Summary
दो रंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे सिस्टम असाधारण ऑप्टिकल और अस्थायी समाधान, समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर आसंजन assays सहित कुछ जीवित कोशिका assays के एक आवश्यकता के साथ वास्तविक समय छवि दृश्यों उत्पन्न करते हैं. सॉफ्टवेयर एक साथ हासिल कर ली उत्सर्जन चैनलों से छवियों को मर्ज करने के लिए नियोजित किया जाता है, pseudocolored छवि दृश्यों का उत्पादन कर रहे हैं.
Abstract
कोशिका झिल्ली में विशिष्ट अणुओं का पता लगाने के लिए बहु रंग immunofluorescence माइक्रोस्कोपी गतिशील प्रवाह शर्तों के तहत सेल आसंजन गवर्निंग तंत्र की जांच करने के लिए समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर assays के साथ मिलकर किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, कई fluorophores के साथ लेबल कैंसर की कोशिकाओं को कैंसर मेटास्टेसिस के तंत्र मॉडल पर एक संभावित प्रतिक्रियाशील सब्सट्रेट पर perfused किया जा सकता है. हालांकि, वास्तविक समय रहते सेल के विश्लेषण के लिए छवि अधिग्रहण में मल्टी चैनल एक कैमरा सिस्टम और रंग कैमरों प्रदर्शनी कमियों. इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम एक साथ प्रवाह चैम्बर में fluorescently लेबल कोशिकाओं की वास्तविक समय छवि दृश्यों पर कब्जा करने के लिए एक दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली का इस्तेमाल किया. दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे सिस्टम फिल्टर परिभाषित तरंगदैर्ध्य जिससे एक साथ दो स्थानिक समान लेकिन फ्लोरोफोरे विशिष्ट छवियों पर कब्जा करने के दो मोनोक्रोम सीसीडी कैमरों, में चलता है. बाद में, psuedocolored एक चैनल छवियों को एक एकल में संयुक्त रहे हैंवास्तविक समय कोशिकाओं हित के एक क्षेत्र में तेजी से आगे बढ़ पर कई अणु लक्ष्य प्रकट कर सकते हैं कि अनुक्रम विलय कर दिया.
Introduction
ऐसे immunostaining के रूप में कोशिका की सतह पर अणुओं के विश्लेषण के लिए तरीके, रासायनिक अणु लक्ष्य का पता लगाने की अनुमति, fluorophores संयुग्मित रहे हैं कि जांच के काम पर. लाइव सेल इमेजिंग और hydrodynamic प्रवाह आधारित कोशिका आसंजन assays आमतौर पर सेलुलर और / या आणविक स्तर 1, 2 पर शारीरिक प्रक्रियाओं पर कब्जा करने के लिए डिजाइन मोनोक्रोम सीसीडी कैमरों के साथ दर्ज हैं. इन कैमरों तेजी से फ्रेम दर (प्रति सेकंड से अधिक 30 फ्रेम) देने, और (कारण तेजी से फ्रेम दर और कम जोखिम बार के लिए) असाधारण अस्थायी समाधान प्रदान करते हैं, बेहद संवेदनशील हैं. हालांकि, मोनोक्रोम कैमरों केवल छवियों को इकट्ठा करने के लिए (एक fluorophore का पता लगाने के) एक ही उत्सर्जन चैनल पर कब्जा कर सकते हैं. एक कैमरा उत्सर्जन बंटवारे सिस्टम एकाधिक उत्सर्जन चैनलों पर कब्जा करने के लिए शामिल किया है, लेकिन अक्सर देखने के क्षेत्र को कम करने और सभी चैनलों के लिए इमेजिंग एक ही जोखिम समय की आवश्यकता हो सकती है. Multip के साथ लेबल की कोशिकाओं से पूरे रंग स्पेक्ट्रम पर कब्जा करने के लिएLe एक रंग कैमरा एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, fluorophores. हालांकि, रंग कैमरों कुछ अनुप्रयोगों में लाइव सेल इमेजिंग के लिए वांछित अस्थायी समाधान प्रदान करने के आम तौर पर सक्षम नहीं हैं. एक और इमेजिंग डिवाइस एक उच्च अस्थायी समाधान को बनाए रखना है, जबकि यह कई तरंग दैर्ध्य छवि जीवित कोशिकाओं के लिए फायदेमंद है, जिसमें अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है. एक प्रमुख प्रयोगात्मक आवेदन कोशिकाओं एक संभावित प्रतिक्रियाशील सब्सट्रेट 1, 3 से अधिक physiologically प्रासंगिक शर्तों पर perfused हैं जिसमें समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर आसंजन परख है. विशिष्ट कोशिका की सतह अणुओं व्यक्त कि प्रवाह में कोशिकाओं का पालन करना और ऐसे आसंजन अणुओं या सतह adsorbed बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन 4, 5 व्यक्त एक सेल monolayer के रूप में सब्सट्रेट, पर रोल कर सकते हैं. रोलिंग कोशिकाओं एक दूसरे के भागों में घूर्णी और translational आंदोलन से गुजरना सकता है. रोलिंग और ऐसी कोशिका की सतह अणुओं के समूहों के रूप में पक्षपाती कोशिकाओं, पर आणविक सुविधाओं, भी potenti हैअल कोशिका की सतह पर सक्रिय पुनर्गठन से गुजरना करने के लिए. इस प्रकार, इमेजिंग सिस्टम एक असाधारण अस्थायी समाधान प्रदान करनी चाहिए (दूसरे या अधिक से अधिक 30 फ्रेम प्रति और जोखिम बार "शून्य के पास") सेल 6, 7 रोलिंग का कदम दर कदम प्रगति को दिखाता है कि एक छवि अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए. दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे सिस्टम एकाधिक fluorophores के साथ लेबल कोशिकाओं इमेजिंग के लिए इन मांगों को पूरा करने में सक्षम हैं.
दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे सिस्टम देखने का पूरा क्षेत्र बनाए रखते हुए एक साथ दो स्थानिक समान लेकिन फ्लोरोफोरे विशिष्ट छवियों पर कब्जा करने के लिए इसी तरह के दो कैमरों में फिल्टर प्रतिदीप्ति चैनलों विभाजन और. यह तकनीक हर चैनल में वास्तविक समय में कब्जा कर लिया छवि की सीधी तुलना सक्षम बनाता है और उपयोगकर्ता को जल्दी से विभिन्न इमेजिंग क्षमताओं के साथ कैमरा मॉडलों के बीच स्विच करने के लिए अनुमति देता है. यह सुविधा बेहतर प्रणाली पर कब्जा करने की अनुमति है कि एक कैमरे में छवि पर कब्जा सेटिंग्स समायोजन करने के लिए उपयोगी हैविभिन्न तीव्रताओं, जन्मों, और विलुप्त होने गुणांक 8 के साथ fluorophores. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित, दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे सिस्टम कई तरंग दैर्ध्य में लाइव सेल इमेजिंग assays की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग की अनुमति और सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग करने वाले इन विट्रो assays में वृद्धि हो सकती है.
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Protocol
1. सॉफ्टवेयर स्थापना
- StreamPix SimulPix मॉड्यूल या संग्रह और मोनोक्रोम सीसीडी कैमरों से कब्जा कर लिया छवियों के संयोजन में सक्षम अन्य इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ 5 मल्टी कैमरा सॉफ्टवेयर खरीद.
- StreamPix 5 के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं में शामिल हैं: 2 जीबी रैम या अधिक के साथ 2.4 गीगा या बेहतर के साथ कोर 2 डुओ से लैस एक पीसी. एक समर्थित आईईईई डिजिटल या एनालॉग कैमरा और संगत फ्रेम धरनेवाला. विंडोज XP/7/Vista 32 या 64 बिट. संकल्प 1024 x 768 या अधिक समर्थन की निगरानी. अच्छा 2 डी प्रदर्शन के साथ एक ग्राफिक एडाप्टर (OCU 16x या बेहतर व्यक्त की सिफारिश की है) और RAID-O विन्यास के साथ रिकॉर्डिंग के लिए 7200 RPM हार्ड डिस्क ड्राइव.
2. दो रंग एक साथ वास्तविक समय इमेजिंग में सक्षम दोहरी कैमरा प्रणाली की स्थापना
- माइकर की वीडियो पोर्ट में DC2 C-माउंट एडाप्टर फिसलने से माइक्रोस्कोप को DC2 Photometrics उत्सर्जन फाड़नेवाला, या इसी तरह की दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे डिवाइस से कनेक्टडिवाइस पर dichroic का आवास सुलभ है कि इस तरह के oscope.
- महिला C-माउंट 1 में दो मोनोक्रोम सीसीडी कैमरों डालें और महिला 2 C-माउंट. समान कैमरों बेहतर कर रहे हैं. इसी तरह के कैमरों का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अनुकूलता आंतरिक हार्डवेयर, सबसे महत्वपूर्ण बात सीसीडी छवि संवेदक पर निर्भर है.
- दोनों कैमरों से चित्र प्रदर्शित करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. निम्नलिखित कदम (2.3.1 - 2.3.4) SimulPix मॉड्यूल के साथ StreamPix 5 को लागू करते हैं और अन्य मल्टी कैमरा इमेजिंग सॉफ्टवेयर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- ओपन StreamPix 5 और कार्य रिबन में "कार्यस्थान" का चयन करें.
- ओपन "कार्यस्थान प्रबंधक" स्क्रीन का अभी तक सही पर स्थित है और "नया कार्यक्षेत्र" का चयन करें.
- एक कैमरा के नामकरण के बाद, सॉफ्टवेयर पहले से भरे सूची से एक धरनेवाला का चयन करने के लिए संकेतों का पालन करें. कैमरा मॉडल से मेल खाते धरनेवाला चुने और दूसरा कैमरा कार्यक्षेत्र के लिए दोहराएँ. मर्ज किए गए कार्यक्षेत्र के लिए, एक बार फिर दोहराना लेकिन त्रुटि एम "सभी कैमरों का उपयोग में कर रहे हैं"essage दिखाई देगा. यह संदेश सामान्य है.
- मर्ज किए गए कार्यक्षेत्र भरी हुई है एक बार, कार्यक्षेत्र 1 और कार्यक्षेत्र 2 से देखने स्क्रीन के दाहिने हाथ की ओर स्थित डॉकिंग पैनल में मर्ज किए गए कार्यक्षेत्र के लिए कैमरों आवंटित.
- दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली में कैमरों संरेखित करें.
- उज्ज्वल क्षेत्र या एक PlanApo 40X उद्देश्य (या अधिक) का उपयोग निर्माता द्वारा प्रदान अंशांकन ग्रिड के साथ चरण विपरीत में कैमरों संरेखित करें.
- खुर्दबीन मंच पर निर्माता द्वारा प्रदान की गई थी कि धातु में लिपटे अंशांकन ग्रिड जगह, खुर्दबीन eyepieces के लिए प्रकाश भेजें, और खुर्दबीन मंच पर ग्रिड वर्ग.
- ध्यान में ग्रिड ले आओ.
- विस्थापित, लेकिन कैमरा 1 (बाईपास कैमरा) के लिए पंक्ति में, dichroic आवास को दूर नहीं करते. Binning बिना और autoscaling बिना ग्रिड प्रदर्शित करें. C-माउंट बंदरगाह 1 पर ध्यान समायोजन डायल का उपयोग कर छवि ध्यान दें.
- दोहरी channe में dichroic आवास पुशएल अधिग्रहण डिवाइस पूरी तरह से छवि दोनों कैमरों को dichroic द्वारा विभाजित है कि इतनी.
- थोड़ा ढीला तीन 5/64 "शिकंजा सेट और ग्रिड के उन्मुखीकरण C-माउंट 2 बंदरगाह पर ध्यान समायोजन डायल का उपयोग करना. दोनों छवियों में समान है जब तक महिला C-माउंट 2 पर दूसरा कैमरा बारी बारी, कैमरा से छवि लाना ध्यान में 2.
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर का मर्ज किए गए कार्यक्षेत्र में संयुक्त छवि का उपयोग संरेखण को अंतिम रूप. यह एक अंशांकन ग्रिड के दो चित्रों के एक वास्तविक समय pseudocolor ओवरले देखने के लिए अनुमति देता है. DC2 के सही पक्ष पर ही आर / एल का उपयोग कर घुंडी संयुक्त छवि पदों को समायोजित. छवियों की बाईं / सही ऊर्ध्वाधर सीमा ठीक से गठबंधन किया है, जब तक यह दस्ता समायोजित करें.
- क्षैतिज ग्रिड सलाखों गठबंधन ठीक तरह से कर रहे हैं जब तक दूसरी छवि के ऊपर / नीचे संरेखण समायोजित करने के लिए यू / डी घुंडी का प्रयोग करें.
- ऊपर / नीचे संरेखण के दौरान एक मामूली कैमरा रोटेशन तीन 5/64 "इंच scre ढीला द्वारा, सही यह समस्या तब होती हैWS कैमरा 2 और बारी बारी के लिए प्रदर्शित की छवि ठीक से गठबंधन किया है जब तक.
3. समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर आसंजन परख के लिए कैंसर कोशिकाओं की तैयारी
- न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) में संस्कृति बीटी -20 स्तन कैंसर की कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री सेल्सियस और सीओ 2 के रूप में पहले 2 वर्णित 5.0% के साथ मध्यम पूरा करने के लिए पूरक.
- हार्वेस्ट कैंसर एक पतला trypsin उपचार के साथ कोशिकाओं और एक hemocytometer साथ कोशिकाओं गिनती.
- धो और कैल्शियम और मैग्नीशियम (DPBS +) के साथ DPBS में गोजातीय सीरम (बीएसए) से 0.1% एल्बुमिन में 10 7 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं को निलंबित.
- 0.1% बीएसए DPBS + में एक पूर्व निर्धारित इष्टतम एकाग्रता के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी, शुद्ध माउस विरोधी मानव CD24 और शुद्ध चूहे HECA-452 (एंटी sialofucosylated एंटीजन) पतला. 30 मिनट 9, 10 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- 1,200 rpm पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए. ASPIप्राथमिक एंटीबॉडी की दर, और 0.1% बीएसए DBPS + के साथ दो बार धोने कोशिकाओं.
- 0.1% बीएसए DPBS + में एक पूर्व निर्धारित इष्टतम एकाग्रता के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी, बकरी विरोधी माउस आईजीजी AlexaFluor 568 (उत्सर्जन अधिकतम, 603 एनएम), और बकरी विरोधी चूहा आईजीएम AlexaFluor 488 (उत्सर्जन अधिकतम, 519 एनएम), पतला. 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- 0.1% बीएसए DPBS + में 10 6 कोशिकाओं / एमएल में 0.1% बीएसए DPBS + में दो बार कोशिकाओं को धो लें और निलंबित.
4. समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर आसंजन परख के लिए प्रतिक्रियाशील सब्सट्रेट की तैयारी
- एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान अंदर फिट बैठता है कि समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर के इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों के लिए ट्यूबिंग के दो अलग लंबाई कनेक्ट करें. एक ट्यूब एक निर्दिष्ट प्रवाह दर पर द्रव वापस ले लेंगे जो सिरिंज पंप, 0.1% बीएसए DPBS + और अन्य में निलंबित लेबल की कोशिकाओं के जलाशय से जुड़ जाएगा.
- प्रवाह चैम्बर 1 एक निर्वात लाइन से कनेक्ट करें.
- 35 मिमी टिशू कल्चर di अधिक प्रवाह चैम्बर स्थित करेंश ई selectin (चो ई) व्यक्त चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं की एक monolayer युक्त. चो ई कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर सदस्य पूरा मध्यम में वृद्धि हुई है और 5.0% सीओ 2 2 गया.
- एक पर्याप्त वैक्यूम मुहर 1 सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह चैम्बर और / या प्रवाह चैम्बर गैसकेट को समायोजित करें.
- उचित सील और हवा बुलबुला गठन 1 का कोई दृश्य सबूत के लिए प्रवाह चैम्बर विधानसभा निगरानी, जलाशय से द्रव वापस ले लें.
- माइक्रोस्कोप (Leica डीएमआई 6000B) पर प्रवाह चैम्बर विधानसभा रखें 1.
5. दो रंग छवि अधिग्रहण
- एक प्रकाश गाइड में उच्च तीव्रता प्रकाश और जोड़े को यह उत्पन्न करने के लिए बिजली की एक Leica ईएल -6000 कॉम्पैक्ट प्रकाश स्रोत, या इसी तरह के उपकरण,. एक वांछित रंग / तीव्रता के fluorophores उत्तेजित करने के लिए, एक संयोजन फिल्टर क्यूब, यानी जी / आर (हरा / लाल) फिल्टर क्यूब के माध्यम से इस प्रकाश पारित करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें.
- Dichroic आवास (उदास) सही परिचालन की स्थिति में है और यह सुनिश्चितबाईपास मोड में नहीं है.
- प्रतिदीप्ति मोड में माइक्रोस्कोप चलाओ और (लाल, हरे /) उचित प्रतिदीप्ति फिल्टर क्यूब का चयन करें.
- 1 कैमरे में समय जोखिम और लाभ का निर्धारण करते हैं (लाल, 620 ± 60 एनएम) और कैमरा 2 (हरा, 535 ± 40 एनएम).
- दोनों लाल और हरे रंग का उत्सर्जन चैनलों में छवियों को प्राप्त करने के लिए dichroic दबाना. केवल लाल fluorophore साथ लेबल की कोशिकाओं के साथ एक प्रवाह चैम्बर परख का प्रयोग करें, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर की "जी सेटिंग" में कैमरा 1 का जोखिम समय का समायोजन करके लाल चैनल में एक छवि प्राप्त करते हैं.
- 1 कैमरे के जोखिम समय के लिए कैमरा 2 के प्रदर्शन के समय से मिलान. एक छवि ग्रीन चैनल में मनाया जाता है, खून के माध्यम से कलाकृतियों मौजूद हैं और दोनों को कैमरे में समय जोखिम कम किया जाना चाहिए.
- खून के माध्यम से विरूपण साक्ष्य नहीं रह ग्रीन चैनल में दिखाई दे रहा है जब तक समय जोखिम को कम करने, कैमरा 1 और कैमरा 2 में बराबर समय जोखिम में रखते हुए. छवि visibilit सुधार करने के लिए कैमरा 1 के लाभ को समायोजितयदि आवश्यक हो तो लाल चैनल में y.
- केवल हरी fluorophore साथ लेबल की कोशिकाओं के साथ 5.4.3, लेकिन कैमरा 1 से एकत्र लाल चैनल में खून के माध्यम से कलाकृतियों के बिना ग्रीन चैनल में छवि कोशिकाओं के लिए कैमरा 2 के साथ समय जोखिम को परिभाषित - दोहराएँ 5.4.1 दोहराएँ.
- Retitrate एंटीबॉडी खून के माध्यम से कलाकृतियों 11 सफाया, या कैमरा 1 और कैमरा 2 का जोखिम बार काफी अलग हैं, तो इस तरह के चित्र अस्थायी misaligned हो सकता है कि विलय नहीं किया जा सकता है.
- एक साथ प्रवाह चैम्बर प्रयोग में दो मोनोक्रोम सीसीडी कैमरों से कब्जा कर लिया छवियों को देखने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
- Streampix 5 की SimulPix मॉड्यूल या एक वैकल्पिक सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग दोनों कैमरों से एकत्र छवियों को मर्ज.
- यदि आवश्यक हो तो स्थानिक, मर्ज किए गए छवियों के लिए पंक्ति में SimulPix या वैकल्पिक सॉफ्टवेयर में डिजिटल सुधार समायोजन का उपयोग करें. छवियाँ क्षैतिज, ऊर्ध्वाधर के लिए SimulPix मॉड्यूल के साथ ठीक किया जा सकता, और घूर्णी समायोजन.
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Representative Results
एक समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर आसंजन परख एक साथ दो उत्सर्जन चैनलों में वास्तविक समय छवि दृश्यों पर कब्जा कर लिया है कि एक दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली (चित्रा 1) प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली fluorescently विरोधी मानव CD24 और HECA-452 (sialofucosylated एंटीजन का पता लगाने) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और उचित माध्यमिक एंटीबॉडी (चित्रा 2) के साथ लेबल रहे थे कि बीटी -20 कोशिकाओं का पता चला. कुछ रोलिंग कोशिकाओं लाल संकेत (CD24) अभी तक undetectable हरे संकेतों (HECA-452) प्रदर्शित, दूसरों को हरी संकेतों और undetectable लाल संकेत प्रदर्शित, और अभी तक अन्य कोशिकाओं (चित्रा 2) के संकेतों को लाल और हरे दोनों का प्रदर्शन किया. विलय कर दिया उत्सर्जन चैनलों बीटी -20 कोशिकाओं पर रोलिंग और चो ई monolayers के पालन (आंकड़े 3 और 4) की सतह पर CD24 और sialofucosylated अणुओं के वितरण और colocalization का पता चला. दोहरी कैमरा उत्सर्जन splitting प्रणाली मूल कारण कैमरों के संरेखण के लिए एक मामूली छवि संरेखण त्रुटि थी, लेकिन इस त्रुटि StreamPix 5 की SimulPix मॉड्यूल का उपयोग कर डिजिटल समायोजन (चित्रा 5) के साथ ठीक किया गया था. कुल मिलाकर, दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली ऐसी कोशिकाओं को देखने के क्षेत्र के माध्यम से तेजी से बढ़ने में जो प्रवाह चैम्बर आसंजन assays, के रूप में आवेदन में सेलुलर और आणविक सुविधाओं को प्रकट करने की जरूरत है, स्थानिक लौकिक, और ऑप्टिकल संकल्प किया है.
चित्रा 1. एक समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर आसंजन परख में छवियों को प्राप्त करने के लिए एक दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली का चित्रण. एक सिरिंज पंप समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर में सब्सट्रेट पर कोशिकाओं छिड़कना के लिए प्रयोग किया जाता है. एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप से जुड़े दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली एक dichroic मीटर का उपयोग करता हैदो कैमरों में उत्सर्जन चैनलों विभाजन और फिल्टर करने के लिए irror और फिल्टर क्यूब्स. इन कैमरों एक साथ दो स्थानिक समान लेकिन फ्लोरोफोरे विशिष्ट छवि दृश्यों पर कब्जा. मल्टी कैमरा इमेजिंग सॉफ्टवेयर से लैस कंप्यूटर विलय और प्रत्येक उत्सर्जन चैनल से रिकॉर्ड छवि दृश्यों के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2. एक दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली एक समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर आसंजन परख की वास्तविक समय एक साथ इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था. (1) मानव विरोधी CD24 और विरोधी माउस आईजीजी AlexaFluor 568 (pseudocolored लाल, उत्सर्जन अधिकतम के साथ लेबल बीटी -20 कोशिकाओं, 603 एनएम, कैमरा 1, 620 ± 60 एनएम) और (2) HECA-452 और विरोधी चूहा आईजीएम AlexaFluor 488 (हरा, उत्सर्जन अधिकतम 519 एनएम pseudocolored, कैमरा 2, 535 ± 40 एनएम) एक चो ई monolayer अधिक perfused थे दीवार कतरनी तनाव में = 1 डाएन / 2 सेमी. दोहरी कैमरा मैं मर्ज किए गएMages एक रोलिंग सेल आबादी के भीतर विविधता पता चलता है और कोशिका की सतह अणुओं की अभिव्यक्ति के आधार पर रोलिंग व्यवहार को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. = 100 माइक्रोन स्केल बार. एक 10X उद्देश्य से अधिग्रहीत छवि.
चित्रा 3. (Pseudocolored लाल) और sialofucosylated अणुओं (हरा pseudocolored) 1 डाएन / 2 सेमी = दीवार कतरनी तनाव में एक चो ई monolayer पर रोलिंग CD24 व्यक्त बीटी -20 कोशिकाओं दिखा एक दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली द्वारा कब्जा कर लिया मर्ज किए गए चित्रों में से एक समय अनुक्रम. कैमरा यह प्रवाह की दिशा में प्रतिक्रियाशील सब्सट्रेट पर लुढ़का के रूप में "अंत पर खत्म" tumbling एक सेल पर सेल सुविधाओं को ट्रैक करने के लिए ऑप्टिकल और अस्थायी समाधान बनाए रखा. सफेद तीर कोशिका की सतह अणुओं के एक नज़र रखी क्लस्टर से संकेत मिलता है. हर चैनल में उत्सर्जन का संकेत है मैं में pseudocolored और विलय कर दिया गयाmaging सॉफ्टवेयर. Colocalized संकेत पीला / नारंगी प्रकट ध्यान दें. फिर भी चित्र दिखाया समय बिंदुओं पर वास्तविक समय छवि दृश्यों से निर्यात किया गया. = 10 माइक्रोन स्केल बार. एक 40x उद्देश्य के साथ प्राप्त कर लिया छवियाँ.
चित्रा 4. दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली CD24 (लाल pseudocolored) की colocalization और बीटी -20 स्तन कैंसर सेल एक चो ई monolayer पर रोलिंग एक प्रतिनिधि द्वारा व्यक्त sialofucosylated अणुओं (हरा pseudocolored). Sialofucosylated (ए) CD24 और (बी) की विषम अभिव्यक्ति का पता चलता है कोशिका की सतह पर अणु एक छवि में बल दिया है. लाल और हरे रंग pseudocolored उत्सर्जन चैनलों विलय कर रहे हैं जब पीला / नारंगी रंग के धब्बे pseudocolored के रूप में अणुओं की (सी) colocalization प्रकट होता है. सेल व्यास लगभग 10 मीटर है. छवियों का अधिग्रहण वाईएक 40x उद्देश्य वें.
1 कैमरे और कैमरा 2 में कब्जा कर लिया छवियों की, क्षैतिज ऊर्ध्वाधर, और घूर्णी स्थानिक सेटिंग को चित्रा 5.Adjustments मर्ज किए गए छवि में स्थानिक संरेखण में सुधार कर सकते हैं. सही कोशिकाओं आसंजन परख में पालन और चल रहे हैं कि कैसे चित्रित करने के लिए उचित संरेखण महत्वपूर्ण है . (ए) एक भी बीटी -20 सेल का एक विलय छवि की वजह से कैमरा स्थिति के लिए ग़लत है. (बी) के स्थानिक संरेखण StreamPix 5 की SimulPix मॉड्यूल में सॉफ्टवेयर समायोजन के साथ सुधार हुआ है. (सी) सॉफ्टवेयर समायोजन पास सही संरेखण को प्राप्त करने. स्केल बार = 2 माइक्रोन. एक 40x उद्देश्य के साथ प्राप्त कर लिया छवियाँ.
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Discussion
दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली सेल या आणविक आंदोलन तेजी से है जहां अनुप्रयोगों में उच्च गुणवत्ता के चित्र पर कब्जा करने की जरूरत है, स्थानिक लौकिक, और ऑप्टिकल संकल्प किया है. प्रतिनिधि परिणाम पैदा करने में, सॉफ्टवेयर सेटिंग्स और कैमरा सेटिंग्स सहित दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली में पैरामीटर, रोलिंग और पक्षपाती कोशिकाओं spatially और अस्थायी गठबंधन किया गया, जिसमें एक मर्ज किए गए छवि अनुक्रम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया. Misalignment दोनों हरे और लाल चैनलों में रोल करने के लिए मनाया एक एकल कक्ष मर्ज किए गए कार्यक्षेत्र में दो रोलिंग कोशिकाओं के रूप में प्रकट हो सकता है ठीक से जांच के तहत भौतिक घटना को व्यक्त नहीं करते कि छवियों, जैसे में परिणाम कर सकते हैं के रूप में यह अनुकूलन कदम महत्वपूर्ण है. प्रोटोकॉल के 2.4 चरण में वर्णित के रूप में कैमरों शारीरिक रूप से जुड़ रहे हैं जब स्थानिक संरेखण दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली की स्थापना में हासिल किया जाना चाहिए. छवियों कैप्टन के स्थानिक संरेखण के लिए डिजिटल सुधारकैमरों द्वारा ured इमेजिंग सॉफ्टवेयर (कदम 5.7 और चित्रा 5) में डिजिटल संरेखण सेटिंग्स के माध्यम से (एस), क्षैतिज ऊर्ध्वाधर, या घूर्णी ऑफसेट के लिए लागू किया जा सकता है.
जोखिम समय, ऑफसेट, और लाभ: 1 कैमरे और कैमरा 2 से कब्जा कर लिया छवियों के बीच अस्थायी संरेखण कैमरों की "जी सेटिंग" समायोजन करके प्राप्त किया जा सकता है. लाभ और ऑफसेट मर्ज किए गए चित्रों में से अस्थायी संरेखण को प्रभावित किए बिना समायोजित किया जा सकता है, अभी तक कैमरे के बीच प्रयोक्ता परिभाषित जोखिम समय में विचलन misalignment में परिणाम कर सकते हैं. इस प्रकार लाभ प्रत्येक कैमरे में छवियों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल जोखिम बार के बीच अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. लाभ समायोजन काफी छवि गुणवत्ता में समझौता करने के लिए प्रकट जब आदर्श रूप में, कैमरों के बीच जोखिम समय में अंतर केवल अनुमति दी जानी चाहिए. वैकल्पिक रूप से, एंटीबॉडी अनुमापन प्रयोगों (एक कैमरे द्वारा अपेक्षित जोखिम समय में अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए सेल लेबलिंग अनुकूलन करने के लिए किया जा सकता हैएक) के कारण के कारण प्रत्येक एंटीबॉडी / फ्लोरोफोरे से पता चला आणविक अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर करने के लिए प्रत्येक fluorophore या (ख) के अंतर्निहित गुणों को. हालांकि, यह भी एंटीबॉडी अनुमापन प्रयोगों खून के माध्यम से कलाकृतियों (कदम 5.4.5) 11 को रोकने के लिए सबसे अच्छा अभ्यास कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए.
दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली एक साथ छवि अलग उत्सर्जन चैनलों में दो अणु लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया गया था, वैकल्पिक तकनीकों एक साथ कई उत्सर्जन चैनलों में छवियों पर कब्जा करने में सक्षम हैं. इन इमेजिंग सिस्टम ही रंग कैमरों से confocal सूक्ष्मदर्शी के लिए सीमा, और प्रत्येक फायदे और छवि गुणवत्ता, गति के सापेक्ष नुकसान है, और 12-17 लागत. विशेष रूप से, गुंजयमान स्कैनर शामिल है कि राज्य के अत्याधुनिक लेजर स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी फ्रेम प्रति सेकंड की सैकड़ों में छवियों को प्राप्त करने में सक्षम प्रभावशाली बहु वर्णक्रमीय इमेजिंग सिस्टम हैं. ये confocal प्रणाली, अत्यंत शक्तिशाली हैंलेकिन उनकी लागत कोर सुविधाओं के माध्यम से इन प्रणालियों का उपयोग किया है कि शोधकर्ताओं की संख्या सीमित कर सकता है. अंत में, मल्टी चैनल इमेजिंग प्रणाली सबसे उपयुक्त है जो प्रत्येक प्रयोगशाला हुक्म की अनुसंधानात्मक जरूरतों और संसाधनों.
इस के साथ साथ वर्णित विधि एक दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दो उत्सर्जन चैनलों में वास्तविक समय छवि दृश्यों को प्राप्त करने के लिए समझाना. इसी तरह मोनोक्रोम सीसीडी कैमरों से दो उत्सर्जन चैनलों में कब्जा कर लिया छवियों के स्थानिक और लौकिक संरेखण एक साथ कोशिकाओं पर एकाधिक लक्ष्य अणुओं का पता चलता है कि उच्च गुणवत्ता वाले वास्तविक समय विलय कर छवि दृश्यों के उत्पादन के लिए आवश्यक है. दोहरी कैमरा उत्सर्जन बंटवारे प्रणाली के लिए आवेदन प्रवाह assays, कोशिका की सतह अणुओं के स्थानान्तरण, cytoskeletal remodeling, vesicular परिवहन, और 3 डी कण के रूप में देखने का एक पूरा क्षेत्र की असाधारण ऑप्टिकल और अस्थायी समाधान की मांग है कि किसी भी दो रंग जीवित कोशिका विश्लेषण शामिल ट्रैकिंग.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
लेखकों व्यावहारिक विचार विमर्श और पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ. डगलस Goetz (विभाग रासायनिक का और Biomolecular इंजीनियरिंग, ओहियो विश्वविद्यालय) और डॉ. फेबियन Benencia (जैव चिकित्सा विज्ञान विभाग, ओहियो विश्वविद्यालय) धन्यवाद देता हूँ. हम भी मददगार तकनीकी विचार विमर्श (डब्ल्यू Nuhsbaum इंक) के लिए डॉ. क्रिस्टोफर Huppenbauer धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CBET-1106118) और राष्ट्रीय संस्थानों (1R15CA161830-01) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix | ||
References
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