Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates

Published: September 26, 2013 doi: 10.3791/50585
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4, 3,5
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

I 2001, beskrev forskere ved UCLA isolering av en befolkning på voksne stamceller, betegnes Adipose-avledet stamceller eller ASCs, fra fettvev. Denne artikkelen beskriver isolering av ASCs fra lipoaspirates ved hjelp av en manuell, enzymatisk fordøyelse protokollen ved hjelp av collagenase.

Abstract

I 2001, beskrev forskere ved University of California, Los Angeles, isolering av en ny populasjon av voksne stamceller fra utsugd fettvev som de i utgangspunktet betegnes Behandlet Lipoaspirate Celler eller PLA celler. Siden da har disse stamcellene blitt omdøpt til adipose-avledet stamceller eller ASCs og har gått videre til å bli en av de mest populære adulte stamceller populasjoner innen stamcelleforskning og regenerativ medisin. Tusenvis av artikler nå beskrive bruken av ascs i en rekke regenerative dyremodeller, inkludert ben regenerering, perifer nervereparasjon og hjerte-engineering. Nyere artikler har begynt å beskrive mengde bruksområder for ASCs i klinikken. Protokollen vist i denne artikkelen beskriver den grunnleggende prosedyren for manuell og enzymatisk isolere ASCs fra store mengder lipoaspirates hentet fra kosmetiske prosedyrer. Denne protokollen kan lett skaleres opp eller ned til boligen ispiste volumet av lipoaspirate og kan tilpasses til å isolere ascs fra fettvev oppnås gjennom mageoppstrammingsoperasjoner og andre lignende fremgangsmåter.

Introduction

I 2001, ble en antatt bestand av multipotente stamceller fra fettvev beskrevet i tidsskriftet Tissue Engineering en. Disse cellene ble gitt navnet Bearbeidet Lipoaspirate eller PLA celler på grunn av deres avledning fra bearbeidet lipoaspirate vev innhentet gjennom kosmetisk kirurgi. Isoleringen metoden beskrevet i denne artikkelen, var basert på eksisterende enzymatiske strategier for isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra fettvev 2. Den SVF har blitt definert som en minimal behandlet populasjon av røde blodceller, fibroblaster, endotelceller, glatte muskelceller, pericytes og pre-adipocytter som ennå har til å følge en vev kultur substrat to, tre. Dyrking av denne SVF over tid er foreslått for å eliminere mange av disse forurensende celle-populasjoner og resultere i en fastsittende, fibroblastisk populasjon. Disse fibroblaster er blitt identifisert i litteraturen i de siste 40 år som blir forhåndsadipocytter. Men vår forskergruppe vist at disse cellene besatt mesodermal multipotency og omdøpt tilhenger SVF befolkningen som PLA celler. Senere studier av en rekke andre forskningsmiljøer har lagt til dette potensialet, noe som tyder på både endodermal og ectodermal potensialer (for gjennomgang se 4). Siden den gang har mange tilleggsvilkår for disse cellene dukket opp i litteraturen. For å gi noen form for enighet, ble begrepet adipose-avledet stamceller eller ASCs vedtatt på 2 nd årlige IFATS konferansen. Derfor vil uttrykket ASC brukes i denne artikkelen.

Den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen, er en relativt enkel fremgangsmåte som krever standard laboratorieutstyr og bruker enkle reagenser slik som fosfo-bufret saltløsning, standard tissue culture media reagenser og kollagenase. Det kan produsere store mengder ascs avhengig av mengden av utgangs fettvev volum og påfølgende culture tid. Imidlertid kan behandlingen av en slik stor mengde av fettvev presentere noen fysiske problemer som kan reduseres til en viss grad ved bruk av denne protokoll. Videre gjør denne protokollen krever sterile vevskultur-anlegg og som er godkjent for biologisk hetter, og derved nødvendiggjøre bruk av en godkjent vevskultur anlegg. Dette kravet kan også redusere nytten av ASC befolkningen i kliniske applikasjoner med mindre de er isolert i Good Manufacturing Practice (GMP)-godkjente anlegg designet for isolering og utvidelse av materialer for klinisk bruk. Som et alternativ, ville automatiserte systemer som kan isolere ascs i et lukket system i operasjonssalen unngå dette viktige spørsmålet og la for umiddelbar bruk av ascs uten behov for etterfølgende in vitro-ekspansjon. Til dags dato, er det seks automatiserte systemer som er tilgjengelige i handelen for isolering av celler fra humant vev. Disse systemer kan gjøre det mulig å isolere enbetydelig antall ASCs fra store mengder fettvev umiddelbart etter sin avling. Disse ASCs kan da bli gjeninnført i pasienten for en rekke av regenerativ formål uten pasienten å måtte forlate operasjonssalen. I tillegg til denne protokollen beskriver manuell isolering av ascs, er en protokoll for automatisert isolering av ascs hjelp av Celution System også gitt i et ledsagende artikkelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen vist her beskriver den manuelle isolering av ASCs fra lipoaspirates innhentet gjennom kosmetiske prosedyrer ved hjelp av enzymatisk fordøyelse og differensial sentrifugering. Denne protokollen ble først publisert i tidsskriftet Tissue Engineering i 2001 en, der de resulterende cellene ble kalt Behandlet Lipoaspirate Celler eller PLA celler på grunn av sin isolasjon fra lipoaspirates. Imidlertid har begrepet PLA cellen nå blitt erstattet med begrepet Adipose-avledet stamceller eller ASCs å gi feltet en slags konformitet i form av nomenklatur. Cellene isoleres ved denne protokoll har vist seg av mange å besitte mesodermal potensial både in vitro og in vivo (for gjennomgang se 4). I tillegg har de ectodermal og endodermal potensialer av ASC også blitt utforsket fire. Isoleringen teknikk er enkel og rett frem og krever omtrent en time for å fullføre. Den resulterende celles blir dyrket under standard vevskulturbetingelser. Med kultur tid blir ASC befolkningen mer homogen, som består av fibrinoblast celler som utvider lett og viser god levedyktighet på lang sikt i kultur.

Merk: Følgende deler av utstyret som kreves, er oppført på slutten av denne artikkelen. Alle glass, medier og reagenser bør steriliseres gjennom autoklavering eller filtrert gjennom 0,22 mikrometer filtre. Aseptiske vevkulturteknikk bør følges til enhver tid. For å sikre dette, bør alle materialer som er plassert i biosikkerhet kabinett steriliseres ved å spraye med en 70% etanol løsning og tørke med rene papirhåndklær.

En. Før Harvest Forbered opp følgende:

  1. Sterile 1X fosfo-bufret saltvann (PBS) for vasking av de lipoaspirates. Forbered ca 1 L av 1x PBS for hver 100 ml lipoaspirate. Autoklaveres PBS og alleow avkjøles til romtemperatur før bruk. Som et alternativ, kan antibiotisk / antimykotisk tilsettes til en sluttkonsentrasjon på: 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 2,50 ug / ml amfotericin B når den er blitt kald PBS.
  2. Steril 0,075 til 0,1% collagetypen IA (fra Clostridium histolyticum) for enzymatisk fordøyelse av lipoaspirate. Konsentrasjon vil avhenge av kvaliteten og kilden til collagenase - dvs. råolje vs renset. Andre kollagenase typer kan benyttes (f.eks kollagenase type II eller IV) i samme konsentrasjoner. Forbered i 1x PBS og sterilt filter ved hjelp av en 1000 ml filtreringssystem med en 0,22 mikrometer filter (figur 1A). Imidlertid kan sterile glassflasker som er utstyrt med en flaske toppfilter kan også brukes. Tilbered og bruk ved romtemperatur. Kollagenaseklassene løsninger kan oppbevares på kort sikt ved 4 ° C inntil nødvendig. Ikke fryse kollagenaseoppløsning som det kan minske sin aktivitet.
  3. Steril kontroll Medium (CM) for collageinaktivering og dyrking av ASC befolkningen. Til 500 ml av CM, kombinere følgende: 500 ml DMEM (4,5 g / l glukose, L-glutamin), 50 ml føtalt bovinserum (varme-inaktivert), 5 ml penicillin / streptomycin (10,000 IU penicillin, 10 000 ug / ml streptomycin). Som et alternativ, kan 5 ml amfotericin B (250 mikrogram / ml amfotericin B) også legges til. Steril filtrering av dette mediet er nødvendig hvis usterile reagenser anvendes. Plasser CM i et 37 ° C vannbad i 30 min før bruk, for å varme opp mediet.
  4. Sterilt glass og plastartikler for isolasjon. Autoklaver et 1000 ml begerglass og la den avkjøles til romtemperatur før bruk. I tillegg har følgende plasticware klar: aseptisk serologiske pipetter (5 ml, 10 ml og 25 ml), 50 ml sentrifugerør, og vev kultur-behandlet kultur retter.

2. Isolering av ASCs fra Lipoaspirates

De fleste lipoaspirates er samlet i en aspirasjonspumpe beholder (se figur 1B), og kan bestå av tre distinkte lag: 1) et øvre lag av olje på grunn av lysis av modne adipocytter, 2) et midtre lag av fettvev, og 3) et bunn, flytende infranatant med salt og forurensende celletyper som for eksempel røde blodceller (RBC). Den øvre oljelag kan ikke være til stede i betydelige mengder. Hvis tilstede, bør det aspireres som oljeforurensning av det resulterende ASC kultur kan påvirke levedyktigheten til kulturen. Bunnen infranatant bør fjernes før behandling for å minimalisere kontaminering av ASC kulturer med RBC. Dette vil forlate midten, fettvev lag, som så vil bli vasket og enzymatisk fordøyd å frigjøre sin mobil, stromal vaskulær fraksjon (SVF).

  1. Vask av lipoaspirate: Åpne lipoaspirate container i vevet kultur hood og nøye dekanter lipoaspirate i en steril 1 L glassbeger. La de lipoaspirate lag for å skille helt til fettvev laget er godt atskilt (Figur 1B).
    1. Aspirer av oljelaget (hvis til stede) ved hjelp av en steril pipette glass og bunnen saltvann infranatant ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Dette vil få den store majoritet av forurensende røde blodlegemer og saltvann.
    2. Utrede volumet av det resulterende fettvev sjikt og tilsett sterilt 1 x PBS ved et likt volum. Rør aspirer med pipetten brukes for aspirasjon for å blande lipoaspirate med PBS. La de to lagene å avgjøre. Som nevnt ovenfor, kan 1x PBS supplert med antibiotisk / antimykotika.
    3. Aspirer infranatant ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
    4. Fortsett å vaske fettvev brøkdel som skissert i trinn 2.1.2. og 2.1.3. inntil fettlaget har en gul / gylden farge. Sug the infranatant en siste gang, slik at fettvev fraksjonen i begerglass. For å sikre tilfredsstillende fjerning av infranatant, tillate lipoaspirate lag for å sedimentere i 5 minutter etter den siste vaskingen og før den avsluttende aspirasjon.
  2. Enzymatisk fordøyelse av lipoaspirate: Fremstill steril kollagenase 1A-løsning som beskrevet ovenfor, i en filterenhet. Forbered et volum lik det adipose brøkdel og sterilt filter.
    1. Etter filtrering av kollagenaseoppløsning, kast den øvre filterenheten, nøye hell vasket adipose brøkdel inn i kollagenaseoppløsning og tett lukk flasken.
    2. Plasser kollagenase / fettblanding i et 37 ° C vannbad og fordøye ved 37 ° C i 30 min. Rotér collage / adipose blandingen hver 5-10 min og legg tilbake i vannbadet. Fettvev lag bør ta på seg en "mykere" utseende (Figure 1B) som fordøyelsen provenyet. Ytterligere fordøyelsestider (dvs. opp til 2 t) kan brukes hvis fettvev lag fremdeles synes å ha faste stykker av fett i den.
  3. Isolering av ASCs: Plasser fordøyd collage / adipose blandingen tilbake i biosikkerhet kabinettet. Vær sikker på å sterilisere filterenheten med 70% etanol før anbringelse tilbake i kabinettet.
    1. Pipetter 25 ml alikvoter av infranatant inneholder SVF inn i sterile 50 ml sentrifugerør.
    2. Tilsett 25 ml av CM i hvert rør. La CM å inaktivere kollagenase ved inkubering ved romtemperatur i skapet i 5 min.
    3. Sentrifuger i 10 minutter ved 1200 xg for å samle opp SVF som en pellet.
    4. I biosikkerhet kabinett, suge supernatant fra hvert rør. Sikre den øverste oljelaget og eventuelle flytende adipocytter er sugd opp med denne supernatant (
    5. Kombiner de SVF pellets inn i en sentrifuge rør ved hjelp av 30 ml CM og dele likt over to nye 50 ml sentrifugerør. Sentrifuger som i trinn 2.3.3. og aspirer supernatantene fra de to SVF pellets (ikke vist i figur).
      EKSTRA: Hvis RBC er ønsket, resuspender hver SVF pelleten i 10 ml av en RBC lyseringsbuffer (160 mM NH4Cl) og inkuberes ved romtemperatur i 10 min. Sentrifuger som i trinn 2.3.3. og suge supernatantene for å gi de SVF pellets (ikke vist i figuren).
    6. Kombiner de to SVF pellets inn i en ny sentrifugerør bruker 5-10 ml CM (Figur 1B).
    7. For å filtrere ut store vevspartikler, pipettere den resuspenderte pellet SVF på en 100 pm mesh filter plassert på toppen av et nytt 50 ml sentrifugerør og tillater å filtrere ved tyngdekraftstrøm.
    8. Pipettes alikvoter av det resuspenderte(Og filtrert) SVF pellet inneholder ASCs bort på vev-kultur behandlet kultur retter. Supplere hver tallerken med et passende volum av CM.
    9. Kultur cellene i CM i 3-4 dager ved 37 ° C, 5% CO 2 uten endring av medium.

