.
O tipo de colagenase usada variou de grupo para grupo com colagenase de tipo IA, parecendo ser o mais prevalente, 1, 24, 25. No entanto, existem mais de 11 tipos diferentes de colagenase comercialmente disponíveis, cada um com afinidades de digestão de tecidos específicos. Para a digestão do tecido adiposo, empresas como a Sigma Aldrich recomendar tipos colagenase I e II e os dois tipos são bem representados na literatura de hoje 1, 24-27. No seu artigo original, de Zuk et ai. Usar colagenase de tipo IA obtido a partir de fontes de bovino a uma concentração de 0,075% 1. No entanto, a maior parte das fontes comerciais de colagenase de tipo IA são obtidos a partir de agora a bactérias anaeróbicas histolyticum Clostridium ou E. coli geneticamente modificada com C. histolyticum genes. Muitas empresas oferecem inúmeras preparações de colagenase tipo IA, a partir de crude para aqueles preparados através de precipitação com sulfato de amônio. Oprotocolo descrito no artigo JoVE utiliza uma preparação bruta de colagenase de tipo IA que contém não apenas as actividades colagenase, mas também de protease não específica, a clostripaína e actividades enzimáticas trípticos. Embora estas enzimas adicionais são críticos para a eficiência da digestão 28, existem aqueles que reportar variabilidade de lote para lote associado com colagenase de tipo IA em bruto 28, 29, e aumentar as suas concentrações da colagenase até 0,2%, para se obter uma digestão eficiente 23. Esses grupos utilizando colagenase de tipo IA em bruto também recomendam a suplementação com albumina de soro bovino (BSA 0,1-1,0%), a fim de melhorar o desempenho da enzima e aumentar a estabilidade das células dentro da matriz do tecido adiposo. No entanto, isto pode não ser necessário, como o protocolo descrito no artigo utiliza colagenase sem suplementação, sem qualquer efeito adverso na eficiência digestão.
Para aqueles que desejam usar uma colagenase miniatura mais definidoOSIÇÃO, fontes comerciais contendo colagenase altamente purificada, juntamente com uma mistura precisa de proteases estão agora disponíveis. Estas preparações purificar tipos colagenase clostridioses I e II à alta atividade e combiná-los com atividades de protease conhecidos neutros, como dispase e termolisina. Digestão adiposo eficiente utilizando colagenase e de termolisina foi avaliado por Zachar et al. 27. De acordo com este trabalho, 30 Pilgaard et al. Também relatam excelente eficiência da digestão usando várias misturas de colagenase e termolisina. No entanto, eles observam melhor eficiência da digestão usando preparações de colagenase e dispase.
Tempos de digestão para o isolamento de células a partir de tecido adiposo pode variar de estudo para estudo. Muitos protocolos publicados recomendar vezes digestão de 1-2 hr 27, 30. No entanto, é importante perceber que os tempos excessivos de digestão pode vir a afetar o número de AS viávelCs e o seu fenótipo de células estaminais. Pilgaard e colaboradores determinaram que a digestão 2 horas a 37 ° C dá o melhor equilíbrio entre a dissociação de tecidos e funcionalidade ASC 30, com Zachar et al. Recomendando que digestão, após 45 min, ser observada a cada 15 minutos até 2 horas no máximo, com a digestão ser interrompido uma vez que o tecido adiposo assume uma aparência mais homogênea 27. Estamos de acordo com esta recomendação. No entanto, a nossa experiência, a maioria dos tipo colagenase IA preparações em 0,075-0,1% são capazes de digerir grandes quantidades de lipoaspirates em 30-45 min, e que estes tempos são adequadas para libertar um número suficiente de células. Portanto, este protocolo recomenda um tempo de digestão de 30 min. Se for necessário mais tempo, a consistência do lipoaspirado devem ser monitorados e digestão parado quando o lipoaspirado assume uma "cremoso" ou aparência "pastosa" (Figura 1).
Uma vez ªe digestão completa é, isolamento do SVF libertado é simplesmente conseguida utilizando centrifugação. No entanto, como a pressão de aspiração, os efeitos físicos da centrifugação pode ter um efeito sobre a viabilidade de SVF e o número de ASC disponíveis para a cultura. Um estudo realizado por Kurita e colegas 31 mostrou que as velocidades superiores a 3.000 xg pode danificar a ASC. No entanto, as velocidades deve ser suficientemente importante para garantir a peletização adequada de SVF. Como regra geral, a maioria dos protocolos, incluindo este, recomendamos uma velocidade de centrifugação de 1.200-1.500 x g. Cuidados devem ser tomados pelo pesquisador para garantir que eles compreendam a relação entre a força centrífuga (medido em g) e velocidades de centrifugação (medida como rpm), como a relação depende do rotor de centrífuga específica. No entanto, como uma regra, as forças centrífugas mais baixas, como por exemplo 1200 x g, são frequentemente equivalente a velocidade de centrifugação e pode ser utilizada com segurança de forma intercambiável.
Seguindo a fiação, vários distinct camadas são observados no tubo de centrifugação (Figura 1): uma camada superior de óleo e "macias" adipócitos brancos, uma camada de meio de colagenase e uma pelete celular. O sedimento em si pode ter duas camadas distintas: uma camada superior de hemácias e uma menor pelota SVF branco, contendo as ASC. Este protocolo recomenda a aspiração cuidadosa do óleo e adipócitos, enquanto o óleo pode ser tóxico para a cultura de células e os adipócitos foram mostrados para ser capaz de desdiferenciação de volta para um tipo mais primitivo de células 32. No entanto, esses adipócitos podem ser colhidas neste momento, se desejar. Devido a estes contaminantes, este protocolo recomenda uma etapa de lavagem extra para garantir a sua remoção adequada. Esta etapa também permite ao pesquisador combinar várias pelotas SVF para posterior facilidade de filtração. A filtração é provável que seja necessário, devido à presença de grandes pedaços de material fibroso e agregados celulares, após digestão. Estes materiais são facilmente removidosatravés de simples filtração baseado em gravidade através de 70 ou 100 filtros de malha mM. Uma alíquota do filtrado pode ser feita de forma a contar o número de células nucleadas, se desejado e o filtrado restante banhado por aderência ASC e expansão.
Apesar das tentativas diligentes remover tantas hemácias possível, nenhuma preparação ASC será totalmente sem contaminação RBC. Em nosso artigo original, propusemos a remoção desses glóbulos vermelhos através de ressuspensão do sedimento em uma solução hipotônica de 160 mM NH 4 Cl. A maioria dos artigos de isolamento subseqüentes contêm esta etapa e recomendam o uso de NH 4 soluções baseadas em Cl ou água estéril 22-24, 27, 33, embora cuidado deve ser tomado se estiver usando água estéril, para minimizar o tempo que as células são expostas SVF para a solução hipotónica 27. No entanto, este passo pode não ser necessário, como os glóbulos vermelhos são uma população de células não aderentes e podem ser facilmente removidos na sequência de uma cultura durante a noite dea população ASC. Além disso, enquanto que na melhor das hipóteses anedótica, esses glóbulos vermelhos parecem melhorar a expansão inicial das células aderentes resultantes (Zuk, observações não publicadas). Como tal, este protocolo elimina o passo de lise de RBC, e propõe que as culturas iniciais ASC ser deixado expandir na presença destes glóbulos vermelhos para os primeiros 3-4 dias, sem qualquer alteração de meio de cultura. A razão para esta observação pode ser devido a algum tipo de sinalização parácrina de contaminar células sanguíneas ou pode ser simplesmente devido a uma melhor viabilidade com exclusão do passo de lise dos glóbulos vermelhos. Seguindo este, o meio de cultura pode ser aspirado e a maioria dos glóbulos vermelhos removidos por lavagem suave das placas com PBS 1x estéril. Ao longo do tempo, quaisquer eritrócitos restantes acabarão por morrer e ser removida a partir da cultura.
Estudos de Zachar e Boquest estimam que 25-50% da pelota SVF ressuspenso adere à cultura de tecidos de plástico 23, 27. O resultado do "passagem 0" ASC cultures são heterogêneos, composto de células pequenas, redondas pensado para ser ASC e células em forma mais irregular propostas para ser endotelial na origem. Embora estudos de muitos grupos, incluindo o nosso confirmaram a ausência de contaminação de tipos de células, como células musculares lisas, células hematopoiéticas e fibroblastos em culturas ASC 1, a presença de tipos de células adicionais não podem ser descartadas. . Na verdade, Tallone et al caracterizou passagem 0 culturas e observou quatro populações distintas: 1) pequenas, redondas, células rapidamente renovação, 2) células fibroblásticas fusiformes provavelmente o ASC, 3) lentamente replicar grandes células com um mais restrito potenciais (ou seja, pré-adipócitos) e 4) células endoteliais cubóides que são perdidos com a passagem 34. Estudos posteriores demonstraram que o, a população de células em rápida renovação rodada possui a maior multipotencialidade e expressam marcadores de células estaminais normais 35, 36. Além disso, eles podem formar "esferóides" devido àsua rápida proliferação e são muitas vezes cercado por fibroblastos fusiformes. Como tal, é possível que a população ASC fusiformes acima proposto pode ter origem a partir destas células. Após a expansão inicial de passagem destas culturas ASC 0, pensa-se que a cultura continuada durante o tempo selecciona para o CSA, com as culturas resultantes assumindo uma mais fibroblásticas, composição homogénea. No entanto, os restos de células contaminantes pode não ser totalmente excluída e, por conseguinte, a população ASC deve ainda ser considerado heterogénea.
Embora o protocolo descrito neste artigo é simples, barato e não necessita de quaisquer partes de equipamento normalmente não encontradas em instalações de cultura de tecido, que tem a desvantagem de necessitar de uma instalação desse tipo. Numerosos estudos têm investigado as aplicações de translação da ASC por meio de modelos animais e estudos clínicos utilizando o ASC começaram a aparecer (para revisão ver 4
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Disclosures
Os autores deste manuscrito são co-inventores sobre a patente de propriedade da Regentes da Universidade da Califórnia e licenciado para Cytori Therapeutics.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer e agradecer aqueles pessoal adicional de pesquisa que contribuíram para o desenvolvimento do protocolo descrito e seu isolamento da ASC, incluindo: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Zhang Rong, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, e Dr. John Fraser, PhD. Os resultados apresentados foram financiados, em parte, por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde, incluindo os NIAMS e Institutos NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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