Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Published: August 31, 2013 doi: 10.3791/50617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Bacteriology & Parasitology, Tulane National Primate Research Center, Tulane University Health Sciences Center

Summary

Lyme hastalığı Kuzey Amerika'daki en sık bildirilen vektör kaynaklı bir hastalıktır. Etkeni, Borrelia burgdorferi keneler kene ile bulaşan bir spioket bakteridir. Hayvan modellerinde enfeksiyonun İletim ve saptama burada açıklandığı kene besleme, kullanılmasıyla optimize edilir.

Abstract

Lyme hastalığı, Borrelia burgdorferi etken İletim, memeli bilgisayarlar üzerinde kene Ixodes türlerin eki ve kan beslenmesi ile oluşur. Doğada, bu zoonotik bakteriyel patojen rezervuar konak çeşitli kullanabilirsiniz, ancak beyaz ayaklı fare (Peromyscus leucopus) Kuzey Amerika'da larva ve nimf keneler için birincil rezervuar olduğu. İnsanlar en sık B ile enfekte arızi ana nimf aşamasında. B. kene ısırması ile burgdorferi burgdorferi enzootik döngüsü boyunca onun ana uyarlar, böylece memeli konaklarda bu spiroketlerine ve bunların etkileri fonksiyonlarını keşfetmek yeteneği kene besleme kullanımını gerektirir. Buna ek olarak, (tespiti ve bulaşıcı bir maddenin geri kazanılması için doğal vektörü kullanılarak) xenodiagnosis tekniği şifreli enfeksiyonun çalışmalarda yararlı olmuştur. Elde etmek amacıyla nimf o liman B. keneler burgdorferi,Keneler kılcal tüpler aracılığıyla kültür canlı spiroketlerine beslenir. İki hayvan modelleri, fare ve insan olmayan primatlar, en çok kene besleme ilgili Lyme hastalığı çalışmaları için kullanılır. Biz, bu keneler üzerine beslenir ve enfeksiyon veya xenodiagnosis biri için hayvanlardan elde edilebilir olan yöntemleri göstermektedir.

Introduction

2011 yılında, Lyme hastalığı Kuzey Amerika'da (6. en yaygın Ulusal Bildirimi zorunlu hastalık oldu http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi hem genetik ve antijenik (1 gözden), çok yönlü bir mikroptur. Onun genetik anayasa büyük (> 900 kB) kromozomu içeren ve plazmid içerik izolatlar arasında değişen 21 plazmidler (12 doğrusal, dairesel 9), kadar. Çok plazmid açık okuma çerçevelerinin% 90 üzerinde bilinen herhangi bir bakteriyel dizilerine 2,3 ilgisiz olarak, bu spiroketlere öğrendim olmaktır. B. burgdorferi konak bağışıklık potansiyel hedefler olarak antijenleri geniş bir yelpazede sunar. Bununla birlikte, işlenmemiş bir enfeksiyon genellikle devam eder. Kene çevre ve omurgalı konak çevre ile spiroketlerine etkileşim B. tarafından alınmasını gerektirir Enfeksiyon süreci boyunca burgdorferi. Çeşitli plasmidle kodlanmışgenler farklı olarak sıcaklık, pH, hücre yoğunluğu ve kene ömrü 4-8, hatta aşamasında değişikliklere yanıt olarak ifade edilebilir olduğu bilinmektedir.

B. Çalışma doğal yoldan neden olduğu enfeksiyona takip eden enzootik döngüsü boyunca burgdorferi adaptasyon ve konakçı tepkileri uygun hayvan modelleri üzerinde keneler beslemek için yeteneğine dayanır. Bu tür çalışmalar B. liman kenelerin üretme teknik zorlukları ile karşılanmaktadır burgdorferi ve modeli konak üzerinde kene verimli iletim ve / veya besleme sağlanması. Buna ek olarak, enfekte kenelerin tutucu ve geri gereklidir. Kullanılan modeller arasında farenin ve Lyme hastalığı araştırmalarında değerli bir araç olarak hizmet eder, her biri insan olmayan primatlar, bulunmaktadır. B için doğal bir rezervuar bir ana beyaz ayaklı fare gibi burgdorferi, laboratuvar fare B. tarafından kalıcı enfeksiyon destekleyen son derece duyarlı bir ana 9 burgdorferi. FolBöyle C3H suşu olarak hastalığa duyarlı farelerin enfeksiyonu lowing, spiroket cilt, mesane, kas, eklem ve kalp dahil olmak üzere birden dokulara yaymak. Neden olduğu enfeksiyona enflamatuar tepkiler hastalıklı kalp ve eklem dokusu yol açar. Spiroket bu ana inat ve bulaşıcı devam ederken, iltihabi lezyonlar değil insanlarda sürecinin aksine, aralıklı olabilir. Fare modeli böylece B. fazla bilgi vermiştir artrit ve karditis ve bağışıklık tepkileri dahil olmak üzere 10-12 ev burgdorferi kaynaklı patoloji,. Kene vektör 13-21 aktarım için bazı gerekli olması halinde patojenin açısından bakıldığında, farklı olarak memeli enfeksiyon sırasında ifade edilen bazı genlerin, karakterize edilmiştir.

Çeşitli hayvan türlerinin Lyme hastalığı 22 incelemek için kullanılmış olmasına rağmen, rhesus macaques en yakın insan hastalığı 23'ün çoklu organ karakter taklit eder. Diğer aksinehayvan modelleri, örneğin eritema migrans, Kardit, artrit ve periferal ve merkezi sinir sistemleri nöropati gibi hastalık belirtileri genişliği makaklarda gözlenmektedir. Farelerde, B. ana hazne erken ve geç-yaygın belirtileri nadir 9 iken burgdorferi, hastalık, fare zorlanma ve 24 yaş ile değişir. Buna ek olarak, diğer kemirgenler, Lagomorphs ve köpek her B'den nörolojik hastalık sergilemek başarısız burgdorferi enfeksiyonu 25. Önemlisi, makaklar Lyme borreliosis, yani, erken lokalize, erken yaygın, ve geç evre Lyme hastalığının 26-28 her üç aşamadan karakteristik belirtileri gösterirler. Eritem migranlan (EM) insan vakalarının 29% 70-80 meydana düşünülmektedir, ve aynı zamanda rhesus makaklarda 28,30 görülür. Enfeksiyonu takiben spiroket çoklu organ inokülasyon sitesinden yaymak. Spirochetal DNA iskelet mu tespit edildiscles, kalp, safra kesesi, periferik sinir ve sinir ağı, hem de merkezi sinir sistemi (beyin, beyin sapı ve beyincik, omurilik ve dura mater) 31.

Rezervuar yetkinlik 32-36 inceleyen ve B. çalışmalarda kene fareler üzerinde beslemek, kene kolonilerinin yayılması için bize ve diğer araştırma ekipleri tarafından kullanılmıştır burgdorferi 37-40 patogenezine. Bu teknik aynı zamanda xenodiagnosis ve farelerde 41-44 aşı etkinliğinin test edilmesi için kullanılmıştır. Biz Ixodes model geliştirme 28 için maymunları üzerinde kene beslenen, aşı etkinliği 45 bir çalışma, sebat ve sonrası antibiyotik tedavisine 46 değerlendirilmesinde xenodiagnosis için. O liman B. Keneler burgdorferi spiroket yaşam evrelerinde üzerinden iletilen olarak, enfekte fareler üzerinde larva besleme ve çalışmalar için perileri kullanılarak doğal bir enzootik döngüsü içinde muhafaza edilebilir. Bu rapordaBiz vahşi tip veya mutant B ile enfekte kene oluşturmak için nasıl talimat burgdorferi, kılcal tüp besleme kullanarak. Bu da mikroenjeksiyon ile 47 ve daldırma 48 ile gerçekleştirilebilir. B. yapay getirilmesi amacı keneler, kimin iletebilirliği bilinmeyen mutant suşlar çalışma olabilir, yüksek enfeksiyon oranı ile keneler bir grup oluşturmak için, ve bir temiz ve aksi bulaşmamış kene koloniyi koruyarak hata potansiyelini azaltmak için içine burgdorferi. Tutma ve dolu kenelerin iyileşme sağlamak için, böylece ek olarak,, fareler ve insan olmayan primatlar üzerinde kene besleme göstermektedir. Kene beslenmenin kullanımı B. bağışıklık tepkilerinin gelecek çalışmalar için gerekli olan burgdorferi enfeksiyonu, olası Lyme aşı etkinliği ve gizli enfeksiyonların tespiti için xenodiagnosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Lyme hastalığı araştırma için hayvanlar üzerinde kene aşılama ve besleme deneysel taslağı Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1.. Aşılayarak Nymphal Ixodes B ile keneler Kılcal Tüp-besleme kullanarak burgdorferi

Kene ile manipülasyonlar yaparken, elastik kollu, eldiven ve tek bouffant kapakları beyaz laboratuvar mont giyilir.

  1. Bizim teknik Broadwater ark. 49 tarafından bildirilen değiştirilmiş bir versiyonu. Bir pipet çektirmenin kullanarak kırma inceliği Pasteur pipetlerini ısıtma ve çekerek kılcal tüpleri hazırlayın. Forseps kullanma ve diseksiyon kapsamı, optimum çapı (yaklaşık 0.2 mm) için ipuçları bölünürler. Kene mouthpart boyutuna standart bir tüp, bir boyutlandırma kılavuz olarak kullanılır. Pipetlerini hazırlarken bir yüz maskesi giyilmelidir.
  2. B'yi büyüyecek BSK-H ortamı (Sigma) içinde 10 x con 2-8 7 / ml (orta log fazı) burgdorferi% 6 tavşan serumu yakıtını içerir.
  3. 4-6 hafta sonrası larva dökücü için 23 ° C'de saklanan nimf kenelerin kullanın. Yeri yemeğin dış alt yüzeyinde çift taraflı bant ile bir küçük 60 x 15 mm petri üzerine keneler. Yukarı bakacak keneler ventral tarafı yerleştirin.
  4. B. içine kılcal boru ucu batırın Karıştırma sonrası burgdorferi kültür tüpü. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak kene ağız parçaları hypostome üzerinde kılcal tüpü yerleştirin. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, yerinde tüp düzeltmek için döküm kil kullanın.
  5. Çevreleme bir katma düzeyi için büyük bir saydam plastik küvet içinde yapıştırılmış kene ile petri kapları yerleştirin. Islak kağıt havlular nem temin etmek üzere ilave edilir. Defekasyon belirgin olana kadar 30 dakika-2 saat boyunca 37 ° C ısı inkübatör keneler yerleştirin. Bu spiroketlerine içeren ortam kene geçti gösterir.
  6. Beslemeden önce kene çevreye uyum sağlamak için 23 ° C'de 2-4 hafta boyunca keneler dinlendirinhayvanlar üzerinde onları.

2. B. Fareler bulaşmasını Kene tarafından burgdorferi

  1. , Steril su içinde ketamin stokları 1:10 seyreltin. Bir tüberkülin şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin 100 mg / kg, her fare anestezisi
  2. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, geri (Remington pürüzsüz ve ipeksi) elektrik düzeltici cezasına kullanarak orta kulakları fare tıraş.
  3. Başka nesneler ile beyaz bir tavada yakın, fare tüysüz bölgeye nemli bir fırça ile nimf keneler (o liman B. burgdorferi) aktarın. Seçenek olarak ise, enfekte olmamış keneler şüpheli enfeksiyon ile farelerin xenodiagnosis için fareler üzerinde yerleştirilebilir. Kene yerleştirme için temiz, beyaz bir yüzey kullanımı herhangi bir bekâr kenelerin kolayca görülebilir sağlamak için yardımcı olur.
  4. Uzman caging (Allentovvn Caging Allentovvn, PA) fare yerleştirin. Kafes Kafesin altından yükselen bir paslanmaz çelik ızgara oluşur. TO kafes üst altındaki fare serbest hareketine izin vermek için yeterince su şişesi tutucu yükseltmek bizim in-house makine atölyesi tarafından modifiye edildi. Pan tuzak su yaklaşık ½ inç fareleri (Şekil 3A) düşmek herhangi bir kene ile doludur. Fareler anestezi tamamen uyanmak kadar hipotermi riskini en aza indirmek için, mikro dalgada yeniden ısıtma pedleri, kullanımdan önce, kafeslere altına yerleştirilir. Anestezi ve gıda ve su tepsiler karşı ovmak kurtarmak gibi hayvanlar genellikle Ataksik, bu nedenle bu çıkarılmalıdır. Su seviyesi altında kalma farelerin bacaklarda önlemek için yeterince düşüktür.
  5. Eklembacaklıların sürüklenmesini sağlamak için Arapsaçı tuzak macunu (Contech, Victoria, BC, Kanada) ve bant ile kaplı olan bir tepsinin içine kafes yerleştirin. Fareler tek başına kafesli ve anestezi süresince sürekli izlenir.
  6. Fareler anestezi tamamen uyanık olduğunda 2 saat içinde, yemek tepsisi ve su şişesi kafese değiştirilir. 2 sonra4 saat, plastik bir kulübe ve Nylabone kapsayan muhafaza zenginleştirme değiştirilir.
  7. 3, 4 ve 5 gün sonra, beslenen keneler için fare, kafes ve kafes suyunu kontrol edin. Kafes su (yani "altın kaydırma") bir beyaz metal bir tavada elenirken. Beslenen temiz suyla durulayın keneler ve plastik kavanoz (Şekil 3B) saklayabilirsiniz. Günde 3 ve 4, temiz su ile kafes su değiştirin. 5. günde, kafes, ancak kene iyice fareyi sadece kontrol edin. Genellikle bu noktada bütün keneler beslenen ve fareler normal caging iade edilebilir.
  8. Otoklav ve bertarafı için biyolojik tehlike kaplarda, sıvı içeren fare kafesleri, tüm atık yerleştirin. Fareler ve her zaman iyileşmiş yerleştirilen kenelerin sayısının bir günlük tutun.

3. B. Enfeksiyon için primatlarla üzerinde Keneler Besleme burgdorferi veya xenodiagnosis

  1. Kene tutma cihazını hazırlayın: 3 inç x 1 ¾ inç çaplı daire kesiniz3 inç LeFlap (flep) temiz bir neşter ve ölçüm kılavuzunu kullanarak. Biatane köpük ve Duoderm özdeş büyüklükte daireler kesmek için bir şablon olarak cut-out kullanın. Köpük, cilt yüzeyi üzerinde kanadı yükseltmek ve kene olası kırma önlemek için kullanılır. Duoderm yastıklama başka bir katman ekler ve kene kaçış eklenen güvenlik için çevreleme cihazın kenarlarını bindirmeleri. Tutucu cihazın bir diyagramı Şekil 4 de gösterilmiştir.
  2. Veteriner personel kas içine enjeksiyon ile 5-8 mg / kg Telazol ile hayvan uyutmak olacaktır.
  3. Büyüklüğü 40 bıçakları ile donatılmış elektrik trimmer (Oster) kullanarak hayvanın saç Klip. Ceket tarafından karşılanacaktır tüm alanlar kırpılmış vardır: sırt, ön, üst kollar. Tıraş kremi ve çift bıçak tek jilet kullanarak, yakından x 20 cm yatay, dikey, yaklaşık 25 cm'lik bir alan tıraş. Nemli kağıt havlu ile silerek temizleyin ve cildi kuru düşük ısı ile kuru darbe.
  4. T kapağı yerleştirino hayvanın sırtı sadece skapula altında, omurganın her iki tarafında yer alıyor. Bu noktada daire izlemek için bir kalem kullanın. SkinPrep ile silerek daire etrafında deri alanını hazırlayın. Bu tutkal ve muhafaza cihazları yapışmasını etkileyebilecek cilt yağı temizler. Daire çevresinde bir alan 1 cm çevresi boyunca bırakarak-4 sm bir genişliğe sahip deri yapıştırıcı (SkinBond) bir tabaka uygulanır.
  5. Biatane köpüğü yapışkan destek çıkarın ve uygun bir noktada cilde yapıştırmayın. Hayvanlar daha 5 mg / kg Telazol veteriner personeli ile anestezi altına alınır. Cilt tutkal ve Hypafix bant ile kenarları mühür. Kanadın yapışkan destek çıkarın ve Biatane üstüne yapıştırın. LeFlap kenarlarında Hypafix bandı yerleştirin, daha sonra flep örgü kanadını aşağı bant ve hayvan üzerinde ceket yerleştirin. Bant ve Arapsaçı Trap macunu ilave güvenlik için insan olmayan primat caging çevreleyen bir çevre içinde kat uygulanır.
  6. Chemic etkilerini en aza indirmek içinçevreleme cihaz yerde sonra kene beslenmeye Adım 3.4 kullanılan als, keneler 24 saat eklenir. Bu noktada, cihazın güvenlik de kontrol edilir ve gerekirse güçlendirilir. Tipik haliyle, 20 beslenmemiş nimfleri (4-8 hafta sonrası larval dökücü) bir fırça ile cihaz içinde deriye eklenir.
  7. Kanadın ağdan yapışkan destek çıkarın ve yerine mühür. Son olarak, yapıştırıcı maruz Duoderm desteğini çıkartın, çevreleme cihazın üstüne yerleştirin. Açık örgü daire genelinde Hypafix bir parça bant ekleyin ve ceket değiştirin. Tamamlanmış tutucu aygıt Şekil 5A'da gösterilmiştir.
  8. 5 gün sonra, yukarıda olduğu gibi hayvanlar anestezi ve ceketler kaldırılır. Örgü (Şekil 5B) ile kene beslenmesini incelemek için ilk bandı çıkarın. Dikkatle uzak kanadın Duoderm soyun.
  9. Keneler erişim sağlamak için kenarlarında gözenekli kısmını geri çekin. Fed keneler sıklıkla yakın veya altında bulunurKöpük daire (Şekil 5C) ve bir fırça ile çıkarılır ve temiz su yerleştirilir. Cihazı bir kez tüm görünür beslenen keneler toplanır (Şekil 5D) sökün.

Not: Çoğu zaman, tutucu cihaz sadece uzak deriden sıyrılabilir. Yapışma güçlü ve potansiyel olarak cilde zarar olabilir, Unisolve çözgen uzaklaştırılması için hafif bir bölgeye uygulanır. Cilt izopropanol ile sildi ve keneler, 23 ° C'de saklanır Enfeksiyonu için kullanılırsa, keneler B ihtiva numarayı onaylamak için ezilebilir burgdorferi. xenodiagnosis için kullanılırsa, keneler önceki midgut içeriklerinin analizi için 1-3 hafta boyunca tutulur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu aktarım için hayvanlar üzerinde beslenir önce kılcal besleme tamamlanmasından sonra, keneler, genellikle 2-3 hafta boyunca 23 ° C'de dinlenmiş. Kılcal-besleme tekniği kullanarak, beslenen% 90 üzerinde liman B. keneler bulduk burgdorferi. pozitif kenelerin yüzdesi yıkama ile tespit edilir daha sonra bir mikrofüj boru şeklindeki havan tokmağı ile steril PBS içinde onları ezme, peroksit ve etanol keneler. Orta bağırsak içeriği PBS içine dökülen slaytlar üzerinde sabit ve FITC ile konjüge edilmiş bir anti-Borrelia türü antikor ile boyandı. Floresan mikroskop ile izlendi Temsilcisi kene ortabağırsak smear Şekil 2B-C tasvir edilir

Düşük geçit gerginlik B31 vahşi tip B. ile fare enfeksiyon oranları burgdorferi% 100 yakın. B. serolojisi ve kültür bir arada Fare dokularından burgdorferi her bir fare enfekte olup olmadığını belirlemek için kullanılır. A western blot showiB ile enfekte farelerden ng serum antikor tepkileri kene tarafından burgdorferi Şekil 3C gösterilmiştir. Bu teknik, B. bulaşıcılığını ve enfeksiyon incelemek için kullanılmıştır burgdorferi mutant 37-39 suşları.

Biz enfeksiyon ve xenodiagnosis için maymunları üzerinde kene beslenmesinde kullanılanlar var. Çabalar flep çevreleme cihazı uygulayarak kene beslenmesini ve tam beslenen keneler kurtarma geliştirmek için yapılmıştır. Flep ürün insanlarda tıbbi kurtçukların uygulaması için kullanılır, ama biz kene primatlar üzerinde beslemek için değiştirilmiş. Daha önceki çalışmalarda, biz kene muhafaza 27,28,45,46 için sert bir kapsül kullanılan ve 23,5-52,5% 35.2 arasında değişen ortalama% besleme oranı (# beslenen keneler / # kapsüllere eklenir keneler), elde. Enfeksiyon çalışmalarda, iletim (# hayvanlar enfekte / # üzerine beslenen) oranları% 86.5 ortalama. Daha yeni deneylerde, LeFlap kullanarak besleme oranları arasında olmuştur % 50-90. Nadir durumlarda, önceki yöntemi kullanarak keneler kapsül altında ve onlar kuruyacak ve ölmek yapışkan bant, içine sürünerek gelmiştir. Flep kullanılarak geliştirilmiş besleme ve yapışkan çoklu katmanlar bulunan keneler tutmuş.

Kene orta bağırsak hazırlanması (Şekil 2B-C) doğrudan floresan boyama ek olarak, daha hassas yöntemler B tespit etmek için kullanılabilir Kenelerin içinde burgdorferi. Moleküler algılama ve B tespit etmek için kullanılmıştır olabilir standart veya kantitatif ya PCR ile burgdorferi-spesifik DNA 42,50,51. Tespiti için ortak hedefler flab 46,50, OspC 46 ve OspA 42,51 genlerdir. Geri spiroketlerine canlılığı da ortabağırsak hazırlıkları kültürü tarafından incelenmiş ve beslenme xenodiagnostic naif fareler 42. keneler.

iles/ftp_upload/50617/50617fig1.jpg "/>
Şekil 1.. Borreliaburgdoferi İletimi için Hayvanlar Keneler Besleme. Beslenme ile ilgili tekniklerin genel şeması Lyme hastalığı çalışmaları için hayvanlar üzerinde kene. Keneler B. kılcal tüp beslenen kültürler vardır burgdorferi ve bu fareler ve insan olmayan primatlarda (Rhesus makak) olarak Lyme hastalığının hayvan modellerinde, üzerine beslenebilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2,. Kılcal tüp besleme yöntemi ve sonuçları. A) sağdaki kene ve kılcal borunun büyütülmüş görüntüsü gösterilmektedir keneler beslemek için kullanılan cihaz. BC) kenelerin midguts temsili görüntüleri B beslenir burgdorferi. ortabağırsak kobiars anti-Borrelia türe FITC poliklonal antikorlar (Kirkegaard & Perry Labs) ile boyanmış ve fluoresan mikroskop altında incelendi.

Şekil 3,
Laboratuvar fareleri üzerinde besleme Şekil 3.. Ixodes scapularis kene. A) kene beslenmesi için kullanılan fareler için özel kafes. Tel zemin kene toplamak için tavada su üstünde yükselir. Kene ile enfekte farelerde bir anestezi fare) doğru. B resimde gösterilmiştir keneler için kullanılan saklama kapları. C) Temsilcisi immünblotlarında. 21. günde serum Enfeksiyondan B içeren blot ile problandı burgdorferi lizatları ve rekombinant protein OspC, bir immünodominant antijen.

Şekil 4,
Yem için kullanılan kene çevreleme cihazın Şekil 4. Diyagramı yanaklı makaklarda keneler. Birinci katman Biatane köpük oluşur. Flep köpük üstüne yerleştirilir ve Duoderm üçüncü katman. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5. Ixodes scapularis kene-besleme Rh makaklarda üzerinde. A) tam çevreleme cihaz. B, cihaz yoluyla beslenmesi ve tamamen çıkarılmasını takiben flep kaldırılması. D) kene beslenmenin sitesi aşağıdaki kenelerin C) Görünümler cihaz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O liman B. keneler elde etmek için alt çalışmaları için burgdorferi, keneler şunlar olabilir: (1) larva aşamasında enfekte olan fareler üzerinde beslenen, (2) B daldırıldı ya larva veya nimf aşamasında 48-burgdorferi kültürler; (3) B. microinjected burgdorferi 47, ya da (4) kılcal boru beslenen B. 49. burgdorferi. bu yöntemlerin her biri, kene büyük bir kısmının enfeksiyon liman B için kullanılacak sağlamaktan amacına sahip iken, burgdorferi, biz kılcal tüp besleme lehine. Spiroketlerine bilinen miktarlarda aşı gerekli değilse, kılcal besleme yöntemleri keneler zarar daha az potansiyele sahip olabilir. Bu hayvanlar üzerinde beslenmeleri için ise, bu önem taşımaktadır. Araştırmacılar geçirgenlik / enfeksiyon için mutantlar test edilmiştir, bu yöntem de tercih edilebilir. Bu plasmid kaybına neden olabilir 52 kültür içinde büyümenin tanımak önemlidir, bu yüzden kullanımıdüşük geçit B. burgdorferi gereklidir. Ayrıca, spiroketlerine orta yoğunluk ve verilme üzerine yapay, yani keneler post-kapiler besleme hemen kullanılmamalıdır. Spiroket deneylerde kullanılmadan önce kene mikro uyum Bunun yerine, en az 2 haftalık bir süre bırakılır.

Fareler üzerinde keneler besleme, bu daha önce fareler tıraş için gerekli değildir. Biz deri üzerinde kene tükürük etkilerini incelemek için çalıştı (yayınlanmamış) hangi bir önceki çalışmada, tıraş gerekliydi. B) yüksek besleme oranı ve c) kolayca görülebilir bir) tüysüz cilde kolayca eklemek: Bunu yaparken, ve karşı sezgisel, biz keneler olduğunu keşfetti. Yemleme larva veya nimf kullanılan bağlı olarak değişebilir ama perileri kullanıldığı zaman sürekli% 50 üzerindedir. Bu nedenle, önceki beslenmeye fareler tıraş deneyler için değil, aynı zamanda, koloninin yayılması için değil, laboratuarımızda yaygın bir uygulama haline gelmiştir. Daha önce, Tulane Ulusal Primat Araştırma Merkezi'nde bizim Bölümü'nde, 34 maymunlar 5 farklı çalışmalarda 770 Ixodes perileri tarafından üzerine beslenmiştir. 23,5-52,5% arasında değişen besleme oranları (# beslenen / # kapsüllere eklenir) ortalama% 35.2, kene. Enfeksiyon çalışmalarda, iletim ortalama% 86.5 oranları. (Yayımlanmamış) yeni bir pilot çalışmada, 5-75% arasında değişen oranlarını beslenme kene ve sonraki beslenmeye direnç belli oldu. Yemleme 2 nd için daha 3. girişim için çok daha fazla olduğu, ancak girişimleri 2 ve 3 arasında başarı oranları, önemli ölçüde değişmiştir. "Girişimi 2" keneler artık "girişimi 3" kene daha oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. Kene beslenmesini etkiler biz bulduk en önemli faktör kene yaş ve çevre ön deneydir. Kısa bir süre önce kullanmaya kadar 4 ° C sonrası dökücü tutulur olanlar genellikle daha iyi beslemek. Gibi, biz sürekli saklayarak, kenelerin propagandasını tavsiye accordingly ve hayvanlar üzerinde besleme yaparken mevcut kenelerin iki ayrı çok sahip.

Bizim en son çalışmada (yayımlanmamış) biz karşılaştırıldığında besleme flep cihaz ile besleme için sert kapsülü kullanarak makaklarda keneler. Ten maymunlar kapsüller ile bir kez üzerine beslenen ve iki kez LeFlap ile edilmiştir. Bu deney setinde, biz gözlenen ve kapsül ile% 17 (aralık% 5-25) ortalama besleme hızı ve flep ile 54.75 ortalama% oranı (aralık 35-90%). Biz kene beslenme ve sert yapıştırıcı kullanımının azaltılması için daha geniş yüzey alanı beslenmesini artırır olduğunu düşünüyoruz. Flep çevreleme kullanımı da müfettişler kene tüm cihazın çıkarılması olmadan kaldırılabilir gibi keneler, uzun beslemek veya daha fazla kene ekleyelim ya verir. Yapıştırıcılar bazı hayvanlarda (deri immün tepkilerini etkileyebilecek ya da neden olabilir) hafif cilt tahrişine neden olsa Son olarak, flap cihazın kendisi, eğer varsa, hayvanlar için rahatsızlık sınırlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar, teknik destek için Nicole Hasenkampf ve Amanda tardo teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr teşekkür ederim. Kılcal besleme yöntemiyle ilgili talimatlar için ıhlamur Hu ve Adriana Marques LeFlap muhafaza cihazı önerisi için, ve Dr Lise Gern. Bu çalışma NIH / NCRR Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) tarafından ve Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve hibe P51OD011104/P51RR000164 ile Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapı Programları Ofisi (OriP) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
BSK-H Sigma B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste Ladd research T-131
SkinPrep Allegro Medical Supplies 177364
LeFlap, 3" x 3" Monarch Labs
Hypafix tape Allegro Medical Supplies 191523
SkinBond Allegro Medical Supplies 554536
UniSolve Allegro Medical Supplies 176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4" Coloplast 3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border Convatec 187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller David Kopf Instruments Model 700C
Dark field microscope Leitz Wetzlar Dialux
Dissecting microscope Leica Zoom 2000
Mouse caging Allentown caging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porcella, S. F., Schwan, T. G. Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum: a comparison of functional genomics, environmental adaptations, and pathogenic mechanisms. Journal of Clinical Investigation. 107, 651-656 (2001).
  2. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390, 580-586 (1997).
  3. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35, 490-516 (2000).
  4. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 67, 3181-3187 (1999).
  5. Gilmore, R. D., Mbow, M. L., Stevenson, B. Analysis of Borrelia burgdorferi gene expression during life cycle phases of the tick vector Ixodes scapularis. Microbes & Infection. 3, 799-808 (2001).
  6. Ramamoorthy, R., Philipp, M. T. Differential expression of Borrelia burgdorferi proteins during growth in vitro. Infection & Immunity. 66, 5119-5124 (1998).
  7. Ramamoorthy, R., Scholl-Meeker, D. Borrelia burgdorferi proteins whose expression is similarly affected by culture temperature and pH. Infection & Immunity. 69, 2739-2742 (2001).
  8. Schwan, T. G., Piesman, J. Temporal Changes in Outer Surface Proteins A and C of the Lyme Disease-Associated Spirochete, Borrelia burgdorferi, during the Chain of Infection in Ticks and Mice. J. Clin. Microbiol. 38, 382-388 (2000).
  9. Barthold, S. W., de Souza, M. S., Janotka, J. L., Smith, A. L., Persing, D. H. Chronic Lyme borreliosis in the laboratory mouse. Am. J. Pathol. 143, 959-971 (1993).
  10. Barthold, S. W., de Souza, M. Exacerbation of Lyme arthritis in beige mice. Journal of Infectious Diseases. 172, 778-784 (1995).
  11. Barthold, S. W., Feng, S., Bockenstedt, L. K., Fikrig, E., Feen, K. Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi. Clin. Infect. Dis. 25, Suppl 1. S9-S17 (1997).
  12. Miller, J. C., Ma, Y., Crandall, H., Wang, X., Weis, J. J. Gene expression profiling provides insights into the pathways involved in inflammatory arthritis development: Murine model of Lyme disease. Experimental and Molecular Pathology. 85, 20-27 (2008).
  13. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13865-13870 (2000).
  14. Grimm, D., et al. Outer-surface protein C of the Lyme disease spirochete: a protein induced in ticks for infection of mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 3142-3147 (2004).
  15. Zhang, J. R., Norris, S. J. Kinetics and in vivo induction of genetic variation of vlsE in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 66 (1), 3689-3697 (1999).
  16. Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Borjesson, D. L., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population kinetics and selected gene expression at the host-vector interface. Infection & Immunity. 70, 3382-3388 (2002).
  17. Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population dynamics and prototype gene expression during infection of immunocompetent and immunodeficient mice. Infection & Immunity. 71, 5042-5055 (2003).
  18. Liang, F. T., Nelson, F. K., Fikrig, E. Molecular adaptation of Borrelia burgdorferi in the murine host. Journal of Experimental Medicine. 196, 275-280 (2002).
  19. Samuels, D. S. Gene Regulation in Borrelia burgdorferi. Annual Review of Microbiology. 65, 479-499 (1146).
  20. Gilmore, R. D., et al. The bba64 gene of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent, is critical for mammalian infection via tick bite transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 7515-7520 (2010).
  21. Fisher, M. A., et al. Borrelia burgdorferi σ54 is required for mammalian infection and vector transmission but not for tick colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5162-5167 (2005).
  22. Barthold, S. W. Animal models for Lyme disease. Laboratory Investigation. 72, 127-130 (1995).
  23. Pachner, A. R. Early disseminated Lyme disease: Lyme meningitis. American Journal of Medicine. 98, 30S-37S (1995).
  24. Barthold, S. W., Beck, D. S., Hansen, G. M., Terwilliger, G. A., Moody, K. D. Lyme Borreliosis in Selected Strains and Ages of Laboratory Mice. Journal of Infectious Diseases. 162, 133-138 (1990).
  25. Philipp, M. T., Johnson, B. J. Animal models of Lyme disease: pathogenesis and immunoprophylaxis. Trends in Microbiology. 2, 431-437 (1994).
  26. Roberts, E. D., et al. Pathogenesis of Lyme neuroborreliosis in the rhesus monkey: the early disseminated and chronic phases of disease in the peripheral nervous system. Journal of Infectious Diseases. 178, 722-732 (1998).
  27. Roberts, E. D., et al. Chronic lyme disease in the rhesus monkey. Laboratory Investigation. 72, 146-160 (1995).
  28. Philipp, M. T., et al. Early and early disseminated phases of Lyme disease in the rhesus monkey: a model for infection in humans. Infection & Immunity. 61, 3047-3059 (1993).
  29. Steere, A. C., Sikand, V. K. The Presenting Manifestations of Lyme Disease and the Outcomes of Treatment. N. Engl. J. Med. 348, T. reatment.N. .E. ngl.J. .M. ed. 348, 2472-2474 (2003).
  30. Pachner, A. R., Delaney, E., O'Neill, T., Major, E. Inoculation of nonhuman primates with the N40 strain of Borrelia burgdorferi leads to a model of Lyme neuroborreliosis faithful to the human disease. Neurology. 45, 165-172 (1995).
  31. Cadavid, D., O'Neill, T., Schaefer, H., Pachner, A. R. Localization of Borrelia burgdorferi in the nervous system and other organs in a nonhuman primate model of lyme disease. Laboratory Investigation. 80, 1043-1054 (2000).
  32. Mather, T. N., Wilson, M. L., Moore, S. I., Ribiero, J. M. C., Spielman, A. Comparing the Relative Potential of Rodents as Reservoirs of the Lyme Disease Spirochete (Borrelia Burgdorferi). American Journal of Epidemiology. 130, 143-150 (1989).
  33. Mather, T. N., Telford, S. R. Iii, Moore, S. I., Spielman, A. Borrelia burgdorferi and Babesia microti: Efficiency of transmission from reservoirs to vector ticks (Ixodes dammini). Experimental Parasitology. 70 (90), 55-61 (1990).
  34. Telford, S. R., Mather, T. N. 3rd, Adler, G. H., Spielman, A. Short-tailed shrews as reservoirs of the agents of Lyme disease and human babesiosis. Journal of Parasitology. 76, 681-683 (1990).
  35. Mather, T. N., Fish, D., Coughlin, R. T. Competence of dogs as reservoirs for Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi). J. Am. Vet. Med. Assoc. 205, 186-188 (1994).
  36. Telford, S. R., Mather, T. N. 3rd, Moore, S. I., Wilson, M. L., Spielman, A. Incompetence of deer as reservoirs of the Lyme disease spirochete. Am. J. Trop. Med. Hyg. 39, 105-109 (1988).
  37. Lin, T., et al. Analysis of an Ordered, Comprehensive STM Mutant Library in Infectious Borrelia burgdorferi: Insights into the Genes Required for Mouse Infectivity. PLoS ONE. 7, e47532 (2012).
  38. Lin, T., et al. Central Role of the Holliday Junction Helicase RuvAB in vlsE Recombination and Infectivity of Borrelia burgdorferi. PLoS Pathog. 5, e1000679 (2009).
  39. Jacobs, M. B., Norris, S. J., Phillippi-Falkenstein, K. M., Philipp, M. T. Infectivity of the Highly Transformable BBE02- lp56- Mutant of Borrelia burgdorferi, the Lyme Disease Spirochete, via Ticks. Infection and Immunity. 74, 3678-3681 (2006).
  40. Jacobs, M. B., Purcell, J. E., Philipp, M. T. Ixodes scapularis ticks (Acari: Ixodidae) from Louisiana are competent to transmit Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme borreliosis. J. Med. Entomol. 40, 964-967 (2003).
  41. Bockenstedt, L., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S., Fish, D. Detection of Attenuated, Noninfectious Spirochetes in Borrelia burgdorferi-Infected Mice after Antibiotic Treatment. The Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
  42. Barthold, S. W., et al. Ineffectiveness of tigecycline against persistent Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 54, 643-651 (2010).
  43. de Silva, A. M., Telford, S. R., Brunet, L. R. 3rd, Barthold, S. W., Fikrig, E. Borrelia burgdorferi OspA is an arthropod-specific transmission-blocking Lyme disease vaccine. Journal of Experimental Medicine. 183, 271-275 (1996).
  44. Fikrig, E., et al. Vaccination against Lyme disease caused by diverse Borrelia burgdorferi. Journal of Experimental Medicine. 181, 215-221 (1995).
  45. Philipp, M. T., et al. The outer surface protein A (OspA) vaccine against Lyme disease: efficacy in the rhesus monkey. Vaccine. 15, 1872-1887 (1997).
  46. Embers, M. E., et al. Persistence of Borrelia burgdorferi in Rhesus Macaques following Antibiotic Treatment of Disseminated Infection. PLoS ONE. 7, e29914 (2012).
  47. Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. , e2544 (2011).
  48. Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J. Med. Entomol. 40, 364-370 (2003).
  49. Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., de Silva, A. M. Glass Capillary Tube Feeding: A Method for Infecting Nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with The Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Medical Entomology. 39, 285-292 (2002).
  50. Hodzic, E., Feng, S., Holden, K., Freet, K. J., Barthold, S. W. Persistence of Borrelia burgdorferi following antibiotic treatment in mice. Antimicrob Agents Chemother. 52, 1728-1736 (2008).
  51. Bockenstedt, L. K., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S. W., Fish, D. Detection of attenuated, noninfectious spirochetes in Borrelia burgdorferi-infected mice after antibiotic treatment. Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
  52. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56, 1831-1836 (1988).

Tags

Enfeksiyon Sayı 78 Tıp İmmünoloji Enfeksiyon Hastalıkları Biyomedikal Mühendisliği Primatlar Muridae Keneler Borrelia Borrelia Enfeksiyonlar, Keneler Lyme hastalığı xenodiagnosis, Fareler insan olmayan primatlar hayvan modeli
Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Embers, M. E., Grasperge, B. J.,… More

Embers, M. E., Grasperge, B. J., Jacobs, M. B., Philipp, M. T. Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research. J. Vis. Exp. (78), e50617, doi:10.3791/50617 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter