Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

في هذه المقالة نقدم رقاقة ميكروفلويديك لتحليل خلية واحدة. أنه يسمح للالكمي للبروتينات الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة، ورسله الثاني عن طريق فحوصات الفلورسنت أو المناعية.

Abstract

نقدم جهاز ميكروفلويديك التي تمكن من تحديد كمية الجزيئات الحيوية داخل الخلايا في الخلايا وحيدة متعددة في نفس الوقت. لهذا الغرض، محاصرون الخلايا بشكل سلبي في منتصف microchamber. عند تفعيل طبقة تحكم، يتم عزل الخلية من حجم المحيطة في غرفة صغيرة. ويمكن بعد ذلك يتم تبادلها حجم المحيطة دون التأثير على الخلايا المعزولة. ومع ذلك، عند فتح وإغلاق قصيرة للغرفة، والحل في غرفة يمكن استبدالها في غضون بضع مئات من ميلي ثانية. ويرجع ذلك إلى العودة إلى الوراء من الغرف، والخلايا يمكن أن يتعرض لها حلول مختلفة بالتتابع بطريقة التحكم الى حد كبير، على سبيل المثال للحضانة، والغسيل، وأخيرا، تحلل الخلية. وmicrochambers مغلقة بإحكام تمكين الاحتفاظ المحللة، وتقليل والسيطرة على التخفيف بعد تحلل الخلية. منذ تحلل والتحليل تحدث في نفس المكان، ويتم الاحتفاظ حساسية عالية لأنه لا يوجد مزيد من دilution أو فقدان التحاليل يحدث أثناء النقل. وبالتالي فإن تصميم microchamber يتيح تحليل موثوق بها وقابلة للتكرار من الأرقام نسخة صغيرة جدا من الجزيئات داخل الخلايا (attomoles، zeptomoles) صدر من الخلايا الفردية. علاوة على ذلك، يمكن ترتيب العديد من microchambers في شكل مجموعة، والسماح للتحليل العديد من الخلايا في آن واحد، نظرا إلى أن تستخدم الأجهزة البصرية مناسبة للرصد. وقد استخدمنا بالفعل منصة لإثبات صحة مفهوم الدراسات لتحليل البروتينات داخل الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة والمرسلين الثاني بطريقة قابلة للقياس الكمي إما النسبية أو المطلقة.

Introduction

وقد كشفت العديد من الدراسات في الماضي خلية الى خلية الخلافات بين السكان زنزانة كبيرة 1-3، ولا سيما إشارات العمليات 4، أو مبالغ الجزيئات الحيوية مثل البروتينات داخل الخلايا 5،6، الأيض، والعوامل المساعدة 7،8. وتعتبر هذه التغاير أن يكون أهمية أساسية للتكيف الخلايا والتطور 9، ولكن أيضا أن تلعب دورا رئيسيا في ظهور والعلاج من الأمراض مثل السرطان 10-13. وبالتالي، دراسات على مستوى خلية واحدة هي من الفائدة المرتفعة في الأبحاث البيولوجية والدوائية، وخاصة إذا تكشف هذه الدراسات ردود مختلفة من الخلايا بعد العلاج مع المواد الكيميائية النشطة بيولوجيا.

في السنوات الأخيرة، وقد وضعت العديد من المنصات التحليلية التي تسهل تحليل الخلايا الحية واحدة أو التركيب الكيميائي لمحتوى الخلية. بينما الفلورسنت خلية تنشيط الفرز (FACS) هو الذهب الحادي وANDARD لتحليل الإنتاجية العالية جدا من الخلايا الحية واحدة، وطريقة لا يمكن أن تستخدم لتقدير حجم المركبات داخل الخلايا أو يفرز. وقد وعدت ظهور منصات ميكروفلويديك استراتيجيات تحليلية جديدة لتحديد المواقع، والمعالجة والمراقبة للخلايا واحدة. وتم التوصل إلى علامة فارقة في على microfluidics مع دمج PDMS مرن الصمامات التي حققتها الزلزال وزملاء العمل 14،15. هذه الصمامات هي مفيدة لأنها يمكن عزل مناطق في الرقاقة، مثل فصل ثقافتين 16. علاوة على ذلك، كانت قابلة للتطبيق وخاصة بالنسبة للتحليل خلية واحدة، وبالتالي يساعد على تقليل المشاكل التخفيف تحليلها. قوة هذا النهج للتحليل وحيدة الخلية وقد تجلى مؤخرا من قبل هانسن وزملاء العمل، الذي حلل التعبير الجيني من مئات الخلايا واحد في نفس الوقت 17.

عند استهداف البروتينات ونواتج الأيض، وتحليل أمر صعب جدا نظرا لعدم وجود مناسبةطرق mplification، وعدد كبير من مركبات مختلفة الحاضر، والاختلافات في الطبيعة الكيميائية. علاوة على ذلك، من المتوقع أن تكون موجودة بأعداد نسخة منخفضة في حدود بضع عشرة آلاف الجزيئات الحيوية داخل الخلايا 18 الأكثر، وبالتالي الطريقة التحليلية المستخدمة يجب أن يكون لديك حساسية عالية. فحوصات أكثر قوة مثل المناعية والمناعية انزيم مرتبط (ELISA) يصعب على الاندماج في الأجهزة ميكروفلويديك لأنها تتطلب العديد من الخطوات الغسيل والحضانة وكذلك تجميد السطح.

نظرا لهذه التحديات، فإنه ليس من المستغرب أن تم الإبلاغ سوى أمثلة قليلة حيث تم كميا البروتينات او نواتج على مستوى خلية واحدة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن دراسات على إفراز مركبات الفلورسنت 19،20. في الآونة الأخيرة، وقدم مع تنفيذ ELISA لتحليل يفرز (nonfluorescent) البروتينات من ثقافة الخلية (الخلايا THP-1) 21 واحد (طمناعية) الخلايا 10. استهداف البروتينات داخل الخلايا، شي وآخرون. تطوير جهاز ميكروفلويديك التي سهلت تحديد البروتينات داخل الخلايا لتحليل مسارات الإشارات في الخلايا السرطانية عن طريق والمناعية 11. ومع ذلك، تم تحديد كميات النسبية فقط من البروتينات، وكان يستخدم أي التضخيم الأنزيمية لزيادة إشارة للبروتينات وفرة منخفضة.

في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على الجمع بين محاصرة microdevice وحيدة الخلية مع المقايسات المناعية مضان 8 و 22 (الشكل 1). محاصرون الخلايا بشكل سلبي في الهياكل عقبة microsized، والتي تسمح العرض والصرف (السريع) من العوامل الكيميائية الأخرى المتوسطة ودون أي حركة الخلايا. صمام على شكل حلقة حول كل فخ يمكن عزل الخلية في حجم صغير جدا ("وmicrochamber"). وهذا صمام دفعتها مباشرة بعد إدخال عازلة الخلايا lysing (hypoosmolar)، وقال انهالامتحانات التنافسية الوطنية ومنع الجزيئات داخل الخلايا أو الجزيئات يفرز لنزع فتيل بعيدا. الأهم من ذلك، ونظرا لصغر حجم وحدة التخزين (625 رر) يتم تجنب تخفيف كبير من الجزيئات. علاوة على ذلك، منذ يتم تنفيذ تحلل والتحليل في في نفس الموقف في رقاقة، ليست هناك خسارة من analytes بسبب النقل. تصميم رقاقة الموصوفة هنا تضم ​​8 صفوف بالتناوب إما 7 أو 8 microchambers، بلغ مجموعها 60 microchambers. ودفعتها في غرف الصفوف، بحيث تنتفي صفة انتقال التلوث على طول الخط.

منصة يمكن استخدامها في تركيبة مع المقايسات مضان فضلا عن المقايسات المناعية (الشكل 1D). لهذا الأخير، أنشأنا بروتوكولات لتجميد الأجسام المضادة، التي تتوافق مع إنتاج رقاقة وعملية التجميع. وبالتالي منصة يفتح الطريق لفحوصات حساسة وموثوقة وقابلة للقياس الكمي على مستوى خلية واحدة. حتى الآن، وقد استخدمنا جهاز لتحليل طالانزيمات ntracellular ويفرز (الكمي النسبي الذي المقايسات الأنزيمية)، العوامل المساعدة داخل الخلايا والبروتينات والجزيئات الصغيرة (الكمي المطلق من قبل المقايسات نقطة النهاية أو ELISA). في ما يلي، ونحن تصف عملية تصنيع رقاقة عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة متعدد الطبقات وبروتوكولات لالزخرفة من الأجسام المضادة عن طريق microcontact الطباعة والكيمياء السطح. بالإضافة إلى ذلك، يتم إعطاء بعض الأمثلة على استخدام رقاقة والعمليات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU-8 تلفيق ماستر

إعداد كل من القوالب الرئيسية لقنوات (فلويديك والسيطرة، لالخطط وأبعاد انظر الشكل 2) مع بروتوكول التالي ولكن مع أنماط مختلفة قناع. يظهر عملية في الشكل 3A.

  1. تبدأ عن طريق تسخين 4 بوصة رقاقة السيليكون لمدة 10 دقيقة على حرارة 180 درجة مئوية. تحميل رقاقة المجففة على المغطي تدور واستخدام بروتوكول التالية لتدور طلاء SU-8 عام 2015:
    1. تدور رقاقة في 100 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية (الغطاء مفتوحا من تدور المغطي، الاستغناء SU-8 خلال هذه الخطوة، غطاء قريبة بعد الاستغناء).
    2. تدور رقاقة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية (وهذا سوف ينشر مقاومة على رقاقة كله).
    3. تدور رقاقة في 1،750 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (يحدد ارتفاع مقاومة إلى 20 ميكرون).
  2. إزالة مقاومة من على حافة الرقاقة مع الأسيتون (استخدام مسحة) حيث سيؤدي ذلك إلى عصا إلا إلى موقد في الخطوة التالية. نقل الرقاقة لآهotplate في 95 درجة مئوية والحرارة لمدة 4 دقائق. بعد softbake، فضح مقاومة من خلال الضوئية مسجلة لsodalime الزجاج في اليجنر قناع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (150 ميغا جول / سم 2، وتقاس في 365 نانومتر).
  3. بعد التعرض، وتسخين ويفر مرة أخرى في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على موقد. تهدئة رقاقة لRT ومن ثم تزج في حمام من SU-8 المطور لمدة 4 دقائق. يهز بلطف لإزالة غير معلن SU-8. غسل الرقاقة مع غرفة نظيفة الصف الأيزوبروبانول وضربة الجافة مع النيتروجين. تحقق تحت المجهر إذا كانت التنمية الناجحة (لا سيما الفخاخ الخلية). إذا وضعت الفخاخ الخلية تماما، ينبغي أن تكون انعكاسا للرقاقة السيليكون مرئية. إذا لزم الأمر، وتطوير رقاقة مرة أخرى لبضع دقائق.
  4. خبز الرقاقة في الفرن لمدة 2 ساعة على حرارة 180 درجة مئوية لإزالة جميع المذيبات المتبقية. تحقق ذروة القنوات مع خطوة التعريف. إذا كان ارتفاع يختلف عن الارتفاع المطلوب، وتكرار هذا البروتوكول بدءا من الخطوة 1.1 مع رقاقة جديدة وتغيير السرعة تدور (الخطوة 1.1.3). وضع اللمسات الأخيرة على تصنيع القالب الرئيسي بواسطة silanizing الرقاقة مع 1H، 1H، 2H، 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-سيلاني في مجفف بين عشية وضحاها.

2. تصنيع رئيسية لmicrocontact الطباعة

  1. من أجل إعداد قوالب رئيسية لmicrocontact الطباعة، يذوى رقاقة السيليكون لمدة 10 دقيقة على حرارة 180 درجة مئوية. تدور معطف 1 مل HDMS على هذه الرقاقة عند 7،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (في مقاومة تتمسك أفضل لسطح silanized). تدور معطف 2 مل من AZ1518 مقاومة إيجابية مع هذا البروتوكول:
    1. الاستغناء ثابت للمقاومة إلى الرقاقة.
    2. تدور رقاقة لمدة 5 ثانية في 500 دورة في الدقيقة.
    3. تدور رقاقة لمدة 60 ثانية في 4000 دورة في الدقيقة.
  2. بعد ثانية softbake 50 عند 100 درجة مئوية على موقد، فضح مقاومة للأشعة فوق البنفسجية ضوء (21 ميغا جول / سم 2 في 365 نانومتر) من خلال الضوئية وعلى اليجنر قناع. تطوير مقاومة في حمام من الالف الى الياء 726 لمدة 75 ثانية. شطف الرقاقة وضعها مع الماء DI-وضربة دراي مع النيتروجين. إزالة المذيبات المتبقية عن طريق تسخين الرقاقة عند 115 درجة مئوية لمدة 50 ثانية. Silanize الرقاقة تحت فراغ بين عشية وضحاها.

3. تصنيع رقاقة ميكروفلويديك

ويستخدم تصميم الجهاز من طبقتين لهذه التجارب. يتم إعداد الطبقتين على حدة ومستعبدين معا، قبل المستعبدين رقاقة أخيرا على شريحة زجاجية (الشكل 3B). ويصف هذه الخطوة إنتاج PDMS طبقات وختم PDMS لmicrocontact الطباعة.

  1. إعداد 10:01 خليط من PDMS وكيل المعالجة. إعداد حوالي 80 ز PDMS في المجموع (باستخدام التصاميم، وهذا سوف يؤدي إلى رقائق 10). مزيج جزأي بقوة وديغا في PDMS حتى يصبح الخليط هي فقاعة مجانا (~ 30 دقيقة).
  2. وضع رقاقة مع طبقة التحكم داخل طبق بتري والشريط وضعها على الجزء السفلي. المقبل، صب ~ 50 غرام من PDMS على رأس ووضع رقاقة لا يقل عن 2 ساعة في الفرن على 80 درجة مئوية لضمان كاملةعلاج من PDMS. كرر نفس الإجراء لرقاقة microcontact الطباعة، لهذا هناك حاجة ~ 20 ز PDMS.
  3. تدور معطف PDMS على رقاقة مع طبقة فلويديك بسرعة دوران 2،000 دورة في الدقيقة لتشكيل طبقة PDMS عالية حوالي 40 ميكرون. علاج PDMS في الفرن لمدة 1 ساعة على الأقل في 80 ° C.
  4. عندما يشفى كلا الجزأين، وإزالة طبقة التحكم من رقاقة ومقطعة إلى قطع بشفرة حلاقة. لكمة ثقوب اتصال الضغط باستخدام 1 ملم خزعة الناخس. للتخزين، فإنه من المستحسن أن وضع قطعة من الشريط على القنوات.
  5. السندات طبقتين، واتخاذ الرقاقة المغلفة تدور والجزء العلوي ووضعها في نظافة البلازما 23. بعد العلاج البلازما، بسرعة محاذاة كلا أجزاء تحت المجهر مع مسافة العمل الكبيرة. إضافة بعض PDMS الغيار حول الأجزاء العليا وضعت. هذه الخطوة ليست إلزامية، إلا أنه يسهل إزالة PDMS من رقاقة. وضع الرقاقة في الفرن على 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
  6. استخدام مشرط لإزالة بعناية PDMS من رقاقة وقطع الرقائق. لكمة ثقوب الوصول للاتصالات فلويديك مع 1.5 ملم خزعة الناخس.
  7. الانتهاء من رقاقة PDMS الآن ويمكن تخزينها لعدة أشهر. اختياري: إذا تم استخدام رقاقة مع الخزان، وقطع الجزء العلوي من غيض ماصة 200 ميكرولتر واستخدام بعض قطع الغيار، PDMS شبه شفي الغراء على القمة. وضع رقاقة في الفرن مرة أخرى في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.

4. الترابط لزجاج الشرائح

لاستخدام الجهاز لفحوصات الأنزيمية المباشر، فإن الخطوة الوحيدة المطلوبة بعد الترابط هو حجب السطوح. لهذا البروتوكول، انتقل إلى A. ومع ذلك، لاستخدام رقاقة ميكروفلويديك لالمناعية أو ELISAs، يرجى الرجوع إلى بروتوكول B للحد من مواقع الربط فقط على شريحة زجاجية (أي للفحص المجهري TIRF أو SPR). إذا كان هذا التقييد ليست مهمة، تشير إلى A، ولكن استخدام تقارن البيروكسيديز في الخطوة 4.3 وتابع مع الخطوة 4.8في بروتوكول B لخلق سطح ظيفية بالكامل.

قبل تنفيذ بروتوكول A و B: ومن المستحسن لتصفية كل الحلول البروتين المستعملة قبل تعريفهم في رقاقة. الحطام والركام البروتين قد منع وإلا الفخاخ الخلية، مما يؤدي إلى خفض عدد الدوائر التي يمكن استخدامها للتحليل. لهذا الغرض، واستخدام وحدة التكثيف اللابروتيني مرشح لتصفية كل الحلول قبل ادخالها في القنوات.

بروتوكول A (المقايسات الأنزيمية)

  1. لوضع اللمسات الأخيرة على جهاز ميكروفلويديك، والسندات وأجزاء PDMS على شريحة زجاجية. للقيام بذلك، وتنظيف أول شريحة زجاجية مع الصابون والماء المقطر والإيثانول. تجف الشريحة باستخدام تيار النيتروجين. تنظيف الجزء PDMS مع الاسكتلندي.
  2. وضع الجزء PDMS وشريحة زجاجية تنظيفها في نظافة البلازما لمدة 45 ثانية في 18 دبليو ولضمان الترابط مشددة، ووضع شريحة على طبق ساخن (100 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
  3. بعد الترابط، وملء مع رقاقة وluids. طريقة سهلة لتحقيق ذلك هو استخدام قوة الطرد المركزي. قطع الجزء السفلي من 200 ميكرولتر ماصة. للقنوات فلويديك، ملئها عرقلة الحل (ألبومين المصل البقري (4٪ ث / ت) أو بولي-L-يسين) المطعمة غليكول البولي إثيلين (0.05٪ ث / ت) ووضع نصائح في مداخل. ملء سيطرة طبقة مداخل إما مع الماء أو مع حل متسق الضغط التناضحي، على سبيل المثال برنامج تلفزيوني. وضع رقاقة في أجهزة الطرد المركزي (800 x ج) لمدة 5 دقائق. القنوات ينبغي أن تملأ الآن مع السائل تماما. إذا لم يكن كذلك، كرر هذه الخطوة.
  4. احتضان عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غسل الحل للخروج من طبقة السائل مع برنامج تلفزيوني بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة الحقنة. الجهاز هو الآن جاهز للتجارب الخلية.

بروتوكول B (المناعية)

لمحة كاملة من تعديل السطح من الخطوة 4.7 فصاعدا، يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1.

  1. فيPDMS الطوابع cubate لmicrocontact الطباعة مع حل bBSA / BSA (على سبيل المثال 1-100). بعد 30 دقيقة، وتنظيف الطوابع جيدا بالماء المقطر وتجفيف الطوابع تحت تيار من النيتروجين. وضع بسرعة الطوابع على شريحة زجاجية تنظيفها (الشكل 4).
  2. فضح شريحة زجاجية مع ختم جنبا إلى جنب مع الجزء العلوي من رقاقة ميكروفلويديك إلى البلازما الأكسجين لمدة 45 ثانية في أقصى قدر من السلطة (18 ث) في نظافة البلازما. بعد العلاج البلازما، وإزالة الطابع ومحاذاة السطح المطبوع تحت microchambers من الجهاز. وضع رقاقة لمدة 30 دقيقة على طبق ساخن عند 50 درجة مئوية.
  3. لمنع سطح المتبقية، وإدخال العقيمة التي تمت تصفيتها حل جيش صرب البوسنة (4٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني) في رقاقة مع جهاز للطرد المركزي (انظر الخطوة 4.2). احتضان لمدة 1 ساعة ويغسل الحل للخروج من طبقة السائل مع برنامج تلفزيوني (انظر الخطوة 4.3). ويمكن بعد ذلك أن تستخدم رقاقة مباشرة أو تخزينها لمدة تصل الى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية في مربع الرطبة.
  4. لالسطحية ملزمة تعمل بكامل طاقتهاه، وإدخال أفيدين (0.025٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني) في المكمن. استخدام معدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة لمدة 30 دقيقة لسحب الحل أفيدين من خلال القنوات السوائل. بعد ذلك، طرد برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. شطف الخزان تماما.
  5. بعد ذلك، إضافة بروتين G (0.0025٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني)، وتدفق لمدة 30 دقيقة أخرى. يغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة أخرى بعد ذلك. المقبل، إضافة الضد من مصلحة (0.0001٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقيقة. بعد 10 دقيقة، ووقف تدفق لمدة 15 دقيقة للسماح ملزمة. المقبل، ويغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.

5. تجارب الخلايا

هو مكتوب البروتوكول بصفة عامة بسبب مجموعة متنوعة من فحوصات ممكن. كمثال ترد الكواشف اللازمة لفحص السمية G6PDH. الخلية محاصرة الكفاءة الأولي من الجهاز هو حوالي 2.5٪، أي سيتم المحاصرين 5 من أصل 200 خلية. إشغال النهائي من الفخاخ الخلية تعتمد بقوة على خط الخلية المستخدمة، وبروتوكول لتعليقخط الخلية والوقت يتم مسح الخلايا من خلال القناة. للخلايا تنمو بصورة طبيعية في التعليق (مثل U937)، والخلايا واحدة يمكن العثور عليها في نحو 75٪ من الغرف بعد بضع دقائق. إما لا شغل غرف أخرى أو المحتلة من قبل اثنين أو أكثر من الخلايا. بشكل عام، وشغل وحيدة الخلية أصغر لخطوط الخلايا الملتصقة. عند استخدام بروتوكول بتوقيف خفيفة بدلا المعروضة هنا، يقلل من نسبة 30٪ إلى حوالي (كلوة الجنين البشري، وخلايا MLT). يمكن تحسين الإشغال وحيدة الخلية عن طريق العلاج التربسين من الخلايا، ولكن هذا قد تغير أيضا نتائج التجارب.

اعتمادا على الجزيء المستهدف، والامتزاز أو الامتصاص لPDMS يمكن أن تؤثر على النتائج. ويمكن تخفيض امتصاص من خلال منع الأسطح مع BSA أو PLL-G-PEG. امتصاص غير المحتمل بالنسبة لمعظم الجزيئات الحيوية ماء، ولكن يجب أن يكون محددا لل(صغيرة) مكونات الخلية محبة للدهون.

  1. إعداد الخلايا وفقا لبروتوكول معين (على سبيل المثال
  2. تحميل الخلايا على شريحة باستخدام مضخة المحاقن وتدفق إلى الأمام، بدلا من سحب التعليق الخلية. استخدام معدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة للخطوط الخلايا التعليق وارتفاع معدلات تدفق 10-20 ميكرولتر / دقيقة لخلايا لاصقة منذ للحد من المرفقات غير محدد من الخلايا على الجدران القناة.
  3. عندما تمتلئ الفخاخ، وإغلاق الدوائر. إذا العديد من الخلايا التمسك nonspecifically إلى السطح، في محاولة ليطهرهم مع العازلة تفارق الخلية بمعدل تدفق 10-30 ميكرولتر / دقيقة.

بروتوكول A (المقايسات الأنزيمية)

  1. سحب العازلة تحلل من خلال رقاقة. لهذا المثال، هذا المخزن المؤقت هو منطقة عازلة مع hypoosmolar أضاف توين 20 (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 1٪ (V / V) توين 20). للتحلل، والغرف المفتوحة بسرعة وعلى مقربة (أي 500 ميللي ثانية لمعدلات تدفق 10-50 ميكرولتر / دقيقة 7،21). لفحص G6PDH، إضافة 2 ملي الجلوكوز 6 فوسفات، 0.5 ملي NADP، و 0.5 U / مل ديافوراز و 0.3 ملي ريسازورين إلى تحلل العازلة. بدء مراقبة رد الفعل الحركية مباشرة بعد تحلل.

ملاحظة: اختر أي العازلة الذي هو مناسبة للمقايسة، ولكن عارية في الاعتبار أن المنظفات القوية (مثل تريتون، SDS) الخلايا ليز على الفور، وسوف يؤدي إلى فقدان الحليلة خلال افتتاح القاعة.

بروتوكول B (المناعية)

للحصول على وصف قصير من التجارب ELISA الخلية (معدلات التدفق، والوضع غرفة، الخ)، يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1.

  1. لELISA، إضافة كاشف الكشف المطلوبة (مثل الأجسام المضادة الثانوية، مستضد المسمى) مباشرة إلى تحلل العازلة. أضاف هنا Tweeن 20 يقلل من امتصاص غير محددة. ليز الخلايا وفقا للخطوة 5.4. احتضان الخليط لمدة 10-15 دقيقة للسماح ملزمة (فترة حضانة اعتمادا على مستضد الضد والمستعملة).
  2. تقارن انزيم الأجسام المضادة التي كثف nonspecifically على الجدران قناة يمكن أن يؤدي إلى تحويل كاشف الكشف بالفعل داخل الخزان والقنوات. للحد من هذه القضايا الامتزاز، طرد المانع الدائم للانزيم الكشف المستخدمة من خلال رقاقة خلال فترة الحضانة (مغلقة الدوائر، قبل أن يضيف كاشف الكشف). لبرنامج الصحة الإنجابية، استخدم 20 ملي حمض الهيدروكلوريك في الماء لإبطال نشاط الانزيمات كثف nonspecifically بشكل دائم.
  3. بعد فترة حضانة، وإدخال كاشف الكشف (مثل Amplex الأحمر وبيروكسيد الهيدروجين لHRP) إلى الرقاقة. فتح غرف أخرى قريبا لغسل الأجسام المضادة الثانوية nonbound بعيدا وإضافة كاشف الكشف. بدء مراقبة رد الفعل الحركية على الفور.
  4. المعايرة: شلالأجسام المضادة ضد الهدف من الفائدة. غرف قريبة. إعداد تركيزات مختلفة من الحليلة في المخزن أو في الخلية المحللة خارج الرقاقة. تطبيق التركيز على رقاقة وبسرعة تبادل حجم داخل الغرف (500 ميللي ثانية افتتاح الوقت). هذه المرة افتتاح قصيرة بما فيه الكفاية لضمان عدم تراكم إضافية يحدث من الحليلة التنظيف، ويتم الكشف عنها فقط عدد معين من جزيئات من حجم microchamber. من تركيز معروف من المستضد داخل الحل وحجم الغرفة (625 رر)، وحساب كمية داخل الغرفة. بعد ذلك، تابع مع الخطوة 5.5 وإدخال شاردة الكشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

برنامجنا هو قادرا على تحليل مجموعة متنوعة من الخلايا وكذلك جزيئات يفرزها موجودة في أو التي تنتجها الخلايا واحد. هنا، نود أن تقديم دراسات سبيل المثال مختلفة للتأكيد على مجموعة متنوعة من فحوصات ممكن. وسنقدم مثالا للانزيم يفرز (الشكل 5A)، وكذلك انزيم داخل الخلايا (الشكل 5B) والبروتين (أرقام 5C ود). لمزيد من الأمثلة، مثل العوامل المساعدة أو الجزيئات الصغيرة، يرجى الرجوع إلى يير وآخرون (2012) ويير وآخرون (2013).

أولا، نقدم مقايسة لانزيم يفرز (الشكل 5A). عند التنشيط مع phorbol ميريستات خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، وحيدات الإنسان تحفز إفراز الليزوزيم، وهو الانزيم الذي يسبب تحلل الخلية البكتيرية. لهذا الاختبار، المخزن المؤقت الخلية تحتوي على 4 ميثيل مبيليفيريل β-DN، N'-diacetylchitobioside، ركيزة الفلورسنت ضعيفة لlysozYME. على الانقسام من مخلفات السكر بواسطة انزيم، وحررت fluorophore ويمكن الكشف داخل الغرفة. هنا، والاستفادة من microchamber هو التخفيف مصغرا للانزيم يفرز، مما يسمح للكشف عن تركيزات منخفضة الانزيم في غضون فترة زمنية قصيرة. في الشكل 5A، يتم عرض العديد من المنحنيات سبيل المثال تمثل دوران الأنزيمية الليزوزيم يفرز من خلايا U937 حفز واحد. خط الخلية U937 مستمد من المريض مع سرطان الغدد الليمفاوية النقوي، ويمكن أن يتسبب في التمايز الوحيدات المحطة. خط الخلية تنتج TNFα، والليزوزيم β2-المكروغلوبولين بعد التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية. لا دوران كشفها في غرف مفتوحة أو غرف خالية من الخلايا (خط متقطع).

ويبين الشكل 5B الكمي النسبي للانزيم داخل الخلايا، وهنا الجلوكوز 6 فوسفات نازعة (G6PDH). G6PDH هو بروتين التدبير المنزلي وخلايا المنشأ من الأنسجة نفسها لا ينبغي تختلف إلى حد كبير في تركيز G6PDH على مدار 24. هنا، حوصر الخلايا U937 في الغرفة، وزودنا مقايسة مضان للكشف عن G6PDH جنبا إلى جنب مع تحلل العازلة. وتتكون من الجلوكوز 6 فوسفات، NADPH، وديافوراز انزيم وريسازورين الركيزة، والتي يتم تحويلها إلى resorufin الفلورسنت عندما G6PDH موجودا. معدل الزيادة في مضان بمرور الوقت يتوافق مع كمية G6PDH. يسهل رقاقة مزيد من الدراسات حول تأثير المركبات السامة، مثلا عن طريق الحضانة من الخلايا مع المادة السامة (هنا CAMPTOTHECIN) لفترة محددة (60 دقيقة). بعد هذا العلاج، تم مسح الإنزيم صدر بعيدا وو lysed الخلايا، وتم قياس مستوى G6PDH. في الواقع، كان خسارة كبيرة من المحتويات الانزيم داخل الخلايا مرئية بسبب زيادة أبطأ من مضان (خطوط وأعمدة حمراء في الشكل 5B). تفاصيل هذه الدراسة يمكن العثور عليها في يير وآخرون. 8

e_content "> وعلاوة على ذلك، نقدم لك مجموعة من النتائج من المناعية لتحليل كميات GFP داخل الخلايا. للتعبير يسببها، وخلايا HEK293 حيث transfected مع نظام التعبير T-REX. في هذا النظام، GFP التعبير يمكن أن يتسبب من خلال إضافة التتراسيكلين وبعد 8 ساعات من الحضانة، وعلقت الخلايا، مسح على رقاقة، المحاصرين، و lysed في وقت لاحق. التقاط ويجمد الأجسام المضادة للGFP على سطح الزجاج بعد بروتوكول المعروضة هنا لربط GFP صدر من الخلية. الشكل 5C يظهر حركية ملزمة من GFP إلى الأجسام المضادة. في هذا المثال، GFP يمكن قياسها مباشرة من قبل مجموع المجهري مضان الداخلية بسبب مضان من البروتين، ونحن نريد أن نؤكد ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن البروتينات nonfluorescent باستخدام شطيرة ELISA أو ما شابه ذلك الأشكال. لهذا، مكونات الفحص المطلوبة ويمكن إدخال بعد خطوات الغسيل. ميزة ELISA هو تضخيم الإشارات بسببلانزيم، مما أسفر عن المنتج الفلورسنت التي تراكمت داخل microchamber.

أخيرا، نود أن يقدم شطيرة ELISA وحيدة الخلية مع GAPDH كما البروتين الهدف. نحن مصممون GAPDH في الخلايا التعليق U937 وكذلك الخلايا الملتصقة HEK293 (الشكل 5D). لهذا، فإننا يجمد الأجسام المضادة لمكافحة GAPDH (التقاط الأجسام المضادة). بعد تحلل الخلية، وقدم الأجسام المضادة المسمى الإنزيم الثاني (الكشف عن الأجسام المضادة). تم فتح الغرف ويرجع ذلك إلى التدفق، وكانت تغسل الأجسام المضادة الكشف غير منضم بعيدا وقدم Amplex الأحمر إلى القاعة. تم رصد تحويل Amplex الأحمر إلى فلوري resorufin بواسطة HRP (كشف الأجسام المضادة) على مر الزمن في كل microchambers 60 في نفس الوقت. تم تحديد المنحدر من الخطية جزء من رد الفعل. ويرتبط هذا المنحدر مباشرة إلى تركيز الانزيم وبالتالي، إلى تركيز الحليلة. وأظهرت النتائج من الخلايا U937 واحد في المتوسط ​​GAPDHمبلغ 2.6 attomol، مع الحد الأدنى من القيم والقصوى من 2.0 و 3.2 attomol، على التوالي. وكشف تحليل البيانات من 46 HEK الخلايا التي تلك الخلايا الواردة في المتوسط ​​2.5 GAPDH attomol (الحد الأدنى 0.9 attomol؛ القصوى 4.1 attomol).

الشكل 1
الشكل 1. قدم microdevice والخطط لفحوصات مختلفة. أ) microdevice تجميعها. هنا، تمتلئ غرف مع فلوريسئين عن التصور (مخضر). مرئية أيضا هو الخزان، وصلات للطبقة التحكم (الضغط، موصلات 2X4 في الظهر اليسار والجبهة اليمنى) والاتصال إلى ضخ حقنة (الجبهة). ب) التكبير في منطقة microchamber. العديد من هذه الغرف يمكن أن تكون مرتبة في صفيف. لالتصور، تم عزل البرتقال صبغة الطعام داخل الغرف، في حين يتم مسح صبغة الطعام الخضراء من خلال القنوات. يتم تعبئة الطبقة السيطرة على ضغط بالماء. ج) التكبير على microchamber واحدة. د) تخطيطي للعملية الجهاز. ضمن microchamber (منظر جانبي)، هو المحاصرين خلية واحدة ومعزولة. يمكن تحفيز الخلايا، حضنت، وغسلها و lysed أخيرا داخل الرقاقة. يمكن تحليل محتوى الخلوي مباشرة مع المقايسات للإنزيمات أو الإنزيمات المساعدة حيث يتم إنشاء شاردة الفلورسنت على رد الفعل (يسار). للبروتينات أخرى، يمكن تعديل السطح مع الأجسام المضادة التي تربط خصيصا لهذا البروتين المستهدف (يمين). منذ مستضد منضما إلى السطح، والمحللة يمكن غسلها بعيدا وكشف جزيئات مثل الأجسام المضادة الثانوية يمكن أن تضاف إلى قياس البروتين الهدف. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

ه 2 "FO: محتوى العرض =" 5IN "سرك =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "العرض =" 500px "/>
الشكل 2. التخطيطي نظم القناة وأبعاد microchamber. أ) تصميم قناع طبقة فلويديك. تتكون طبقة من فلويديك (من اليسار إلى اليمين) منفذا ومنطقة غرفة، وهو مرشح للاحتفاظ الجسيمات ومجموعات الخلايا ومدخل. A 4 في رقاقة يمكن أن تأوي الهياكل لإنتاج رقائق 10. ب) تصميم قناع من طبقة التحكم المقابلة. ويرجع ذلك إلى المساحة اللازمة للمواءمة، 4 في رقاقة تحتوي على هياكل لإنتاج رقائق 5. ج) رسم تخطيطي للطبقات محاذاة (يسار) والتوسيع تظهر فخ الخلية (يمين)، وكلاهما مع مقاييس الطول. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3 الرقم 3. التخطيطي من SU-8 تجهيز وإنتاج PDMS. أ) رسم تخطيطي للبروتوكول تجهيز SU-8. A رقاقة السيليكون هو مع SU-8 و خبز لينة في 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق المغلفة زيادة ونقصان. يتم نقل المطلوب تصميم قناة ميكروفلويديك على SU-8 باستخدام الضوئية والتعرض للأشعة فوق البنفسجية ضوء. بعد خبز بعد التعرض لل(95 درجة مئوية، 5 دقيقة)، تم تطوير SU-8 و خبز الصعب على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. ب) تخطيطي للرقاقة تلفيق ميكروفلويديك. خليط من PDMS قليل وحدات وكيل المعالجة هو على النموذج الرئيسي للقنوات فلويديك المغلفة تدور، وسكب على النموذج الرئيسي للطبقة التحكم. وصفت السلبيات قناة باللون الوردي. ويشفى كل من طبقات في الفرن. تم تفكيكها جزء رقاقة طبقة التحكم من رقاقة (قناة التحكم باللون الأزرق) واللكم ثقوب للاتصالات ضغط (أبيض). كلا أجزاء التحكم ووالطبقات وضعت السائل في البلازما الأكسجين، وبعد ذلك، يتم ترتيبها والمستعبدين. ثم تم تفكيكها كل رقاقة من النموذج الرئيسي فلويديك (قناة السائل باللون الأحمر) ويتم الوصول لكمات الثقوب فلويديك (أبيض). أخيرا، مستعبدين شريحة وشريحة زجاجية بعد تفعيل السطح في البلازما الأوكسجين. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 4
الشكل 4. التخطيطي للmicrocontact الطباعة. أ) تصنيع ماستر للالطباعة الحجرية الناعمة. وحضنت (1) وختم PDMS مع البروتين (bBSA) حل. (2) تتم إزالة الحل، يتم غسل الدمغة وأحادي الطبقة من البروتين يبقى على الطوابع. (3) يتم وضع ختم على شريحة زجاجية، وبالتالي يتم تحويل البروتينات إلى سور الزجاج الوجه. خلال هذا الوقت، يتعرض رقاقة جنبا إلى جنب مع ختم على الزجاج إلى بلازما الأوكسجين. (4) تتم إزالة الطابع والمستعبدين رقاقة إلى شريحة زجاجية. لتصور، وتظهر هيكلين سبيل المثال، وطبع مع ​​الفلورسنت BSA فلوريسئين المترافقة. ب) منطقة Microcontact المطبوعة في الغرفة. منذ الطباعة والغرف ليست الانحياز، قمنا بتقييم الاختلافات ملزمة على البقع (منطقة المطبوعة) على ثلاث رقائق مختلفة (الأرقام 1-3) وجميع microchambers 60. ونتيجة لذلك، وتقلب الغرفة إلى غرفة صغيرة نسبيا (<2.5٪)، وكان تقلب رقاقة إلى رقاقة ضئيلة (<1٪)، مما يدل على أن هناك في الواقع لا حاجة لمواءمة الهياكل المطبوعة إلى غرف. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

18/50618fig5.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 5. النتائج من G6PDH، الليزوزيم، GFP والمقايسات GAPDH. نتائج ممثل. أ) إفراز إنزيم من الخلايا واحد. اليسار: التخطيطي للمقايسة لانزيم يفرز، هنا الليزوزيم. ويفرز الليزوزيم واحد من قبل، والخلايا U937 سلطة النقد الفلسطينية تنشيط ويتراكم داخل microchambers مغلقة، حيث يحفز إنتاج الفلورسنت 4 methylumbelliferone. الحق: بيانات تم الحصول عليها من تجربة إفراز. تظهر منحنيات الخضراء كثافة مضان بمرور الوقت لغرف التي تحتلها خلية واحدة، كما هو موضح أيضا هو غرفة دون الخلايا (أسود، الخط المنقط) للمقارنة. ب) الكشف عن الخلايا الإنزيمات في الخلايا واحدة. اليسار: تخطيطي للمقايسة لانزيم G6PDH داخل الخلايا. عند تحلل الخلية، ويتم تحريرها G6PDH الخلايا في غرفة، حيث المكونات الأخرى لسلسلة رد الفعل الأنزيمية موجودة. الحق: المنحنيات مثال وبيانات تمثيلية. واحد U937وقد تم تحليل الخلايا عن المحتوى الانزيم هم (أسود). على التأثير السام للCAMPTOTHECIN التي permeabilizes الغشاء، فقد ثلثي انزيم (برتقالي). ج) من البروتينات داخل الخلايا المناعية من خلايا مفردة. اليسار: رسم تخطيطي لالمناعية، وهنا للبروتين GFP داخل الخلايا. ويجمد الأجسام المضادة للGFP على البروتوكول وفقا سطح الموصوفة هنا. وبعد ذلك هي lysed الخلايا على شريحة وتم رصد البقع ملزمة بمرور الوقت باستخدام TIRF المجهري. الحق: الرسم البياني من هذه التجربة تبين حركية ملزمة من GFP إلى الأجسام المضادة يجمد. نقطة زمنية 1 يصادف مقدمة من تحلل العازلة. في نقطة زمنية 2، GFP بدأت تتراكم على السطح، وهذا يعني أن تحلل الخلية قد حدث. ملزمة من GFP إلى الأجسام المضادة اكتمال في نقطة زمنية 3 د) ساندويتش من البروتينات داخل الخلايا ELISA واحد من الخلايا. اليسار: رسم تخطيطي للشطيرة ELISA، وهنا للبروتين GADPH داخل الخلايا. مكافحةويجمد الأجسام المضادة GAPDH على البروتوكول وفقا سطح الموصوفة هنا. وبعد ذلك هي lysed الخلايا على شريحة والمحتضنة. GPADH المحررة منضمة إلى الأجسام المضادة، وجرفت الغرفة وقدم الأجسام المضادة الكشف (HRP جانب). في الخطوة الأخيرة، وجرفت الكشف عن الأجسام المضادة nonbound بعيدا، وقدم كاشف كشف وتمت مراقبة رد فعل على مر الزمن. الحق: الكمي لGAPDH داخل الخلايا U937 وHEK293 اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

سطح بروتوكول التعديل لELISA

خطوة وقت تركيز معدل التدفق خالية من تدفق فترة حضانة غرفة مفتوحة / مغلقة
[دقيقة] (ث / ت)٪ [ميكرولتر / دقيقة] [دقيقة] </ الدفتيريا>
BSA 30 4 - فتح
برنامج تلفزيوني 10 5 فتح
أفيدين 30 0.025 5 فتح
برنامج تلفزيوني 10 5 فتح
بروتين G، البيوتين 30 0.0025 5 فتح
برنامج تلفزيوني 10 5 فتح
الجسم المضاد 20 0.0001 5 15 فتح
برنامج تلفزيوني 10 5 فتح
الخلايا
(300،000 خلية / مل) 		~ 5 30 عندما يتم إغلاق المحتلة الفخاخ.
تحلل العازلة 5 30 فتح قريبا
المانع (مثل حمض الهيدروكلوريك 20 ملي) 15 10 مغلق
برنامج تلفزيوني 2 30 مغلق
كشف كاشف 5 30 فتح قريبا
بدء مراقبة رد فعل

الجدول 1. modificatio السطحيةن بروتوكول لELISA. للتفسير، انظر النص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد فتحت التكنولوجيا على microfluidics إمكانيات جديدة ورائعة للتحليل وحيدة الخلية. على وجه الخصوص، وإمكانية اعتراض وشل الخلايا بشكل فردي عن طريق أدوات ميكروفلويديك سمحت دراسات منهجية على المدى القصير والطويل على خصائص وحيدة الخلية والاستجابة لها. بالإضافة إلى ذلك، التغليف من الخلايا في microdroplets عالية التردد، ولدت على رقاقة، مكنت الدراسات إفراز خلية واحدة، والتي لا يمكن أن يؤديها مع أجهزة الخلوي التقليدية. النهج microdroplet، ومع ذلك، لديها بعض القيود عندما يطلب الحضانة وغسل الخطوات لبروتوكول التحليلية. نهجنا يجمع بين كل من مفاهيم محاصرة الخلايا والعزلة، وبالتالي، فإنه يسهل أداء فحوصات أكثر تعقيدا بما في ذلك على أساس المناعية الأجسام المضادة يجمد السطح. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الطريقة مرنة للغاية فيما يتعلق بتطبيق والهدف التحاليل.

تصميم رقاقة تمكن (ط) ايفيcient محاصرة الخلايا، (ب) توريد مختلف مخازن والكواشف، و (ج) العزلة موثوق بها في وحدة تخزين صغيرة جدا عند الحاجة. بهذه الطريقة يتم تجنب التخفيف من الجزيئات المستهدفة. الستين (إلى مئات) من microchambers متوضعة على جهاز واحد واحد مما يتيح العديد من التجارب في نفس الوقت. الصمامات جولة على شكل إغلاق microchambers يمكن معالجتها معا أو بشكل منفصل حسب الصفوف أو الأعمدة، وهو أمر مهم عندما ينبغي منع انتقال التلوث إلى غرف مجاورة. مع إغلاق microchambers، وقنوات يمكن علاجها مع حلول الضارة مثل حمض الهيدروكلوريك لتنظيف الأغراض دون التأثير على الخلايا المحاصرين. من ناحية أخرى، وتبادل سريع للحجم داخل microchamber هو ممكن. حاليا هناك حاجة إلى وقت الحد الأدنى من 200 ميللي ثانية لفتح بالكامل غرفة وإدخال الكواشف الجديدة (لتبادل كاملة من حجم microchamber، فإن معدل التدفق لابد من النظر).

بينما أسلوبنا هو يختلط جداiable وقابلة للتكرار، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن هناك اثنين من النقاط الحرجة الرئيسي في بروتوكول تصنيع رقاقة والعملية. أولا، ارتباط الطبقات رقاقة اثنين بعد تفعيل البلازما الذي ينبغي القيام به بسرعة. محاذاة أمر بالغ الأهمية، وإلا بعض الغرف أو حتى رقاقة كلها ليست صالحة للاستعمال، لأن الرابطة لا رجعة فيه. هذه الخطوة قد يكون من الصعب بالنسبة للمستخدمين عديمي الخبرة، ومع ذلك، وبعد الحصول على بعض التدريب حتى أقل خبرة العاملين في المختبرات عادة نتائج جيدة. النقطة الحرجة الثانية هي النظافة خلال تجميع واستخدام رقاقة. إذا جزيئات الغبار الموجودة على سطح الرقاقة، فإنها يمكن أن يضر قنوات التحكم والصمامات أو حتى تؤدي إلى كسر PDMS-PDMS أو السندات PDMS من الزجاج. وبالتالي نقضي على الكثير من الاهتمام لإجراءات التنظيف. تجدر الإشارة إلى أنه إلى جانب شكل تلفيق الرئيسي (التي أجريت في غرفة نظيفة)، ونحن ننتج واستخدام الرقائق في بيئة معملية عادية، حيث الغبار والثانية جزيئات موجودة.

على الرغم من كل الرعاية، إذا كان لا يتم إغلاق الغرف بشكل صحيح، فإنه يمكن أن تكون إما أن خطوط الضغط يتم حظر أو لم عملية طلاء تدور لا توفر حق سمك الغشاء. أيضا، من وقت لآخر لاحظنا عدم كفاية الترابط، مما أدى إلى كسر الرابطة بين اثنين PDMS طبقات. إذا العديد من رقائق من نفس الدفعة وتظهر هذه المشكلة، فمن الممكن أن الوقت بين التنشيط البلازما وتشكيلة طويلة جدا. في بعض الأحيان، ونحن من ذوي الخبرة PDMS لزجة على رقائق التي لا يمكن إزالتها بشكل صحيح، وكان نتيجة لعدم كفاية silanization الرقاقة.

مرة واحدة يتم تأسيس أسلوب الإنتاج، ومنصة ميكروفلويديك يمكن استخدامها للعديد من الدراسات المختلفة على مستوى خلية واحدة. هنا، ونحن أظهرت كشف عن وكلاء داخل الخلايا ويفرز مع فحوصات مختلفة، ولكن العديد من فحوصات أخرى ممكنة على رقاقة. معظم البروتينات ليست الفلورسنت وعلى ديبحماية المناخ عبر المناعية ليست واضحة. سوف تنفيذ ELISA في رقاقة يجلب العديد من الفوائد. أولا، يمكن مقايسة مصممة خصيصا للغاية بالنسبة للبروتين المطلوب (عند وجود أجسام مضادة مناسبة). ثانيا، يمكن أن يكون كميا المعلومات من ELISA حتى في حدود تركيز منخفض، وإعطاء عدد من البروتين أو جزيء نسخ موجودة في الخلية.

تم تصميم رقاقة لدينا الحالية لتحليل خلايا الثدييات واحدة. ومع ذلك، وتعديل شرائح لخلايا أخرى مثل البكتيريا والطحالب والخميرة، وينبغي أن يكون ممكنا. حتى الآن، والقيد الوحيد لإجراء التجارب هو الحاجة لفحص على أساس مضان. ومع ذلك، نحن ندرس حاليا تنفيذ مطياف الكتلة كأسلوب الكشف. مرة واحدة يتم تأسيس هذا، فإن مجموعة من المشاكل التحليلية التي يمكن التحقيق مع منصة تكون أوسع نطاقا. علاوة على ذلك، منذ ليس كل تحليل هو ممكن في وجود مخازن تحلل الخلية، ونحنيتم حاليا تقييم أيضا تقنيات مختلفة تحلل الأخرى على المنصة. نحن على يقين من أن منصة ميكروفلويديك تنوعا الواردة في هذه الوثيقة توفر الأساس للدراسات وحيدة الخلية الجديدة على بروتيوم، metabolome وsecretome المستوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

والكتاب الامتنان توم روبنسون للقراءة دليل على المخطوطة، C. BÄRTSCHI وH. بنز لبناء نظام مراقبة ضغط مبنية خصيصا. نود أيضا أن نعترف استخدام مركز المجهر الضوئي (LMC)، وكلاهما في ETH زيورخ أول مرفق غرفة نظيفة و. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شركة ميرك سيرونو ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الإطار 7 (ERC ابتداء غرانت، المشروع رقم 203428، nμLIPIDs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

Tags

علم المناعة، العدد 80، الموائع الدقيقة، البروتينات، ونظم علم الأحياء، وتحليل وحيدة الخلية، المناعية، مختبر على رقاقة، التحليل الكيميائي
رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S.,… More

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter