Summary
År 2001, forskare vid UCLA beskrev isoleringen av en population av stamceller från vuxna, benämnd Fett-derived stamceller eller ASCs, från fettvävnad. Den här artikeln beskriver isolering av ASCs från lipoaspirates med en manuell, enzymatisk spjälkning protokollet använder kollagenas.
Abstract
År 2001, forskare vid University of California, Los Angeles, beskrev isoleringen av en ny population av adulta stamceller från fettsugning fettvävnad att de initialt kallas Bearbetade Lipoaspirate Celler eller PLA-celler. Sedan dess har dessa stamceller döpts som Fett-härledda stamceller eller ASCs och har gått vidare till att bli en av de mest populära vuxna stamceller populationer inom områdena stamcellsforskning och regenerativ medicin. Tusentals artiklar beskrivs nu användningen av ASC: er i en mängd olika regenerativa djurmodeller, inklusive benregenerering, perifer nervreparation och hjärt-engineering. Nya artiklar har börjat för att beskriva den mängd olika användningsområden för ASCs i kliniken. Det protokoll som visas i den här artikeln beskriver den grundläggande proceduren för manuell och enzymatiskt isolera ASCs från stora mängder lipoaspirates erhållits från kosmetiska behandlingar. Detta protokoll kan enkelt skalas upp eller ner för att accommodåt volymen lipoaspirate och kan anpassas för att isolera DSKer från fettvävnad erhållna genom abdominoplasties och liknande förfaranden.
Introduction
År 2001 var en förmodad befolkning på multipotenta stamceller från fettvävnad som beskrivs i tidskriften Tissue Engineering 1. Dessa celler fick namnet Bearbetade Lipoaspirate eller PLA-celler på grund av deras härledning från bearbetad lipoaspirate vävnad som erhållits genom plastikkirurgi. Isoleringen metod som beskrivs i den här artikeln byggde på befintliga enzymatiska strategier för isolering av stromaceller vaskulära fraktion (SVF) från fettvävnad 2. Den SVF har definierats som ett minimalt bearbetade population av röda blodceller, fibroblaster, endotelceller, glatta muskelceller, pericyter och pre-adipocyter som ännu inte hålla sig till en vävnadsodlingssubstrat 2, 3. Odling av denna SVF över tiden har föreslagits för att eliminera många av dessa kontaminerande cellpopulationer och resulterar i en vidhäftande, fibroblastisk befolkning. Dessa fibroblaster har identifierats i litteraturen för de senaste 40 åren som är pre-adipocyter. Men vår forskargrupp visat att dessa celler hade mesodermal multipotency och döptes den vidhäftande SVF befolkningen som PLA-celler. Efterföljande studier av ett stort antal andra forskargrupper har lagt till denna potential, vilket tyder både endodermalt och ektodermala potentialer (för översikt se 4). Sedan dess har ett flertal ytterligare termer för dessa celler föreföll i litteraturen. För att ge någon typ av konsensus, blev termen Adipose-härledda stamceller eller ASCs antogs vid den 2: a årliga konferens IFATS. Som sådan kommer termen ASC användas i den här artikeln.
Protokollet beskrivs i denna artikel är en relativt enkel procedur som kräver standard laboratorieutrustning och använder enkla reagenser såsom fosfor-saltlösning, standardvävnadsodlingsmedier reagenser och kollagenas. Den kan producera ett stort antal DSKer beroende på mängden av utgångs fettvävnad volym och efterföljande cKULTUR tid. Emellertid kan behandling av en sådan stor mängd av fettvävnad presentera några fysiska problem som kan minskas till en grad med hjälp av detta protokoll. Dessutom går detta protokoll kräver sterilt odlingsanläggningar och godkända biosäkerhet huvor, vilket nödvändiggör användning av en godkänd vävnadskultur anläggning. Detta krav kan också minska nyttan av ASC populationen i kliniska tillämpningar, om de är isolerade i god tillverkningssed (GMP)-godkända anläggningar avsedda för isolering och expansion av material för klinisk användning. Som ett alternativ, skulle automatiserade system som kan isolera ASCs i ett slutet system i operationssalen undvika denna viktiga fråga och möjliggöra omedelbar användning av ASCs utan behov av efterföljande in vitro expansion. Till dags dato finns det sex automatiserade system som är kommersiellt tillgängliga för isolering av celler från human vävnad. Dessa system kan göra det möjligt att isolera enbetydande antal ASCs från stora mängder fettvävnad omedelbart efter sin skörd. Dessa ASCs kan sedan återinföras i patienten för olika regenerativa ändamål utan patienten någonsin behöva lämna operationssalen. Utöver detta protokoll beskriver manuell isolering av DSK: er, är ett protokoll för automatiserad isolering av DSK: er med hjälp av Celution systemet också i en kamrat artikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet visas här beskriver manuell isolering av ASCs från lipoaspirates erhållits genom kosmetiska behandlingar med hjälp av enzymatisk nedbrytning och differentialcentrifugering. Detta protokoll publicerades först i tidskriften Tissue Engineering 2001 1, där de resulterande cellerna kallades Bearbetade Lipoaspirate celler eller PLA-celler på grund av deras isolering från lipoaspirates. Däremot har termen PLA cellen nu ersatts med begreppet Fett-derived stamceller eller ASCs att ge området någon form av överensstämmelse vad gäller nomenklatur. De celler som isolerats genom detta protokoll har visats av många att ha mesodermal potential både in vitro och in vivo (för översikt se 4). Dessutom har de ektodermala och endodermala potentialer ASC också undersökts 4. Isoleringen Tekniken är enkel och okomplicerad och kräver ungefär en timme att slutföra. Den resulterande cells odlas under standardbetingelser för vävnadsodling. Med kulturtiden blir ASC befolkningen mer homogen, består av fibroblastceller som expanderar lätt och uppvisar god lönsamhet på lång sikt i kultur.
Anm: Följande delar av utrustning som krävs listas i slutet av denna artikel. Alla glasvaror, media och reagenser ska steriliseras genom autoklavering eller filtreras genom 0.22 um filter. Aseptiska vävnadsodlingsmetoder bör följas vid alla tillfällen. För att säkerställa detta bör alla material som placerats i biosäkerhetsskåp steriliseras genom sprayning med en 70% etanollösning och torkning med rena pappershanddukar.
1. Före skörd, Förbered följande:
- Steril 1X fosfor-saltlösning (PBS) för att tvätta de lipoaspirates. Förbered approximativt 1 liter 1 x PBS för varje 100 ml av lipoaspirate. Autoklavera i PBS och allaow svalna till rumstemperatur före användning. Som ett alternativ, kan antibiotikum / antimykotikum tillsättas till en slutlig koncentration av: 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 2,50 | ig / ml amfotericin B när PBS har svalnat.
- Steril 0,075-,1% kollagenas typ IA (från Clostridium histolyticum) för enzymatisk nedbrytning av lipoaspirate. Koncentration kommer att bero på kvaliteten och källan till kollagenas - det vill säga rå vs renas. Andra kollagenas typer kan användas (t.ex. kollagenas typ II eller IV) vid liknande koncentrationer. Förbered i 1x PBS och sterilfilter med användning av en 1000 ml filtreringssystem med ett 0,22 pm filter (Figur 1A). Emellertid kan sterila glasflaskor försedda med en flasktopp-filter också användas. Förbered och använd vid rumstemperatur. Kollagenas lösningar kan förvaras på kort sikt vid 4 ° C tills det behövs. Frys inte kollagenas lösning eftersom det kan minska sin verksamhet.
- Sterilt kontroll Medium (CM) för kollagenas inaktivering och odling av ASC befolkningen. Till 500 ml av CM, kombinera följande: 500 ml DMEM (4,5 g / L glukos, med L-glutamin), 50 ml fetalt bovint serum (värmeinaktiverat), 5 ml penicillin / streptomycin (10000 lU penicillin, 10000 ^ g / ml streptomycin). Som ett alternativ, kan 5 ml amfotericin B (250 | ig / ml amfotericin B) också tillsättas. Sterilfiltrering av denna media krävs om icke-sterila reagenser används. Placera CM i ett 37 ° C vattenbad i 30 min före användning för att värma upp mediet.
- Sterila glas och plasten för isolering. Autoklav en 1000 ml glasbägare och låt svalna till rumstemperatur före användning. Dessutom har följande plasten klar: aseptisk serologiska pipetter (5 ml, 10 ml och 25 ml), 50 ml centrifugrör och vävnadskulturbehandlad kultur rätter.
2. Isolering av ASC: er från Lipoaspirates
De flesta lipoaspirates uppsamlas i en aspirationsbehållare (se figur 1 B) och kan bestå av tre distinkta skikt: 1) ett övre skikt av olja på grund av lysering av mogna adipocyter, 2) ett mellanskikt av fettvävnad, och 3) en botten, vätska infranatant innehållande saltlösning och kontaminerande celltyper såsom röda blodkroppar (RBC). Det övre oljeskikt får inte förekomma i betydande mängder. Om det finns, bör det aspire som kontaminering av den resulterande ASC kultur oljan kan påverka lönsamheten i kulturen. Botten infranatant bör tas bort före bearbetning för att minimera kontaminering av ASC kulturer med RBK. Detta kommer att lämna i mitten, fettvävnad skikt, som sedan kommer att tvättas och enzymatiskt rötas för att befria sin cell, stromaceller vaskulära fraktion (SVF).
- Tvättning av lipoaspirate: Öppna lipoaspirate behållare i vävnadsodlings hood och försiktigt dekantera lipoaspirate i en steril 1 L glasbägare. Låt lipoaspirate skikten separera tills fettvävnad skiktet är väl separerade (Figur 1B).
- Sug bort oljeskiktet (om närvarande) med användning av en steril glaspipett och botten saltlösning infranatant med användning av en 10 ml serologisk pipett. Detta kommer att ta bort den större majoriteten av kontaminerande röda blodkroppar och saltlösning.
- Bedöm volymen av den resulterande fettvävnad skiktet och lägga steril 1x PBS vid en lika stor volym. Omrör aspirera med pipett som används för aspiration för att blanda den lipoaspirate med PBS. Låt de två skikten att bosätta sig. Såsom noterats ovan kan 1x PBS kompletteras med antibiotika / antimykotika.
- Aspirera infranatant med hjälp av en 10 ml serologisk pipett.
- Fortsätt att tvätta fettvävnad fraktionen som beskrivs i steg 2.1.2. och 2.1.3. tills fettlagret har en gul / guld färg. Aspirera the infranatant en sista gång, lämnar fettvävnad fraktion i glasbägare. För att säkerställa adekvat avlägsnande av infranatant, tillåta lipoaspirate skikten sedimentera under 5 min efter den sista tvättningen och före den slutliga aspiration.
- Enzymatisk nedbrytning av lipoaspirate: Förbered steril kollagenas 1A lösning som beskrivs ovan i en filterenhet. Bered en volym lika med den hos den fettfraktion och sterilfilter.
- Efter filtrering av kollagenas lösningen, kassera den övre filterenheten, försiktigt hälla den tvättade fettfraktionen i kollagenas lösningen och tätt stänga flaskan.
- Placera kollagenas / fett-blandningen i ett 37 ° C vattenbad och smälta vid 37 ° C under 30 min. Snurra försiktigt kollagenas / fettblandningen var 5-10 min och lägg tillbaka i vattenbadet. Det fettvävnad lagret bör ta på sig en "mjukare" utseende (Figure 1B) som matsmältningen skrider. Ytterligare digestionstid (dvs upp till 2 timmar) kan användas om den fettvävnad lagret verkar fortfarande ha fasta bitar av fett i den.
- Isolering av ASCs: Placera smälta kollagenas / fett-blandningen till biosäkerhet skåpet. Var noga med att sterilisera filterenheten med 70% etanol innan den placeras tillbaka i skåpet.
- Pipettera 25 ml alikvoter av infranatant innehållande SVF i sterila 50 ml centrifugrör.
- Tillsätt 25 ml CM till varje rör. Låt CM att inaktivera kollagenas genom inkubering vid rumstemperatur i skåpet under 5 min.
- Centrifugera i 10 minuter vid 1200 x g för att samla upp SVF som en pellet.
- I biosäkerhet skåpet, aspirera supernatanten från varje rör. Se till den övre oljeskiktet och eventuella flytande adipocyter aspireras med denna supernatant (
- Kombinera SVF pellets i ett centrifugrör med 30 ml CM och dela lika över två nya 50 ml centrifugrör. Centrifugera som i steg 2.3.3. och aspirera supernatanterna från de två SVF pellets (som inte visas i figur).
Valfritt: Om RBC-lys önskas, resuspendera varje SVF pelleten i 10 ml av en lyseringsbuffert (160 mM NH4CI) och inkubera vid rumstemperatur i 10 min. Centrifugera som i steg 2.3.3. och aspirera supernatanterna att ge de SVF pellets (som inte visas i figur).- Kombinera de två SVF pellets till ett nytt centrifugrör med hjälp av 5-10 ml CM (Figur 1B).
- För att filtrera bort större vävnadspartiklar, pipett suspenderas SVF pelleten till en 100 ìm mesh-filter placeras på toppen av en ny 50 ml centrifugrör och låt filtrera genom självfall.
- Pipette alikvoter av återsuspenderade(Och filtrerat) SVF pellet innehåller DSK på vävnadskultur behandlade kultur rätter. Komplettera varje maträtt med en lämplig volym av CM.
- Kultur cellerna i CM i 3-4 dagar vid 37 ° C, 5% CO2 utan förändring av media.
- Kombinera SVF pellets i ett centrifugrör med 30 ml CM och dela lika över två nya 50 ml centrifugrör. Centrifugera som i steg 2.3.3. och aspirera supernatanterna från de två SVF pellets (som inte visas i figur).
Efter denna inledande odlingsperiod kan odlingsmedier aspireras och eventuella kontaminerande röda blodkroppar avlägsnas försiktigt genom att tvätta med sterila 1XPBS. Ersätt med CM och fortsätter att odla DSK: er som behövs. Den typ av vävnadsodlingsskål som används och hur den återsuspenderade SVF pellets fördelas mellan dessa rätter kommer att bero på antalet celler som önskade efter konventionell vävnadsodling.
3. Karakterisering av ASC Befolkning: flödescytometri och Multilineage differentiering
När isolerade, bör utföras karakterisering av ASC populationen. Konventionella metoder för detta är bland annat flöde cytoMetry att karakterisera cellytan CD antigenprofilen för cellerna och in vitro differentiering att bekräfta deras multilineage differentieringskapacitet. Medan flera linjer kan bedömas ASCs redogör detta protokoll differentiering av ASCs i celler i adipogena, osteogena och kondrogena härstamningar som ett sätt att bekräfta multilineage mesodermala potentialer 5.
I flera härstamning vitro differentiering av ASCs
- Osteogent Differentiering av DSK: Före induktion, förbereda Osteogenic Medium (OM) enligt följande: Till en 500 ml flaska DMEM (4,5 g / ml glukos) till 25,0 ml FBS (5,0% slutlig koncentration) och 5,0 ml penicillin / streptomycin (10000 lU / ml och 10.000 mg / ml slutkoncentrationer, respektive). För detta, lägg till följande osteogena induktionsmedel för att ge de angivna slutkoncentrationer: Dexametason (0,1 mikroM slutlig), L-askorbinsyra 2-fosfat (50,0 mikroM slutlig) Och β-glycerofosfat (10,0 mM slutlig).
- Före induktion, skörd och platta de odlade DSK till önskad vävnadsodlingsskål så att en sammanflytning på ca 50% uppnås. För varje experimentell maträtt pläterade, plåt ytterligare en maträtt för en icke-inducerad kontroll. Kultur över natten i CM.
OBS: 50% sammanflytning rekommenderas för att möjliggöra fortsatt spridning som kan uppstå under loppet av induktion - På dagen för induktion, avlägsna mediet och lägg till följande: OM att de önskade osteogena experimentella brunnar och CM till kontrollbrunnarna. Volymen av media som används kommer att bero på storleken av den vävnadsodlingsskål. För 12 brunnar, 1,0 ml medium per brunn är tillräcklig. För sex brunnar, 2,0 ml medium per brunn är tillräcklig. För 100 mm skålar bör 10,0 ml av medium per skål användas.
- Kultur cellerna i minst 14 dagar med förändringar i lämpligt medium varje 3-4dagar. Mycket osteogena ASC populationer kan visa tecken på extracellulärt mineral nedfall så tidigt som 7 dagar induktion.
- Osteogent differentiering (dvs. cellulära mineral nedfall) kan bekräftas med en von Kossa histologisk färgning för kalciumfosfat. Denna fläck kommer att producera en svart-brun fällning att identifiera närvaron av extracellulära kalciumfosfat (se figur 2).
Att färga med von Kossa-reagens:- Ta OM från experimentcellerna och CM från kontrollcellerna
- Fixera cellerna för 60 min i 4,0% paraformaldehyd förberedd i 1x PBS.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 x PBS.
- Inkubera cellerna med 2,0% silvernitrat (framställt i vatten) i mörker under 30 min.
- Avlägsna silvemitrat, tvätta två gånger med destillerat vatten och lufttorka cellerna.
- Exponera cellerna för UV-ljus under 60 min för att utveckla calCium fosfatfällning.
- Tvätta cellerna flera gånger med 1 x PBS.
- Motfärga cellen med hematoxylin om så önskas.
- Före induktion, skörd och platta de odlade DSK till önskad vävnadsodlingsskål så att en sammanflytning på ca 50% uppnås. För varje experimentell maträtt pläterade, plåt ytterligare en maträtt för en icke-inducerad kontroll. Kultur över natten i CM.
- Adipogena Differentiering av DSK: Före induktion, förbereda adipogena Medium (AM) enligt följande: Till en 500 ml flaska DMEM (4,5 g / ml glukos) till 50,0 ml FBS (10,0% slutlig koncentration) och 5,0 ml penicillin / streptomycin (10000 lU / ml och 10000 ug / ml slutkoncentrationer, respektive). För detta, lägg till följande adipogena induktionsmedel för att ge de angivna slutkoncentrationer: dexametason (1,0 mikroM slutlig), 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX - 0,5 mM slutlig), indometacin (0,2 mM slutlig) och insulin (10,0 mikroM slutlig ).
- Före induktion, skörd och platta de odlade DSK till önskad vävnadsodlingsskål så att en sammanflytning på ca 80% uppnås. För varje experimentell maträtt pläterade, plåt ett tilläggal skålen för en icke-inducerad kontroll. . Kultur natten i CM Obs: adipogena differentiering av ASCs verkar vara effektivare med ökad sammanflyt.
- På dagen för induktion, avlägsna mediet och lägg till följande: AM till önskade osteogena experimentella brunnar och CM till kontrollbrunnarna. Volymen av media som används kommer att bero på storleken av den vävnadsodlingsskål. För 12 brunnar, är tillräcklig 1.0.ml av media per brunn. För sex brunnar, 2,0 ml medium per brunn är tillräcklig. För 100 mm skålar bör 10,0 ml av medium per skål användas.
- Kultur cellerna under minst 14 dagar med byten av lämpligt medium var 3-4 dag. Mycket adipogena ASC populationer kan visa tecken på lipid vacuole bildning så tidigt som 7 dagar induktion.
- ASC: er som genomgår adipogena differentiering kommer att utveckla flera lipid vakuoler som lätt kan visualiseras under ljusmikroskop. Dessutom adipogena differentiering kanbekräftas med en Oil Red O histologisk fläck som kommer att ackumuleras inom dessa vakuoler (se figur 2).
Att färga med Oil Red O:- Ta bort materialet från de experimentella och kontrollceller och rätta till dem i 60 min med hjälp av en 10% formell kalcium fixativ. För att framställa detta fixativ, kombinera följande: 1,0 g CaCl2, 25,0 ml 16% paraformaldehyd (4,0% slutlig) och 75,0 ml destillerat vatten.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 x PBS.
- Tvätta cellerna kortvarigt med 70% etanol.
- Inkubera cellerna vid rumstemperatur under 5 min med Oil Red O-lösning. För att framställa den Oil Red O lösning, lös 2,0 g Oil Red O pulver i 50,0 ml 70% etanol och 50,0 ml aceton.
- Tvätta cellerna med 70% etanol och sedan med kranvatten.
- Visualisera cellerna snart efter färgning på grund av fädning av fläcken med tiden.
- Kondrogen Differentiering av ASCs: kondrogen differentiering uppnås genom en hög densitet kultur teknik kallad "Microkultur". Före kultur, förbereda kondrogen Medium (ChM) enligt följande: Till en 500 ml flaska DMEM (4,5 g / ml glukos) till 5,0 ml FBS (1% slutlig koncentration) och 5,0 ml penicillin / streptomycin (10.000 IE / ml och 10000 pg / ml slutkoncentrationer, respektive). För detta, lägg till följande kondrogena induktionsmedel för att ge de angivna slutkoncentrationer: L-askorbinsyra-2-fosfat (50,0 ng / ml slutlig), insulin (6,25 mikrogram / ml slutlig), transferrin (6,25 mikrogram / ml slutlig) och TGFβ1 (10,0 ng / ml).
- Skörda DSKer och centrifugera under 5 min vid 1200 xg för att pelletera cellerna. Räkna cellerna för att bestämma densiteten av cellsuspensionen.
- För att framställa de mikromass pelletar förbereda två cellsuspensioner: en försökssuspension framställd i ChM vid en densitet av 1 x 10 7 cellers / ml och en kontrollsuspension framställd i cm vid en densitet av 1 x 10 7 celler / ml.
- Placera 10,0 | il "droppar" av den cellulära suspensionen i individuella brunnar i en flerbrunnsskål. Tillåt att vidhäfta under 2-3 h vid 37 ° C.
- Overlay försiktigt pläterade droppar med antingen ChM eller CM försiktigt så att inte separera cellerna.
- Kultur cellerna i upp till 14 dagar i ChM eller CM med förändringar i medel var 3-4 dagar. Celler odlade i ChM kondenserar under denna tid för att bilda en hög densitet Micromass pelleten med liten eller inga celler i ett omgivande monoskiktet. Kontrollceller odlade kommer inte genomgå denna kondens och många kommer att finnas som ett monolager.
- För att bekräfta kondrogenes, fixera pellets för 15 min i 4,0% paraformaldehyd (framställd i 1 x PBS) vid rumstemperatur. Fläck på närvaron av sulfaterade proteoglykaner med användning av en Alcian Blue histologisk färgning.
Att färga med hjälp av Alcian Blue:- Tvätta paraformaldehyde fixerade pellets en gång i 1 x PBS.
- Inkubera pellets i 0,1 N HCl (pH 1,0) i 5 min för att sänka deras pH.
- Avlägsna HCl och tillsätt 1% Alcian blue-reagens (framställd i 0,1 N HCl, pH 1,0). Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Avlägsna Alcian blue reagens och tvätta pelleten med 0,1 N HCl (pH 1,0) för att avlägsna överflödig färg.
- Ytterligare tvättningar med användning av kranvatten kan användas för att minska bakgrundsfärgning.
- Som ett alternativ kan de mikromasspellet skördas, fixerades över natt i 10% formalin, inbäddades i paraffin och sektioner färgades för Alcian blue.
4. Flödescytometriska Karakterisering av ASCs
Karakterisering av cellytan CD antigenprofil kan åstadkommas genom konventionell flödescytometri.
- Beredning av ASCs för flödescytometri: Priortill analys, utarbeta en flödescytometri Buffer (FCB) bestående av följande: 1,0% BSA, 2,0% FBS och 0,025% saponin förberedd i 1x PBS.
- Skörda DSKer och centrifugera cellerna under 5 min vid 1200 xg för att producera en pellet.
- Resuspendera cellerna i steril 1XPBS och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Bestäm celldensitet av suspensionen.
- Dividera suspensionen upp i alikvoter om 5 x 10 5 celler totala och centrifuger för att pelletera.
- Avlägsna PBS-supernatanten och fixera cellerna under 60 min vid -20 ° C med ett överskott av iskall 70% etanol. Om nödvändigt kan dessa celler att lagras i denna 70%-ig etanol i en -20 ° C frys tills de behövdes.
- Efter fixering försiktigt aspirera etanol och försiktigt tvätta pelleten två gånger med ett överskott av FCB. Att tvätta:
- Lägg till ett överskott av FCB och försiktigt suspendera pelleten.
- Centrifugera under 5 minuter vid 1200 x g för att samla upp cellerna ensa pellet.
- Försiktigt aspirera FCB supernatanten.
- Upprepa.
- Avlägsna slutlig FCB tvättvätskan från varje alikvot och återsuspendera i 100 pl av FCB. Lägg till önskad fluorokrom-konjugerade primära antikroppen med användning av tillverkarens föreslagna utspädning. Inkubera cellerna på is med antikroppen under 30 minuter.
OBS: Om fluorokromkonjugerade primära antikroppar inte är tillgängliga, får icke-konjugerade primära antikroppar användas. - För varje fluorokrom som använts (t.ex. FITC, PE), inkubera en alikvot av celler med 100 ml FCB innehållande isotypmatchad IgG som en negativ kontroll.
- Inkubera en delmängd i 100 ml FCB innehåller inga antikroppar som en extra kontroll.
- Tvätta varje portion av cell två gånger med FCB som beskrivs i steg 4.1.5. Efter den sista tvättningen, resuspendera portioner i 100 ml FCB och fortsätt med analysflöde.
Obs: Om icke-konjugerade primära antikroppar användes: Efter detta tvättsteg inkubera alikvoter på is under 20 min med FCB kompletterat med lämplig fluorokrom-konjugerad sekundär antikropp med användning av tillverkarens föreslagna utspädning. Tvätta två gånger som det beskrivs i steg 4.1.5.
- Flödesanalys av ASCs: För flödesanalys, bör minst 10.000 händelser räknas. Ofärgade och isotypmatchad kontroller bör användas för att sätta grindar med framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC). För detta bör inga kontroller antikroppar (dvs. ofärgade) i steg 4.1.8 användas för att eliminera skräp och döda ASCs. De isotypmatchad IgG kontroller av steg 4.1.7. bör användas för att fastställa områden med positiv fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet kontur ovan beskriver en manuell, enzymatisk metod för isoleringen av en SVF från en stor volym lipoaspirate provet. Inom denna SVF finns många cellpopulationer, inklusive ASC. Ett flertal studier föreslår att odla denna SVF under standardvävnadsodlingsbetingelser kommer att välja för en vidhäftande fibroblast kan antas komma att i huvudsak bestå av typen ASC. I överensstämmelse med detta har vi visat, med användning av flödescytometri och immunofluorescens, att odlade SVF pellets bli väsentligen fria från de större kontaminerande celltyper, nämligen de röda blodkropparna, glatta muskelceller och celler av den endoteliala härstamning 1. Den resulte ASC populationen är relativt homogent i utseende och bestod av fibroblastliknande celler (Figur 2). Dessa vidhäftande DSKer växer bra i odling under standardbetingelser för vävnadsodling och uppvisar en måttlig populationsfördubblingstid 1 vilket gör dem lämpliga för många molekylära och cell biology studier in vitro och regenerativa studier in vivo. Men i ljuset av den heterogena naturen av den isolerade SVF är nödvändig validering av ASC populationen. Talrika studier har använt flödescytometri för att karakterisera CD antigenprofilen hos odlade DSKer som ett potentiellt medel för att identifiera dessa celler, både in vitro och in vivo 5-9. Tabell 1 sammanfattar resultaten från många av dessa studier. Samtidigt som ett uttryck för en del av dessa CD-antigener är fortfarande kontroversiell, är det allmänt accepterat att odlade ASCs är CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 och CD140a positiv. Frånvaron av talrika hematopoetiska CD-antigener, såsom CD31 och CD45, är förenligt med den mesodermalt ursprung för ASCs, även om expressionen av specifika hematopoetiska markörer såsom CD34 förblir olöst vid denna tidpunkt. Nyligen ASC antigena profiler, bestämd genom flödescytometri, har använts för att selektera med avseende på specifik SUBPOPulations 10-12 i hopp om att producera ASCs med förbättrade differentieringskapacitet.
Som den mest populära sättet att validering, in vitro-induktion av ASC befolkningen med hjälp av definierade odlingsbetingelser resulterar i deras differentiering till mesodermala, ektodermala och endodermala härstamningar (för översikt se 4) (Figur 2). Även om in vitro-tri-GRODDBLAD potential har lett till att användningen av ASCs för en mängd olika regenerativa modellsystem, differentiering till osteogent, är i allmänhet tillräcklig för att identifiera ASC och bekräfta sin multipotens adipogena och kondrogena celler. I våra händer, den adipogena differentiering av ASC: er resulterar i celler som innehåller ljusa lipid vakuoler som färgas med användning av Oil Red O 5. Osteogena differentierings resultat av alkalisk fosfatas-positiva celler och ansamling av extracellulär mineral som färgar med användning av en kalciumfosfat Von Kossa Stain 5.Kondrogen differentiering under hög densitet mikromassförhållanden producerar pellets som innehåller sulfaterade proteoglykaner (detekteras med hjälp av en Alcian blå fläck) och uttrycker kollagen typ 2 5. Både skelettmuskulatur och glatt muskulatur differentiering kan ses med DSKer färgning för skelettmuskel myosin och MyoD1 och glattmuskelaktin 5, 13, 14. Differentiering i ektodermala härstamning föreslås genom antagandet av en neuronal-liknande morfologi genom inducerade ASCs och uttrycket av många neuronala markörer, däribland att Neun, en neuronal transkriptionsfaktor 5. Slutligen, induktion av DSK: er mot en lever / endodermal härstamning utifrån fastställda villkor 15 resulterar i celler som uttrycks alfa-fetoprotein, en välkänd markör för lever hepatocyter. Dessa markörer, tillsammans med många andra som publicerats under de senaste 10 åren visar tydligt att ASC är en pluripotenta stamceller befolkningen som lätt kan underhållas ochförökas in vitro och induceras mot celler av tre embryonala köns härstamningar. Kopplat till deras regenerativa potential in vivo (för översikt se 4), kan ASC vara ett kraftfullt komplement till de verktyg för en regenerativ forskare eller kliniker.
Figur 1. Manuell, enzymatisk isolering av humana ASCs från lipoaspirate prover. A. Förberedelse för isolering: Före isolering följande komponenter bör förberedas: 1) 1x PBS (utan kalcium eller magnesium), steriliseras genom autoklavering, 2) en lösning av 0,075 till 0,1% kollagenas typ IA, upprättad i 1x PBS och steriliseras genom filtrering med hjälp av en 0,22 um filterenhet, 3) Kontroll Medium (CM) för efterföljande odling av ASC befolkningen. B. Isolering av ASCs: En steg-för-steg guide för isolering av stromaceller vaskulära fraktion (SVF) från lipoaspirates visas. Steg inkluderar tvättning av lipoaspirate med steril 1x PBS, matsmältning med hjälp av kollagenas typ IA, samling av SVF genom centrifugering, och SVF filtrering. Efterföljande odling av SVF kommer att resultera i en vidhäftande fibroblast population innehåller ASC befolkningen. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Flera härstamning differentiering potential vidhäftande ASC befolkningen. Odlade SVF celler resulterar i en relativt homogen population av vidhäftande, fibroblastiska ASCs. Induktion av ASC befolkningen under definierade förhållanden leder till celler i adipogena, osteogena, kondrogen, skelett myogena och släta myogena härstamningar.Dessutom kan DSKer också differentieras till celler av ektodermalt härstamning, uttrycker NeuN, en markör för neuroner och alfa-fetoprotein (AFP) en etablerad markör för endodermalt / hepatisk cell lineage. Vissa histologi och immunofluorescerande bilder är tagna från tidigare publicerade resultat 1,5,6,7,8,9. Differentiering härstamning, tillsammans med histologiska, immunohistologic eller fluorescerande fläck visas. Klicka här för att visa en större bild.
| Expression profil | ||
| positivt uttryck | negativa uttryck | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| föreslagna fenotyp av ASCs (Gemensamt mellan två eller flera studier) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| kontroversiell markörer i DSKer (Differential resultat över flera studier) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| stromal cell markörer | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| hematopoetiska markörer | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| markörer i gemensamt mellan två eller flera studier som visas i fetstil SMA = glattmuskelaktin HLA = humant leukocytantigen ABCG2 = flera läkemedel transportproteinet G2 | ||
Tabell 1. Cellyteexpression profiler av mänskliga ASCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fettvävnad för isolering av ASCs kan komma i många former: från fasta bitar av vävnad som framställts genom resektion eller lipoplasty till mindre bitar som erhållits genom antingen spruta extraktion eller sug-assisterad lipoplasty (dvs. fettsugning). Huruvida fler SVF celler (och därmed ASCs) kan erhållas från opererande eller aspirefettprover är oklart motstridiga studier har presente 16, 17. Det är möjligt att någon form av fettvävnad är mer än lämplig för isolering av SVF celler och ASCs så länge föraren är skicklig i sin isoleringsteknik. Men fettsugning gör håller en fördel över resektion i det är det mindre invasiv och kräver betydligt mindre postoperativ vård. Även de typer av fettsugning har ökat under det senaste decenniet, inklusive tekniker, såsom ultraljudsassisterad, servo och laser-fettsugning 18, den vanligaste förblir SVULLEN fettsugning,där fettutrymmet är översvämmad med stora mängder av steril saltlösning, bedövningsmedel och kärlsammandragande medel före aspiration 19. Valet av teknik som kan variera från kirurg till kirurg. Men medan medlen för extraktion kan verka oviktigt för forskaren, är det viktigt att inse att den teknik som kan ha en effekt på ASC antal och viabilitet. Till exempel, kan öka fettsugning vakuumtryck negativt påverka SVF cellutbyte 20. Dessutom minskar i ASC spridning har mätts vid ultraljud-fettsugning 17.
Men erhållits bör aspirera behandlas snabbt som förvaringstemperaturer kan påverka SVF livskraft och eventuell ASC avkastning. Studier av Matsumoto et al. Har visat att ASC utbyte minskar om aspirera lagras vid rumstemperatur under längre än 24 h. 21. Vid behov kan 24 timmars förvaring vid 4 ° C användas utan någon skadlig effekts på de biologiska egenskaperna hos ASC befolkningen, men, återigen, cellviabiliteten kan minska om denna lagringstiden ökas utöver den punkten. Lättheten att lipoaspirate bearbetning är direkt relaterad till den totala volymen. Mindre volymer, som erhålls genom sprut extraktion, är relativt lätt att bearbeta. Däremot kan större volymer pirat, som erhållits genom fettsugning, presentera fysiska utmaningar. Till exempel kan något så enkelt att överföra fett från aspirationsbehållare, så att den kan tvättas med problem när aspirations volymen är stor. Det protokoll som beskrivs i denna artikel är tänkt att lindra en del av dessa utmaningar.
I stort har den isolering av ASC befolkningar från lipoaspirates använder den enzymatiska metod som beskrivs i den här artikeln inte förändrats nämnvärt under de senaste 10 åren. Det finns många protokoll tillgängliga via PubMed som är utmärkt i sin beskrivning av den isolering av DSK: er från lipoaspirates. Me flesta av dem skissera en mycket liknande protokoll med mindre modifikationer. I grund och botten är det lipoaspirate tvättas av föroreningar, rötas enzymatiskt för att frigöra SVF och SVF, som innehåller ASC befolkningen, samlas in genom centrifugering. De flesta stora volym lipoaspirates anländer i någon typ av vakuumbehållaren - konfiguration som kan variera från kirurg till kirurg. Detta protokoll rekommenderas avlägsnande av aspirera till en stor, steril bägare före tvätt, eftersom själva behållaren kan vara en föroreningskälla, om inte ordentligt rengjorda innan du placerar i biosäkerhet huva. När väl överförts och får sedimentera genom gravitation kommer aspirera separera i tre skikt: ett topp, oljeskiktet som är resultatet av lys av mogna adipocyter, ett mittfettskikt och ett bottenskikt av salin och kontaminerande röda blodkroppar. Oljeskiktet bör tas bort eftersom vi har märkt att det kan vara giftigt för de resulterande cellkulturer (opublicerade observationer). Även detta protocol rekommenderar att infranatant av saltlösning och RBK kommer bort innan den första tvätten, för att minska det potentiella antalet förorenande RBC när DSK odlas. Däremot har en studie av Francis et al. Föreslog att denna infranatant också kan vara en källa till DSK: er 22. Användningen av en 10 ml serologisk pipett gör avlägsnandet av denna infranatant relativt lätt. Vad som återstår är den fettskiktet som sedan kan enkelt tvättas med användning av steril PBS, eller om så önskas, steril PBS supplementerat med antibiotika och antimykotika för att minska risken för kontaminering från 23 till 25. Efter tvättning fettvävnad enzymatiskt med användning av en steril lösning av kollagenas typ IA. Användningen av en filtreringsenhet, såsom Millipore-enhet som visas i denna video kombinerar ett lämpligt medel för aseptisk filtrering av kollagenas i en sluten behållare i vilken den tvättade fettvävnad kan adderas för efterföljande vattenbad digerering vid 37 ° C.
Den typ av kollagenas som används har varierat från grupp till grupp med kollagenas typ IA tycktes vara vanligare 1, 24, 25. Emellertid finns det över 11 olika typer av kollagenas kommersiellt tillgängliga, var och en med rötnings affiniteter för specifika vävnader. Vid rötning av fettvävnad, företag som Sigma Aldrich rekommenderar kollagenas typ I och II och de båda typerna är väl representerade i dagens litteratur 1, 24-27. I sin ursprungliga artikeln, Zuk et al. Använder kollagenas typ IA från nötkreatur från källor vid en koncentration av 0,075% 1. Men de flesta kommersiella källor för kollagenas typ IA nu erhållits från anaeroba bakterier Clostridium histolyticum eller E. coli som modifierats genetiskt med C. histolyticum gener. Många företag erbjuder många beredningar av kollagenas typ IA, från råolja till dem som förberett genom ammoniumsulfatutfällning. Denprotokoll som beskrivs i detta JUPITER artikeln använder en rå beredning av typ IA kollagenas som innehåller inte bara kollagenas aktiviteter, men även icke-specifik proteas, klostripain och tryptic enzymatiska aktiviteter. Även om dessa ytterligare enzymer är avgörande för matsmältningen effektivitet 28, det finns de som rapporterar parti till parti variabilitet i samband med rå kollagenas typ IA 28, 29 och öka deras koncentrationer av kollagenas upp till 0,2% för att få en effektiv matsmältning 23. De grupper som använder rå kollagenas typ IA rekommenderar även dess komplettering med bovint serumalbumin (0,1 till 1,0% BSA) för att öka enzymets prestanda och öka stabiliteten i cellerna i den fett-matris. Men detta kanske inte är nödvändigt, eftersom det protokoll som beskrivs i den här artikeln använder kollagenas utan tillskott med någon negativ effekt på matsmältningen effektivitet.
För dem som vill använda en mer definierad kollagenas composition, kommersiella källor som innehåller mycket renat kollagenas tillsammans med en exakt blandning av proteaser finns nu tillgängliga. Dessa preparat renar klostridiala kollagenas typ I och II till hög aktivitet och kombinerar dem med kända neutrala proteas-aktiviteter, såsom dispas och termolysin. Effektiv adipose spjälkning med användning av kollagenas och termolysin har rapporterats av Zachar et al. 27. I överenskommelse med detta arbete, Pilgaard et al. 30 rapporterar också utmärkt matsmältning effektivitet med hjälp av flera blandningar av kollagenas och termolysin. Men de observerar bättre matsmältning effektivitet med hjälp av preparat av kollagenas och dispas.
Nedbrytningstider för isolering av celler från adipos vävnad kan variera från studie till studie. Många publicerade protokoll rekommenderar uppslutningstider 1-2 tim 27, 30. Det är emellertid viktigt att inse att överdrivna uppslutningstider i slutändan kan påverka antalet viabla ASCs och deras stamceller fenotyp. Pilgaard och kollegor har fastställt att 2 tim rötning vid 37 ° C ger den bästa balansen mellan vävnadsdissociering och ASC funktionalitet 30, med Zachar et al. Rekommenderar att matsmältningen, förbi 45 min, observeras var 15 min till 2 timmar max, med matsmältningen stoppas när den fettvävnad tar på ett mer homogent utseende 27. Vi håller med om denna rekommendation. Emellertid är det vår erfarenhet att de flesta kollagenas typ IA beredningar på 0,075 till 0,1% är i stånd att smälta stora mängder lipoaspirates i 30-45 min och att dessa tider är tillräckligt för att frigöra ett tillräckligt antal celler. Därför rekommenderar detta protokoll en uppslutning på 30 min. Om det krävs mer tid, skulle konsekvensen av lipoaspirate övervakas och matsmältning stoppas när lipoaspirate antar en "krämig" eller "soupy" utseende (Figur 1).
När the matsmältningen är klar, isolering av det frigjorda SVF är helt enkelt åstadkoms med hjälp av centrifugering. Men liksom aspirationstryck, kan de fysiska effekterna av centrifugering har en effekt på SVF viabilitet och antalet ASC: er som finns för kulturen. En studie av Kurita och kollegor 31 har visat att hastigheter över 3.000 xg kan skada ASC. Dock bör hastigheten vara tillräckligt stor för att säkerställa tillräcklig pelletering av SVF. Som regel de flesta protokoll, inklusive denna, rekommenderar en centrifugehastighet på 1,200-1,500 x g.. Försiktighet bör iakttas av forskaren för att se till att de förstår sambandet mellan centrifugalkraften (mätt i gram) och centrifugeringshastighet (mätt som rpm), eftersom förhållandet beror på den specifika centrifugrotorn. Men som regel lägre centrifugalkrafter, såsom 1200 xg, ofta är ekvivalent med centrifugeringsvarvtal och betryggande sätt kan användas omväxlande.
Efter spinning, flera distinct skikten observeras i centrifugröret (figur 1): ett toppskikt av olja och "fluffiga" vita adipocyter, ett mitt kollagenas skikt och en cellpellet. Pelleten själv kan ha två distinkta skikt: ett övre skikt av röda blodkroppar och en nedre vit SVF pellet, innehållande DSKer. Detta protokoll rekommenderar försiktig aspiration av oljan och adipocyter, vilket oljan kan vara toxiska för cellkulturen och adipocyter har visat sig vara i stånd att dedifferentiering tillbaka till en mer primitiv celltyp 32. Dock kan dessa adipocyter skördas vid denna punkt, om så önskas. På grund av dessa föroreningar, rekommenderar detta protokoll ett extra tvättsteg för att säkerställa deras tillräcklig borttagning. Detta steg ger också forskaren att kombinera flera SVF pellets för efterföljande enkel filtrering. Filtrering sannolikt är nödvändigt på grund av närvaron av stora bitar av fibrotisk material och cellulära aggregat efter matsmältningen. Dessa material är lätta att avlägsnagenom enkel gravitationsbaserad filtrering genom 70 eller 100 ìm mesh filter. En alikvot av filtratet kan vidtas i syfte att räkna antalet kärnförsedda celler om så önskas och resterande filtratet klädd för ASC följsamhet och expansion.
Trots ihärdiga försök att ta bort så många röda blodkroppar som möjligt, kommer ingen ASC preparatet vara helt utan RBC kontamination. I vår ursprungliga artikeln, föreslog vi att avlägsna dessa röda blodkropparna genom resuspension av pellets i en hypoton lösning på 160 mM NH 4 Cl. Majoriteten av efterföljande isolering artiklar innehåller detta steg och rekommenderar användning av NH 4 Cl-baserade lösningar eller sterilt vatten 22-24, 27, 33, även om försiktighet måste iakttas vid användning av sterilt vatten, för att minimera den tid de SVF cellerna exponeras till hypoton lösning 27. Emellertid kan detta steg inte nödvändigt eftersom de röda blodkropparna är en icke vidhäftande cellpopulationen och kan lätt tas bort efter en övernattning kultur avASC populationen. Dessutom, medan anekdotiska i bästa fall, dessa RBK verkar för att förbättra den initiala utbyggnaden av de resulterande vidhäftande celler (ZUK, opublicerade observationer). Som sådan, eliminerar detta protokoll RBC lys steg och föreslår att de första ASC kulturerna tillåtas expandera i närvaro av dessa röda blodkropparna för de första 3-4 dagarna utan någon förändring av odlingsmedium. Anledningen till denna observation kan bero på någon typ av parakrin signalering från att förorena blodkroppar eller kan helt enkelt bero på bättre lönsamhet med uteslutande av RBC lys steg. Efter detta, kan odlingsmediet aspireras och majoriteten av de röda blodkropparna avlägsnades genom försiktig tvättning av plattorna med sterilt 1x PBS. Med tiden kommer eventuella kvarvarande röda blodkropparna så småningom dör och tas bort från kulturen.
Studier av Zachar och Boquest har beräknat att 25-50% av den återsuspenderade SVF pelleten vidhäftar till vävnadsodlingsplast 23, 27. Den resulterande "passage 0" ASC cultures är heterogena, som består av små, runda celler tros vara ASCs och mer oregelbundet formade celler föreslås bli endothelial ursprung. Medan studier av många grupper, inklusive vår har bekräftats att ingen kontaminerande celltyper som SMC, hematopoetiska celler och fibroblaster i ASC kulturer 1, kan närvaron av ytterligare celltyper inte uteslutas. . Faktum tallone m.fl. har präglat passage 0 kulturer och observerade fyra distinkta populationer: 1) små, runda, snabbt förnya celler, 2) spolformad fibroblastceller tros vara ASC, 3) långsamt repliker stora celler med ett mer begränsat potential (dvs pre-adipocyter) och 4) cuboidal endotelceller som går förlorade med passagen 34. Senare studier har visat att den runda, snabbt förnyande cellpopulationen är av högst multipotentialitet och uttrycka typiska markörer stamceller 35, 36. Dessutom kan de bilda "sfäroider" på grund avderas snabba spridning och är ofta omgivna av spolformad fibroblaster. Som sådan, är det möjligt att spindelformade ASC population föreslås ovan kan härröra från dessa celler. Efter initial expansion av dessa passage 0 ASC kulturer, är det tänkt att en fortsatt odling över tid väljer för ASC, med de resulterande kulturerna antar en mer fibroblastisk, homogen sammansättning. Men rester av kontaminerande celler kan inte helt uteslutas och därför bör ASC befolkning fortfarande anses vara heterogen.
Medan det protokoll som beskrivs i denna artikel är enkel, billig och kräver inte några delar av utrustning som normalt inte finns i en vävnadsodlingsanläggning, men det har den nackdelen att de kräver en sådan anläggning. Ett flertal studier har undersökt de translationella tillämpningar av ASCs genom djurmodeller och kliniska studier med ASC har börjat dyka upp (för översikt se 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna av detta manuskript är co-uppfinnare på ett patent som ägs av The Regents vid University of California och licensieras till Cytori Therapeutics.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna och tacka de ytterligare forskningspersonal som bidragit till utvecklingen av den beskrivna protokollet och dess isolering av DSK: er, bland annat: Dr H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD , Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, Dr Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, PhD, och Dr John Fraser, PhD. De resultat som presenteras finansierades delvis med forskningsanslag från National Institutes of Health, inklusive NIAMS och NIDCR institut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
References
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
