Robust 3D DNA FISH Bruke Direkte merkede prober

Summary

Vi beskriver en robust og allsidig protokoll for å analysere kjernefysisk arkitektur ved 3D DNA FISH hjelp direkte merket fluorescerende prober.

Abstract

3D DNA FISH har blitt et viktig verktøy for å analysere tredimensjonale organiseringen av kjernen, og flere varianter av teknikken har blitt publisert. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll som er optimalisert for robusthet, reproduserbarhet, og brukervennlighet. Lyst fluorescerende direkte merkede prober er generert ved nick-translasjon med amino-allyldUTP etterfulgt av kjemisk kopling av fargestoffet. 3D DNA fisken er utført ved hjelp av en fryse-tine trinnet for celle permeabilization og et oppvarmingstrinn for samtidig denaturering av proben og nukleært DNA. Protokollen er aktuelt for en rekke celletyper og en rekke sonder (BACS, plasmider, fosmids, eller hele kromosomer Maling) og gir mulighet for høy gjennomstrømming automatisert bildebehandling. Med denne metoden rutinemessig vi undersøke kjernefysiske lokalisering av inntil tre kromosomale regioner.

Introduction

DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH-DNA) gir den tredimensjonale visualisering av individuelle genloci, subchromosomal domener og til og med hele kromosomer under alle faser av cellesyklusen. 2D FISH brukes for metafase studier mens 3D fisk har vært mye brukt for å undersøke forholdet mellom den romlige organiseringen av genomet og dens funksjon under interfase ^(1,2 og referanser deri). Historisk ble co-foreningen studier utført ved å undersøke titalls til hundrevis av individuelle loci ved FISH. Mer nylig kraftig høy gjennomstrømning 3C-baserte teknikker som 4C og Hi-C har blitt utviklet ^tre, slik at etterforskningen av molekylære krysstale mellom mange tusen forskjellige loci. Mens 3C-baserte teknikker og DNA fisk kan være komplementære metoder, har de ikke nødvendigvis svare på de samme spørsmålene. 3C baserte metoder gir et ensemble avlesning av blandede celle populasjoner, noe som resulterer i en probabiltet for co-foreninger. I kontrast, mens lav i gjennomstrømning, FISH teknikker gir mulighet til å analysere romlige arrangementer av loci eller kromosomer i individuelle celler i henhold til deres utviklings-eller celle syklus etapper. Derfor vil FISH fortsette å være et viktig verktøy for sondering kjernefysiske struktur-funksjon relasjoner.

Det er to viktige hensyn i å utføre vellykkede 3D fisk eksperimenter. Disse er; en. skaffe optimalt merkede prober og to. Valget av mobilnettet behandlinger, inkludert fiksering, pre-og post-hybridisering trinn, for å bevare kjernefysisk morfologi så mye som mulig, samtidig som DNA tilstrekkelig tilgjengelig for sondehybridisering. Effektiv probe merking er kritisk viktig for FISH. Tradisjonelt har nick-oversettelse blitt brukt for å innføre enten hapten eller fluorofor-konjugerte nukleotider ^4.. Tilsvarende kommersielle nick-oversettelse Pakkene er tilgjengelig for direkte hapten eller fluorophore innlemmelse, but også for to-trinns merking ved hjelp aminoallyl nukleotider og amin-reaktive fargestoffer. Sistnevnte gjør dye innlemmelse mer effektiv ved å gi DNA polymerase en mindre klumpete molekyl å jobbe med. Mer nylig har sett for ikke-enzymatisk merking av DNA blitt utviklet som utnytter koordinerende binding av platina til nukleinsyrer. FISH prober kan også kjøpes allerede merket ^fem. Mens kits og kommersielt produsert sonder uten tvil gi brukervennlighet, de er betydelig dyrere enn å kjøpe de enkelte komponentene og produsere sonder i huset. Vi optimalisert en lav kostnad nick-translasjon-protokoll for å direkte merke mange forskjellige BAC prober i flere farger. Vi har oppdaget at å skaffe et høyrent BAC DNA er kritisk og resulterer i et krav om bare 10-20 ng probe pr fisk lysbilde, sammenlignet med 10 - 20 ganger mer når uren mal-DNA blir brukt, noe som resulterer i betydelige kostnads-og arbeidskrevende besparelser. Bruken av amino-allyldUTP tillater merking av fleksibelprober med tilgjengelige amin-reaktive fargestoffer (f.eks Alexa Fluor eller Cy-fargestoffer) eller haptener (f.eks biotin, Digoxigenin). Hapten-merkede prober blir detektert av fluorofor-konjugerte antistoffer eller streptavidin for å forsterke og visualisere signalet. Bright direkte merkede prober viser generelt mindre bakgrunn flekker og unngå over-forsterkning av signaler, dermed resulterer i en mer nøyaktig gjengivelse av kjernefysiske lokalisering og locus morfologi.

Det finnes flere forskjellige FISH teknikker som bruker ulike bindemiddel, pre-behandlinger, og post-hybridisering vasker men disse vanligvis faller inn i følgende kategorier: glutaraldehyd fiksering med NaOH denaturering, formaldehyd fiksering med HCl denaturering, og formaldehyd fiksering med varme denaturering ^6-9 . Hver av disse har fordeler og ulemper. Glutaraldehyd fiksering resulterer i god kjernefysisk strukturelle bevaring, men krever behandling med reduksjonsmidler å minimereden resulterende autofluorescence, og NaOH behandling må kontrolleres nøye for å balansere tilstrekkelig DNA denaturering og potensiell skade på kjernefysisk struktur ^6. Formaldehyd fiksering er mindre sterk, noe som gir en økt sannsynlighet for forstyrrelsene av kjernefysisk arkitekturen, men også vanligvis gi sterkere og mer pålitelig signaler og lavere autofluorescens ^9.. HCl behandling depurinates DNA og strimler ut proteiner, noe som gir god tilgang til DNA for sondene, men kan også innføre DNA pauser. Oppvarming skiller fysisk de to DNA-trådene som resulterer i god target hybridisering og sterke signaler, men kan føre til at noen forstyrrelse av kjernefysiske struktur ^åtte. Den grad til hvilken hver av disse teknikkene påvirker protein epitoper varierer sterkt ^6,9, som resulterer i behovet for å bestemme eksperimentelt for hvert protein optimal protokollen som skal brukes i immuno-Fish eksperimenter.

Mens det ikke er "perfekt" DNA FISH technique, kan de alle være nyttig hvis godt kontrollert. Vårt mål var å optimalisere en protokoll for robust og reproduserbar DNA FISH for å undersøke romlige posisjonering av flere loci i en rekke celletyper ^10, med fokus på oppvarming metode for de fleste pålitelige signaler. Med dette og anvendelse av et automatisert avbildningssystem rettet vi på å øke gjennomstrømningen for enkelt-celle analyse av kjernefysiske ordninger.

Protocol

En. Genererer Direkte merket DNA prober av Nick Oversettelse

Merk: Direkte merkede prober laget av BACS (100-250 kb) konsekvent produsere lyse signaler. Hvis mindre sonder er nødvendig, bruke fosmids (40-50 kb) eller plasmider som inneholder 5-10 kb inserts. Identifiser BAC eller fosmid kloner tilsvarende spesifikke gener ved hjelp Ensemble eller UCSC genom nettlesere. Forbered høy kvalitet BAC DNA ved gjentatt nedbør eller bruke kommersielt tilgjengelige kits. Jo mindre preparatet er forurenset med bakterielle genom-DNA, er den mindre sonde som er nødvendig per lysbilde. Utføre merking i to trinn: nick oversettelse innføre aminoallyl-dUTP og kjemiske kobling av et amin-reaktive fargestoff.

1.1. Nick-translasjon

Under nick oversettelse, er DNase Jeg pleide å opprette én tråd pauser. DNA Polymerase jeg elongates 3 'endene av disse "nick", erstatte eksisterende nukleotider med nye, t herved 'oversette' nick og dermed gi muligheten til å innlemme merket nukleotider. Aminoallyl-dUTP er valgt på grunn av effektiv inkorporering av DNA Polymerase jeg og dets potensial for senere kjemisk kopling til amin-reaktive fargestoffer eller haptener. Det er avgjørende for å oppnå den rette balansen mellom DNase I sammenpressing og DNA polymerase I oversettelse, for mye DNase jeg vil resultere i overdreven DNA fordøyelsen og gir lav avkastning og korte fragment størrelsene, for lite vil ikke produsere nok kutt for polymerase å initiere oversettelse, gi store fragment størrelse og dårlig inkorporering av aminoallyl-dUTP. Følgende protokoll fungerer godt, men det kan være nødvendig for å titrere DNase I fra forskjellige batcher eller ulike produsenter.

1. Sett opp merking reaksjon på is og inkuberes i 2 timer ved 16 ° C. Dette bør produsere 0,5-1 mg nick-oversatt DNA og kan skaleres opp. Fortynn 1:30 i DNase I DNase I-buffer (dvs. 0.3 U / ul).

1 "> Komponent Konsentrasjon på lager Volum eller beløp BAC DNA 5-10 mikrogram NTB buffer 10x 5 ul DTT 0,1 M 5 ul dNTP mix 10x 5 ul Aminoallyl-dUTP 0,5 mM 6 ul DNA-polymerase I 10 U / mL 1 ul DNase I 10 U / mL En ul (av en 1:30 fortynning) H ₂ O til 50 pl

2. Løpe 1 ul på en 2% agarosegel for å kontrollere størrelsen av de merkede fragmenter. Mens du kjører gel, holde reaksjonen på is. Vellykket nick translatipå vil resultere i en smøre med mesteparten av fragmentene som kjører mellom 150 bp og 700 bp med noen større fragmenter på ~ 1 kb (KRITISK STEP: se Representative resultater). Legg eventuelt til en annen en ul av en fersk 01:30 DNase I fortynning og Inkuber ved 16 ° C i 15-30 min. Inkubasjonstid vil variere i henhold til mengden og kvaliteten av BAC-DNA.
3. Inaktivere DNase I ved oppvarming til 75 ° C i 10 min.
4. Clean-up amin-modifisert DNA ved hjelp av PCR rensing kit. Eluer i 100 mL H ₂ O.
5. Etanol utfelte DNA ved tilsetning av 10 ul 3 M NaOAc (pH 5,2) og 275 mL etanol. La ved -20 ° C i minst 1 time eller over natten. Spinn med maksimal hastighet i 30 min ved 4 ° C. Vask pellet med 500 mL 70% etanol og la det lufttørke. Dette trinnet fjerner spor av aminer som vil forstyrre merkingen reaksjonen. Resuspender pellet i 6 mL H ₂ O per 1x første reaksjon.
6. Bruk 1 ul for å bestemme konsentrasjonen av den amin-modifiserte DNAav microvolume UV-spektroskopi.

1.2. Kobling av det fluorescerende fargestoff

Fluorescerende merking av proben er oppnådd ved kjemisk kopling av fargestoffet. Alexa Fluor succinimidyl-ester fargestoffer reagere med aminer med amino-allyldUTP modifiserte DNA for å danne en kovalent binding, for derved å produsere direkte merkede prober. Alexa 488 Fluor, 555, og 647 fargestoffer har vært vellykket for denne prosessen.

1. Juster 4 ug av amino-allyl modifisert DNA i et volum på 5 ul, varme til 95 ° C i 5 min, smekk kul på is og tilsett 3 mL av 0,2 M _NaHCO3.
2. Oppløs én tilsetning av amin-reaktive fargestoff i 2 mL vannfri DMSO ved romtemperatur. Tilsett 8 mL modifisert DNA med ₃ NaHCO, vortex, puls sentrifugering og inkuberes ved romtemperatur i mørke i 1 time.

Bemerk: aminet reaktive fargestoffer kan brukes til å merke mer enn en probe basert på det følgende skjema. Siden oare 10-20 ng av probe brukes per lysbilde merking, gir 1 mikrogram nok probe for 50-100 lysbilder. Det er også mulig å lagre amin-modifiserte DNA for fremtidige merking reaksjoner ved -20 ° C.

DNA beløp	DNA volum	0,2 M NaHCO3	Volum av fargestoff	Total	Nok for
4 x 1 mikrogram	1.25 ul hver	0.75 ul hver	0.5 ul hver	2,5 pl (1/4)	50-100 lysbilder hver
3 x 1,35 mikrogram	1,67 ul hver	1 ul hvert	0,67 ul hver	3,34 mL (1/3)	65-130 lysbilde hver
2 x 2 mikrogram	2,5 pl hvert	1.5 ul hver	1 ul hvert	5 ul (1/2)	100-200glir hver
1 x 4 mikrogram	5 ul	3 ul	2 ul	10 mL (full)	200-400 lysbilder

3. Legg 90 mL H ₂ O og rense merket probe ved hjelp av PCR rensing kit. Eluer i 100 mL 10 mMTris-Cl (pH 8,5).
4. Bestem probe konsentrasjon og merking effektivitet ved microvolume hele spekteret spektroskopi (se figur 2) ved hjelp av Beer-Lambert ligningene (Instruksjoner er gitt i databladet som følger med Alexa Fluor reaktive fargestoffer eller kan bli funnet på nettet). Prober som inneholder 3-6 fargestoffer per 100 bp fungere godt. Prober med lavere grad av inkorporering kan gi svake FISK signaler. Alternativt kan løpe 5 pl på en 2% agarosegel uten DNA farge og sjekke inkorporering av det fluorescerende fargestoff ved hjelp av en phosphoimager. Post-beis gel med etidiumbromid eller DNA flekker alternativer og sammenligne merket DNA til total DNA.

Via disse trinnene, er celler av interesse festet til lysbilder og permeabilized. Cellulær DNA og direkte merkede prober blir deretter denatureres sammen på en kokeplate og hybridisert natten over i en lys-tett fuktet kammer.

2.1. Dag 1

1. Probe Nedbør
   Merk: Bunnfallet sonder på et tidspunkt i løpet av dag 1. Dette kan godt utføres i parallell til behandling av cellene, og behøver ikke å bli utført på begynnelsen av dagen.
   1. Bland 10-20 ng direkte merket probe, 6 ul C ₀ t-1 DNA (6 ug), 1 ul enkelttrådet DNA fra laks testikler (9,7 pg) og justere volumet til 100 pl med vann.
   2. Tilsett 10 mL 3 M NaOAc og 275 ul EtOH, og bland ved å virvle. Bunnfallet i minst 1 time ved -20 ° C.
   3. Sentrifugering i mikrosentrifuge ved maksimal hastighet i 30 min ved 4 ° C. Vask pellet med 70% EtOH og spinne igjen. Tørr pelletog resuspender i 5 mL avionisert formamid. Resuspender i 30 min ved 37 ° C under rysting ved 1000 rpm beskyttet mot lys (sted folie over Thermomixer).
   4. Tilsett 5 ul av dekstransulfat og ryste blandingen i ytterligere 10 min ved 37 ° C igjen beskyttet mot lys. Pipette opp og ned like før pipettering på dekkglass.
      Merk: For kromosom maleri kombinert med BAC prober, hele kromosom maleri prober som leveres i klar-til-bruk hybridisering mix er et praktisk alternativ. Gjensuspender utfelt BAC probe (med ₀ C t1 DNA og enkelttrådet DNA fra laks testiklene) i 10 ul kromosom maling mix med pipettering opp og ned. Inkuber ved 37 ° C under rysting ved 300 til 500 rpm i 10 min. Bruk 10 mL av kromosom maling / BAC probe mix per spot.
2. Feste Cells til lysbilder
   Merk: celler tilbøyelighet til å følge lysbilder sterkt varierer med celletype. For hver celletype, bestemmeoptimal settling tid og celletetthet empirisk. For konsistente resultater, bør cellene være i en enkel cellesuspensjon.
   For brukervennlighet sirkel området cellene vil bli oppdaget på med en hydrofob penn, selv for celler resuspendert i PBS dette er ikke strengt nødvendig. En hydrofob barriere hindrer suspensjon fra å spre seg på lysbildet, holder opptil tre prøver per objektglass pent separert og tillater anvendelse av meget små volumer av antistoff-løsning i immuno-fisk. Dessuten kan spotting område holdes på et minimum hvis celle tall er lave.
3. Mus føtale leverceller
   1. Samle hver E13.5 mus fosterets lever i ca 1,5 ml PBS og resuspender ved pipettering opp og ned. Sentrifugering i mikrosentrifuge ved 3000 rpm i 2 min. Gjenta vasker tre ganger. På de siste vask, stamme cellene gjennom en 70 mikrometer sil. Resuspender celler fra ett leveren i 160 mL PBS og bruke 50 μ per spot. La celler til å avgjøre i 2 min ved romtemperatur.
4. MOuse ES-celler
   En. Mus ES-celler vil ikke holde seg lett til lysbildet. På et lysbilde, sirkel området cellene vil bli oppdaget på med en hydrofob penn. Utarbeide en suspensjon av 20,000-50,000 celler per 80-100 ul i normal kultur medium, pipette i sirkel og la til fest for ca 3 timer i en fuktet inkubator. Merk: Alternativt kan ES-celler dyrkes på lysbilder, men vil så danne kolonier som kan hemme automatisert bildebehandling.
5. Faste Cells
   En. Noen eksperimenter krever bruk av faste celler som ikke fester seg til lysbilder av seg selv. Milde sentrifugering ved 300 rpm i 3 min ved hjelp av en cytosentrifuge bevarer den tredimensjonale strukturen av cellene og sikrer at cellene ikke faller av.

Celletype	Suspensjon i	Bosetting tid	Kommentar
Musfetal leveren	PBS	2 min	På benk
Mus ES	DMEM med kosttilskudd	4 timer	37 ° C i fuktet inkubator
Mus lymfocytter	PBS	2 min	På benk
Mus P20 kjønnsceller	Fix i løsning	Cytospin	På benk

3. For å fikse celler, forsiktig senk lysbilde i 4% PFA (FORSIKTIG: utføre i avtrekksskap) i 10 min. Fix celler med raset flatt i en skuff for beste oppbevaring av celler (f.eks 50 ml 4% PFA i lokket på et tips boks). Merk: Dette trinnet gjelder ikke celler løst før vedlegg til lysbilder.

For alle etterfølgende trinn, bruke 50 ml eller 100 ml Coplin krukker. Pass på å ikke skrape celler av når den kjører lysbilder mellom glassene.

4. Quench i 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 i 10 min ved RT.
5. Permeabilize celler i 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 i PBS i 10 min ved RT.
6. Vask to ganger i PBS i 5 min ved RT.
7. Inkuber i minst 20 minutter i 20% glyserol / PBS ved RT. Merk: På dette punktet, kan slides lagres i 50% glyserol / PBS ved -20 ° C i minst flere uker. Det har blitt observert at etter lagring i minst en dag resulterer i en økning i signalstyrke ^9.. Omkalibrer i romtemperatur 20% glyserol / PBS før du fortsetter. Merk: Dette er et praktisk utgangspunkt for å starte utløsende sondene (se 2.1.1).
8. 3x fryse / tining i flytende nitrogen. Senk ett lysbilde om gangen i flytende nitrogen ved hjelp av en liten dewar. Trekke seg etter noen få sekunder og en karakteristisk hvesing og legg på papir håndkle for å tine. Vent til ugjennomsiktig frossen glyserol å forsvinne deretter fryse igjen. Opptil 15 slides kan gjøres komfortabelt i rotasjon for tre fryse / tine sykluser.
9. Waske to ganger i PBS i 5 min ved RT.
10. Inkuber i 0,1 M HCl i 30 minutter ved RT.
11. Vask i PBS i 5 min ved RT.
12. Permeabilize i 0,5% saponin/0.5% Triton X-100/PBS i 30 min ved RT.
13. Vask to ganger i PBS i 5 min ved RT.
14. Ekvilibrere i 50% formamide/2x SSC i minst 10 min ved RT.
15. Pipette sonde på et dekkglass. Fjern lysbilde fra glasset og tørk av overflødig væske rundt cellen spot (s) med et papirhåndkle. Som formamid tørker fort, tar seg ikke å tørke ut celler. For lysbilder med to eller tre celle flekker, gjelder 10 ul av probe per flekk på en 22 mm x 50 mm dekkglass tilsvarende øye plassering på lysbildet. Inverter dekkglass på gli over spot (s). Tett med gummi sement og la dette tørke helt. Beskyttes mot lys i alle påfølgende stadier.
16. Heat lysbilder til 78 ° C for nøyaktig 2 min på en varm plate (f.eks en invertert oppvarming blokk, KRITISK STEP: se diskusjon). Plasser en cover (pappeske eller sim vis lik) over den varme platen for å beskytte mot lys ved denaturering.
17. Inkuber over natten ved 37 ° C i en lystett fuktet kammer. Å fukte, plasserer papirhåndklær i en lystett boks og dempe med vann.

2.2 Dag 2

1. Forbered Coplin krukker med løsninger til riktig temperatur for etterfølgende vask trinn. Beskytt lysbilder fra lys så mye som mulig under alle påfølgende trinn. En kaffe kan gjør en god lystett dekke for Coplin krukker.
2. Trekk av gummi sement og sted raset i 2x SSC til Dekkglass løsne og gli av.
3. Vask i 50% formamide/2x SSC i 15 min ved 45 ° C. Plasser lokket på vannbad for å beskytte mot lys.
4. Vask i 0,2 x SSC i 15 min ved 63 ° C.
5. Vask i 2x SSC i 5 min ved 45 ° C.
6. Vask i 2x SSC i 5 min ved RT.
7. Vask i PBS i 5 min ved RT.
8. Flekk med DAPI (5 ug / ml i 2 x SSC) i 2 min i en Coplin krukke ved RT.

innhold "> Merk: DAPI-løsning kan lagres ved 4 ° C i mørke i 2 måneder.

9. Destain i PBS i 5 min ved RT.
10. For å montere dekkglass, pipette montering medium på et dekkglass. Bruk 10 mL per celle sted, ved hjelp av 22 mm x 22 mm Dekkglass for ett sted, og 22 mm x 50 mm dekkglass for 2:58 flekker. Tørk av PBS rundt cellen sted så mye som mulig, men tar seg ikke å tørke ut cellene. Inverter dekkglass på lysbildet, og forsegle med neglelakk.

Representative Results

Protokollen er beskrevet her (figur 1 for oversikt) har blitt brukt til stor effekt å kombinere DNA FISH med høy gjennomstrømming bildeopptak for analyse av genomisk organisering. Generering av god kvalitet sonder er avgjørende for å lykkes (se diskusjon). Figur 2 viser to viktige kvalitetskontroller for FISH sonder. Etter nick-oversettelse, bør en smøre av DNA være synlig med mesteparten av fragmentene som kjører mellom 150 og 700 bp (Figur 2A). Etter kjemisk kopling, kan inkorporering av det fluorescerende fargestoff måles etter spektroskopisk analyse av sonden (figur 2B).

Ved bruk av gode sonder, som følge av DNA FISH protokollen resulterer vanligvis i lyse DNA FISK signaler om lav bakgrunn. Vi har med hell brukt denne protokollen på en rekke forskjellige celletyper, og med enten epi-fluorescens eller confocal mikroskoper. Automatisert bildebehandling ved hjelp av en epi-fluorescence mikroskop krever skarpe, lett identifiserbare FISK signaler med litt bakgrunn (figur 3), mens konfokalmikroskopi krever mer intense signaler. Figur 4A viser representative behandlede bilder. Kjernefysiske koordinater av fisk signaler kan oppnås, og romlige relasjoner genomisk regioner kan beregnes (for eksempel se Figur 4B). Vi har også brukt bildestakker innhentet av konfokalmikroskopi for 3D modellering av FISH signaler innenfor sine kromosom territorier (Movie 1).

Figur 1. Arbeidsflyt for probe merking og DNA FISH. Probe forberedelse er vist i blått. DNA FISH prosedyren er vist i svart med detaljer gitt i grønt.

Figur 2. Merking prober ved nick-oversettelse og kvalitetssikring av merkede prober. A) Gel viser ideell smøre før oppvarming for å inaktivere DNase I (lane 1: DNA ladder, 2 kjørefelt og 3: BACS etter nick-oversettelse). Fragmenter bør ligge i området 150-700 bp. En ekstra smøre på ~ 1 kb er ofte observert med vellykkede nick-oversettelse reaksjoner. B) Microvolume hele spekteret analyse av merkede prober. En DNA-topp ved 260 nm er observert med en andre topp svarende til absorbansen bølgelengden for fluoroforen at proben er merket med: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Vist er tre sonder med god innlemmelse: fluoroforen absorbansavlesninger toppene er en lignende høyde eller høyere enn DNA-toppene. Alexa Fluor 647 har vanligvis høyere absorbansenn Alexa Fluor 555, som i sin tur har høyere absorbans enn Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorberer også litt lys ved 260 nm, derav første toppen for denne sonden er høyere enn de andre. Prober med dårlig innlemmelse vis fluoroforen absorbans 2-3 ganger lavere enn den DNA-absorbans. Prober med mer enn 2 ganger høyere enn fluoroforen peak DNA topp typisk inneholde ukonjugert fargestoff som kan forårsake bakgrunn i fisken.

Figur 3. Skjermbilde fra MetaCyte 3D FISH bildebehandlingsprogrammer viser en typisk tre-farge FISH eksperiment. Skjermen er delt inn i flere deler. A) Raw felt-of-view (FOV) bilde tatt med Metafer / MetaCyte lysbildeskanning system. B) Gallery bilder av identifiserte atomkjerner som har undergone bildebehandling og segmentering for FISH signaler. Ulike typer data kan vises på hver gallery image. I dette eksempelet celle nummer vises øverst til venstre med ulike interallelic og interlocus avstander øverst til høyre og til begge sider under hvert bilde. C) Slide navn med antall kjerner identifisert i analysen. D) Visning av raset med området skannes av system. E) Utvidelse av det skannede området. Hvite flekker representerer identifisert kjerner per FOV. F) Behandlede data. I dette eksempelet maksimal interallelic avstander mellom grønne signaler (øverst) og røde signaler (nederst) er vist. Data som vises er fra mus P20 kjønnsceller. Prober er plassert på forskjellige kromosomer, som dekker HBB og HBA gener og en histone klynge. Klikk her for å se større figur .

Figur 4. Eksempler på behandlede bilder og avledede posisjonelle data. A) Behandlet bilder for E13.5 mus føtale leverceller farget med BAC prober plassert på forskjellige kromosomer som dekker Myc og KCNQ1 gener (kalles myc og KvDMR, farget grønn og rød, henholdsvis). B) Tukey box-kinnskjegg tomter representerer interallelic avstand fordelingen for de samme loci i 600 kjerner. Interallelic avstand er plottet som en brøkdel av kjernene 'radius (avstand / radius) å ta hensyn til variasjoner i kjernefysisk størrelse. ES cellekjerner ha en radius på rundt 5 mikrometer. Røde prober er vesentlig nærmere hverandre enn grønne prober (***: p <0,01, uparet t-test). Data fra ^10.

Movie 1. 3D-modellering av to loci innen sitt kromosom territory. To BAC prober som ligger nær hver ende av mus kromosom 7 ble merket (rød og langt rødt, (pseudo-farget hvitt)) og hybridisert sammen med en hel kromosom maling (grønn) til mus ES-celler. Klikk her for å se film .

Discussion

3D DNA FISH har blitt et anerkjent verktøy for å analysere romlige ordninger i kjernen. Mens FISH gir visuelle og direkte resultater, som med hver teknikk, må man være klar over sine begrensninger. DNA FISH ansikter iboende problem som relativt tøffe behandlinger er nødvendig for å gjøre kromatin tilgjengelig for FISH sonder som til slutt forstyrrer kjernefysisk struktur-svært ting som skal analyseres. Flere strategier har vært gjort for å sjonglere tilgjengelighet og struktur bevaring. I protokollen som er beskrevet her, er kromosomal DNA gjort tilgjengelig med fryse-tine permeabilization av celler og varme denaturering før sondehybridisering. Solovei, et al., (2002) analyserte strukturelle endringer etter lignende behandling, og fant at den gjennomsnittlige forskyvning av kromatin domener var 300 nm som begrenser oppløsningen av strukturell analyse til om lag 1 Mb regioner i genomet ^åtte. Mens dette ikke er høy oppløsning, deter en rimelig skala for å analysere kjernefysisk stilling.

En mer praktisk hensyn til FISH analyse er at bildeopptak og målinger av kjernefysiske avstandene er tidkrevende prosesser som begrenser antall kjerner som kan analyseres. For å studere sjeldne hendelser vi som mål å gjøre høy gjennomstrømming automatisert bildebehandling. Deretter, med egnede kontroller på plass, kan tilstrekkelig antall sammenlignes for å muliggjøre robust statistisk analyse av romlige relasjoner. Vi rutinemessig analyse 600 kjerner per datapunkt som vi fastslå 3D-koordinatene til alle FISH signaler i kjernefysiske volum. Disse dataene krever svært lite lagringsplass og gir mulighet for analyse av inter-og intra-allelisk avstander, eller radial posisjoner til enhver senere tidspunkt. Videre kan automatisert behandling utføres i en forsker blind måte som i stor grad reduserer sannsynligheten for bevisstløs skjevhet.

For å aktivere denne typen høy gjennomstrømning analyser, var vårt mål å etablere en rask og effektiv måte å utføre DNA FISH. Vi fant protokollen beskrevet her for å være svært robust, konsekvent produsere sterke signaler med lav bakgrunn. Det fungerte for alle celletyper vi prøvde forutsatt at vi tilpasset det skritt å feste cellene til lysbildet. Dessuten, med ett unntak, kunne alle BACS vi brukte bli omgjort til lyse sonder. Vi har også med hell oppdaget en rekke kjernefysiske proteiner ved antistoffarging etter DNA FISH. Mens for noen proteiner dette fungerer godt, anbefaler vi sammenligning med tradisjonelle immunfluorescens (IF) for å sikre konsistens i antistoffarging mønster mellom IF og DNA immuno FISH (sammenlign ^11).

Generelt, fant vi at prober merket i forskjellige farger produsert de samme resultatene. Imidlertid bør følgende aspekter tas i betraktning ved valg av merking fargestoff. Først må fargen på fluoroforen å være godt påviselig i mikroskop used. Andre bør bølgelengden til lyset som emitteres av fluoroforene være tilstrekkelig forskjellig for å unngå utfalling gjennom inn i den andre kanal. Dette vil avhenge av filtrene i mikroskop. Og for det tredje, i det minste i våre hender, noen farger produsere lyse signaler med større jevnhet enn andre. Vi har alltid brukt DAPI (blå) som en counterstain som gjør Alexa Fluor 555 (rød), 488 (grønn) og 647 (langt rødt) gode valg for merking sonder. Med vår imaging system, fant vi Alexa Fluor 555 (rød) til å produsere de skarpeste signaler, etterfulgt av Alexa Fluor 488 (grønn). Alexa Fluor 647 (langt rødt) har den ulempen at den ikke kan oppdages av det menneskelige øyet og derfor ingen signaler kan sees når man ser ned i mikroskopet. Dermed, hvis du gjør to-farge FISH, anbefaler vi en kombinasjon av røde og grønne fargestoffer.

To prinsipielle problemer kan oppstå: celler vask av lysbilder og svake signaler. Hvor godt cellene holder seg til raset er enormt variabel between celletyper, og den beste protokollen for å bosette / frø cellene må bestemmes. Vi har med hell brukt enten positivt ladet eller Poly-L-lysin belagt lysbilder (kjøpt klar til bruk), men fant celler generelt levd bedre å Poly-L-lysin belagt lysbilder. Vi fant også at når cellene var for tette hele områder ville skrelle av som et ark, mens automatisert bildebehandling var hemmet hvis cellene var for tynt. Således, dersom prøven ikke er for kostbar, bør ulike celle tall bli utsådd for å bestemme den ideelle tetthet. Hvis cellene er spesielt utsatt for å vaske av, kan en hydrofob barriere penn brukes, og fisk trinn kan utføres ved forsiktig pipettering løsninger direkte på lysbildet. Pipettering også reduserer drastisk volumene av reagenser som trengs, men tar betydelig lengre tid når du gjør flere lysbilder.

Svake signaler er vanligvis på grunn av dårlig sonder, og det er vel verdt å investere tid i å lage gode. Ren BAC DNA bør bruked som utgangsmateriale som kan oppnås ved gjentatt utfelling eller kommersielt tilgjengelige kit. Kontaminering med bakterielt genom DNA påvirker negativt sonde kvalitet og forsiktig håndtering under cellelyse og filtrering av den cellelysat er nødvendig for å holde den på et minimum. Det er imidlertid ikke nødvendig å anvende en eksonuklease trinn å fordøye lineære DNA, da denne i stor grad reduserer utbyttet. Effektiv merking av proben er avgjørende. Den viktigste kvalitetskontroll for dette trinnet er å sjekke fragment størrelse etter nick oversettelse (se Representative resultater). En "god" smøre vil nesten alltid resultere i en fargerike probe. Vi har imidlertid funnet at av og til en viss BAC ikke kan behandles i en god sonden, og en annen BAC må velges. Et annet viktig skritt er varme denaturering. Hvis temperaturen er for lav, vil DNA være bare delvis denaturert og sondehybridisering vil bli svekket. Hvis temperaturen er for høy, kjernekraft struktur will perturbert mer enn nødvendig. I våre hender, er 78 ° C på en varm blokk invertert den ideelle kompromiss, men dette kan variere avhengig av den respektive varme-blokk benyttes.

Vi har hatt gode resultater ved hjelp Vectashield montering medium, men fant ut at SlowFade Gold har mindre bakgrunn og bevarer den fluorescerende signal lenger. Vi anbefaler ikke bruk av hard-set montering medium som vi fant dette å påvirke 3D-struktur og å danne luftbobler over tid.

Som konklusjon, lyst fluorescerende merkede prober direkte sammen med den DNA FISH-protokollen er beskrevet her gir en effektiv løsning for robust og hurtig analyse av kjernefysisk arkitektur som er anvendelig til en lang rekke biologiske spørsmål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
NTB buffer			Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
DTT	Invitrogen	D-1532	Step 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Aminoallyl-dUTP	Ambion	AM8439	Step 1.1.1
DNA Polymerase I	New England Biolabs	M02095	Step 1.1.1
DNase I recombinant RNase free	Roche	4716728001	Step 1.1.1
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Step 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Step 1.1.5, Step 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Step 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications	Invitrogen (Molecular Probes)	A32750, A32756, A32757	Step 1.2.2
DMSO (anhydrous)	Sigma Aldrich	276855	Step 1.2.2
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102	Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)
Single stranded DNA from salmon testes	Sigma	D7656	Step 2.1.1.1
Deionised formamide	Sigma	F-9037	Step 2.1.1.3 (Health hazard)
Dextran sulphate	Sigma Life Sciences	D8906	Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
XMP painting probes	MetaSystems	000000-0528-837	Step 2.1.1.4
Poly-L-lysine coated slides	Sigma Aldrich	P0425	Step 2.1.2
Hydrophobic pen (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Step 2.1.2
70 μm sieve (Mouse f–tal liver cells only)	BD Falcon	352350	Step 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Tris-Cl			Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Saponin from Quillaja bark	Sigma Aldrich	47036	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Triton X-100	Sigma	T9284	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650	Step 2.1.6
HCl	VWR	20252	Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)
Formamide	Sigma Aldrich	47670	Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)
SSC			Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Coverslips 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Step 2.1.15
Coverslips 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Step 2.1.15
Rubber cement	Marabu	2901 (10 000)	Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)
DAPI	Invitrogen Molecular Probes	D3571	Step 2.2.8 (Health hazard)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Step 2.2.10 (mounting medium)
Clear nail polish	Any supplier		Step 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimager	GE Life Sciences		Step 1.2.4
Coplin jars	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)	Step 2.1.3 onwards
Liquid nitrogen dewar	Any supplier		Step 2.1.7
Base with Black Lid (light-tight chamber)	Simport	M920-2	Step 2.1.17
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room)
Imaging and Image processing
Metafer - Imaging Automation Platform	MetaSystems		automated imaging software
MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis	MetaSystems		automated imaging software
Axio Imager Z2 upright	Zeiss		epifluorescence microscope used with automated imaging
IX81 confocal microscope (FV1000)	Olympus		confocal microscope
Bitplane, version 7.3	Imaris		image analysis and 3D modelling software
Scientific volume Imaging, version 4.1	Huygens		image analysis and deconvolution software
FISH buffers and reaction mixes Name Composition Comments 10 x NTB buffer 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 0.05 M MgCl2 0.5 mg/ml BSA dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μl aliquots at -20 °C 0.5 mM dATP 0.5 mM dCTP 0.125 mM dTTP 4 % PFA Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 °C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA. Store 50 ml aliquots at -20 °C, do not re-freeze 2 % saponin solution Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Store 5 ml aliquots at -20 °C 20 x SSC Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Dextran sulphate mix 20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight. Store 500 μl aliquots at -20 °C