Etter denne innledende kulturen perioden, kan dyrkningsmedium suges og eventuelle forurensende røde blodlegemer forsiktig fjernet ved vasking med steril 1XPBS. Erstatt med CM og fortsette til kultur de ASCs etter behov. Typen av vevskultur fatet anvendes, og hvor det resuspenderte pellet SVF er fordelt på disse tallerkner, vil avhenge av antall celler ønskede følgende konvensjonell vevskultur.

Tre. Karakterisering av ASC Befolkning: flowcytometri og multilineage Differensiering

Når isolert, bør karakterisering av ASC populasjon skal utføres. Konvensjonelle tilnærminger til dette kan være flyt cytometry å karakterisere celleoverflaten CD-antigen profil av cellene og in vitro differensiering for å bekrefte deres multilineage differensieringskapasitet. Mens flere linjene kan vurderes i ASCs, skisserer denne protokollen differensiering av ASCs inn cellene i adipogenic, osteogenisk og chondrogenic linjene som et middel til å bekrefte multilineage mesodermal potensialer fem.

In vitro multi-avstamning Differensiering av ASCs

  1. Osteogen Differensiering av ascs: Før induksjon, klar Osteogenic Medium (OM) som følger: Til en 500 ml flaske med DMEM (4,5 g / ml glukose) tilsett 25,0 ml FBS (5,0% sluttkonsentrasjon) og 5,0 ml penicillin / streptomycin (10.000 IU / ml og 10 000 mg / ml sluttkonsentrasjoner henholdsvis). Til dette, legge til følgende osteogenic induksjons agenter for å gi de angitte sluttkonsentrasjoner: Dexamethasone (0,1 mikrometer finalen), L-askorbinsyre 2-fosfat (50,0 mikrometer slutt) Og β-glycerophosphate (10,0 mM final).
    1. Før induksjon, innhøsting og plate dyrkede ascs i ønsket vevskultur fatet, slik at en konfluens på omtrent 50% er oppnådd. For hver eksperimentell fatet belagt, plate en ekstra tallerken for en ikke-indusert kontroll. Kultur overnatter i CM.
      Merk: 50% konfluens anbefales for å gi rom for fortsatt spredning som kan oppstå i løpet av induksjonen
    2. På dagen for induksjon, fjerne medium og legge til følgende: OM til de ønskede osteogenic eksperimentelle brønner og CM til kontrollbrønnene. Volumet av mediet som benyttes, vil avhenge av størrelsen på vevskultur fatet. For 12 brønn retter, 1,0 ml av media per brønn er tilstrekkelig. For seks brønn retter, 2,0 ml av media per brønn er tilstrekkelig. For 100 mm skåler, bør 10,0 ml av mediet pr fatet anvendes.
    3. Kultur cellene i minimum 14 dager med endringer av det aktuelle mediet hver 3-4dager. Meget osteogenic ASC populasjoner kan vise tegn på ekstracellulære mineral deponering så tidlig som 7 dager induksjon.
    4. Osteogent differensiering (dvs. ekstracellulære mineral deponering) kan bekreftes ved hjelp av en von Kossa histologisk flekken for kalsiumfosfat. Denne flekk vil produsere en brunsvart bunnfall som identifiserer nærværet av ekstracellulært kalsium-fosfat (se figur 2).
      Å farge med von Kossa reagens:
      1. Fjern OM fra de eksperimentelle celler og CM fra kontrollcellene
      2. Fikser cellene for 60 min i 4,0% paraformaldehyde utarbeidet i 1x PBS.
      3. Vask cellene to ganger med 1x PBS.
      4. Inkuber cellene med 2,0% sølvnitrat (fremstilt i vann) i mørket i 30 min.
      5. Ta av sølvnitrat, vask to ganger med destillert vann og lufttørke cellene.
      6. Expose cellene mot UV-lys for 60 min å utvikle calCium fosfatbunnfall.
      7. Vask cellene flere ganger med 1XPBS.
      8. Counterstain cellen med hematoxylin hvis ønskelig.
  1. Adipogenic Differensiering av ascs: Før induksjon, klar Adipogenic Medium (AM) som følger: Til en 500 ml flaske med DMEM (4,5 g / ml glukose) tilsett 50,0 ml FBS (10,0% sluttkonsentrasjon) og 5,0 ml penicillin / streptomycin (10.000 IU / ml og 10 000 ug / ml sluttkonsentrasjoner henholdsvis). Til dette, legge til følgende adipogenic induksjons agenter for å gi de angitte sluttkonsentrasjoner: deksametason (1,0 mikrometer finalen), 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX - 0,5 mM endelig), indometacin (0,2 mM endelig) og insulin (10,0 mikrometer finalen ).
    1. Før induksjons, høste og plate de dyrkede ASCs i ønsket vev kultur parabolen slik at en konfluens på ca 80% er oppnådd. For hver eksperimentell fatet belagt, plate et tilleggal parabolen for en ikke-indusert kontroll. . Kultur over natten i CM Note: Adipogenic differensiering av ASCs ser ut til å være mer effektiv med økt confluency.
    2. På dagen for induksjon, fjerne medium og legge til følgende: AM til de ønskede osteogenic eksperimentelle brønner og CM til kontrollbrønnene. Volumet av mediet som benyttes, vil avhenge av størrelsen på vevskultur fatet. For 12 brønn retter, er tilstrekkelig 1.0.ml av media per brønn. For seks brønn retter, 2,0 ml av media per brønn er tilstrekkelig. For 100 mm skåler, bør 10,0 ml av mediet pr fatet anvendes.
    3. Kultur cellene i minimum 14 dager med endringer av det aktuelle mediet hver 3-4 dager. Meget adipogenic ASC populasjoner kan vise tegn på lipid vacuole formasjon så tidlig som 7 dager induksjon.
    4. ASCs gjennomgår adipogenic differensiering vil utvikle flere lipid vakuoler som kan være lett å visualisere under lysmikroskop. I tillegg adipogenic differensiering kanbekreftes ved hjelp av en Oil Red O histologisk flekk som vil samle innenfor disse vakuoler (se figur 2).
      Å farge med Oil Red O:
      1. Fjern materialet fra de eksperimentelle og kontroll celler og fikse dem i 60 min ved hjelp av en 10% formell kalsium fiksativ. For å fremstille denne fikseringsmiddel, kombinere følgende: 1,0 g CaCl 2, 25,0 ml 16% paraformaldehyd (4,0% endelig) og 75,0 ml destillert vann.
      2. Vask cellene to ganger med 1x PBS.
      3. Vask cellene en kort stund med 70% etanol.
      4. Inkuber cellene ved romtemperatur i 5 min med Oil Red O-løsning. For å fremstille den Oil Red O-løsning, oppløses 2,0 g Oil Red O pulver i 50,0 ml 70% etanol og 50,0 ml aceton.
      5. Vask cellene med 70% etanol og deretter med vann fra springen.
      6. Visual cellene snart etter farging på grunn av fading av flekken med tiden.
  1. Chondrogenic Differensiering av ASCs: Chondrogenic differensiering oppnås gjennom en høy tetthet kultur teknikk kalt "Micro kultur". Før kultur, klar Chondrogenic Medium (CHM) som følger: Til en 500 ml flaske med DMEM (4,5 g / ml glukose) tilsett 5,0 ml FBS (1% sluttkonsentrasjon) og 5,0 ml penicillin / streptomycin (10.000 IU / ml og 10 000 pg / ml sluttkonsentrasjoner på henholdsvis). Til dette, legge til følgende chondrogenic induksjons agenter for å gi de angitte sluttkonsentrasjoner: L-askorbinsyre-2-fosfat (50,0 mikrogram / ml final), insulin (6,25 mg / ml final), transferrin (6,25 mg / ml final) og TGFβ1 (10,0 ng / ml).
    1. Høste ASCs og sentrifuger i 5 min ved 1200 xg å pellet cellene. Tell cellene for å bestemme tetthet av cellesuspensjonen.
    2. For å fremstille pellets Micromass, forberede to cellesuspensjoner: en eksperimentell suspensjon fremstilt i chm med en tetthet på 1 x 10 7 celles / ml, og en kontrollsuspensjon fremstilt in CM i en tetthet på 1 x 10 7 celler / ml.
      1. Plasser 10,0 ul "dråper" av cellesuspensjonen i individuelle brønner i en multi-brønn fatet. Tillat å følge i 2-3 timer ved 37 ° C.
      2. Forsiktig lapper belagt dråper med enten CHM eller CM være forsiktig med å distansere cellene.
      3. Kultur cellene i opp til 14 dager i CHM eller CM med endringer i middels hver 3-4 dager. Celler dyrket i chm vil kondensere i løpet av denne tiden for å danne en høy tetthet Micromass pellet med liten eller ingen celler i et området monolag. Kontroll celler dyrket vil ikke gjennomgå denne kondens og mange vil bli funnet som en monolayer.
      4. For å bekrefte chondrogenesis, løse pellets i 15 minutter i 4,0% paraformaldehyd (fremstilt i 1 x PBS) ved romtemperatur. Flekk for tilstedeværelsen av sulfaterte proteoglykaner ved hjelp av en Alcian Blå histologisk flekken.
        Å farge bruker Alcian Blå:
        1. Vask paraformaldehyde-faste pellets en gang i 1x PBS.
        2. Inkuber pellets i 0,1 N HCl (pH 1,0) i 5 min for å senke deres pH.
        3. Fjern HCl og tilsett 1% Alcian blått reagens (fremstilt i 0,1 N HCl, pH 1,0). Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
        4. Fjern Alcian blått reagens og vaske pelletene med 0,1 N HCl (pH 1,0) for å fjerne overskudd av flekken.
        5. Ytterligere vaskinger ved bruk av springvann kan brukes for å redusere bakgrunnsfarging.
        6. Som et alternativ, kan de Micro pellets høstes, fast over natten i 10% formalin, innebygd i parafin og delene farget for Alcian Blå.

4. FLOWCYTOMETRISKE Karakterisering av ASCs

Karakterisering av celleoverflate-antigenet CD profil kan oppnås gjennom konvensjonelle strømningscytometri.

  1. Utarbeidelse av ASCs for flowcytometri: Priortil analyse, utarbeide en flowcytometrisystemer Buffer (FCB) består av følgende: 1,0% BSA, 2,0% FBS og 0,025% saponin utarbeidet i 1x PBS.
    1. Høste ascs og sentrifuger cellene i 5 min ved 1200 x g for å gi en pellet.
    2. Suspender cellene i sterile 1XPBS og telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Bestem celletetthet på suspensjonen.
    3. Fordel suspensjonen opp i aliquoter på 5 x 10 5 celler totalt og sentrifuger til pellet.
    4. Fjern PBS supernatanten og fikser cellene i 60 min ved -20 ° C med et overskudd av is-kald 70% etanol. Om nødvendig, kan disse cellene bli lagret i dette 70% etanol i en -20 ° C fryseboks til det skal brukes.
    5. Etter fiksering, omhyggelig suge etanol og vaskes forsiktig pelleten to ganger med et overskudd av FCB. Å vaske:
      1. Til et overskudd av FCB ​​og forsiktig resuspender pelleten.
      2. Sentrifuger i 5 min ved 1200 xg å samle cellene ensa pellet.
      3. Aspirer forsiktig FCB supernatanten.
      4. Gjenta.
    6. Ta den siste FCB vask supernatant fra hver prøve og resuspender i 100 mL av FCB. Legg ønsket fluorokromkonjugerte primære antistoff bruke produsentens foreslåtte fortynning. Inkuber cellene på is med antistoffet i 30 minutter.
      Merk: Hvis fluorokromkonjugerte primære antistoffer ikke er tilgjengelige, kan det ikke-konjugerte primære antistoffer brukes.
    7. For hvert fluorokrom anvendes (f.eks FITC, PE), inkubere en aliquot av celler med 100 ml FCB innehold isotype-matchet IgG som en negativ kontroll.
    8. Inkuber en alikvot på 100 ml inneholdende FCB ingen antistoffer som en ytterligere kontroll.
    9. Vask hver delmengde av celle to ganger med FCB som beskrevet i trinn 4.1.5. Etter den siste vaskingen, resuspendere i 100 ml alikvoter av FCB ​​og fortsette med strømningsanalyse.
      Merk: Hvis ikke-konjugerte primære antistoffer ble brukt: Etter dette vasketrinn inkuber alikvoter på is i 20 min med FCB supplert med passende fluorokrom-konjugert sekundært antistoff ved bruk av produsentens foreslåtte fortynning. Vask to ganger som beskrevet i trinn 4.1.5.
  2. Flow analyse av ASCs: For strømningsanalyse, bør et minimum av 10 000 hendelser telles. Unstained og isotype-matchet kontroller bør brukes til å sette porter ved forover scatter (FSC) og side scatter (SSC). For dette bør ingen antistoff kontroller (dvs. unstained) fra trinn 4.1.8 benyttes for å eliminere avfall og døde ascs. De isotype-matchet IgG kontroller av trinn 4.1.7. skal brukes til å etablere områder med positiv fluoresens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen skisse over beskriver en manuell, enzymatisk fremgangsmåte for isolering av en SVF fra et stort volum lipoaspirate prøven. Innenfor denne SVF er mange cellepopulasjoner, inkludert ASC. Tallrike studier foreslår at dyrkning av denne SVF under standard vevskulturbetingelser vil selektere for en fastsittende fibroblast populasjon sannsynlig å være sammensatt hovedsakelig av ASC type. I samsvar med dette har vi vist, ved hjelp av flyt-cytometri og immunfluorescens, som dyrkede SVF pellets blir i det vesentlige fri for de store forurensende celletyper, nemlig RBCs, glatte muskelceller og cellene i det endoteliale lineage 1.. Den resulterende ASC befolkningen er relativt homogent utseende og består av fibroblast-lignende celler (figur 2). Disse heft ascs vokser godt i kultur under standard vevskulturbetingelser, og oppviser en moderat populasjon fordoblingstiden en som gjør dem egnet for mange molekylær-og celle biology studier in vitro og regenererende studier in vivo. Imidlertid, i lys av den heterogene art av det isolerte SVF, er det nødvendig validering av ASC befolkningen. Tallrike studier har brukt strømningscytometri for å karakterisere CD antigene profil av dyrkede ascs som et mulig middel for å identifisere disse celler både in vitro og in vivo 5-9. Tabell 1 oppsummerer resultatene fra mange av disse studiene. Mens uttrykk for noen av disse CD antigener fortsatt kontroversielt, er det stor enighet om at kultur ASCs er CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 og CD140a positiv. Fraværet av en rekke hematopoetiske CD-antigener, slik som CD31 og CD45, er konsistent med den mesodermal opprinnelse ascs, selv om ekspresjonen av spesifikke hematopoetiske markører som CD34 forblir uløst på dette tidspunkt. Nylig, ASC antigene profiler, som bestemmes av flowcytometri, har blitt brukt til å velge for spesifikke SUBPOPulations 10-12 i håp om å produsere ASCs med forbedrede differensierings kapasiteter.

Som de mest populære hjelp av validering, in vitro induksjon av ASC befolkningen ved hjelp av definerte kultur forhold resultater i deres differensiering i mesodermal, ectodermal og endodermal linjene (for gjennomgang se 4) (figur 2). Selv om in vitro-tri-bakterie sjikt potensial har resultert i bruk av ascs for et bredt spekter av regenerative modellsystemer, differensiering i osteogene, er generelt tilstrekkelig til å identifisere ASC og bekrefte dets multipotency adipogenic og chondrogenic celler. I våre hender, den adipogenic differensiering av ASCs resultater i celler som inneholder lyse lipid vakuoler som flekker bruker Oil Red O 5. Osteogenic differensiering resultater i alkalisk fosfatase-positive celler og akkumulering av ekstracellulære mineral som flekker ved hjelp av et kalsiumfosfat Von Kossa Stain fem.Chondrogenic differensiering under høyt tetthet Microforhold produserer pellets som inneholder sulfat proteoglykaner (oppdages ved hjelp av en Alcian blå flekken) og uttrykker kollagen type 2 5. Både skjelettmuskel og glatt muskel-differensiering kan sees med ascs farging for skjelettmuskel myosin og MyoD1 og glatt muskel aktin 5, 13, 14. Differensiering inn i ectodermal avstamning er foreslått gjennom forutsetningen om nevronale lignende morfologi av indusert ASCs og uttrykket av mange nevrale markører, blant annet som Neun, en neuronal transkripsjonsfaktor fem. Til slutt, induksjon av ASCs mot en lever / endodermal avstamning basert på etablerte forhold 15 resultater i celler som uttrykk alfaføtoprotein, en velkjent markør for lever hepatocytter. Disse markørene, sammen med mange andre som er publisert i løpet av de siste 10 årene tyder på at ASC er en pluripotent stamcelle befolkningen som lett kan vedlikeholdes ogdyrket i vitro og induserte mot cellene i de tre embryonale bakterie linjene. Koplet til sine regenererende potensialer i vivo (for gjennomgang se 4), kan ASC være et kraftig tillegg til de verktøy av en regenerativ forsker eller kliniker.

Figur 1
Figur 1. Manual, enzymatisk isolering av menneskelige ASCs fra lipoaspirate prøver. A. Fremstilling for isolering: Før isolering følgende komponenter må fremstilles: 1) 1x PBS (uten kalsium eller magnesium), sterilisert via autoklavering, 2) en løsning av 0,075 til 0,1% kollagenase IA typen, fremstilt på 1 x PBS og steriliseres ved filtrering under anvendelse av et 0,22 um filter-enhet, 3) kontrollmedium (CM) for etterfølgende kultur av ASC populasjonen. B. Isolering av ASCs: En steg-for-steg guide for isolering av stromal vaskulær fraksjonen (SVF) fra lipoaspirates vises. Trinn omfatter vasking av den lipoaspirate med steril 1 x PBS, fordøyelse ved hjelp av kollagenase typen IA, oppsamling av SVF ved sentrifugering og filtrering SVF. Påfølgende dyrking av SVF vil resultere i en tilhenger fibroblast befolkningen inneholder ASC befolkningen. Klikk her for å se større figur.

Fig. 2
Figur 2. Multi-avstamning differensiering potensialet i den heft ASC befolkningen. Dyrkede SVF celler resultere i en relativt homogen befolkning på tilhenger, fibrinoblast ASCs. Induksjon av ASC befolkningen under definerte vilkår resultater i cellene i adipogenic, osteogenisk, chondrogenic, skjelett myogenic og glatte myogeniske linjene.I tillegg kan ascs også bli differensiert i celler av ectodermal avstamning, uttrykker Neun, en markør for nevroner og alfa-fetoprotein (AFP), en etablert markør av endodermal / hepatisk celle linjen. Noen histologi og Immunofluorescent bildene er tatt fra tidligere publiserte resultater 1,5,6,7,8,9. Differensiering avstamning, sammen med histologisk, immunohistologic eller fluorescerende flekken er vist. Klikk her for å se større figur.

Expression profil
positive uttrykk negative uttrykk
CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e,
CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-en 		CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146,
HLA-DR, SMA, ABCG2
slått fenotype av ASCs
(Vanlig mellom to eller flere studier) 		CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a,
HLA-ABC, STRO-en 		CD11a, CD11b, CD11c, CD14,
CD31, CD45, CD106, CD144
kontroversielle markører i ASCs
(Differensial resultater over flere studier) 		CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR
stromal cell markører CD29, CD44, CD73, CD90, CD166
blodkreft markører CD31, CD34, CD45, ABCG2
markører i felles mellom to eller flere studier vist i fet skrift
SMA = glatt muskel aktin
HLA = human leukocytt antigen
ABCG2 = multi-drug transporter protein G2

Tabell 1. Celleoverflaten uttrykk profiler på menneske ASCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fettvev for isolering av ASCs kan komme i mange former: fra solide biter av vev innhentet gjennom reseksjon eller fettsuging til mindre biter innhentet gjennom enten sprøyte utvinning eller inntaks-assistert fettsuging (dvs. fettsuging). Enten flere SVF celler (og dermed ASCs) kan fås fra reseksjon eller aspirerte adipose prøvene er uklart så motstridende studier har blitt presentert 16, 17. Det er mulig at enten form av fettvev er mer enn egnet for isolering av SVF celler og ascs så lenge som operatøren er dyktig i deres isolasjon teknikk. Imidlertid gjør fettsuging ha en fordel i reseksjon i at det er mindre invasiv og krever betydelig mindre postoperativ pleie. Mens hvilke typer fettsuging har økt det siste tiåret, blant annet teknikker, for eksempel ultralyd-assistert, servo og laser-assistert fettsuging 18, er fortsatt den vanligste tumescent fettsuging,der adipose rommet er oversvømmet med store mengder sterilt saltvann, anestesi og vasoconstrictors før aspirasjon 19. Valget av teknikk som kan variere fra kirurgen å kirurg. Imidlertid, mens midlene for ekstraksjon kan virke uvesentlig for forskeren, er det viktig å innse at teknikken kan ha en effekt på ASC antall og levedyktighet. For eksempel kan økt fettsuging vakuum press negativ innvirkning SVF celle avkastning 20. Videre reduseres i ASC spredning har blitt målt på ultralyd-assistert fettsuging 17.

Men innhentet, bør aspirer bli behandlet raskt som lagringstemperaturer kan påvirke SVF levedyktighet og eventuell ASC yield. Studier av Matsumoto et al. Har vist at ASC utbyttet avtar hvis aspirat lagres ved romtemperatur i mer enn 24 timer 21. Om nødvendig kan det 24 timers lagring ved 4 ° C kan brukes uten noen skadelig virknings om de biologiske egenskapene til ASC befolkningen, men igjen, celle-levedyktighet kan reduseres dersom lagringstiden økes over det punktet. Den enkle lipoaspirate behandling er direkte relatert til det samlede volum. Mindre volum, innhentet gjennom sprøyte utvinning, er relativt enkle å behandle. Men større volum aspirates, innhentet gjennom fettsuging, presentere fysiske utfordringer. For eksempel kan noe så enkelt å overføre fettet fra aspirasjon beholderen, slik at den kan vaskes presentere problemer når aspirate volumet er stort. Protokollen er skissert i denne artikkelen er ment å lindre noen av disse utfordringene.

Av og store, har isolering av ASC populasjoner fra lipoaspirates ved hjelp av enzymatisk metode beskrevet i denne artikkelen ikke endret seg vesentlig i løpet av de siste 10 årene. Det er mange protokoller tilgjengelig via PubMed som er utmerket i sin beskrivelse av isolering av ASCs fra lipoaspirates. Most av dem skissere en veldig lignende protokoll med mindre modifikasjoner. I utgangspunktet er det lipoaspirate vasket av forurensninger, fordøyd enzymatisk å frigjøre SVF og SVF, inneholder ASC befolkningen, er samlet inn gjennom sentrifugering. De fleste store volum lipoaspirates ankommer på en eller annen form for vakuumbeholderen - konfigurasjonen av disse kan variere fra kirurgen å kirurg. Denne protokollen innstiller fjerning av aspireres inn i et stort, sterilt begerglass før vasking, fordi beholderen i seg selv kan være en kilde til forurensning hvis ikke skikkelig rengjort før de legges i biosikkerhet hette. Når overført og tillatt å sedimentere av tyngdekraften, vil aspirat skilles i tre lag: et topp, oljelaget som er resultatet av lysis av modne adipocytter, en midt adipose lag og et nedre lag med saltvann og forurensende røde blodlegemer. Oljelaget bør fjernes så vi har lagt merke til at det kan være giftig for de resulterende cellekulturer (upubliserte observasjoner). Også denne protocol anbefaler at infranatant av salt-og RBC blir fjernet før den første vask for å redusere den potensielle antall kontaminerende RBCs når ascs dyrkes. Imidlertid har en studie av Francis et al. Antydet at dette infranatant kan også være en kilde til ASCs 22. Bruken av en 10 ml serologisk pipette gjør fjerningen av denne infranatant relativt enkelt. Det som gjenstår er fettsjikt som deretter kan lett vaskes ved hjelp av sterilt PBS, eller om ønsket, supplert med antibiotika og antimykotiske steril PBS for å redusere muligheten for kontaminasjon 23-25. Etter vasking, blir fettvev enzymatisk fordøyet ved hjelp av en steril løsning av kollagenase typen IA. Bruken av en filtreringsenhet som Millipore enhet som er vist i denne video kombinerer et praktisk middel for aseptisk filtrering av kollagenase i en lukket beholder til hvilken den vaskede fettvev kan tilsettes for etterfølgende vann-bad fordøyelse ved 37 ° C.

Den type kollagenase anvendes har variert fra gruppe til gruppe med kollagenase typen IA tilsynelatende å være mer utbredt 1, 24, 25. Men, er det over 11 forskjellige typer collage kommersielt tilgjengelige, hver med fordøyelsen slektskap til bestemte vev. For fordøyelsen av fettvev, selskaper som Sigma Aldrich anbefaler kollagenaseklassene typer I og II, og begge typene er godt representert i dagens litteratur 1, 24-27. I sin opprinnelige artikkel Zuk et al. Bruk kollagenase typen IA oppnådd fra bovine kilder ved en konsentrasjon på 0,075% en. Imidlertid er de fleste kommersielle kilder til collagetypen IA nå innhentet fra anaerobe bakterien Clostridium histolyticum eller E. coli genmodifisert med C. histolyticum gener. Mange selskaper tilbyr en rekke preparater av collagetypen IA, fra råolje til de forberedt gjennom ammonium sulfate nedbør. DenProtokollen beskrevet i denne artikkelen Jove anvender et urent preparat av typen IA kollagenase som inneholder ikke bare kollagenase-aktiviteter, men også ikke-spesifikk protease, og clostripain tryptic enzymatiske aktiviteter. Selv om disse ytterligere enzymer er kritiske for fordøyelse effektivitet 28, det er de som rapporterer lot til lot variabilitet forbundet med rå kollagenase typen IA 28, 29 og øke deres konsentrasjoner av kollagenase opp til 0,2% for å oppnå effektiv fordøyelse 23.. De grupper som bruker rå kollagenase typen IA anbefaler også sitt tilskudd av bovint serum-albumin (0,1 til 1,0% BSA) for å forbedre enzymenes ytelse og øke stabiliteten av de celler i adipose matrise. Dette kan imidlertid ikke være nødvendig, som protokollen er skissert i denne artikkelen bruker collagenase uten tilskudd med ingen negativ effekt på fordøyelsen effektivitet.

For de som ønsker å bruke et mer definert collage composition, kommersielle kilder som inneholder svært renset collage sammen med en presis blanding av proteaser er nå tilgjengelig. Disse forberedelsene rense clostridial kollagenaseklassene type I og II til høy aktivitet og kombinerer dem med kjente nøytrale protease aktiviteter, for eksempel dispase og thermolysin. Effektiv adipose fordøyelse ved hjelp av collagenase og thermolysin har blitt rapportert av Zachar et al. 27. Etter avtale med dette arbeidet, Pilgaard et al. 30 rapporterer også utmerket fordøyelsen effektivitet ved hjelp av flere blandinger av collagenase og thermolysin. Men de observere bedre fordøyelse effektivitet ved hjelp av preparater av collagenase og dispase.

Fordøyelse ganger for isolering av celler fra fettvev kan variere fra studie til studie. Mange publiserte protokoller anbefalt fordøyelsestider på 1-2 timer 27, 30. Imidlertid er det viktig å innse at for høye fordøyelsestider kan til slutt påvirke antallet levedyktige ASCs og deres stamcelle fenotype. Pilgaard og kolleger har fastslått at 2 timers fordøyelse ved 37 ° C gir den beste balanse mellom vev dissosiasjon og ASC funksjonalitet 30 med Zachar et al. Anbefale at fordøyelsen, forbi 45 minutter, observeres hvert 15 min til 2 t maksimum, med fordøyelsen blir stoppet når fettvev tar på seg en mer homogen utseende 27. Vi er enige med denne anbefalingen. Imidlertid er det vår erfaring at de fleste kollagenase type Ia preparater på 0,075 til 0,1% er i stand til å fordøye store mengder lipoaspirates i 30-45 min, og at disse tider er tilstrekkelig til å frigjøre et tilstrekkelig antall celler. Derfor anbefaler denne protokollen en fordøyelse tid på 30 min. Hvis mer tid er nødvendig, bør konsistensen av lipoaspirate overvåkes og fordøyelse stoppes når lipoaspirate antar en "kremaktig" eller "suppelignende" utseende (figur 1).

Når the fordøyelsen er avsluttet, isolering av det frigjorte SVF blir ganske enkelt oppnådd ved hjelp av sentrifugering. Men som press aspirasjon, kan de fysiske effektene av sentrifuge ha en effekt på SVF levedyktighet og antall ASCs tilgjengelige for kultur. En studie av Kurita og kolleger 31 har vist at hastigheter over 3000 xg kan skade ASC. Imidlertid bør hastigheter være betydelig nok til å sikre tilstrekkelig pelletering av SVF. Som regel de fleste protokollene, inkludert denne, anbefaler en sentrifugehastighet på 1,200-1,500 x g. Forsiktighet bør utvises ved forskeren for å sikre at de forstår sammenhengen mellom sentrifugalkraft (målt i gram) og sentrifugeringshastighet (målt som rpm), som forholdet avhenger av den spesifikke sentrifugerotoren. Men som regel lavere sentrifugalkraft, slik som 1200 xg, er ofte tilsvarer sentrifugehastighet, og kan trygt brukes om hverandre.

Etter spinning, flere distinct lag er observert i sentrifugerøret (figur 1): et toppsjikt av olje og "myke" hvite adipocytter, et mellomsjikt kollagenase og en cellepellet. Pelleten i seg selv kan ha to distinkte lag: en øvre lag av RBCs og en lavere hvit SVF pellet, som inneholder ascs. Denne protokollen innstiller forsiktig aspirasjon av olje-og fettceller, som oljen kan være toksisk for cellekultur, og adipocytter har vist seg å være i stand til å dedifferentiation tilbake til en mer primitiv celletypen 32.. Imidlertid kan disse adipocytter høstes på dette punkt om ønsket. På grunn av disse miljøgiftene, anbefaler denne protokollen en ekstra vasking skritt for å sikre sine tilstrekkelig fjerning. Dette trinnet kan også forskeren å kombinere flere SVF pellets for påfølgende enkel filtrering. Filtrering er sannsynlig å være nødvendig på grunn av nærvær av store stykker av fibrotiske materiale og cellulære aggregater etter fordøyelsen. Disse materialene kan enkelt fjernesgjennom enkle tyngdekraften basert filtrering gjennom 70 eller 100 mikrometer mesh filtre. En aliquot av filtratet kan settes i verk for å telle antallet av kjerneholdige celler hvis det er ønskelig, og det gjenværende filtrat belagt for ASC tilslutning og ekspansjon.

Til tross for iherdige forsøk på å fjerne så mange RBC som mulig, vil ingen ASC forberedelse være helt uten RBC forurensning. I vårt opprinnelige artikkel, har vi foreslått å fjerne disse RBCs ved resuspendering av pelleten i en hypoton løsning av 160 mM NH4Cl. De fleste etterfølgende isolerings-artikler inneholder dette trinnet og anbefaler bruk av NH4Cl-baserte løsninger eller sterilt vann 22-24, 27, 33, selv om forsiktighet må utvises ved bruk av sterilt vann, for å minimere tiden det SVF cellene eksponeres til hypoton løsning 27. Imidlertid kan dette trinnet ikke være nødvendig da RBC-er et ikke-vedheftende cellepopulasjon, og kan lett fjernes etter en natts kulturASC befolkningen. Videre, mens anecdotal i beste fall, disse RBC-er synes å forbedre den innledende utvidelse av de resulterende adherente celler (Żuk, upubliserte observasjoner). Som sådan, eliminerer denne protokollen RBC trinnet og foreslår at de innledende ASC kulturene tillates å ekspandere i nærvær av disse RBC-er for de første 3-4 dager uten noen endring av dyrkningsmediet. Grunnen til denne observasjonen kan skyldes noen form for paracrine signale forurenser blodceller eller kan rett og slett skyldes bedre levedyktighet med utelukkelse av RBC trinnet. Etter dette, kan kulturmediet aspireres og flertallet av RBC fjernes ved forsiktig vasking av platene med sterilt 1 x PBS. Over tid vil eventuelle gjenværende RBC slutt dø og bli fjernet fra kulturen.

Studier av Zachar og Boquest har anslått at 25-50% av det resuspenderte SVF pellet holder vev kultur plast 23, 27. Den resulterende "passage 0" ASC cultures er heterogene, som består av små, runde celler antas å være ASCs og mer uregelmessig formede celler foreslått å være endothelial opprinnelse. Mens studier av mange grupper, inkludert våre har bekreftet fravær av forurensende celletyper som SMCS, blodkreft celler og fibroblaster i ASC kulturer 1, kan tilstedeværelsen av flere celletyper ikke utelukkes. . Faktisk har Tallone et al preget passasje 0 kulturer og observert fire distinkte populasjoner: 1) liten, rund, raskt fornye celler, 2) spindel-formet fibrinoblast celler antas å være den ASC, 3) sakte replikere store celler med en mer begrenset potensielle (dvs. pre-adipocytter) og 4) kubisk endotelceller som er tapt med passering 34. Senere studier har vist at den runde, raskt fornye cellen befolkningen besitter den høyeste multipotentiality og uttrykke typiske stamcellemarkører 35, 36. Videre kan de danner "sfæroider" på grunnderes raske spredning og er ofte omgitt av spindel-formet fibroblaster. Som sådan, er det mulig at spindelformede ASC populasjon foreslått ovenfor, kan stamme fra disse cellene. Etter innledende utvidelse av disse passasje 0 ASC kulturer, er det tenkt at fortsatt dyrking over tid velger for ASC, med de resulterende kulturer forutsatt en mer fibroblastic, homogen sammensetning. Imidlertid rester av kontaminerende celler kan ikke helt utelukkes, og derfor bør den ASC populasjon fremdeles betraktes som heterogene.

Mens den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen, er enkel, billig og ikke krever noen deler av utstyr som normalt ikke finnes i en vevskultur-anlegget, har den den ulempe at det krever en slik innretning. Tallrike studier har undersøkt de translasjonsforskning anvendelser av ASCs gjennom dyremodeller og kliniske studier med ASC har begynt å dukke opp (for gjennomgang se 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne av dette manuskriptet er co-oppfinnere på et patent som eies av The Regents av University of California og lisensiert til Cytori Therapeutics.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne og takke de ytterligere forskning personell som bidro til utviklingen av den beskrevne protokollen og dens isolasjon av ASCs, inkludert: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, og ​​Dr. John Fraser, PhD. Resultatene presenteres ble finansiert delvis av forskningsmidler fra National Institutes of Health, inkludert de NIAMS og NIDCR Institutes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) Mediatech Cellgro 10-013-CV with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin Mediatech Cellgro 30-002-CI 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B Mediatech Cellgro 30-003-CF 250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline) Mediatech Cellgro 25-053-CI without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA Mediatech Cellgro 20-031-CV 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) Sigma C2674 crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated Gemini Bioproducts 100106 USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-104
25 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes Genesee Scientific 21-106
100 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-202
150 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-203
500 ml Stericup Filter Units Millipore SCGPU05RE PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers FisherBrand 22-363-549 100 μm nylon mesh
dexamethasone - water soluble Sigma D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate disodium salt Sigma G-9422 also known as glycerophosphate
insulin Sigma I-6634 made from bovine pancreas
indomethacin Sigma I-7378
apo-transferrin Sigma T-4382
TGFβ1 R&D Systems 240-B-002 recombinant human
Oil Red O Sigma O-0625
Alcian Blue Sigma A-5268
Silver nitrate Sigma S-0319
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 supplied as a 16 % stock
Name Company Catalog Number Comments
Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood Thermo Scientific ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge Hermle Labnet Z383 Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg
Water bath Fisher Scientific Isotemp S52602Q 5-10L capacity, capable of 37C
Automated Pipette Aids Drummond Pipette Aid XL 4-000-105
CO2 Incubator Thermo Scientific Forma 310 direct heat or water jacketed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

Tags

Cellular Biology fettvev stamceller Mennesker cellebiologi biologi (generelt) enzymatisk fordøyelse collagenase celleisolasjon stromal Vaskulær Brøk (SVF) adipose-avledet stamceller ASCs lipoaspirate fettsuging
Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S.,… More

Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates. J. Vis. Exp. (79), e50585, doi:10.3791/50585 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter