Summary
Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos.
Abstract
A microscopia de imunofluorescência multi-color para detectar moléculas específicas na membrana da célula pode ser acoplado com os ensaios de câmara de fluxo paralelo à placa de investigar os mecanismos que regulam a adesão de células em condições de escoamento dinâmico. Por exemplo, as células cancerosas marcadas com vários fluoróforos podem ser perfundidos sobre um substrato potencialmente reativo para modelar mecanismos de metástase do câncer. No entanto, multi-canal de sistemas únicos de câmera e câmeras coloridas deficiências apresentam na aquisição de imagens para análise de células vivas em tempo real. Para superar essas limitações, foi utilizado um sistema de separação de emissão de câmara dupla de capturar simultaneamente sequências de imagens em tempo real de células marcadas com fluorescência na câmara de fluxo. Comprimento de onda do filtro sistemas de divisão de emissão dupla de câmera definido varia em duas câmeras CCD monocromático, capturando, assim, simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicas do fluoróforo. Subsequentemente, psuedocolored imagens de um canal são combinados numa únicaem tempo real fundiu seqüência que pode revelar várias moléculas-alvo em células movendo-se rapidamente através de uma região de interesse.
Introduction
Os métodos para análise de moléculas na superfície das células, tais como a imunocoloração, empregam sondas que são quimicamente conjugados com fluoróforos, permitindo a detecção de moléculas alvo. Imagens de células vivas e ensaios de adesão de células baseadas no fluxo hidrodinâmicas são gravadas com câmeras CCD monocromático projetado para capturar os processos fisiológicos a nível celular e / ou molecular 1, 2. Essas câmeras são altamente sensíveis, entregar taxas de quadro rápidas (mais de 30 quadros por segundo), e fornecer resolução temporal excepcional (devido a taxas de quadro rápidas e tempos de exposição curto). No entanto, as câmeras monocromáticas só pode capturar um único canal de emissão (a detecção de um único fluoróforo) para coletar imagens. Sistemas de divisão de emissão de uma única câmara podem ser incorporados para captar vários canais de emissão, mas muitas vezes reduzir o campo de visão e exigem o mesmo tempo de exposição para a imagem de todos os canais. Para capturar o espectro de cores a partir de células marcadas com multiple fluoróforos, uma câmara de cor pode ser usado como alternativa. No entanto, câmeras de cor geralmente não são capazes de fornecer a resolução temporal desejado para imagens de células vivas em determinadas aplicações. Outro dispositivo de imagem é necessária para aplicações em que é vantajosa a imagem de células vivas em vários comprimentos de onda, mantendo uma alta resolução temporal. Uma aplicação experimental principal é o ensaio de adesão de câmara de fluxo de placas paralelas, em que as células são perfundidos em condições fisiologicamente relevantes sobre um substrato potencialmente reactiva 1, 3. As células em fluxo que expressam moléculas da superfície celular específicos podem aderir e rolo sobre o substrato, tal como uma monocamada de células que expressam as moléculas de adesão ou de proteínas extracelulares adsorvido à superfície da matriz 4, 5. Rolando células podem sofrer movimento de rotação e de translação em frações de segundo. Características moleculares sobre rolamento e células aderentes, tais como aglomerados de moléculas de superfície celular, também têm o potenciômetroal de sofrer reorganização activa na superfície da célula. Assim, sistemas de imagem deve fornecer uma resolução temporal excepcional (30 quadros por segundo ou mais, e "quase zero" tempos de exposição) para gerar uma seqüência de imagens que ilustra a progressão passo-a-passo de célula rolando 6, 7. Sistemas de divisão de emissão câmera dupla são capazes de atender a essas demandas para a imagem latente células marcadas com vários fluoróforos.
Sistemas de divisão de emissão câmera dupla dividir e canais de fluorescência do filtro em duas câmeras semelhantes de capturar simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicos de fluoróforo, mantendo o pleno campo de visão. Esta tecnologia permite a comparação direta da imagem capturada em tempo real em cada canal e permite ao usuário alternar rapidamente entre os modelos de câmeras com diferentes capacidades de imagem. Esse recurso é útil para fazer ajustes nas configurações de captura de imagem em uma câmera que melhor permitem que o sistema para capturarfluoróforos com diferentes intensidades, vidas, e coeficientes de extinção 8. Juntamente com o software de imagem, sistemas de divisão de emissão da câmera dupla permite a gravação em tempo real de ensaios de imagens de células vivas em vários comprimentos de onda e pode aumentar a ensaios in vitro que utilizam a fluorescência para estudar o comportamento das células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instalação de Software
- Compre StreamPix 5 software multi-câmera com módulo SimulPix ou outro software de imagem capaz de coletar e combinar imagens captadas por câmeras CCD monocromática.
- Os requisitos mínimos para StreamPix 5 incluem: Um PC equipado com Core 2 Duo com 2.4 GHz ou superior, com 2 GB de RAM ou superior. Uma câmera digital ou analógico IEEE apoiado e compatível placa de captura. O Windows XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Um monitor com suporte para resolução 1024 x 768 ou superior. Um adaptador gráfico com bom desempenho 2D (OCU Express 16x ou melhor é recomendado) e 7.200 RPM disco rígido para gravar com configuração RAID-O.
2. Instalação de sistema de câmera dupla capaz de duas cores simultâneas em tempo Real Imaging
- Conecte o divisor DC2 Photometrics emissão, ou semelhante dispositivo câmera dupla divisão de emissões, ao microscópio, deslizando o adaptador DC2 C-mount na porta de vídeo do microscope de tal modo que a carcaça da dicróico no dispositivo é acessível.
- Insira duas câmeras CCD monocromático em fêmea de montagem C 1 e C-mount fêmea 2. Câmeras idênticas são preferíveis. Câmaras similares podem ser utilizados, mas a compatibilidade depende do hardware interno, o mais importante o sensor de imagem CCD.
- Use software de imagem para exibir imagens de ambas as câmaras. Os passos seguintes (2.3.1 - 2.3.4) aplicam-se a StreamPix 5 com módulo SimulPix e deve ser adaptada para outro software de imagem multi-câmera.
- Abrir StreamPix 5 e selecione "espaço de trabalho" na fita tarefa.
- Abrir "gerente da área de trabalho", localizada na extremidade direita da tela e selecione "novo espaço de trabalho".
- Depois de nomear uma câmera, siga software pede para selecionar um capturador de uma lista pré-preenchida. Selecione o grabber combinando o modelo da câmera e repita para o segundo espaço de trabalho da câmara. Para a área de trabalho mesclado, repito mais uma vez, mas "todas as câmeras estão em uso" erro mENSAGEM aparecerá. Esta mensagem é normal.
- Uma vez que o espaço de trabalho resultante da fusão é carregado, atribuir câmeras de espaço de trabalho um espaço de trabalho e 2 para o espaço de trabalho incorporada no painel de encaixe localizado no lado direito do ecrã de visualização.
- Alinhe as câmeras no sistema de separação, emissão câmera dual.
- Alinhar as câmaras em campo brilhante ou de contraste de fase com a grelha de calibração fornecidas pelo fabricante, utilizando uma objectiva 40X PlanApo (ou maior).
- Enviar luz para as oculares do microscópio, coloque a grelha de calibração revestido de metal que foi fornecida pelo fabricante no palco microscópio e Praça da grade no palco microscópio.
- Traga a grade em foco.
- Deslocar, mas não remova, o alojamento dicróica para alinhar a câmera 1 (câmera manual). Exibir a grade sem binning e sem autoscaling. Foque a imagem usando o botão de ajuste de foco no porta C-mount 1.
- Empurrar a caixa para o duplo dicróico Circuitosl dispositivo de aquisição totalmente, de modo que a imagem é dividida pelo dicróico para ambas as câmaras.
- Solte os três 5/64 "set parafusos e gire a segunda câmera na fêmea de montagem C 2 até que a orientação da rede é idêntico em ambas as imagens. Usando o botão de ajuste do foco em C-mount porta 2, trazer a imagem da câmera 2 em foco.
- Finalize o alinhamento usando a imagem combinada no espaço de trabalho resultante da fusão do software de imagem. Isto permite que se veja uma pseudo sobreposição em tempo real das duas imagens da grelha de calibragem. Ajustar a posição da imagem combinados utilizando apenas o botão R / L, no lado direito da DC2. Ajuste este botão até que limite vertical direita / esquerda das imagens é precisamente alinhadas.
- Use o botão L / D para ajustar o alinhamento up / down da segunda imagem até que as barras da grade horizontal estão devidamente alinhados.
- Se durante o alinhamento para cima / baixo uma ligeira rotação da câmera ocorre, corrigir este problema, soltando os três 5/64 "polegadas screws para câmera de 2 e gire até que a imagem exibida está bem alinhada.
3. Preparação de células de câncer de placas paralelas de fluxo Câmara Adesão Assay
- Culturas células BT-20 do cancro da mama em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com meio completo com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C e 5,0% de CO 2, como descrito anteriormente 2.
- Células de câncer de colheita com um tratamento diluída tripsina e contagem de células com um hemocitômetro.
- Lavar e suspender as células em 10 7 células / ml em 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS com cálcio e magnésio (DPBS +).
- Dilui-se os anticorpos primários, ratinho purificada CD24 anti-humano e de rato purificada HECA-452 (anti-antigénios sialofucosylated), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 minutos 9, 10.
- Células centrifugar a 1.200 rpm para obter um pellet de células. Aspiclassificar o anticorpo primário, e lavar as células duas vezes com 0,1% de BSA DBPS +.
- Dilui-se anticorpos secundários, de cabra anti-IgG de ratinho AlexaFluor 568 (emissão máxima, 603 nm), e de cabra anti-IgM de rato AlexaFluor 488 (emissão máxima, 519 nm), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 min.
- Lave as células duas vezes e suspensão em 0,1% de BSA DPBS + a 10 6 células / ml em 0,1% BSA DPBS +.
4. Preparação de Reactive Substrato para Placa Paralela Fluxo Câmara Adesão Assay
- Conectar dois comprimentos separados de tubo para as portas de entrada e de saída da câmara de fluxo de placas paralelas que se encaixa dentro de 35 mm de cultura de tecidos prato. Um tubo vai ligar ao reservatório de células marcadas em suspensão em 0,1% de BSA DPBS + e o outro para a bomba de seringa, que irá retirar o fluido a uma taxa de fluxo especificada.
- Ligar uma linha de vácuo para a câmara de fluxo 1.
- Posicione a câmara de fluxo ao longo de 35 mm de cultura de tecidos dish contendo uma monocamada de células de ovário de hamster chinês que expressam E-selectina (CHO-E). As células CHO-E foram cultivadas em meio completo MEM a 37 ° C e 5,0% de CO 2 2.
- Ajustar a câmara de fluxo e / ou junta câmara de fluxo para assegurar um selo de vácuo adequada 1.
- Retire fluido do reservatório, monitoramento da montagem de câmara de fluxo para vedação adequada e nenhuma evidência visual de formação de bolhas de ar 1.
- Coloque o conjunto câmara de fluxo em microscópio (Leica DMI 6000B) 1.
5. Duas cores Aquisição de Imagem
- Poder fonte Leica EL-6000 luz compacta, ou dispositivo similar, para gerar luz de alta intensidade e par-a em um guia de luz. Use um microscópio invertido para passar esta luz através de um filtro de combinação do cubo, ou seja, G / R (verde / vermelho) cubo de filtro, para excitar fluoróforos de uma cor / intensidade desejada.
- Certifique-se de habitação dicróica está na posição correcta de funcionamento (deprimido) enão está no modo manual.
- Operar microscópio de fluorescência no modo e selecionar adequada cubo de filtro de fluorescência (verde / vermelho).
- Determinar o tempo de exposição e ganho de câmera 1 (vermelho, 620 ± 60 nm) e câmera de 2 (verde; 535 ± 40 nm).
- Pressione a dicróica para obter imagens em ambos os canais de emissão de vermelho e verde. Usar um ensaio de câmara de fluxo com células marcadas com apenas o fluoróforo vermelho, e obter uma imagem no canal vermelho, ajustando o tempo de exposição da câmara 1 em "configurações vivo" do software de imagem.
- Combine o tempo de exposição de 2 a câmera o tempo de exposição da câmera 1. Se uma imagem é observada no canal verde, artefactos de purga estão presentes e tempo de exposição, em ambas as câmaras tem de ser reduzida.
- Manter o tempo de exposição equivalente em câmera 1 e câmera de 2, reduzir o tempo de exposição até que o artefato de sangria-through não é mais visível no canal verde. Ajuste o ganho da câmera 1 para melhorar a imagem visibility no canal vermelho, se necessário.
- Repita os passos 5.4.1 - 5.4.3 com células marcadas apenas com o fluoróforo verde, mas definir o tempo de exposição com a câmera de 2 a células de imagem no canal verde, sem artefatos sangram-through no canal vermelho coletadas pela câmera 1.
- Anticorpos Retitrate se artefatos sangram-through não podem ser eliminados 11, ou se os tempos de exposição da câmera e uma câmera de 2 são substancialmente diferentes de tal forma que se fundiu imagens podem ser temporariamente desalinhado.
- Use um software de imagem para visualizar as imagens capturadas simultaneamente a partir de duas câmeras CCD monocromático no experimento câmara de fluxo.
- Mesclar imagens recolhidas a partir de ambas as câmaras, utilizando o módulo de SimulPix Streampix 5 ou um pacote de software alternativo.
- Use ajustes de correção digitais em SimulPix ou software alternativo para alinhar espacialmente as imagens incorporadas, se necessário. As imagens podem ser corrigidos com o módulo SimulPix para horizontal, verticale ajustes de rotação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um ensaio de adesão câmara de fluxo de placas paralelas foi utilizado para demonstrar um sistema de separação de emissão de câmara dupla que simultaneamente capturado sequências de imagens em tempo real em dois canais de emissão (Figura 1). O sistema de separação de emissão de câmara dupla detectado células BT-20, que foram marcadas por fluorescência com CD24 anti-humano e HECA-452 (detecção de antigénios sialofucosylated) anticorpos monoclonais e anticorpos secundários adequados (Figura 2). Algumas células rolando exibido sinais vermelhos (CD24) Ainda sinais verdes indetectáveis (HECA-452), outros sinais exibidos verdes e sinais vermelhos indetectáveis, e ainda outras células exibidos tanto vermelho e verde sinais (Figura 2). Canais de emissão fundidos revelaram a distribuição e uma co-localização de CD24 e moléculas sialofucosylated na superfície de células BT-20 de rolamento em e aderir a monocamadas de células CHO-E (Figuras 3 e 4). A câmera dupla spli emissãosistema tting originalmente tinha uma imagem ligeiro erro de alinhamento devido ao alinhamento das câmeras, mas esse erro foi corrigido com ajustes digitais (Figura 5), utilizando o módulo de SimulPix StreamPix 5. Ao todo, o sistema de separação de emissão de câmara dupla tem a resolução espacial, temporal e óptica necessária para revelar características celulares e moleculares em aplicações tais como ensaios de adesão câmara de fluxo, em que as células se movem rapidamente através do campo de visão.
Figura 1. Ilustração de um sistema de separação, câmera dupla emissão para a aquisição de imagens em um ensaio de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Uma bomba de seringa é usada para aspergir células sobre substrato na câmara de fluxo de placas paralelas. O sistema de separação de emissão de câmara dupla conectada a um microscópio de epifluorescência invertido usa uma dicróica mirror e cubos de filtro para dividir e filtrar os canais de emissão em duas câmaras. Estas câmeras capturar simultaneamente duas sequências de imagens idênticas, mas espacialmente específicas do fluoróforo. Um computador equipado com software de imagem multi-câmera é usado para mesclar e gravar sequências de imagens de cada canal de emissões.
Figura 2. Um sistema de separação de emissão de câmara dupla foi utilizado para o tempo real de imagens simultânea de um ensaio de adesão de placa da câmara de fluxo paralelo. Células BT-20 marcadas com (1), CD24 anti-humano e anti-rato IgG AlexaFluor 568 (pseudocolored vermelho, emissão máxima, 603 nm; câmera 1, 620 ± 60 nm) e (2) HECA-452 e anti-rato IgM AlexaFluor 488 (pseudocolored verde, emissão max 519 nm; câmera de 2, 535 ± 40 nm) foram perfundidos sobre uma monocamada CHO-E a tensão de cisalhamento = 1 dina / cm 2. Câmera dupla fundiu imagos revelam heterogeneidade dentro de uma população de células de laminagem e pode ser utilizado para caracterizar os comportamentos de laminagem baseados na expressão de moléculas da superfície celular. Barra de escala = 100 pm. Imagem adquirida com uma objetiva de 10X.
Figura 3. A seqüência temporal de imagens fundidas capturados por um sistema de separação de emissão de câmara dupla mostrando BT-20 células expressando CD24 moléculas (vermelhas pseudocolored) e sialofucosylated (pseudocolored verde) rolando em uma monocamada CHO-E a tensão de cisalhamento = 1 dina / cm 2. Câmaras mantida a resolução óptica e temporal para controlar recursos de células em uma célula de caída "sobre a extremidade final", como laminados sobre o substrato reactivo no sentido do fluxo. As setas brancas indicam um grupo de lagartas de moléculas da superfície celular. Sinais de emissão em cada canal foram pseudocolored e se fundiram na isoftware maging. Note-se que os sinais aparecem colocalized amarelo / laranja. As imagens estáticas foram exportados a partir de sequências de imagens em tempo real em momentos mostrados. Escala da barra = 10 m. Imagens adquiridas com uma objetiva de 40X.
Figura 4. Sistema de separação de emissão de câmera dupla revela co-localização de CD24 (pseudocolored vermelho) e moléculas sialofucosylated (pseudocolored verde) expressas por um representante BT-20 de células de câncer de mama rolando em uma monocamada CHO-E. Expressão heterogênea de (A) e CD24 (B) sialofucosylated moléculas na superfície celular, é enfatizado em cada imagem. (C) co-localização de moléculas aparece como amarelo / laranja pseudocolored pontos quando os canais de emissão pseudocolored vermelhos e verdes são mescladas. Diâmetro da célula é de cerca de 10 um. Wi imagens adquiridasª objetiva de 40X.
Figura 5.Adjustments nas configurações espaciais horizontais, verticais e de rotação de imagens capturadas em câmera 1 e câmera de 2 pode melhorar o alinhamento espacial na imagem mesclada. Alinhamento adequado é fundamental para retratar com precisão como as células estão aderindo e rolando no ensaio de adesão . (A) A imagem resultante da fusão de uma única célula a BT-20 está desalinhado devido ao posicionamento da câmara. (B) o alinhamento espacial é melhorada com ajustes de software no módulo SimulPix de StreamPix 5. (C) Outros ajustes de software alcançar o alinhamento quase perfeito. Barra de escala = 2 m. Imagens adquiridas com uma objetiva de 40X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O sistema de separação de emissão de câmara dupla tem a resolução espacial, temporal e óptica necessária para capturar imagens de alta qualidade em aplicações onde a célula ou o movimento molecular é rápido. Em gerando os resultados representativos, os parâmetros do sistema de separação de emissão de câmara dupla, incluindo as configurações de software e as configurações da câmera, foram otimizados para obter uma sequência imagem mesclada em que rolamento e as células aderentes foram espacialmente e temporalmente alinhados. Esta etapa de otimização é fundamental, pois o desalinhamento pode resultar em imagens que não transmitem adequadamente o fenômeno físico sob investigação, por exemplo, uma única célula observada a rolar em ambos os canais verde e vermelho pode aparecer como duas células que rolam no espaço de trabalho resultante da fusão. Alinhamento espacial deve ser alcançado na configuração do sistema de separação de emissão de câmara dupla quando as câmeras estão fisicamente alinhados conforme descrito no passo 2.4 do protocolo. Correções digitais para o alinhamento espacial das imagens captrado pelas câmeras pode ser aplicado para horizontal, vertical ou rotacional compensada (s) através de configurações de alinhamento digitais no software de imagem (passo 5.7 e Figura 5).
Alinhamento temporal entre as imagens capturadas pela câmera e uma câmera de 2 pode ser conseguido ajustando as configurações de "ao vivo" das câmeras: o tempo de exposição, compensação e ganho. Ganho e offset pode ser ajustada sem afetar o alinhamento temporal das imagens fundidas, ainda desvios no tempo de exposição definido pelo usuário entre câmeras pode resultar em desalinhamento. Assim, o ganho pode ser ajustado para compensar a diferença entre os tempos de exposição utilizados para recolher imagens em cada câmara. O ideal é que apenas deve ser permitido diferenças no tempo de exposição entre as câmeras quando ajustes de ganho parecem comprometer significativamente a qualidade da imagem. Alternativamente, as experiências de titulação de anticorpos podem ser realizados para optimizar a marcação celular para compensar as diferenças de tempo de exposição necessários para cada câmara (a) devido às suas propriedades inerentes de cada fluoróforo ou (b), devido a diferenças nos níveis de expressão moleculares detectados por cada anticorpo / fluoróforo. No entanto, também deve notar-se que as experiências de titulação de anticorpos são as melhores práticas para evitar artefactos de purga (passo 5.4.5) 11.
Embora o sistema de separação de emissão de câmara dupla foi usado para simultaneamente imagem duas moléculas-alvo em canais separados de emissão, as tecnologias alternativas são capazes de capturar imagens simultaneamente em vários canais de emissão. Estes sistemas de imagem variam de câmeras de cor única para microscopia confocal, e cada um tem vantagens e desvantagens em relação à qualidade de imagem, velocidade, e custar 12-17. Em particular, state-of-the-art microscopia confocal de varredura a laser que incorporam scanners de ressonância são sistemas de imagem multi-espectral impressionantes, capazes de adquirir imagens em centenas de quadros por segundo. Estes sistemas confocal são extremamente poderosos,mas seu custo pode limitar o número de pesquisadores que têm acesso a estes sistemas através de instalações nucleares. Em última análise, as necessidades de investigação e recursos de cada ditame laboratório que sistema de imagens multi-canal é o mais apropriado.
Os métodos aqui descritos explicam como obter sequências de imagens em tempo real em dois canais de emissão, utilizando um sistema de dupla emissão câmera divisão e software de imagem. Alinhamento espacial e temporal das imagens capturadas em dois canais de emissão por câmeras CCD monocromático semelhantes é essencial para a produção de em tempo real sequências de imagens fundidas de alta qualidade que revelam simultaneamente múltiplas moléculas-alvo em células. As candidaturas para o sistema de separação de emissão de câmara dupla inclui qualquer de duas cores análise de células vivas que exige resolução óptica e temporal excepcional de um campo cheio de vista, tais como ensaios de caudal, a translocação de moléculas de superfície celular, a remodelação do citoesqueleto, o transporte vesicular, e de partículas em 3D rastreamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Douglas Goetz (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade Ohio) e Dr. Fabian Benencia (Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade Ohio) para discussões criteriosas e revisão do manuscrito. Agradecemos também o Dr. Christopher Huppenbauer para discussões úteis técnicas (W. Nuhsbaum Inc.). Este trabalho foi financiado por concessões do National Science Foundation (CBET-1106118) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R15CA161830-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix | ||
References
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
