En Mikrofluid Chip til Alsidig kemisk analyse af enkelte celler

Summary

I denne artikel præsenterer vi en mikrofluid chip til enkelt celle analyse. Det giver mulighed for kvantificering af intracellulære proteiner, enzymer, cofaktorer, og sekundære budbringere ved hjælp af fluorescerende eller immunassays.

Abstract

Vi præsenterer en mikrofluid anordning, der muliggør kvantitativ bestemmelse af intracellulære biomolekyler flere enlige celler i parallel. Til dette formål er cellerne passivt fanget i midten af ​​en mikrokammer. Ved aktivering af kontrol lag cellen isoleret fra den omgivende mængde i et lille kammer. Det omgivende volumen kan derefter udveksles uden at påvirke den isolerede celle. På kort åbning og lukning af kammeret kan udskiftes dog, at løsningen i kammeret inden for et par hundrede millisekunder. På grund af reversibiliteten af kamrene, kan cellerne udsættes for forskellige løsninger sekventielt i en i høj grad kontrollerbar måde, f.eks til inkubation, vask og endelig cellelysis. De tætsluttende microchambers muliggøre fastholdelse af lysatet, minimere og styre fortynding efter cellelysis. Da lysis og analyse forekomme på samme sted, er høj følsomhed bevares, fordi ingen yderligere dilution eller tab af analytterne opstår under transport. Den mikrokammer design gør derfor pålidelig og reproducerbar analyse af meget små kopi antal intracellulære molekyler (attomol, zeptomoles) frigives fra de enkelte celler. Desuden kan mange microchambers arrangeres i et array format, som tillader analyse af mange celler på en gang, eftersom passende optiske instrumenter anvendes til overvågning. Vi har allerede brugt platformen for proof-of-concept studier til at analysere intracellulære proteiner, enzymer, cofaktorer og sekundære budbringere i enten relativ eller absolut kvantificerbar måde.

Introduction

Mange undersøgelser i fortiden har vist celle-til-celle forskelle inden en stor celle population ^1-3, især signaleringsprocesser ^4, eller mængden af intracellulære biomolekyler såsom proteiner ^5,6, metabolitter og cofaktorer ^7,8. Disse heterogeneities anses for at være fundamentalt vigtigt for celle tilpasning og evolution ^9, men også spille en central rolle i fremkomsten og behandling af sygdomme såsom kræft ^10-13. Derfor undersøgelser af enkelt-celle niveau er af stor interesse i biologisk og farmakologisk forskning, især hvis disse undersøgelser afslører de forskellige celle respons efter behandling med bioaktive kemiske stoffer.

I de seneste år er der blevet udviklet mange analytiske platforme, der letter analyse af enkelte levende celler eller den kemiske sammensætning af celleindholdet. Mens fluorescerende cellesortering (FACS) er guld standard for meget high-throughput analyse af enkelte levende celler, kan metoden ikke være ansat til kvantificering af intracellulære eller sekreterede forbindelser. Fremkomsten af ​​mikrofluide platforme har lovet nye analytiske strategier for positionering, behandling og observation af enkeltceller. En milepæl i microfluidics blev nået med integrationen af fleksible PDMS ventiler realiseret af Quake og kollegaer ^14,15. Disse ventiler er nyttige, da de kan isolere regioner på chip, fx adskille to kulturer ^16. Desuden er de især anvendes til enkelt-celle analyse og dermed bidrage til at reducere analyt udvanding problemer. Effekten af denne tilgang til enkelt-celle analyse er for nylig blevet demonstreret af Hansen og kolleger, der analyserede genekspression fra hundredvis af enlige celler i parallel ^17.

Når målretning proteiner og metabolitter, er meget vanskeligt at analysen på grund af manglen på egnede amplification metoder, det store antal af forskellige forbindelser til stede, og deres variationer i kemisk natur. Endvidere er de fleste intracellulære biomolekyler forventes at være til stede i lavt antal kopi i størrelsesordenen nogle få titusinder ^18, hvorfor den anvendte analysemetode skal have en høj følsomhed. Kraftigere assays, såsom immunoassays og enzymkoblede immunoassays (ELISA) er vanskelige at integrere i mikrofluidenheder da de kræver flere vask og inkubationstrinnene samt overfladebehandling immobilisering.

På grund af disse udfordringer, er det ikke overraskende, at der er rapporteret om kun et par eksempler, hvor proteiner eller metabolitter blev kvantificeret på enkelt-celle niveau. For eksempel har undersøgelser af udskillelsen af fluorescerende forbindelser er rapporteret ^19,20. For nylig blev implementering med ELISA præsenteret for analysen af udskilles (fluorescerende) proteiner fra en cellekultur (THP-1 celler) ²¹ og single (immune) celler ^10. Målretning intracellulære proteiner, Shi et al. Udviklet en mikrofluid anordning, lettes identifikation af intracellulære proteiner til analyse af signalveje i tumorceller ved hjælp af et immunoassay ^11. Imidlertid blev kun relative mængder af proteiner bestemmes og ingen enzymatisk opformering blev anvendt til at øge signal til lav tæthed proteiner.

For nylig var vi i stand til at kombinere en enkelt celle fældefangst microdevice med fluorescensanalyser ⁸ og immunoassays ²² (figur 1). Celler passivt fanget i microsized hurdle strukturer, som tillader forsyning og (hurtig) udveksling af mellemstore og andre kemiske midler uden nogen bevægelse af cellerne. En ringformet ventil omkring hver fælde muliggør isolering af cellen i en meget lille mængde ("den mikrokammer"). Denne ventil aktiveres umiddelbart efter indførelsen af ​​en celle-lysering (hypoosmolar) puffer, hannce forhindrer intracellulære molekyler eller udskilles molekyler diffundere væk. Vigtigst er det, på grund af den lille størrelse af volumen (625 pl) store fortynding af molekylerne undgås. Da lysis og analyse udføres i på den samme position på chippen, er der ingen tab af analysander grund til transport. Chippen design her beskrevet består af 8 alternerende rækker af enten 7 eller 8 microchambers, i alt 60 microchambers. Kamrene aktiveres i rækker, således at krydskontaminering langs en linje er udelukket.

Platformen kan anvendes i kombination med fluorescensanalyser samt immunologiske assays (figur 1d). For sidstnævnte har vi etableret protokoller til immobilisering af antistoffer, der er forenelige med chip produktion og montage proces. Derfor platformen åbner vejen for følsomme, pålidelige og kvantificerbare analyser på enkelt celle niveau. Indtil nu har vi brugt apparatet til analyse af intracellular og udskilles enzymer (relativ kvantificering af enzymatiske assays), intracellulære cofaktorer, proteiner og små molekyler (absolut kvantificering af endpoint assays eller ELISA). I det følgende beskriver vi processen chip fremstilling ved hjælp af flerlags blød litografi og protokoller for mønstret af antistofferne ved hjælp af microcontact trykning og overfladekemi. Derudover er nogle eksempler på chip brug og drift givet.

Protocol

1.. SU-8 Master Fabrication

Forbered begge master forme til kanalerne (fluidiske og kontrol, for diagrammer og dimensioner jf. figur 2) med følgende protokol, men med forskellige maske mønstre. Processen er vist i figur 3a.

1. Start ved opvarmning af en 4 tommer siliciumwafer i 10 minutter ved 180 ° C. Indlæse dehydreret wafer på en spin-coater og bruge følgende protokol for spin-coating SU-8 2015:
   1. Spin wafer ved 100 rpm i 20 sek (åben låget på spin-coater, dispensere SU-8 under dette trin, luk låget efter udlevering).
   2. Spin wafer ved 500 rpm i 10 sek (dette vil sprede modstå over hele wafer).
   3. Spin wafer ved 1.750 rpm i 30 sek (definerer højden af ​​resisten til 20 um).
2. Fjern modstå fra kanten af ​​skiven med acetone (brug en vatpind), da dette ellers vil holde sig til kogepladen i det næste trin. Overfør wafer ahotplate ved 95 ° C og varme i 4 min. Efter softbake udsætter modstå gennem en fotomaske tapede til sodalime glas i en maske aligner med UV-lys (150 mJ / cm ^2, målt ved 365 nm).
3. Efter eksponeringen opvarme skiven igen ved 95 ° C i 5 minutter på en varmeplade. Afkøl wafer til RT og derefter nedsænke den i et bad af SU-8 developer for 4 min. Ryst forsigtigt for at fjerne ikke-eksponerede SU-8. Vask wafer med clean-room kvalitet isopropanol og blæs tør med nitrogen. Kontroller under et mikroskop, hvis udviklingen var en succes (især celle fælder). Hvis celle fælder er fuldstændigt udviklet, bør refleksionen af ​​siliciumskiven være synlige. Hvis det er nødvendigt, udvikle wafer igen for et par minutter.
4. Bag skiven i en ovn i 2 timer ved 180 ° C for at fjerne alt tilbageværende opløsningsmiddel. Kontroller højden på kanaler med et trin profiler. Hvis højden er forskellig fra den ønskede højde, skal du gentage denne protokol, som begynder ved trin 1.1 med en ny wafer ogændre spin-hastighed (trin 1.1.3). Færdiggør fabrikation af master formen ved silanizing wafer med 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silan i en ekssikkator natten over.

2. Master Fabrication for Microcontact udskrivning

1. For at forberede master-forme til microcontact udskrivning dehydrere en silicium wafer i 10 minutter ved 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS på denne wafer ved 7.500 rpm i 30 sekunder (det modstå klæber bedre til en silaniserede overflade). Spin-coat 2 ml af AZ1518 positiv modstå med denne protokol:
   1. Statisk dispensering af resisten på skiven.
   2. Spin wafer i 5 sekunder ved 500 rpm.
   3. Spin wafer i 60 sekunder ved 4000 rpm.
2. Efter 50 sek softbake ved 100 ° C på en varmeplade, udsætte modstå mod UV-lys (21 mJ / cm ² ved 365 nm) gennem en fotomaske og en maske aligner. Udvikle modstå i et bad af AZ 726 for 75 sek. Skyl den udviklede wafer med DI-vand og slag dRy med kvælstof. Fjerne tilbageværende opløsningsmiddel ved opvarmning af vaflen ved 115 ° C i 50 sek. Silanize wafer under vakuum natten over.

3. Fremstillingen af ​​Mikrofluid Chip

En to-lags enhed design anvendes til disse eksperimenter. De to lag fremstilles separat og er bundet sammen, før chippen endelig klæbet på et objektglas (figur 3b). Dette trin beskriver fremstillingen af ​​PDMS lag, og PDMS stempel microcontact udskrivning.

1. Forbered en 10:01 blanding af PDMS og hærdning agent. Forbered cirka 80 g PDMS i alt (ved hjælp af vores designs, vil dette resultere i 10 chips). Bland begge dele energisk og afgasses PDMS, indtil blandingen er fri for blærer (~ 30 min.)
2. Placer skiven med kontrollen lag inde i en petriskål og tape det på bunden. Dernæst hældes ~ 50 g PDMS på toppen og sætte skiven i mindst 2 timer i en ovn ved 80 ° C for at sikre fuldstændighærdning af PDMS. Gentag samme procedure for microcontact udskrivning wafer, for det ~ er brug for 20 g PDMS.
3. Spin-coat PDMS på skiven med den fluide lag ved en rotationshastighed på 2000 rpm til dannelse af en ca 40 um høj PDMS lag. Cure PDMS i en ovn i mindst 1 time ved 80 ° C.
4. Når begge dele er hærdet, fjernes kontrol lag fra skiven og skæres i stykker med et barberblad. Punch pres tilslutning huller ved hjælp af en 1 mm biopsi puncher. Til opbevaring, er det tilrådeligt at sætte et stykke tape over kanalerne.
5. Til at binde de to lag, tage spin-belagt wafer og den øverste del og placere dem i et plasma renere ^23. Efter plasma behandling, hurtigt justere begge dele under et mikroskop med stor arbejdsafstand. Tilføj nogle ekstra PDMS omkring de anbragte øverste dele. Dette trin er ikke obligatorisk, men det letter fjernelsen af ​​PDMS fra wafer. Placer skiven i en ovn ved 80 ° C i mindst 1 time.
6. Brug en skalpel til forsigtigt at fjerne PDMS fra wafer og at skære mikrochips. Punch adgang huller til fluidisk forbindelser med en 1,5 mm biopsi puncher.
7. PDMS chip er nu færdig og kan opbevares i flere måneder. Valgfrit: Hvis chippen anvendes med et reservoir, skæres den øverste del af en 200 ul pipettespids og bruge nogle reservedele, semi-cured PDMS til at lime den på toppen. Sæt chippen i ovnen igen ved 80 ° C i mindst 1 time.

4.. Binding til objektglas

Hvis du vil bruge enheden til direkte enzymatiske assays, det eneste skridt påkrævet efter limning er blokering af overflader. Til denne protokol, videre til A. Men at bruge mikrofluid chip til immunoassays eller ELISA'er henvises til protokol B for at begrænse de bindingssteder kun til objektglas (dvs. for TIRF mikroskopi eller SPR). Hvis denne begrænsning ikke er vigtigt, henvises til A, men bruger biotinylerede konjugater i trin 4.3 og fortsætte med trin 4.8i protokol B for at skabe en fuldt funktionel overflade.

Forud for udførelse af protokol A og B: Det er tilrådeligt at filtrere alle de anvendte protein løsninger inden indføre dem i chippen. Debris og proteinaggregater ellers kan blokere celle fælder, hvorved antallet af kamre, der kan anvendes til analyse. Til dette formål skal du bruge en nonprotein adsorberende filterenhed til at filtrere alle løsninger, før indføre dem ind i kanalerne.

Protokol A (enzymatiske assays)

1. For at færdiggøre mikrofluid enhed, binde PDMS dele på en glasplade. For at gøre dette, skal du først rense en glasplade med sæbe, destilleret vand og ethanol. Tør slæden ved hjælp af en nitrogenstrøm. Rengør PDMS del med tape.
2. Sæt PDMS del og renset objektglas i plasma renere for 45 sekunder ved 18 W. For at sikre en stram binding, sætte chip på en varmeplade (100 ° C) i 5 min.
3. Efter limning, fylde chip med fluids. En nem måde at opnå dette på er at bruge centrifugalkraft. Skær den nederste del af 200 pi pipettespids. For strømningstekniske kanaler, fylde dem med blokerende opløsning (bovint serumalbumin (4% w / v) eller poly-L-lysin) podet polyethylenglycol (0,05% w / v), og spidserne i indløbene. Fyld kontrollag indløb med vand eller med en isosmotisk opløsning, fx PBS. Placer chip i centrifugen (800 xg) i 5 min. Kanalerne skal nu fyldt med væske helt. Hvis ikke, skal du gentage dette trin.
4. Inkubér blokerende opløsning i mindst 30 minutter ved stuetemperatur. Vask opløsningen ud af det fluide lag med PBS ved en strømningshastighed på 10 ul / min ved anvendelse af en sprøjtepumpe. Apparatet er nu klar til celle eksperimenter.

Protokol B (immunoassays)

For en komplet oversigt over overflademodifikationen fra trin 4.7 og fremefter, se tabel 1..

5. Icubate PDMS frimærker til microcontact udskrivning med en bBSA / BSA-opløsning (fx 1-100). Efter 30 minutter rengøre frimærkerne grundigt med destilleret vand og tør stempel under en strøm af nitrogen. Hurtigt placere frimærker på en rengjort objektglas (Figur 4).
6. Bring objektglasset med stempel sammen med den øverste del af mikrofluid chip til oxygenplasma i 45 sekunder ved maksimal effekt (18 W) i et plasma renere. Efter plasma behandling, fjerne stempel og tilpasse den trykte overflade nedenunder microchambers på enheden. Placer chip til 30 minutter på en varm plade ved 50 ° C.
7. Til at blokere den resterende overflade indføre sterilfiltreret BSA-opløsning (4% (w / v) i PBS) i chippen med en centrifuge (se trin 4.2). Der inkuberes i 1 time, og opløsningen vaskes ud af det fluide lag med PBS (se trin 4.3). Chippen kan derefter anvendes direkte eller opbevares i op til 2 uger ved 4 ° C i en fugtig boks.
8. For en fuldt funktionel bindende overflade indføre avidin (0,025% (w / v) i PBS) i reservoiret. Brug en strømningshastighed på 5 ul / min i 30 minutter for at trække avidin opløsning gennem fluidkanalerne. Bagefter skylles PBS i 10 min. Skyl beholderen grundigt.
9. Derefter tilsættes protein G (0,0025% (w / v) i PBS) og skyl i yderligere 30 minutter. Vask med PBS i en anden 10 minutter bagefter. Dernæst tilsættes antistoffet af interesse (0,0001% (w / v) i PBS) i 10 min. Efter 10 minutter standse strømmen i 15 minutter for at tillade binding. Dernæst vaskes med PBS i 10 min.

5.. Cell Eksperimenter

Protokollen er skrevet i generelle vendinger på grund af de mange forskellige mulige assays. Som et eksempel de nødvendige reagenser til G6PDH toksicitet assay er givet. Den oprindelige celle indeslutningseffektivitet af enheden er omkring 2,5% svarende til 5 ud af 200 celler vil blive fanget. Den endelige belægning af cellen fælder høj grad afhænger af den anvendte cellelinje, protokollen til at suspenderecellelinjen og det tidspunkt, hvor cellerne skyllet gennem kanalen. For celler naturligt vokser i suspension (såsom U937), kan enkelte celler findes i omkring 75% af kamrene efter et par minutter. De øvrige kamre er enten ikke udfyldt, eller besat af to eller flere celler. I almindelighed encellede belægning er mindre for adhærente cellelinier. Ved brug af forholdsvis svage suspenderende protokol præsenteres her, den procentdel falder til omkring 30% (HEK, MLT-celler). Encellede belægning kan forbedres ved trypsinbehandling af cellerne, men dette kan også påvirke resultaterne af forsøgene.

Afhængigt af målmolekylet, kan adsorption eller absorption til PDMS påvirke resultaterne. Adsorption kan reduceres ved at blokere de overflader med BSA eller PLL-g-PEG. Absorption er usandsynligt for de fleste hydrofile biomolekyler, men det skal kontrolleres for (små) lipofile cellekomponenter.

1. Forbered celler i overensstemmelse med den specifikke protokol (fx
2. Indlæse celler på chippen under anvendelse af en sprøjtepumpe og fremløb, snarere end at trække cellesuspension. Brug en strømningshastighed på 5 ul / min suspension cellelinjer og højere strømningshastigheder på 10-20 ul / min for klæbende celler siden for at reducere uspecifik binding af celler på kanalvæggene.
3. Når fælderne er fyldt, skal du lukke kamrene. Hvis mange celler klæbe uspecifikt til overfladen, så prøv at vaske dem væk med celledissociering buffer ved en flowhastighed på 10-30 ul / min.

Protokol A (enzymatiske assays)

4. Træk lysisbuffer gennem chippen. For dette eksempel, denne buffer er en hypoosmolar buffer med tilsat Tween 20 (10 mM Tris-HCI, 10mM KCI, 1,5 mM _MgCl2, 1% (v / v) Tween 20). For lyse, hurtigt åbne og lukke kamre (dvs. 500 msek til flowhastigheder på 10-50 ul / min ^7,21). For G6PDH assay tilsættes 2 mM glucose-6-phosphat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml diaphorase og 0,3 mM resazurin til lysisbuffer. Begynde at overvåge den kinetiske reaktion umiddelbart efter lysering.

Bemærk: Vælg en buffer, som er egnet til analyse, men bare i tankerne, at stærke rengøringsmidler (som Triton, SDS) lysere celler straks og vil føre til et tab af analysand under kammerets åbning.

Protokol B (immunoassays)

For en kort beskrivelse af ELISA-celle eksperimenter (strømningshastigheder status kammer, osv.), henvises til tabel 1.

5. For ELISA, tilsættes den krævede påvisningsreagens (fx sekundært antistof, mærket antigen) direkte til den lysisbuffer. Den her tilføjet Tween 20 reducerer den uspecifikke adsorption. Lyse af cellerne i overensstemmelse med trin 5.4. Inkuber blandingen i 10-15 minutter for at tillade binding (inkubationstid afhængigt af det anvendte antigen og antistof).
6. Antistof enzymkonjugater der adsorberet uspecifikt til kanalvæggene kan føre til en omlægning af påvisningsreagenten allerede inde i reservoiret og kanaler. For at reducere problemer af denne adsorption, skylle en permanent inhibitor af den anvendte enzymdetektion gennem chippen under inkubationstiden (kamre lukket, før tilsætning af påvisningsreagens). For HRP bruge 20 mM HCI i vand til permanent inaktivere uspecifikt adsorberede enzymer.
7. Efter inkubationstid indføre påvisningsreagens (f.eks Amplex Red og hydrogenperoxid HRP) til chippen. Åbn kamrene kort tid igen for at vaske ikke-bundet sekundært antistof væk og tilføje påvisningsreagenset. Begynde at overvåge den kinetiske reaktion med det samme.
8. Kalibrering: Immobilisereantistoffet mod målet af interesse. Luk kamre. Forbered forskellige koncentrationer af analyt i puffer eller cellelysat off-chip. Påfør en fusion chip og hurtigt udveksle volumen inde i kamre (500 msek åbning tid). Denne åbning tid er tilstrækkelig kort til at sikre, at ingen yderligere akkumulation sker fra analyt rødmen, og opdages kun et bestemt antal molekyler fra volumen af ​​mikrokammer. Fra den kendte koncentration af antigenet inden i opløsningen, og volumenet af kammeret (625 pl), beregne inde i kammeret. Bagefter fortsætte med trin 5.5 og introducere afsløring delen.

Representative Results

Vores platform er i stand til at analysere en række intracellulære samt secernerede molekyler til stede i eller dannes af enkeltceller. Her vil vi gerne præsentere forskellige eksempler undersøgelser for at understrege de forskellige mulige analyser. Vi vil give et eksempel for et secerneret enzym (figur 5a) samt et intracellulært enzym (figur 5b) og protein (figur 5c og d). For flere eksempler, såsom cofaktorer eller små molekyler, henvises til Eyer et al. (2012) og Eyer et al. (2013).

Først præsenterer vi et assay for et secerneret enzym (figur 5a). Ved aktivering med phorbolmyristatacetat (PMA), humane monocytter inducere sekretion af lysozym, et enzym, som inducerer bakteriecellelyse. Til dette assay cellen buffer indeholder 4-Methylumbelliferyl β-DN, N'-diacetylchitobioside et svagt fluorescerende substrat for lysozyme. Ved spaltning af sukker rester af enzymet er fluoroforen frigives og kan påvises inde i kammeret. Her fordel af mikrokammer er minimeret fortynding af det secernerede enzym, hvilket tillader påvisning af lave enzymkoncentrationer inden for en kort tidsperiode. I figur 5a, er der flere eksempler kurver vist repræsenterer den enzymatiske omsætning af lysozym udskilles fra enkelte stimulerede U937-celler. U937-cellelinien stammer fra en patient med histiocytisk lymfom og kan induceres til terminal monocytisk differentiering. Cellelinjen producerer TNFa, lysozym og β2-mikroglobulin efter stimulering med PMA. Ingen omsætning er påviselig i åbne kamre eller celle-fri kamre (stiplet linie).

Figur 5b viser den relative kvantificering af et intracellulært enzym, her glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH). G6PDH er en husholdning protein og celler fra samme væv oprindelse bør ikke varierer meget i deres G6PDH koncentration ^24. Her blev U937-celler fanget i kammeret, og vi leverede et fluorescens-assay til påvisning af G6PDH sammen med lysisbuffer. Den består af glucose-6-phosphat, NADPH, enzymet diaphorase og substratet resazurin, som omdannes til fluorescerende resorufin når G6PDH er til stede. Stigningstakten i fluorescens over tid, svarer til mængden af ​​G6PDH. Mikrochippen letter yderligere undersøgelser af virkningen af toksiske forbindelser, fx ved inkubation af cellerne med et toksin (her camptothecin) for en defineret tid (60 min.) Efter denne behandling blev frigivet enzym skyllet væk, og cellerne blev lyseret, og niveauet af G6PDH blev målt. Faktisk et betydeligt tab af intracellulære enzymindhold var synlig på grund af en langsommere stigning i fluorescens (røde linier og kolonner i figur 5b). Nærmere oplysninger om denne undersøgelse kan findes i Eyer et al. ^8.

e_content "> Endvidere viser vi resultaterne fra et immunassay til analyse af intracellulære GFP beløb. For induceret ekspression, HEK293-celler, hvor transficeret med T-REx ekspressionssystem. I dette system GFP-ekspression kan induceres ved tilsætningen af ​​tetracyklin . Efter 8 timers inkubation blev cellerne suspenderet, skylles på chippen, fanget og efterfølgende lyseret. Optagelse anti-GFP-antistoffer blev immobiliseret på glasoverfladen ved at følge protokollen, der præsenteres her for at binde den frigivne GFP fra cellen. Figur 5c viser bindingskinetik af GFP til antistoffet. I dette eksempel kunne GFP måles direkte ved total intern fluorescensmikroskopi på grund af fluorescensen af ​​proteinet. Vi ønsker at understrege, at fluorescerende proteiner kan også påvises ved hjælp af en sandwich-ELISA eller lignende formater. Til dette kan de nødvendige assaykomponenterne indføres efter vasketrinene. Fordelen ved ELISA er signalforstærkning som følgetil enzymet, hvilket gav et fluorescerende produkt, der er akkumuleret inde i mikrokammer.

Endelig vil vi gerne præsentere en enkelt celle sandwich-ELISA med GAPDH som målet protein. Vi bestemt GAPDH i U937 suspensionsceller samt vedhængende HEK293 celler (figur 5D). Til dette har vi immobiliserede anti-GAPDH antistof (capture-antistof). Efter cellelyse blev det andet enzymmærkede antistof (detektionsantistof) indført. Kamrene blev åbnet, og på grund af strømmen blev ubundne antistoffer afsløring skyllet væk og Amplex Red blev introduceret til kammeret. Omdannelsen af ​​Amplex Red til fluorescerende resorufin af HRP (detektionsantistof) blev overvåget over tid i alle 60 microchambers på samme tid. Hældningen fra den lineære del af reaktionen blev bestemt. Denne hældning er direkte korreleret til koncentrationen af ​​enzymet og dermed koncentrationen af ​​analyt. Resultaterne fra enkelte U937-celler viste en gennemsnitlig GAPDHbeløb på 2,6 attomol, med minimal og maksimal værdier på 2,0 og 3,2 attomol hhv. Dataanalysen 46 HEK-celler viste, at de celler, der er indeholdt i gennemsnit 2,5 attomol GAPDH (minimal 0,9 attomol, maksimal 4,1 attomol).

Figur 1. Den microdevice og skemaer af de forskellige analyser præsenteres. A) Den samlede microdevice. Her er de kamre fyldt med fluorescein til visualisering (grøn fluorescens). Også synlige er reservoiret, tilslutningerne til kontrol lag (tryk, 2x4 stik i ryggen venstre og forreste højre) og forbindelsen til sprøjtepumpe (front). B) Zoom ind på mikrokammer området. Mange af disse kamre kan arrangeres i et array. For visualisering, var orange mad farvestof isoleret inde i kamrene, hvorimod grøn mad farvestof skylles igennem kanalerne. Trykket kontrol lag er fyldt med vand. C) Zoom på en enkelt mikrokammer. D) Skematisk af enhedens funktion. Inden for en mikrokammer (set fra siden), er en enkelt celle fanget og isoleret. Cellen kan stimuleres, inkuberet, vasket og til sidst lyseret i chippen. Det cellulære indhold kan analyseres direkte med assays for enzymer eller coenzymer, hvor en fluorescerende del, der dannes ved reaktion (til venstre). For andre proteiner kan overfladen modificeres med antistoffer, der binder specifikt til målproteinet (højre). Da antigenet er bundet til overfladen, kan lysatet vaskes væk og afsløring molekyler såsom sekundære antistoffer kan tilføjes at kvantificere målproteinet. Klik her for at se større billede .

e 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Skematisk af kanalsystemer og dimensioner mikrokammer. A) Mask udformning af den fluide lag. Den fluide lag består af (fra venstre til højre) et udløb kammeret regionen, et filter til at tilbageholde partikler og celleklynger og et indløb. A 4 i wafer kan havnen strukturerne for produktion af 10 chips. B) Mask design af den tilsvarende kontrol lag. På grund af den nødvendige plads for tilpasning, en 4 i wafer indeholder strukturerne for produktion af 5 chips. C) Skematisk af tilpasset lag (til venstre) og udvidelsen viser en celle fælde (til højre), begge med længdeskalaer. Klik her for at vise større billede .

Figur 3. Skematisk af SU-8 forarbejdning og PDMS produktion. A) Skematisk af SU-8 behandlingsprotokol. En siliciumskive er spin-belagt med SU-8 og soft-bagt ved 95 ° C i 4 min. Den ønskede mikrofluid kanal design er overført til SU-8 under anvendelse af en fotomaske og UV-lys. Efter en post-eksponering bage (95 ° C, 5 min) er SU-8 er udviklet og hårdt bages ved 180 ° C i 2 timer. B) Skematisk af mikrofluid chip opspind. En blanding af PDMS oligomer og hærdning agent er spin-belagt på master formularen til fluidumydelse kanaler og hældes på master formular for kontrol lag. Kanal-negativer er afbildet i pink. Begge lag hærdes i en ovn. Styringen lag chip del adskilles fra skiven (styrekanal blå) og huller til tryktilslutningerne udstanses (hvid). Begge dele-kontrol ogvæske lag-er placeret i ilt plasma, og bagefter, de er rettet ind og limes. Hele chip dernæst demonteret fra den fluide mester formular (fluidkanal i rød) og fluidisk adgang laves huller (hvid). Endelig chip og en glasplade bundet efter aktivering overflade i ilt plasma. Klik her for at se større billede .

Figur 4.. Skematisk af microcontact udskrivning. A) Master fabrikation til blød litografi. (1) Et PDMS stempel inkuberes med protein (bBSA) løsning. (2) Opløsningen fjernes, stempel vaskes og et monolag af protein forbliver på frimærket. (3) Stemplet placeres på en glasplade, og dermed proteinerne overføres til glas sur ansigt. I løbet af denne tid, er mikrochippen sammen med stempel på glasset udsættes for en ilt plasma. (4) Stemplet fjernes, og mikrochippen er bundet til objektglasset. For visualisering, er to eksempler strukturer vist, trykt med fluorescerende BSA-fluorescein konjugat. B) Microcontact trykt areal per kammer. Da trykning og kamre ikke er justeret, vi vurderet de variationer på bindende spots (trykt område) på tre forskellige chips (nummer 1-3) og alle 60 microchambers. Som et resultat, kammer-til-kammer variabilitet er relativt lille (<2,5%) og chip-til-chip variabilitet var ubetydelig (<1%), hvilket viser, at der faktisk ikke er behov for at tilpasse de trykte strukturer til kamrene. Klik her for at se større billede .

18/50618fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Resultater fra G6PDH, lysozym, GFP og GAPDH assays. Repræsentative resultater. A) Enzym sekretion fra enkeltceller. Venstre: skematisk af analysen for et secerneret enzym, her lysozym. Lysozym udskilles af enkelt, PMA-aktiverede U937-celler og ophobes i de lukkede microchambers, hvor det katalyserer produktionen af ​​fluorescerende 4-methylumbelliferon. Til højre: Data fra et sekret eksperiment. De grønne kurver viser fluorescensintensiteten over tid for kamre besat af en celle, er også vist et kammer uden celler (sort, stiplet linje) til sammenligning. B) påvisning af intracellulære enzymer i enkeltceller. Venstre: Skematisk af assay for intracellulært enzym G6PDH. Efter cellelyse, er intracellulær G6PDH frigives ind i kammeret, hvor de andre komponenter til en enzymatisk reaktion kaskade er til stede. Til højre: Eksempel kurver og repræsentative data. Single U937Cellerne blev analyseret for deres indhold af enzymer (sort). Ved toksiske påvirkning af camptothecin, som permeabiliserer membranen, blev to tredjedele af enzymet tabt (orange). C) Immunoassay af intracellulære proteiner af enkeltceller. Venstre: Skematisk af et immunoassay, her for den intracellulære protein GFP. Anti-GFP-antistoffer blev immobiliseret på overfladen ifølge protokollen beskrevet heri. Celler blev derefter lyseret på chip og de bindende steder blev overvåget over tid ved hjælp TIRF mikroskopi. Til højre: Graf fra sådan et eksperiment, der viser de bindingskinetik af GFP til de immobiliserede antistoffer. Tidspunkt 1 markerer indførelsen af ​​lysisbuffer. På tidspunkt 2, er GFP begynder at akkumulere på overfladen, hvilket betyder, at cellelyse er forekommet. Binding af GFP til antistofferne er afsluttet på tidspunkt 3. D) Sandwich-ELISA af intracellulære proteiner af enkeltceller. Venstre: Skematisk af en sandwich-ELISA, her for den intracellulære protein GADPH. Anti-GAPDH-antistoffer immobiliseret på overfladen ifølge protokollen beskrevet heri. Celler blev derefter lyseret på chip og inkuberes. Frigjort GPADH er bundet til antistof, blev kammeret vasket og detektion antistof (HRP-koblet) blev indført. I et sidste trin blev ikke-bundet detektionsantistof vasket væk, påvisningsreagens blev indført, og reaktionen blev overvåget over tid. Til højre:. Kvantificering af GAPDH inde U937 og HEK293 celler Klik her for at se større billede .

Overflademodificering protokol for ELISA

Step		Tid	Koncentration	Flow rate	Flow-fri inkubationstid	Kammer åben / lukket
		[Min]	(W / v)%	[Ul / min]	[Min]		</ Td>
BSA		30	4.	-		Åbent
PBS		10		5.		Åbent
Avidin		30	0.025	5.		Åbent
PBS		10		5.		Åbent
Protein G, biotin		30	0,0025	5.		Åbent
PBS		10		5.		Åbent
Antistof		20	0,0001	5.	15	Åbent
PBS		10	5.		Åbent
Celler (300.000 celler / ml)		~ 5		30		Luk når fælder er besat.
Lysebuffer		5.		30		Åbent kort
Inhibitor (fx 20 mM HCl)		15		10		Lukket
PBS		2		30		Lukket
Detektionsreagens		5.		30		Åbent kort
Begynde at overvåge reaktion

Tabel 1.. Overflade modification protokol for ELISA. For forklaring, se tekst.

Discussion

MicroFluidics teknologi har åbnet nye og spændende muligheder for enkelt-celle analyse. I særdeleshed, har mulighed for at fælde og immobilisere celler individuelt ved microfluidic værktøjer tilladt systematiske kort-og langsigtede undersøgelser af encellede egenskaber og respons. Derudover indkapsling af celler i højfrekvente mikrodråber, genereres på en mikrochip, har gjort det muligt encellede sekretion undersøgelser, som ikke kan udføres med konventionelle cytometri enheder. Den mikrosmådråbe tilgang har dog nogle begrænsninger, når der kræves inkubations-og vasketrin for den analytiske protokol. Vores tilgang kombinerer både begreberne celle fældefangst og isolation, og derfor er det lettere at udføre mere komplekse analyser, herunder immunoassays baseret på overfladeaktive immobiliserede antistoffer. Derudover er metoden meget fleksibel med hensyn til anvendelses-og målanalytter.

Udformningen af ​​mikrochippen giver (i) effekstrækkelig celle fældefangst, (ii) levering af forskellige buffere og reagenser, og (iii) pålidelig isolation i en meget lille volumen, når det kræves. På denne måde fortynding af målmolekylerne undgås. Tres (til hundreder) af microchambers er placeret på en enkelt anordning, der sikrer mange eksperimenter parallelt. De runde-formede ventiler lukning af microchambers kan løses sammen eller særskilt af rækker eller kolonner, hvilket er vigtigt, når krydskontaminering til tilstødende kamre bør forhindres. Med lukket microchambers kan kanalerne blive behandlet med skadelige løsninger såsom saltsyre til rengøring uden at påvirke de fangne ​​celler. På den anden side, hurtig udveksling af voluminet inde i mikrokammer er mulig. I øjeblikket en minimal tid på 200 ms er nødvendig for fuldt ud at åbne kammeret og indføre nye reagenser (til fuldstændig udveksling af mikrokammer volumen, strømningshastigheden må betragtes).

Mens vores metode er meget reliable og reproducerbar, bør man huske på, at der er to væsentlige kritiske punkter i protokollen af ​​chip fabrikation og drift. Først bindingen af ​​de to chip lag efter plasma aktivering skal ske hurtigt. Tilpasningen er kritisk, ellers nogle kamre eller endda hele chip er ikke brugbart, da bindingen er irreversibel. Dette skridt kan dog være vanskeligt for uerfarne brugere, efter nogen træning selv mindre erfarne laboratorie arbejdere får normalt gode resultater. Det andet kritiske punkt er fuldstændig rent under montering og anvendelse af mikrochip. Hvis støvpartikler er til stede på overfladen af ​​chippen, kan de kompromis styrekanaler og ventiler eller endda føre til en afbrydelse af PDMS-PDMS eller PDMS glas binding. Vi bruger derfor en masse opmærksomhed til rengøringsprocedurer. Det skal bemærkes, at ud over master formular fabrikation (udføres i et rent rum), vi producerer og bruger mikrochips i et normalt laboratorium miljø, hvor støv etnd partikler er til stede.

Trods al den omhu, hvis kamrene ikke lukker korrekt, kan det være, at enten trykledninger er blokeret eller spin coating proces ikke give den rigtige membran tykkelse. Også fra tid til tid, vi observeret utilstrækkelig limning, hvilket resulterer i brud på bånd mellem de to PDMS lag. Hvis mange chips fra samme parti viser dette problem, er det muligt, at tiden mellem plasma aktivering og tilpasningen er for lang. Nogle gange har vi oplevet klistrede PDMS på wafers, som ikke kunne fjernet ordentligt og var et resultat af utilstrækkelig silanisering af wafer.

Når produktionsmetoden er etableret, kan microfluidic platform anvendes til mange forskellige undersøgelser på enkelt celle niveau. Her viste vi påvisning af intracellulære og udskilte midler med forskellige assays, men mange andre assays er mulige på chippen. De fleste proteiner er ikke fluorescerende og deres debeskyttelse via immunoassays er ikke ligetil. Implementering af ELISA i chippen vil bringe mange fordele. For det første kan assayet være konstrueret meget specifikt for det ønskede protein (når egnede antistoffer er til stede). For det andet kan information fra ELISA kvantificeres selv ved lave koncentrationsgrænser, hvilket giver antallet af protein-eller molekyle-kopier til stede i cellen.

Vores nuværende chip er beregnet til analyse af enkelte pattedyrceller. Men ændringen af ​​chip til andre celler, såsom bakterier, alger og gær, bør være mulig. Indtil nu er den eneste begrænsning for eksperimenter er behov for en assay baseret på fluorescens. Men vi er i øjeblikket studerer gennemførelsen af ​​massespektrometri som en afsløring teknik. Når dette er etableret, vil den række af analytiske problemer, der kan undersøges med platformen være endnu bredere. Endvidere, da ikke alle analyser er muligt i nærvær af cellelyse buffere, viøjeblikket også evaluere forskellige andre lysis teknikker på platformen. Vi er sikre på, at den alsidige microfluidic platform præsenteret heri giver grundlag for nye encellede undersøgelser af proteom, metabolomet og secretome niveau.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane	ABCR (Karlsruhe, Germany)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
AZ 726 developer	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A-4503
Bovine serum albumin, biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Cell dissociation buffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Hydrochloric acid	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	109634
Magnesium chloride hexahydrate	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)	n.a.
PBS	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG grafted	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
Potassium chloride	Fluka	60132
Protein G, biotin	Sigma Fine Chemicals	41624
Silicon wafer	Si-Mat (Kaufering, Germany)	n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Biorad	1610716
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter	TRP	99722
1/1.5 mm biopsy puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm	Partec	04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.
Hotplate HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
MA-6 mask aligner	Karl Suess	n.a.
Multizoom AZ100M microscope	Nikon Corporation	n.a.
Photomask	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Plasma Cleaner PDC-32G	Harrick	n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.
Spin Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.
Syringe pump neMESYS	Cetoni	n.a.