Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Summary

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Abstract

FISH 3D DNA è diventato uno strumento importante per analizzare l'organizzazione tridimensionale del nucleo, e diverse variazioni della tecnica sono stati pubblicati. In questo articolo descriviamo un protocollo che è stato ottimizzato per la robustezza, la riproducibilità e la facilità d'uso. Vivaci fluorescenti sonde marcate direttamente sono generati da nick-translation con amino-allyldUTP seguita da accoppiamento chimica del colorante. FISH 3D DNA viene eseguita utilizzando una fase di congelamento-scongelamento per permeabilizzazione cellulare e una fase di riscaldamento per denaturazione simultanea di sonda e DNA nucleare. Il protocollo è applicabile ad una gamma di tipi di cellule e una varietà di sonde (BAC, plasmidi, fosmidi, o vernici Chromosome interi) e permette l'imaging automatizzato ad alta produttività. Con questo metodo abbiamo quotidianamente indaghiamo localizzazione nucleare di un massimo di tre regioni cromosomiche.

Introduction

DNA ibridazione in situ fluorescente (FISH DNA) permette la visualizzazione tridimensionale dei singoli loci genici, domini subchromosomal e anche interi cromosomi durante tutte le fasi del ciclo cellulare. FISH 2D viene utilizzato per studi metafase mentre FISH 3D è stato ampiamente utilizzato per sondare il rapporto tra l'organizzazione spaziale del genoma e la sua funzione durante l'interfase ^(1,2 e riferimenti ivi citati). Storicamente, gli studi di co-associazione sono stati eseguiti da indagando decine a centinaia di singoli loci dai pesci. Tecniche più recentemente potente high throughput 3C-based come 4C e Hi-C sono stati sviluppati ^3, permettendo l'indagine molecolare, cross-talk tra molte migliaia di differenti loci. Mentre le tecniche di 3C-based e FISH DNA possono essere metodi complementari, non necessariamente rispondere alle stesse domande. Metodi basati 3C forniscono una lettura insieme di popolazioni cellulari miste, con un conseguente probalità per la co-associazioni. Al contrario, mentre in basso rendimento, le tecniche base di pesce offrono la possibilità di analizzare le disposizioni spaziali di loci o cromosomi nelle cellule individuali in base alle loro diverse fasi del ciclo di sviluppo o cellulare. Quindi, FISH continuerà ad essere un importante strumento per sondare i rapporti struttura-funzione nucleari.

Ci sono due considerazioni importanti nello svolgimento di successo esperimenti di FISH 3D. Questi sono: 1. ottenendo sonde marcate in modo ottimale e 2. scelta di trattamenti cellulari, compresa la fissazione, pre e procedura post-ibridazione, per preservare morfologia nucleare il più possibile rendendo DNA sufficientemente accessibile per l'ibridazione della sonda. Etichettatura sonda efficiente è di fondamentale importanza per i pesci. Tradizionalmente, nick-translation è stato usato per introdurre o aptene o nucleotidi fluoroforo-coniugati ^4. Allo stesso modo, i kit commerciali nick-traduzione sono disponibili per aptene diretta o fluoroforo incorporazione, but anche per l'etichettatura in due fasi utilizzando nucleotidi aminoallyl e coloranti ammina-reattiva. Quest'ultimo rende incorporazione colorante più efficace dando polimerasi DNA una molecola meno ingombrante con cui lavorare. Più recentemente, kit per l'etichettatura non enzimatica di DNA sono stati sviluppati che sfruttano legame coordinativo di platino per acidi nucleici. Sonde FISH possono anche essere acquistati già etichettato ^5. Mentre i kit e le sonde prodotte commercialmente senza dubbio dare la facilità d'uso, sono notevolmente più costosi rispetto all'acquisto dei singoli componenti e la produzione di sonde in-house. Abbiamo ottimizzato un protocollo di traduzione nick a basso costo al fine di etichettare direttamente molte diverse sonde BAC in più colori. Abbiamo scoperto che l'ottenimento di DNA altamente puro BAC è critica e risultati in un requisito per solo il 10-20 ng di sonda per vetrino FISH, rispetto a 10-20 volte più quando viene utilizzato impuro DNA stampo, con conseguente maggiore costo e tempo- risparmio. L'uso di ammino-allyldUTP permette di etichettatura flessibilesonde con coloranti ammina-reattivi disponibili (ad esempio, Alexa Fluor o Cy-coloranti) o apteni (es. biotina, digossigenina). Aptene-sonde marcate vengono rilevati da anticorpi coniugati fluoroforo o streptavidina per amplificare e visualizzare il segnale. Luminoso sonde marcate direttamente mostrano generalmente meno la colorazione di fondo e di evitare sovra-amplificazione dei segnali, e quindi una conseguente rappresentazione più accurata della localizzazione nucleare e locus morfologia.

Ci sono diverse tecniche di pesci diversi che utilizzano diversi fissativi, pre-trattamenti e lavaggi post-ibridazione, ma questi generalmente rientrano nelle seguenti categorie: fissazione glutaraldeide con NaOH denaturazione, la fissazione di formaldeide con HCl denaturazione, e la fissazione di formaldeide con denaturazione al calore ^6-9 . Ognuno di questi ha vantaggi e svantaggi. Glutaraldeide risultati fissaggio in buona conservazione strutturale nucleare, ma richiede un trattamento con agenti riducenti per ridurre al minimol'autofluorescenza risultante, e il trattamento NaOH deve essere attentamente controllato per bilanciare sufficiente denaturazione del DNA e potenziali danni alla struttura nucleare ^6. Fissazione formaldeide è meno forte, dando una maggiore probabilità di perturbazioni di architettura nucleare, ma anche in genere dando segnali più forti e più affidabile e più bassi autofluorescenza ^9. HCl trattamento depurinates DNA e ne estrae le proteine, che fornisce un facile accesso al DNA per le sonde, ma può anche introdurre rotture del DNA. Riscaldamento separa fisicamente i due filamenti di DNA con conseguente buona ibridazione target e segnali forti, ma può causare qualche perturbazione della struttura nucleare ^8. Il grado in cui ciascuna di queste tecniche affetti epitopi proteici varia ampiamente ^6,9, con la conseguente esigenza di determinare sperimentalmente per ogni proteina il protocollo ottimale da utilizzare in esperimenti di immuno-FISH.

Mentre non vi è alcun 'perfetto' DNA FISH technique, tutti possono essere utili se ben controllata. Nostro obiettivo era ottimizzare un protocollo per robusto e riproducibile FISH DNA per indagare posizionamento spaziale dei loci multipli in una varietà di tipi cellulari ^10, concentrandosi sul metodo di riscaldamento per la maggior parte dei segnali affidabili. Con questo e l'uso di un sistema di imaging automatizzato abbiamo puntato ad aumentare il throughput per l'analisi di singole cellule di accordi nucleari.

Protocol

1. Generazione di sonde di DNA marcate direttamente da Nick traduzione

Nota: le sonde marcate direttamente realizzati dalla BAC (100-250 kb) realizzare regolarmente i segnali luminosi. Se sono necessarie sonde più piccole, utilizzare fosmidi (40-50 kb) o anche plasmidi contenenti inserti kb 5-10. Identificare BAC o fosmid cloni corrispondenti a geni specifici utilizzando Ensemble o browser genoma UCSC. Preparare BAC DNA di alta qualità da ripetute precipitazioni o utilizzare i kit disponibili in commercio. Il meno la preparazione è contaminato con DNA genomico batterico, meno sonda è necessaria per ogni diapositiva. Eseguire l'etichettatura in due fasi: traduzione nick introducendo aminoallyl-dUTP e accoppiamento chimica di un colorante ammina-reattiva.

1.1. Nick traduzione

Durante la traduzione nick, DNasi I è utilizzato per creare singole-filamento. DNA polimerasi I allunga 'estremità di questi' del 3 nick ", sostituendo i nucleotidi esistenti con quelli nuovi, t dichiara 'tradurre' il nick e fornendo così l'opportunità di incorporare nucleotidi marcati. Aminoallyl-dUTP viene scelta a causa della incorporazione efficiente dalla DNA polimerasi I e il suo potenziale per un successivo attacco chimico per coloranti reattivi-ammina o apteni. E 'fondamentale per ottenere il giusto equilibrio tra DNasi I intaccare e DNA polimerasi I di traduzione; troppo DNasi I comportino un'eccessiva digestione DNA dando a basso rendimento e dimensioni dei frammenti brevi, troppo poco non produrre abbastanza nick per la polimerasi per iniziare la traduzione, dando grande dimensione del frammento e la scarsa integrazione di aminoallyl-dUTP. Il seguente protocollo funziona bene, ma può essere necessario per titolare la DNAsi I lotti differenti o da diversi fabbricanti.

1. Impostare l'etichettatura reazione in ghiaccio e incubare per 2 ore a 16 ° C. Questo dovrebbe produrre 0,5-1 mg DNA nick-tradotto e può essere installato su. Diluire DNasi I 1:30 DNasi I tampone (cioè 0,3 U / mL).

1 "> Componente Concentrazione di magazzino Volume o importo BAC DNA 5-10 mcg NTB tampone 10x 5 microlitri DTT 0.1 M 5 microlitri dNTP mix 10x 5 microlitri Aminoallyl-dUTP 0,5 mM 6 pl DNA polimerasi I 10 U / ml 1 microlitri DNasi I 10 U / ml 1 ml (di una diluizione 1:30) H ₂ O a 50 microlitri

2. Esegui 1 microlitri su un gel di agarosio al 2% per controllare la dimensione dei frammenti marcati. Mentre si esegue il gel, tenere la reazione in ghiaccio. Successo nick translation si tradurrà in uno striscio con la maggior parte dei frammenti che corrono tra 150 bp e 700 bp con alcuni frammenti più grandi di ~ 1 kb (PUNTO CRITICO: vedi Rappresentante dei risultati). Se necessario, aggiungere un altro 1 ml di una fresca 1:30 DNasi I diluizione e incubare a 16 ° C per 15-30 min. Tempo di incubazione varierà secondo la quantità e la qualità di BAC DNA.
3. Inattivare DNasi I mediante riscaldamento a 75 ° C per 10 min.
4. Clean-up DNA ammina-modificato utilizzando un kit di purificazione PCR. Eluire in 100 ml H ₂ O.
5. Etanolo DNA precipitato per aggiunta di 10 microlitri NaOAc 3 M (pH 5.2) e 275 ml di etanolo. Lasciare a -20 ° C per almeno 1 ora o durante la notte. Girare alla massima velocità per 30 min a 4 ° C. Lavare pellet con 500 microlitri 70% di etanolo e lasciare asciugare all'aria. Questo passaggio rimuove tracce di ammine che interferiscono con la reazione di marcatura. Risospendere il pellet in 6 ml H ₂ O per 1x reazione iniziale.
6. Usare 1 microlitri per determinare la concentrazione del DNA ammina-modificatomediante spettroscopia UV microvolumi.

1.2. Accoppiamento del colorante fluorescente

Etichettatura fluorescenza della sonda è ottenuta mediante accoppiamento chimico del colorante. Alexa Fluor succinimidyl coloranti esteri reagiscono con le ammine di DNA amino-allyldUTP modificato per formare un legame covalente, producendo in tal modo sonde marcate direttamente. Alexa Fluor 488, 555, 647 e coloranti hanno avuto successo per questo processo.

1. Regolare 4 mg di DNA amino-allil modificato per un volume di 5 microlitri, riscaldare a 95 ° C per 5 min, scattare raffreddare su ghiaccio, e aggiungere 3 ml di 0,2 M _NaHCO3.
2. Sciogliere un'aliquota di colorante reattivo ammina in 2 microlitri DMSO anidro a temperatura ambiente. Aggiungere 8 ml DNA modificato con _NaHCO3, vortice, impulso di spin e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 ora.

Nota: I coloranti reattivi ammine possono essere usati per etichettare più di una sonda basata sul seguente schema. Dal momento oolo 10-20 ng di sonda viene utilizzata per l'etichettatura di diapositive, 1 mg dà abbastanza sonda per 50-100 diapositive. È anche possibile memorizzare DNA ammina-modificato per reazioni di marcatura future a -20 ° C.

Quantità di DNA	Volume di DNA	0,2 M NaHCO3	Volume di colorante	Totale	Abbastanza per
4 x 1 ug	1,25 ml ciascuno	0,75 ml ciascuno	0,5 microlitri ciascuno	2,5 microlitri (1/4)	50-100 diapositive ciascuno
3 x 1,35 mcg	1,67 ml ciascuno	1 microlitri ciascuno	0,67 ml ciascuno	3,34 microlitri (1/3)	65-130 diapositiva ogni
2 x 2 mg	2,5 microlitri ciascuno	1,5 ml ciascuna	1 microlitri ciascuno	5 microlitri (1/2)	100-200scivola ogni
1 x 4 microgrammi	5 microlitri	3 ml	2 microlitri	10 microlitri (completo)	200-400 diapositive

3. Aggiungere 90 ml di H ₂ O e purificare sonda marcata con un kit di purificazione PCR. Eluire in 100 microlitri 10 mMTris-Cl (pH 8,5).
4. Determinare la concentrazione della sonda e l'efficienza di etichettatura mediante spettroscopia gamma completa microvolumi (vedi figura 2) utilizzando le equazioni di Beer-Lambert (istruzioni riportate nella scheda tecnica che accompagna i Alexa Fluor coloranti reattivi o si possono trovare on-line). Sonde contenenti 3-6 coloranti per 100 bp funzionano bene. Sonde con bassi gradi di incorporazione possono dare segnali FISH deboli. In alternativa, eseguire 5 microlitri su un gel di agarosio al 2% del DNA senza macchia e controllare l'incorporazione del colorante fluorescente utilizzando una phosphoimager. Posta-macchia il gel con bromuro di etidio o alternative di colorazione del DNA e confrontare il DNA marcato a DNA totale.

Tramite le seguenti fasi, le cellule di interesse sono fissati alle diapositive e permeabilizzate. DNA cellulare e sonde marcate direttamente sono poi denaturati insieme su una piastra calda e ibridati durante la notte in una camera umidificata a tenuta di luce.

2.1. Giorno 1

1. Sonda Precipitazioni
   Nota: le sonde precipitato a un certo punto durante Day 1. Questo può essere comodamente eseguita in parallelo al trattamento delle cellule e non deve essere fatto all'inizio della giornata.
   1. Mescolare 10-20 ng sonda direttamente etichettato, 6 ml C ₀ t-1 DNA (6 mg), 1 ml DNA a singolo filamento da testicoli di salmone (9,7 mg) e regolare il volume a 100 ml con acqua.
   2. Aggiungere 10 ml 3 M NaOAc e 275 microlitri EtOH, e mescolare nel vortex. Precipitare per almeno 1 ora a -20 ° C.
   3. Spin in microcentrifuga alla massima velocità per 30 min a 4 ° C. Lavare pellet con EtOH 70% e far girare di nuovo. Secco pellete risospendere in 5 microlitri formammide deionizzata. Sospendere di nuovo per 30 minuti a 37 ° C sotto agitazione a 1000 giri al riparo dalla luce (posto sopra il foglio thermomixer).
   4. Aggiungere 5 ml di destrano solfato mix e agitare per altri 10 min a 37 ° C al riparo dalla luce nuovamente. Pipettare su e giù appena prima di dispensazione sul vetrino.
      Nota: Per la pittura cromosoma combinata con sonde BAC, interi cromosomi sonde di pittura che sono forniti in pronta all'uso mix di ibridazione sono una scelta conveniente. Risospendere il precipitato sonda BAC (con C ₀ t1 DNA e DNA a singolo filamento da testicoli di salmone) in 10 microlitri cromosoma vernice mescolare pipettando su e giù. Incubare a 37 ° C agitando a 300-500 rpm per 10 min. Utilizzare 10 ml di cromosoma vernice / BAC sonda mix per punto.
2. Collegamento celle di diapositive
   Nota: le cellule propensione ad aderire alle diapositive varia con il tipo di cellula. Per ciascun tipo di cellula, determinare ilottimale tempo di assestamento e di densità cellulare empiricamente. Per risultati coerenti, le celle devono essere in una sospensione di cellule singole.
   Per facilità d'uso cerchio l'area delle celle verrà avvistato su con una penna idrofobo, anche se per le cellule risospese in PBS questo non è strettamente necessario. Una barriera idrofoba impedisce la sospensione di diffondersi sul vetrino, continua fino a tre campioni per vetrino ben separati e consente l'impiego di molto piccoli volumi di soluzione di anticorpi in immuno-FISH. Inoltre, la zona chiazze può essere ridotto al minimo se il numero di cellule sono bassi.
3. Topo cellule epatiche fetali
   1. Raccogliere ogni E13.5 il mouse fegato fetale a circa 1,5 ml di PBS e risospendere pipettando su e giù. Spin in microcentrifuga a 3.000 rpm per 2 min. Ripetere lava tre volte. Al lavaggio ultimi, cellule filtrare attraverso un setaccio 70 micron. Risospendere le cellule da un fegato in 160 l di PBS e utilizzare 50 μ per ogni posto. Lasciare le cellule per 2 minuti a temperatura ambiente.
4. Mouse ES Cellule
   1. Cellule ES di topo non si attaccano facilmente alla diapositiva. In una diapositiva, cerchio l'area delle celle verrà avvistato su con una penna idrofobo. Preparare una sospensione di 20.000-50.000 cellule per 80-100 microlitri nel normale terreno di coltura, pipetta in circolo e partono da allegare per circa 3 ore in un incubatore umidificato. Nota: In alternativa, le cellule staminali possono essere coltivate su vetrini, ma poi formare colonie che potrebbero ostacolare l'imaging automatizzati.
5. Cellule fissate
   1. Alcuni esperimenti richiedono l'uso di cellule fisse che non si attaccano alle diapositive da soli. Filatura dolci a 300 rpm per 3 minuti usando una citocentrifuga conserva la struttura tridimensionale delle cellule e assicura che le cellule non cadono.

Tipo di cella	Sospensione in	Tempo di assestamento	Commento
Topofegato fetale	PBS	2 min	Sulla panchina
Topo ES	DMEM con gli integratori	4 ore	37 ° C in incubatore umidificato
Linfociti mouse	PBS	2 min	Sulla panchina
Topo P20 cellule germinali	Fissare in soluzione	Cytospin	Sulla panchina

3. Per fissare le cellule, delicatamente immergere diapositive nel 4% PFA (ATTENZIONE: eseguire in cappa) per 10 min. Fissare le cellule con la slitta piatta in un vassoio per la migliore conservazione di cellule (per esempio 50 ml 4% PFA nel coperchio di una scatola di punta). Nota: Questo passo non si applica alle cellule fisse prima di attaccamento alle diapositive.

Per tutte le fasi successive, utilizzare 50 ml o 100 ml vaschette Coplin. Fare attenzione a non raschiare le cellule off quando si spostano le diapositive tra vasi.

4. Quench in 0.1 M Tris-Cl, pH 7,4 per 10 minuti a RT.
5. Permeabilize cellule in 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 in PBS per 10 minuti a RT.
6. Lavare due volte in PBS per 5 min a RT.
7. Incubare per almeno 20 min a 20% glicerolo / PBS a RT. Nota: A questo punto, i vetrini possono essere memorizzati in 50% glicerolo / PBS a -20 ° C per almeno diverse settimane. E 'stato osservato che la memorizzazione per almeno un giorno si traduce in un aumento della forza del segnale ^9. Ricalibrare a temperatura ambiente 20% di glicerolo / PBS prima di procedere. Nota: Questo è un punto comodo per iniziare a precipitare le sonde (vedi 2.1.1).
8. 3x congelamento / scongelamento in azoto liquido. Immergere una diapositiva alla volta in azoto liquido utilizzando un piccolo dewar. Ritirare dopo pochi secondi e un caratteristico rumore di scoppio, e posto su un tovagliolo di carta per lo sbrinamento. Attendere opaco glicerolo congelato per scomparire poi congelare di nuovo. Fino a 15 diapositive può essere fatto comodamente a rotazione per tre cicli di congelamento / scongelamento.
9. Wcenere due volte in PBS per 5 min a RT.
10. Incubare in HCl 0,1 M per 30 minuti a RT.
11. Lavare in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
12. Permeabilize nel 0,5% saponin/0.5% X-100/PBS Triton per 30 min a RT.
13. Lavare due volte in PBS per 5 min a RT.
14. Equilibrare nel 50% formamide/2x SSC per almeno 10 minuti a temperatura ambiente.
15. Sonda Pipetta su un vetrino. Rimuovere diapositiva dal vaso e asciugare il liquido in eccesso intorno al punto cellulare (s) con un tovagliolo di carta. Come si asciuga rapidamente formammide, fare attenzione a non asciugare cellule. Per le diapositive con due o tre punti di cellule, applicare 10 ml di sonda per ogni posto su di un 22 millimetri x 50 mm coprioggetto corrispondente per individuare posizione nella diapositiva. Inverti coprioggetto sul vetrino sopra spot (s). Sigillare con mastice e permettere che questo si asciughi completamente. Proteggere dalla luce in tutte le fasi successive.
16. Diapositive di calore a 78 ° C per esattamente 2 minuti su una piastra calda (ad esempio un blocco di riscaldamento rovesciata, PUNTO CRITICO: vedi la discussione). Mettere un coperchio (scatola di cartone o sim Ilar) sopra il piatto caldo al riparo dalla luce durante la denaturazione.
17. Incubare per una notte a 37 ° C in una camera umidificata a tenuta di luce. Per umidificare, mettere gli asciugamani di carta in una scatola a tenuta di luce e di inumidire con acqua.

2.2 Giorno 2

1. Preparare vaschette Coplin con soluzioni alla giusta temperatura per le successive fasi di lavaggio. Proteggere i vetrini dalla luce il più possibile durante tutte le fasi successive. Un caffè può fa una buona copertura a tenuta di luce per vaschette Coplin.
2. Staccare mastice e luogo vetrino in SSC 2x fino coprioggetto allentare e sfilare.
3. Lavare a 50% formamide/2x SSC per 15 min a 45 ° C. Mettere il coperchio sulla bagnomaria per proteggerlo dalla luce.
4. Lavare a 0.2x SSC per 15 min a 63 ° C.
5. Lavare in SSC 2x per 5 min a 45 ° C.
6. Lavare in 2x SSC per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Lavare in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Colorare con DAPI (5 mg / ml in 2x SSC) per 2 minuti in una vaschetta Coplin a RT.

contenuto "> Nota: La soluzione DAPI può essere conservato a 4 ° C al buio per 2 mesi.

9. Destain in PBS per 5 min a RT.
10. Per montare il coprioggetti, pipetta mezzo di montaggio su un vetrino. Utilizza 10 microlitri per posto cella, da 22 mm x 22 mm coprioggetto per uno spot, e 22 mm x 50 coprioggetto mm per 2-3 punti. Asciugare PBS intorno al punto cella il più possibile, ma attenzione a non far seccare le cellule. Inverti coprioggetto sul vetrino, e sigillare con smalto.

Representative Results

Il protocollo qui descritto (Figura 1 per una panoramica), è stato utilizzato con grande effetto per combinare FISH DNA con l'acquisizione di immagini ad alta velocità per l'analisi di organizzazione genomica. La generazione di sonde di buona qualità è fondamentale per il successo (vedi discussione). Figura 2 mostra due importanti controlli di qualità per le sonde FISH. Dopo nick-translation, uno striscio di DNA dovrebbe essere visibile con la maggior parte dei frammenti in esecuzione tra i 150 e 700 bp (Figura 2A). Dopo accoppiamento chimico, incorporazione del colorante fluorescente può essere misurato mediante analisi spettroscopica della sonda (Figura 2B).

Quando si utilizza buone sonde, seguendo il protocollo FISH DNA di solito si traduce in segnali FISH DNA luminose a basso fondo. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo su una varietà di diversi tipi di cellule, e sia con microscopi a fluorescenza o confocale. L'imaging automatico utilizzando un epi-fluorescence microscopio richiede taglienti, segnali FISH facilmente identificabile con sfondo poco (Figura 3), mentre la microscopia confocale richiede segnali più intensi. Figura 4A mostra immagini elaborate rappresentative. Coordinate nucleari di segnali FISH possono essere ottenuti, e le relazioni spaziali di regioni genomiche possono essere calcolati (per un esempio vedere la Figura 4B). Abbiamo anche utilizzato stack di immagini ottenute al microscopio confocale per la modellazione 3D di segnali FISH nei loro territori cromosomici (Movie 1).

Figura 1. Flusso di lavoro per l'etichettatura e la sonda FISH DNA. Preparazione della sonda è in blu. Procedimento FISH DNA appare in bianco con dettagli forniti nel verde.

Figura 2. Etichettatura sonde da nick-traduzione e il controllo di qualità delle sonde marcate. A) Gel mostrando striscio ideale prima di riscaldamento per inattivare DNasi I (corsia 1: scala del DNA, corsia 2 e 3: BAC dopo nick-translation). Frammenti dovrebbero essere nel range 150-700 bp. Un ulteriore striscio a ~ 1 kb è frequentemente osservata con successo reazioni nick-traduzione. B) Microvolume analisi spettro completo di sonde marcate. Un picco di DNA a 260 nm si osserva con un secondo picco corrispondente alla lunghezza d'onda di assorbimento del fluoroforo della sonda è marcato con: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Visualizzati sono tre sonde con buona incorporazione: picchi di assorbimento fluorofori sono una altezza simile o superiore a quella dei picchi di DNA. Alexa Fluor 647 ha in genere maggiore assorbanzadi Alexa Fluor 555, che a sua volta ha assorbanza superiore Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 assorbe anche qualche luce a 260 nm, quindi il primo picco di tale sonda è superiore alle altre. Sonde con scarsa incorporazione spettacolo fluoroforo assorbanza 2-3 volte inferiore rispetto alla assorbanza DNA. Sonde con più di 2 volte superiore picco fluoroforo di DNA di picco in genere contengono colorante non coniugata che possono causare sfondo nel pesce.

Figura 3. Screenshot del software di imaging 3D FISH MetaCyte che mostra un tipico esperimento di FISH a tre colori. Lo schermo è diviso in più parti. A) campo di vista (FOV) immagini Raw catturata dal Metafer / sistema di scansione MetaCyte diapositiva. B) Galleria di immagini di nuclei identificati che hanno Onuelaborazione di immagini dergone e segmentazione per segnali FISH. Vari tipi di dati possono essere visualizzati su ogni immagine galleria. In questo esempio, il numero di cellulare viene visualizzato in alto a sinistra con varie interallelic e interlocus distanze alto a destra e su entrambi i lati sotto ogni immagine. C) nome della diapositiva con il numero di nuclei individuati nell'analisi. D) Rappresentazione della slitta con l'area acquisita dal sistema. E) Allargamento della zona sottoposta a scansione. Macchie bianche rappresentano nuclei individuati per FOV. F) I dati elaborati. In questo esempio vengono mostrati massime distanze interallelic tra i segnali verdi (in alto) e segnali rossi (in basso). I dati indicati sono da topo P20 cellule germinali. Le sonde si trovano su cromosomi diversi, che coprono Hbb e geni HBA e un cluster istoni. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Esempi di immagini elaborate e dati posizionali derivati. A Immagini) trattati per E13.5 topo cellule epatiche fetali marcate con sonde BAC situati su cromosomi diversi che coprono Myc e KCNQ1 geni (chiamati myc e KvDMR, di colore verde e rosso, rispettivamente). B) Tukey box-whisker che rappresentano la distanza interallelic distribuzione per gli stessi loci in 600 nuclei. Distanza Interallelic è tracciata come una frazione del raggio del nucleo '(distanza / raggio) per tenere conto di variazioni di dimensione nucleare. Nuclei delle cellule ES hanno un raggio di circa 5 micron. Raggi rossi sono significativamente inferiore a quello di sonde verdi (***: p <0.01, spaiati t-test). Dati da ^10.

Movie 1. Modellazione 3D di due loci nel loro cromosoma territory. Due sonde BAC situati vicino alle estremità di topo cromosoma 7 sono stati etichettati (rosso e rosso lontano, (bianco pseudo-colorato)) e ibridati con una vernice cromosoma intero (verde) di topo cellule ES. Clicca qui per vedere film .

Discussion

FISH 3D DNA è diventato uno strumento ampiamente riconosciuto per analizzare disposizioni spaziali nel nucleo. Mentre il pesce fornisce risultati visivi e diretti, come con ogni tecnica, bisogna essere consapevoli dei suoi limiti. FISH DNA affronta il problema intrinseco che i trattamenti relativamente dure sono necessarie per rendere cromatina accessibile per sonde FISH che alla fine interrompe nucleare struttura-la cosa che deve essere analizzato. Diverse strategie sono state perseguite a destreggiarsi tra accessibilità e la conservazione della struttura. Nel protocollo qui descritto, il DNA cromosomico viene resa accessibile dal congelamento-scongelamento permeabilizzazione delle cellule e denaturazione termica prima di ibridazione della sonda. Solovei, et al., (2002) ha analizzato cambiamenti strutturali dopo trattamento simile ed ha trovato che lo spostamento medio dei domini cromatinici era 300 nm che limita la risoluzione di analisi strutturale a circa 1 Mb regioni nel genoma ^8. Mentre questo non è alta risoluzione, essaè un ragionevole per analizzare la posizione nucleare.

Una considerazione più pratica per l'analisi FISH è che l'acquisizione dell'immagine e misure di distanze nucleari sono processi richiede tempo che limitano il numero di nuclei che può essere analizzato. Al fine di studiare eventi rari abbiamo cercato di fare imaging ad alta velocità automatizzato. Poi, con comandi idonei in atto, numero sufficiente possono essere confrontati per permettere l'analisi statistica robusta delle relazioni spaziali. Noi abitualmente Analizziamo 600 nuclei per ogni punto di dati per il quale si determinano le coordinate 3D di tutti i segnali FISH all'interno del volume nucleare. Questi dati richiedono poco spazio di archiviazione e consentono l'analisi di inter-e intra-allelica distanze o posizioni radiali in qualsiasi momento successivo. Inoltre, il trattamento automatizzato può essere fatto in modo cieco ricercatore che riduce notevolmente la probabilità di distorsione inconsapevole.

Per abilitare questo tipo di analys ad alto rendimentosi, il nostro obiettivo era quello di stabilire un modo veloce ed efficiente di eseguire FISH DNA. Abbiamo trovato il protocollo qui descritto per essere estremamente robusta, costantemente produrre segnali luminosi a basso fondo. Ha funzionato per tutti i tipi di cellule che abbiamo provato fornito abbiamo adattato la fase di fissare le cellule al vetrino. Inoltre, con una sola eccezione, tutti i BAC abbiamo utilizzato potrebbero essere trasformate in sonde luminose. Abbiamo anche rilevato con successo un certo numero di proteine ​​nucleari mediante colorazione anticorpale dopo FISH DNA. Mentre per alcune proteine ​​questo funziona bene, si consiglia di confronto con immunofluorescenza tradizionale (IF) per garantire la coerenza del pattern di colorazione anticorpale tra IF e DNA immuno FISH (cfr. ^11).

Generalmente, abbiamo trovato che sonde marcate in diversi colori producevano gli stessi risultati. Tuttavia, i seguenti aspetti devono essere considerati quando si sceglie il colorante etichettatura. Prima, il colore del fluoroforo deve essere ben rilevabile con il microscopio uSED. In secondo luogo, la lunghezza d'onda della luce emessa dai fluorofori dovrebbe essere sufficientemente diverso per evitare sanguinare attraverso nell'altro canale. Questo dipenderà filtri nel microscopio. E terzo, almeno nelle nostre mani, alcuni colori producono segnali luminosi più coerente di altri. Abbiamo sempre usato DAPI (blu) come di contrasto che rende Alexa Fluor 555 (rosso), 488 (verde), e 647 (rosso lontano) buone scelte per l'etichettatura di sonde. Con il nostro sistema di imaging, abbiamo trovato Alexa Fluor 555 (rosso) per produrre i segnali luminosi, seguiti da Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (rosso lontano) ha lo svantaggio che non può essere rilevata dall'occhio umano e quindi non segnali può essere visto quando guardando il microscopio. Così, se facendo FISH a due colori, si consiglia la combinazione di coloranti rossi e verdi.

Possono sorgere due problemi principali: le cellule lavare via le diapositive e segnali deboli. Come le cellule e aderire alla diapositiva è betw estremamente variabiletipi di cellule een, e il miglior protocollo per risolvere / seme le cellule devono essere determinati. Abbiamo utilizzato con successo sia con carica positiva o vetrini rivestiti di poli-L-lisina (acquistati pronti per l'uso), ma abbiamo trovato le cellule generalmente rispettati meglio vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Abbiamo anche scoperto che quando le cellule erano intere zone troppo dense avrebbe tolto come un foglio, mentre l'imaging automatizzato è stato ostacolato se le cellule erano troppo scarsi. Così, se il campione non è troppo preziosa, numeri cellulari differenti dovrebbero essere seminate per determinare la densità ideale. Se le cellule sono particolarmente inclini a lavare, una penna barriera idrofobica può essere utilizzato, e passi FISH può essere eseguita con una pipetta con attenzione le soluzioni direttamente sul vetrino. Pipettaggio inoltre riduce drasticamente i volumi dei reagenti necessari, ma richiede molto più tempo quando si fa più diapositive.

I segnali deboli sono di solito a causa di sonde poveri, e vale la pena di investire tempo nel fare buoni. Clean BAC DNA deve essere un usod come materiale che può essere ottenuto mediante ripetute precipitazione o kit disponibili in commercio partenza. Contaminazione con DNA genomico batterico influisce negativamente sulla qualità sonda e accurato trattamento durante la lisi cellulare e filtraggio del lisato cellulare è necessaria per mantenerlo al minimo. E ', tuttavia, non è necessario utilizzare un passo esonucleasi per digerire il DNA lineare, in quanto ciò riduce notevolmente rendimento. Etichettatura efficiente della sonda è di fondamentale importanza. Il controllo di qualità più importante per questo passaggio sta controllando la dimensione del frammento dopo la traduzione nick (vedi Rappresentante dei risultati). Un 'buon' striscio quasi sempre si tradurrebbe in un brillantemente sonda colorata. Tuttavia, abbiamo trovato che occasionalmente un certo BAC non può essere trasformato in una buona sonda, e una diversa BAC deve essere scelto. Un altro passo importante è la denaturazione al calore. Se la temperatura è troppo bassa, il DNA sarà solo parzialmente denaturate e ibridazione sonda sarà compromessa. Se la temperatura è troppo elevata, la struttura nucleare will essere turbato più del necessario. Nelle nostre mani, 78 ° C su blocco calda invertito è il compromesso ideale, ma questo può variare a seconda del rispettivo blocco calda utilizzata.

Abbiamo avuto buoni risultati utilizzando montaggio Vectashield medie, ma ha scoperto che SlowFade Oro ha meno di fondo e mantiene il segnale fluorescente a lungo. Si sconsiglia l'utilizzo di hard-set di mezzo di montaggio, come abbiamo trovato che questo influisce struttura 3D e di formare bolle d'aria nel corso del tempo.

In conclusione, brillantemente fluorescenti sonde marcate direttamente insieme al protocollo FISH DNA qui descritti offrono una soluzione efficiente per l'analisi robusta e rapida dell'architettura nucleare che è applicabile ad un'ampia varietà di questioni biologiche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
NTB buffer			Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
DTT	Invitrogen	D-1532	Step 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Aminoallyl-dUTP	Ambion	AM8439	Step 1.1.1
DNA Polymerase I	New England Biolabs	M02095	Step 1.1.1
DNase I recombinant RNase free	Roche	4716728001	Step 1.1.1
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Step 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Step 1.1.5, Step 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Step 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications	Invitrogen (Molecular Probes)	A32750, A32756, A32757	Step 1.2.2
DMSO (anhydrous)	Sigma Aldrich	276855	Step 1.2.2
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102	Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)
Single stranded DNA from salmon testes	Sigma	D7656	Step 2.1.1.1
Deionised formamide	Sigma	F-9037	Step 2.1.1.3 (Health hazard)
Dextran sulphate	Sigma Life Sciences	D8906	Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
XMP painting probes	MetaSystems	000000-0528-837	Step 2.1.1.4
Poly-L-lysine coated slides	Sigma Aldrich	P0425	Step 2.1.2
Hydrophobic pen (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Step 2.1.2
70 μm sieve (Mouse f–tal liver cells only)	BD Falcon	352350	Step 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Tris-Cl			Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Saponin from Quillaja bark	Sigma Aldrich	47036	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Triton X-100	Sigma	T9284	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650	Step 2.1.6
HCl	VWR	20252	Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)
Formamide	Sigma Aldrich	47670	Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)
SSC			Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Coverslips 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Step 2.1.15
Coverslips 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Step 2.1.15
Rubber cement	Marabu	2901 (10 000)	Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)
DAPI	Invitrogen Molecular Probes	D3571	Step 2.2.8 (Health hazard)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Step 2.2.10 (mounting medium)
Clear nail polish	Any supplier		Step 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimager	GE Life Sciences		Step 1.2.4
Coplin jars	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)	Step 2.1.3 onwards
Liquid nitrogen dewar	Any supplier		Step 2.1.7
Base with Black Lid (light-tight chamber)	Simport	M920-2	Step 2.1.17
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room)
Imaging and Image processing
Metafer - Imaging Automation Platform	MetaSystems		automated imaging software
MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis	MetaSystems		automated imaging software
Axio Imager Z2 upright	Zeiss		epifluorescence microscope used with automated imaging
IX81 confocal microscope (FV1000)	Olympus		confocal microscope
Bitplane, version 7.3	Imaris		image analysis and 3D modelling software
Scientific volume Imaging, version 4.1	Huygens		image analysis and deconvolution software
FISH buffers and reaction mixes Name Composition Comments 10 x NTB buffer 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 0.05 M MgCl2 0.5 mg/ml BSA dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μl aliquots at -20 °C 0.5 mM dATP 0.5 mM dCTP 0.125 mM dTTP 4 % PFA Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 °C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA. Store 50 ml aliquots at -20 °C, do not re-freeze 2 % saponin solution Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Store 5 ml aliquots at -20 °C 20 x SSC Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Dextran sulphate mix 20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight. Store 500 μl aliquots at -20 °C