Robust 3D DNA FISH Brug Direkte mærkede prober

Summary

Vi beskriver en robust og alsidig protokol for analyse nukleare arkitektur ved 3D DNA FISH hjælp direkte mærkede fluorescerende prober.

Abstract

3D DNA FISH er blevet et vigtigt værktøj til at analysere tredimensionelle organisering af kernen, og flere variationer af teknikken er blevet offentliggjort. I denne artikel beskriver vi en protokol, der er blevet optimeret til robusthed, reproducerbarhed, og brugervenlighed. Brightly fluorescerende direkte mærkede prober er genereret af nick-translation med amino-allyldUTP efterfulgt af kemisk kobling af farvestoffet. 3D DNA FISH udføres under anvendelse af en fryse-tø trin for celle permeabilisering og et opvarmningstrin til samtidig denaturering af probe og nuklear DNA. Protokollen er gældende for en række celletyper og en række prober (BAC, plasmider, fosmids eller helt kromosom Paints) og giver mulighed for high-throughput automatiseret billeddannelse. Med denne metode vi rutinemæssigt undersøge kernelokalisering af op til tre kromosomale regioner.

Introduction

DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH DNA) giver den tre-dimensionelle visualisering af individuelle gen loci, subchromosomal domæner og endda hele kromosomer i alle faser af cellecyklus. 2D FISH anvendes til metafase undersøgelser mens 3D FISH er blevet grundigt anvendt til at probe forholdet mellem rumlige organisering af genomet og dets funktion i løbet af interfase ^(1,2 og referencer deri). Historisk set blev co-forening undersøgelser udført ved at undersøge snesevis til hundredvis af enkelte loci ved FISH. For nylig kraftfulde højt gennemløb 3C-baserede teknikker såsom 4C og Hi-C er blevet udviklet ^3, tillader undersøgelse af molekylære cross-talk mellem mange tusinde forskellige loci. Mens 3C-baserede teknikker og DNA fisk kan komplementære metoder, de ikke nødvendigvis svare på de samme spørgsmål. 3C baserede metoder giver et ensemble udlæsning af blandede cellepopulationer, hvilket resulterer i en sandsyntet for co-foreninger. I modsætning hertil, mens lav i gennemløb FISK baserede teknikker giver mulighed for at analysere rumlige arrangementer af loci eller kromosomer i individuelle celler i henhold til deres udviklingsmæssige eller cellecyklus faser. Derfor vil FISH fortsat være et vigtigt redskab til sondering nukleare struktur-funktion relationer.

Der er to store overvejelser i at udføre vellykkede 3D FISH eksperimenter. Disse er; 1. opnåelse optimalt mærkede prober og 2. Valget af cellulære behandlinger, herunder fiksering, præ-og post-hybridiseringsbetingelser trin, for at bevare nukleare morfologi så meget som muligt, samtidig med at DNA tilstrækkelig tilgængelig for probehybridisering. Effektiv sonde mærkning er afgørende vigtigt for FISH. Traditionelt har nick-translation blevet anvendt til at indføre enten hapten eller fluorofor-konjugerede nukleotider ^4.. Tilsvarende kommercielle nick-oversættelse kits er tilgængelige for direkte hapten eller fluorophor inkorporering, BUt også for to-trins mærkning hjælp aminoallyl nukleotider og amin-reaktive farvestoffer. Sidstnævnte gør farvestof inkorporering mere effektiv ved at give DNA-polymerase en mindre pladskrævende molekyle at arbejde med. For nylig har kits til ikke-enzymatisk mærkning af DNA blevet udviklet, som udnytter koordinerende binding af platin til nukleinsyrer. FISH prober kan endda købes allerede er mærket ^5. Mens kits og kommercielt fremstillede sonder uden tvivl giver brugervenlighed, de er væsentligt dyrere end at købe de enkelte komponenter og producere sonder internt. Vi optimeret en lav pris nick translation protokol med henblik på direkte mærke mange forskellige AKB prober i flere farver. Vi opdagede, at opnå særdeles rent BAC DNA er kritisk og resulterer i et krav om kun 10-20 ng probe pr FISH dias, sammenlignet med 10 - 20-fold mere, når uren skabelon DNA anvendes, hvilket resulterer i større omkostnings-og tid- besparelser. Anvendelsen af ​​amino-allyldUTP muliggør fleksibel mærkning afsonder med ledige amin-reaktive farvestoffer (f.eks Alexa Fluor eller Cy-farvestoffer) eller haptener (fx biotin, digoxigenin). Hapten-mærkede prober detekteres ved fluorofor-konjugerede antistoffer eller streptavidin at forstærke og visualisere signalet. Bright direkte mærkede prober viser generelt mindre baggrundsfarvning og undgå overdreven forstærkning af signaler, og dermed resulterer i en mere nøjagtig gengivelse af kernelokalisering og locus morfologi.

Der er flere forskellige fisk teknikker, der bruger forskellige fikseringsmidler, pre-behandlinger, og post-hybridisering vasker men disse generelt falder i følgende kategorier: glutaraldehyd fiksering med NaOH denaturering, formaldehyd fiksering med HCI denaturering, og formaldehyd fiksering med varme denaturering ^6-9 . Hver af disse har fordele og ulemper. Glutaraldehyd fiksering resulterer i god nukleare strukturel konservering, men kræver behandling med reduktionsmidler for at minimereden resulterende autofluorescence og NaOH behandling skal nøje kontrolleres for at balancere tilstrækkeligt DNA denaturering og potentielle skade på nukleare struktur ^6.. Formaldehyd fiksering er mindre stærk, hvilket giver en øget risiko for forstyrrelser af nuklear arkitektur, men også typisk give stærkere og mere pålidelige signaler og lavere autofluorescens ^9.. HCI behandling depurinates DNA og strips ud proteiner, der giver god adgang til DNA for sonderne, men kan også indføre DNA pauser. Varme fysisk adskiller de to DNA-strenge resulterer i godt mål hybridisering og stærke signaler, men kan forårsage en vis forstyrrelse af nukleare struktur ^8.. I hvor høj grad hvert af disse teknikker påvirker proteinepitoper varierer meget ^6,9, hvilket resulterer i kravet om eksperimentelt bestemme for hvert protein den optimale protokol til brug i immuno-FISH eksperimenter.

Mens der ikke er 'perfekt' DNA FISH technique kan de alle være nyttigt, hvis velkontrolleret. Vores mål var at optimere en protokol for robust og reproducerbar DNA FISH at undersøge rumlige placering af multiple loci i en række celletyper ^10, fokus på opvarmning metode for de fleste pålidelige signaler. Med dette og anvendelse af et automatiseret billedbehandlingssystem vi formål at øge throughput til enkelt-celle analyse af nukleare arrangementer.

Protocol

1.. Generering Direkte mærkede DNA-prober ved nick-translation

Bemærk: Direkte mærkede prober fremstillet fra BAC (100-250 kb) konsekvent producere lyse signaler. Hvis mindre sonder er påkrævet, brug fosmids (40-50 kb) eller endog plasmider indeholdende 5-10 kb skær. Identificer BAC eller fosmid kloner svarende til specifikke gener ved hjælp af Ensemble eller UCSC genom browsere. Forbered høj kvalitet BAC DNA'et ved gentagen udfældning eller benytte kommercielt tilgængelige kits. Jo mindre præparatet er forurenet med bakteriel genomisk DNA, er det mindre proben kræves per slide. Udfør mærkning i to trin: nick translation indføre aminoallyl-dUTP og kemiske kobling af en amin-reaktivt farvestof.

1.1. Nick Translation

Under nick translation er DNase I bruges til at skabe enkelt-strenget pauser. DNA-polymerase I elongates 3'-enderne af disse 'nicks «, erstatte de eksisterende nukleotider med nye, t hermed "oversætte" nick og dermed give mulighed for at indarbejde mærkede nukleotider. Aminoallyl-dUTP er valgt på grund af en effektiv inkorporering af DNA-polymerase I og dens potentiale for senere kemisk kobling til amin-reaktive farvestoffer eller haptener. Det er afgørende for at opnå den rette balance mellem DNase I nicking og DNA-polymerase I oversættelse for meget DNase I vil resultere i overdreven DNA fordøjelsen giver lavt udbytte og korte fragmentstørrelser, for lidt, vil ikke producere nok nicks for polymerase at indlede oversættelse, giver store fragment størrelse og dårlig inkorporering af aminoallyl-dUTP. Følgende protokol fungerer godt, men det kan være nødvendigt at titrere DNAse I fra forskellige batches eller forskellige fabrikanter.

1. Opsæt mærkning reaktion på is og inkuberes i 2 timer ved 16 ° C. Dette skal producere 0,5-1 ug nicktranslateret DNA og kan skaleres op. Fortynd DNase 01:30 i DNase I-puffer (dvs. 0,3 U / ul).

1 "> Component Koncentration af lager Volumen eller mængden BAC DNA 5-10 ug NTB buffer 10x 5 pi DTT 0,1 M 5 pi dNTP-blanding 10x 5 pi Aminoallyl-dUTP 0,5 mM 6 pi DNA-polymerase I 10 U / ul 1 pi DNase I 10 U / ul 1 pi (af en 1:30 fortynding) _H2O til 50 pi

2. Run 1 pi på en 2% agarosegel for at kontrollere størrelsen af ​​de mærkede fragmenter. Mens du kører gel, holder reaktionen på is. Vellykket nick translatipå vil resultere i en overhældes med hovedparten af ​​fragmenterne kører mellem 150 bp og 700 bp med nogle større fragmenter på ~ 1 kb (kritiske trin: se Repræsentative resultater). Hvis det er nødvendigt, tilføjer en anden 1 ml af en frisk 01:30 DNase I fortynding og inkuberes ved 16 ° C i 15-30 min. Inkubationstid vil variere alt efter mængden og kvaliteten af ​​BAC DNA.
3. Inaktivere DNase I ved opvarmning til 75 ° C i 10 min.
4. Oprydning aminmodificeret DNA under anvendelse af en PCR-oprensningskit. Eluer i 100 pi H ₂ O.
5. Ethanolpræcipitat DNA ved tilsætning af 10 pi 3 M NaOAc (pH 5,2) og 275 pi ethanol. Efterlad ved -20 ° C i mindst 1 time eller natten over. Spin ved maksimal hastighed i 30 minutter ved 4 ° C. Vask pellet med 500 pi 70% ethanol, og lad det lufttørre. Dette trin fjerner sporstoffer aminer, som vil forstyrre mærkning reaktion. Resuspender pellet i 6 pi H ₂ O pr 1x første reaktion.
6. Brug 1 pi at bestemme koncentrationen af ​​amin-modificerede DNAved microvolume UV-spektroskopi.

1.2. Kobling af fluorescerende farvestof

Fluorescerende mærkning af proben opnås ved kemisk kobling af farvestoffet. Alexa Fluor succinimidylester farvestoffer reagerer med aminer med amino-allyldUTP modificerede DNA til dannelse af en kovalent binding, hvorved der produceres direkte mærkede prober. Alexa Fluor 488, 555, og 647 farvestoffer har været en succes for denne proces.

1. Juster 4 ug amino-allyl modificerede DNA til et volumen på 5 mikroliter, opvarmes til 95 ° C i 5 min, afkøles på is snap, og tilsættes 3 ​​pi 0,2 M _NaHCO3.
2. Opløs en alikvot af amin reaktivt farvestof i 2 pi vandfrit DMSO ved stuetemperatur. Tilsæt 8 pi modificeret DNA med _NaHCO3, vortex, pulscentrifugeres og inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 1 time.

Bemærk: De aminreaktive farvestoffer kan anvendes til at mærke mere end én probe baseret på følgende skema. Siden only 10-20 ng sonden anvendes per dias mærkning 1 ug giver nok probe for 50-100 dias. Det er også muligt at lagre aminmodificeret DNA til fremtidige mærkning reaktioner ved -20 ° C.

DNA beløb	DNA volumen	0,2 M NaHCO3	Volumen af farvestof	Total	Nok til
4 x 1 ug	1.25 pi hver	0.75 pi hver	0,5 pi hver	2,5 pi (1/4)	50-100 dias hver
3 x 1,35 ug	1,67 pi hver	1 pi hver	0,67 pi hver	3.34 pi (1/3)	65-130 slide hver
2 x 2 ug	2,5 pi hver	1,5 pi hver	1 pi hver	5 pi (1/2)	100-200glider hver
1 x 4 ug	5 pi	3 pi	2 pi	10 pi (full)	200-400 dias

3. Tilføj 90 pi _H2O og rense mærket probe under anvendelse af en PCR-oprensningskit. Elueres i 100 ul 10 mM Tris-CI (pH 8,5).
4. Bestem probekoncentration og mærkning effektivitet ved microvolume fulde spektrum spektroskopi (se figur 2) efter Beer-Lambert ligninger (Instruktioner er givet i databladet, der ledsager Alexa Fluor reaktive farvestoffer, eller kan findes online). Sonder, der indeholder 3-6 farvestoffer per 100 bp fungerer godt. Sonder med lavere grader af inkorporering kan give svage FISH signaler. Alternativt, køre 5 pi på en 2% agarose gel uden DNA pletten og tjek indarbejdelsen af ​​det fluorescerende farvestof ved hjælp af en phosphoimager. Post-plet gelen med ethidiumbromid eller DNA farvning alternativer og sammenligne mærket DNA til totalt DNA.

Via de følgende trin, er celler af interesse fastgjort til dias og permeabiliseres. Cellulært DNA og direkte mærkede prober derefter denatureret sammen på en varmeplade og hybridiseret natten over i en lystæt fugtigt kammer.

2.1. Dag 1

1. Probe Nedbør
   Bemærk: bundfald sonder på et tidspunkt i løbet af dag 1. Dette kan bekvemt udføres parallelt med behandling af cellerne og behøver ikke at ske i begyndelsen af ​​dagen.
   1. Bland 10-20 ng direkte mærket probe, 6 pi C ₀ t-1 DNA (6 ug), 1 pi enkeltstrenget DNA fra laks testikler (9,7 ug) og justere lydstyrken til 100 pi med vand.
   2. Tilsæt 10 ul 3 M NaOAc og 275 pi EtOH og vortexes. Udfældes i mindst 1 time ved -20 ° C.
   3. Spin i mikrocentrifuge ved maksimal hastighed i 30 min ved 4 ° C. Vask pellet med 70% EtOH og spin igen. Tør pelletog resuspender i 5 ul deioniseret formamid. Resuspender i 30 min ved 37 ° C under omrystning ved 1000 rpm beskyttet mod lys (sted folie over Thermomixer).
   4. Tilsættes 5 ul dextransulfat mix og rystes i yderligere 10 minutter ved 37 ° C, igen beskyttet mod lys. Pipetteres op og ned lige inden pipettering onto dækglas.
      Bemærk: Ved kromosom maleri kombineret med BAC sonder, hele kromosom maleri prober, der leveres i klar-til-brug hybridiseringsblanding er en bekvem løsning. Resuspender udfældet BAC sonde (med C ₀ t1 DNA og enkeltstrenget DNA fra laks testikler) i 10 pi kromosom paint mix ved pipettering op og ned. Inkuber ved 37 ° C under omrystning ved 300-500 rpm i 10 min. Brug 10 ul af kromosom paint / BAC probe mix per stedet.
2. Montering Celler til Slides
   Bemærk: cellerne tilbøjelighed til at klæbe til dias i høj grad varierer med celletype. For hver celletype, bestemmeoptimale settling tid og celledensitet empirisk. For konsistente resultater bør cellerne være i en enkelt cellesuspension.
   Til brugervenlighed cirkel området vil cellerne blive spottet på med en hydrofob pen, selv om cellerne resuspenderet i PBS dette ikke er strengt nødvendigt. En hydrofob barriere forhindrer suspensionen i at sprede sig på diaset, holder op til tre prøver pr slide pænt adskilt, og giver mulighed for anvendelse af meget små mængder af antistof opløsning i immuno-FISH. Desuden kan spotte området holdes på et minimum, hvis celle tal er lave.
3. Mus føtale leverceller
   1. Saml hver E13.5 mus føtal lever i ca 1,5 ml PBS og resuspender ved pipettering op og ned. Spin i mikrofuge ved 3.000 rpm i 2 min. Gentag vasker tre gange. På den sidste vask stamme celler gennem en 70 um si. Resuspender celler fra en lever i 160 pi PBS og bruge 50 μ pr plet. Forlade celler til at nøjes med 2 minutter ved stuetemperatur.
4. MOuse ES-celler
   1.. Mus ES-celler vil ikke holde let til diaset. På et dias, området cirkel cellerne vil blive spottet på med en hydrofob pen. Forbered en suspension af 20.000-50.000 celler pr 80-100 ul i normalt dyrkningsmedium, pipette i cirklen og lad at vedhæfte for ca 3 timer i en fugtig inkubator Note:. Alternativt kan ES-celler dyrkes på dias, men vil så danne kolonier, som kan hæmme automatiseret billeddannelse.
5. Fikserede celler
   1.. Nogle eksperimenter kræver anvendelse af fikserede celler, der ikke knytter sig til lysbilleder af sig selv. Blid centrifugering ved 300 rpm i 3 minutter under anvendelse af en cytocentrifuge bevarer den tredimensionelle struktur af cellerne og sikrer, at celler ikke falder af.

Celletype	Suspension i	Bilæggelse af tid	Kommentar
Musføtal lever	PBS	2 min	På bænken
Mus ES	DMEM med kosttilskud	4 timer	37 ° C i befugtet inkubator
Muselymfocytter	PBS	2 min	På bænken
Muse P20 kønsceller	Fix i opløsning	Cytospin	På bænken

3. At fastsætte celler, forsigtigt nedsænkes dias i 4% PFA (ADVARSEL: udføre i stinkskab) i 10 min. Fix celler med slæden fladt i en bakke for bedste fastholdelse af celler (fx 50 ml 4% PFA i låget på et tip boks) Bemærk:. Dette trin gælder ikke for celler fastlagt forud for tilknytning til dias.

For alle efterfølgende trin, skal du bruge 50 ml eller 100 ml Coplin-skåle. Pas på ikke at skrabe celler fra når flytning dias mellem krukker.

4. Dæmpning i 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 i 10 minutter ved stuetemperatur.
5. Permeabilisere celler i 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
6. Vaskes to gange i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
7. Inkuber i mindst 20 minutter i 20% glycerol / PBS ved RT Bemærk:. På dette tidspunkt kan objektglassene opbevares i 50% glycerol / PBS ved -20 ° C i mindst flere uger. Det er blevet observeret, at lagring i mindst en dag resulterer i en stigning i signalstyrke ^9.. Rekalibrere ved stuetemperatur 20% glycerol / PBS, før du fortsætter Bemærk:. Dette er en praktisk udgangspunkt at starte udfældning af prober (se 2.1.1).
8. 3x fryse / optøning i flydende nitrogen. Submerge dias ad gangen i flydende nitrogen ved hjælp af en lille Dewar. Trække efter et par sekunder, og en karakteristisk poppende lyd, og læg dem på køkkenrulle til optøning. Vent på uigennemsigtig frosset glycerol at forsvinde og derefter fryse igen. Op til 15 slides kan gøres komfortabelt i rotation i tre fryse / tø cykler.
9. Wash to gange i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
10. Inkuber i 0,1 M HCI i 30 minutter ved stuetemperatur.
11. Vask i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
12. Permeabilisere i 0,5% saponin/0.5% Triton X-100/PBS i 30 min ved RT.
13. Vaskes to gange i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
14. Ækvilibrere i 50% formamide/2x SSC i mindst 10 minutter ved stuetemperatur.
15. Pipette sonden på et dækglas. Fjern dias fra krukken og tørre overskydende væske omkring cellen spot (r) med en papirserviet. Som formamidet tørrer hurtigt, passe på ikke at tørre ud cellerne. For dias med to eller tre celle pletter, gælder 10 pi sonde per spot på en 22 mm x 50 mm dækglas svarende til at spotte placering på diaset. Vend dækglas på glide hen over spot (r). Seal med gummi cement og gøre det muligt at tørre helt. Beskyt mod lys i alle efterfølgende faser.
16. Heat dias til 78 ° C netop 2 min på en varmeplade (f.eks en inverteret varmeblok, afgørende skridt: se diskussion). Placer et cover (papkasse eller sim Ilar) ud over den varme plade for at beskytte mod lys under denaturering.
17. Inkuber natten over ved 37 ° C i en lystæt fugtigt kammer. At befugte placere papirservietter i en lystæt kasse og dæmpe med vand.

2,2 Dag 2

1. Forbered Coplin-skåle med løsninger til den rette temperatur for efterfølgende vaske trin. Beskyt slides mod lys så meget som muligt i alle efterfølgende trin. En kop kaffe kan gør en god lystæt dækning for Coplin-skåle.
2. Peel off gummi cement og sted slide i 2x SSC indtil dækglas løsne og glide.
3. Vask i 50% formamide/2x SSC i 15 minutter ved 45 ° C. Læg låg på vandbad for at beskytte mod lys.
4. Vask i 0,2 X SSC i 15 minutter ved 63 ° C.
5. Vask i 2x SSC i 5 minutter ved 45 ° C.
6. Vask i 2x SSC i 5 minutter ved stuetemperatur.
7. Vask i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
8. Pletten med DAPI (5 mg / ml i 2x SSC) i 2 min i en Coplin krukke ved RT.

indhold "> NB: DAPI opløsning kan opbevares ved 4 ° C i mørke i 2 måneder.

9. Affarves i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
10. For at montere dækglasset, pipette montering medium på et dækglas. Brug 10 pi per celle stedet, ved hjælp af 22 mm x 22 mm dækglas til én stedet, og 22 mm x 50 mm dækglas i to til tre pletter. Tør PBS omkring cellen stedet så meget som muligt, men pas på ikke at tørre ud cellerne. Vend dækglas på dias og tætning med neglelak.

Representative Results

Protokollen beskrevet her (figur 1 for oversigt) er blevet anvendt med stor effekt at kombinere DNA-FISH med high-throughput billedoptagelse til analyse af genomisk organisation. Den generation af god kvalitet sonder er afgørende for succes (se diskussion). Figur 2 viser to vigtige kvalitetskontroller for fisk sonder. Efter nick-translation, bør en udstrygning af DNA være synlig med hovedparten af fragmenterne kører mellem 150 og 700 bp (figur 2A). Efter kemisk kobling, kan inkorporering af det fluorescerende farvestof måles ved spektroskopisk analyse af proben (figur 2B).

Når du bruger gode sonder efter DNA FISH-protokollen normalt resulterer i lyse DNA FISH signaler på lavt baggrund. Vi har med succes brugt denne protokol på en række forskellige celletyper, og med enten epi-fluorescens eller konfokal mikroskoper. Automatiseret billeddannelse ved hjælp af en epi-fluorescence mikroskop kræver skarpe, let identificerbare FISH signaler med lidt baggrund (figur 3), mens konfokal mikroskopi kræver mere intense signaler. 4A viser repræsentative behandlede billeder. Nukleare koordinater af fisk signaler kan opnås, og rumlige relationer genomiske regioner kan beregnes (for eksempel se figur 4B). Vi har også brugt billedstakke opnået ved konfokal mikroskopi til 3D-modellering af fisk signaler på deres kromosom territorier (Movie 1).

Figur 1. Workflow for sonde mærkning og DNA FISH. Probe forberedelse er vist i blåt. DNA FISH procedure er vist i sort med oplysningerne i grønt.

Figur 2. Mærkning sonder ved nick-translation og kvalitetskontrol af mærkede prober. A) gel, der viser ideelle smøre før opvarmning for at inaktivere DNase I (bane 1: DNA stigen, bane 2 og 3: BAC'er efter nick-translation). Fragmenter skal være i 150-700 bp rækkevidde. En yderligere smøre på ~ 1 kb observeres ofte med succesrige nick-translation reaktioner. B) Microvolume fulde spektrum analyse af mærkede prober. En DNA top ved 260 nm iagttaget med en anden top svarende til absorbansen bølgelængden af ​​fluoroforen proben er mærket med: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Vist er tre sonder med god inkorporering: fluorofor absorbanstoppe er samme højde som eller højere end DNA toppe. Alexa Fluor 647 har typisk højere absorbansend Alexa Fluor 555, som igen har højere absorbans end Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorberer også nogle lys ved 260 nm, hvorfor den første top for denne probe er højere end de andre. Prober med dårlig inkorporering show fluorophor absorbans 2-3-fold lavere end DNA absorbans. Sonder med en mere end 2 gange højere fluorophor top end DNA spids typisk indeholde ukonjugeret farvestof, der kan forårsage baggrund i FISH.

Figur 3. Screenshot fra MetaCyte 3D FISH imaging software viser en typisk trefarvet FISH eksperiment. Skærmen er opdelt i flere dele. A) Rå field-of-view (FOV) billede fra Metafer / MetaCyte diasscanning system. B) Gallery af billeder af identificerede kerner, der har unundergået billedbehandling og segmentering for fisk signaler. Forskellige typer af data kan vises på hvert galleri billede. I dette eksempel celle nummer vises øverst til venstre med forskellige interallelic og interlocus afstande øverst til højre og til begge sider under hvert billede. C) Slide navn med antallet af kerner identificeret i analysen. D) skildring af slæden med området scannet af system. E) Udvidelse af det scannede område. Hvide pletter repræsenterer identificeret kerner per FOV. F) Forarbejdede data. I dette eksempel maksimale interallelic afstande mellem grønne signaler (øverst) og røde signaler (nederst) er vist. Der vises data fra muse P20 kønsceller. Sonder er placeret på forskellige kromosomer, der dækker Hbb og HBA-gener og et histon klynge. Klik her for at se større figur .

Figur 4.. Eksempler på behandlede billeder og afledte positionelle data. A) skal behandles billeder til E13.5 mus fosterleverceller farvet med BAC sonder på forskellige kromosomer, der dækker Myc og KCNQ1 gener (betegnet myc og KvDMR, farvet grøn og rød, henholdsvis). B) Tukey box-knurhår plots repræsenterer interallelic distance fordeling for de samme loci i 600 kerner. Interallelic afstand er plottet som en brøkdel af kernen 'radius (afstand / radius) at tage højde for variationer i kernestørrelse. ES cellekerner har en radius på omkring 5 um. Røde prober er betydeligt tættere sammen end grønne prober (***: p <0,01, uparret t-test). Data fra ^10..

Movie 1. 3D-modellering af to loci inden deres kromosom territory. To BAC sonder tæt til enten slutningen af musekromosom 7 blev mærket (rød og langt rød, (pseudo-farvet hvid)) og hybridiseret sammen med et helt kromosom paint (grøn) til muse ES-celler. Klik her for at se filmen .

Discussion

3D DNA FISH er blevet en bredt anerkendt værktøj til at analysere rumlige arrangementer i kernen. Mens FISH giver visuelle og direkte resultater, som med hver teknik, er man nødt til at være opmærksom på sine begrænsninger. DNA FISK står den iboende problem, at relativt barske behandlinger er nødvendige for at gøre kromatin tilgængelige for fisk prober, som i sidste ende forstyrrer nukleare struktur-den meget ting, der skal analyseres. Adskillige strategier er blevet forfulgt at jonglere tilgængelighed og struktur konservering. I protokollen beskrevet her, er kromosomalt DNA gjort tilgængelig ved fryse-tø-permeabilisering af celler og varmedenaturering før probehybridisering. Solovei, et al. (2002) analyserede strukturelle ændringer efter lignende behandling og fandt, at den gennemsnitlige forskydning af kromatin domæner var 300 nm, hvilket begrænser løsningen af strukturelle analyse til ca 1 Mb regioner i genomet ^8.. Selvom dette ikke er høj opløsning, deter en rimelig skala til analyse nukleare position.

En mere praktisk overvejelse for FISH analyse er, at billedet køb og målinger af nukleare afstande er tidskrævende processer, som begrænser antallet af kerner, der kan analyseres. For at studere sjældne begivenheder, vi havde til formål at gøre high throughput automatiseret billeddannelse. Så med passende kontroller på plads, kan tilstrækkeligt antal sammenlignes for at muliggøre robust statistisk analyse af rumlige relationer. Vi rutinemæssigt analyserer 600 kerner per datapunkt, som vi bestemme 3D koordinater af alle fisk signaler inden den nukleare volumen. Disse data kræver meget lidt lagerplads og giver mulighed for analyse af inter-og intra-allel afstande eller radiale positioner på ethvert senere tidspunkt. Desuden kan automatiseret behandling gøres på en forsker blind måde som i høj grad reducerer sandsynligheden for ubevidste bias.

For at aktivere denne form for high throughput analyser vores mål var at etablere en hurtig og effektiv måde at udføre DNA FISH. Vi fandt protokollen beskrevet her for at være yderst robust, konsekvent producerer lyse signaler med lav baggrund. Det virkede for alle celletyper vi forsøgt forudsat vi tilpasset det trin fastgørelse af cellerne til diaset. Desuden med en enkelt undtagelse, kunne alle BAC'erne brugte vi blive forvandlet til lyse sonder. Vi har også med succes opdaget en række nukleare proteiner ved antistoffarvning efter DNA FISH. Mens for nogle proteiner Dette fungerer godt, anbefaler vi, sammenlignet med traditionel immunofluorescens (IF) for at sikre sammenhængen i antistoffarvning mønstret mellem IF og DNA immuno FISK (sammenligne ^11).

Generelt fandt vi, at prober mærket i forskellige farver producerede de samme resultater. Imidlertid bør følgende aspekter tages i betragtning, når du vælger mærkning farvestof. Først, farven af ​​fluoroforen skal være godt påviseligt ved mikroskop used. For det andet bør bølgelængden af ​​lys, der udsendes af de fluoroforer være tilstrækkeligt forskellige til at undgå bløder igennem ind i den anden kanal. Dette vil afhænge af filtrene i mikroskopet. Og tredje, i det mindste i vores hænder, producere nogle farver lyse signaler mere konsekvent end andre. Vi har altid brugt DAPI (blå) som en kontrastfarve, som gør Alexa Fluor 555 (rød), 488 (grøn) og 647 (langt rød) gode valg til mærkning sonder. Med vores billedbehandlingssystem, fandt vi Alexa Fluor 555 (rød) for at fremstille de lyseste signaler, efterfulgt af Alexa Fluor 488 (grøn). Alexa Fluor 647 (langt rød) har den ulempe, at det ikke kan detekteres af det menneskelige øje, og derfor ingen signaler kan ses, når man ser ned mikroskopet. Så hvis laver tofarvede FISH, anbefaler vi en kombination af røde og grønne farver.

To principielle problemer kan opstå: celler afvaskning dias og svage signaler. Hvor godt celler holde sig til slide er enormt variabel meleen celletyper, og den bedste protokol at afvikle / frø cellerne skal fastsættes. Vi har med succes anvendt enten positivt ladet eller poly-L-lysin-overtrukne objektglas (købt klar til brug), men fandt celler generelt klæbet bedre til poly-L-lysin-overtrukne objektglas. Vi fandt også, at når cellerne var for tætte hele områder ville skalle som et ark, mens automatiserede billeddannelse blev hæmmet, hvis celler var for sparsomme. Således, hvis prøven ikke er alt for kostbar, bør forskellige celle numre seedes til at bestemme den ideelle massefylde. Hvis cellerne er særligt tilbøjelige til at vaske, kan en hydrofob barriere pennen kun anvendes, og FISH trin kan udføres ved omhyggeligt at pipettere løsninger direkte på objektglasset. Pipetting også drastisk reducerer mængden af ​​nødvendige reagenser, men tager betydeligt længere tid, når du laver flere dias.

Svage signaler er normalt på grund af dårlige sonder, og det er værd at investere tid i at gøre gode. Ren BAC DNA bør anvended som udgangsmateriale, kan opnås ved gentagen udfældning eller kommercielt tilgængelige kits. Forurening med bakteriel genomisk DNA negativt påvirker sonde kvalitet og omhyggelig håndtering under cellelyse og filtrering af cellelysatet er forpligtet til at holde det på et minimum. Det er imidlertid ikke nødvendigt at anvende en exonuklease trin at fordøje lineært DNA, da dette reducerer udbyttet. Effektiv mærkning af sonden er afgørende. Den vigtigste kvalitetskontrol for dette trin er at kontrollere fragment størrelse, efter nick translation (se Repræsentative resultater). En 'god' smøre vil næsten altid resultere i en farvestrålende probe. Imidlertid har vi fundet, at der lejlighedsvis en vis BAC ikke kan forarbejdes til en god sonde, og en anden BAC skal vælges. Et andet vigtigt skridt er varmedenatureringen. Hvis temperaturen er for lav, vil DNA'et kun delvist denatureret og probehybridisering vil blive forringet. Hvis temperaturen er for høj, nuklear struktur will være foruroliget mere end nødvendigt. I vores hænder, er 78 ° C på en inverteret hot blok den ideelle kompromis, men kan variere afhængigt af den respektive varme anvendte blok.

Vi har haft gode resultater ved hjælp af Vectashield montering medium, men fandt, at SlowFade Gold har mindre baggrund og bevarer det fluorescerende signal i længere tid. Vi anbefaler ikke brug af hard-set montering medium, som vi fandt dette at påvirke 3D-struktur og danne luftbobler over tid.

Afslutningsvis tilbyde flotte fluorescerende direkte mærkede prober sammen med DNA-FISH protokollen beskrevet her en effektiv løsning for robust og hurtig analyse af nukleare arkitektur, som er anvendelig til en bred vifte af biologiske spørgsmål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
NTB buffer			Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
DTT	Invitrogen	D-1532	Step 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Aminoallyl-dUTP	Ambion	AM8439	Step 1.1.1
DNA Polymerase I	New England Biolabs	M02095	Step 1.1.1
DNase I recombinant RNase free	Roche	4716728001	Step 1.1.1
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Step 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Step 1.1.5, Step 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Step 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications	Invitrogen (Molecular Probes)	A32750, A32756, A32757	Step 1.2.2
DMSO (anhydrous)	Sigma Aldrich	276855	Step 1.2.2
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102	Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)
Single stranded DNA from salmon testes	Sigma	D7656	Step 2.1.1.1
Deionised formamide	Sigma	F-9037	Step 2.1.1.3 (Health hazard)
Dextran sulphate	Sigma Life Sciences	D8906	Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
XMP painting probes	MetaSystems	000000-0528-837	Step 2.1.1.4
Poly-L-lysine coated slides	Sigma Aldrich	P0425	Step 2.1.2
Hydrophobic pen (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Step 2.1.2
70 μm sieve (Mouse f–tal liver cells only)	BD Falcon	352350	Step 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Tris-Cl			Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Saponin from Quillaja bark	Sigma Aldrich	47036	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Triton X-100	Sigma	T9284	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650	Step 2.1.6
HCl	VWR	20252	Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)
Formamide	Sigma Aldrich	47670	Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)
SSC			Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Coverslips 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Step 2.1.15
Coverslips 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Step 2.1.15
Rubber cement	Marabu	2901 (10 000)	Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)
DAPI	Invitrogen Molecular Probes	D3571	Step 2.2.8 (Health hazard)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Step 2.2.10 (mounting medium)
Clear nail polish	Any supplier		Step 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimager	GE Life Sciences		Step 1.2.4
Coplin jars	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)	Step 2.1.3 onwards
Liquid nitrogen dewar	Any supplier		Step 2.1.7
Base with Black Lid (light-tight chamber)	Simport	M920-2	Step 2.1.17
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room)
Imaging and Image processing
Metafer - Imaging Automation Platform	MetaSystems		automated imaging software
MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis	MetaSystems		automated imaging software
Axio Imager Z2 upright	Zeiss		epifluorescence microscope used with automated imaging
IX81 confocal microscope (FV1000)	Olympus		confocal microscope
Bitplane, version 7.3	Imaris		image analysis and 3D modelling software
Scientific volume Imaging, version 4.1	Huygens		image analysis and deconvolution software
FISH buffers and reaction mixes Name Composition Comments 10 x NTB buffer 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 0.05 M MgCl2 0.5 mg/ml BSA dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μl aliquots at -20 °C 0.5 mM dATP 0.5 mM dCTP 0.125 mM dTTP 4 % PFA Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 °C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA. Store 50 ml aliquots at -20 °C, do not re-freeze 2 % saponin solution Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Store 5 ml aliquots at -20 °C 20 x SSC Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Dextran sulphate mix 20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight. Store 500 μl aliquots at -20 °C