Summary
In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.
Abstract
Wij presenteren een microfluïdische apparaat dat de kwantitatieve bepaling van intracellulaire biomoleculen in meerdere afzonderlijke cellen parallel maakt. Hiertoe worden de cellen passief gevangen in het midden van een microkamer. Na activering van de besturingslaag wordt de cel geïsoleerd van de omringende volume in een kleine kamer. De omliggende volume kan dan worden uitgewisseld zonder dat de geïsoleerde cel. Echter, bij korte openen en sluiten van de kamer, de oplossing in de kamer kan worden vervangen binnen een paar honderd milliseconden. Door de omkeerbaarheid van de kamers kunnen de cellen worden blootgesteld aan verschillende oplossingen achtereenvolgens een zeer controleerbare wijze, bijv. voor incubatie, wassen en tenslotte cellysis. De goed afgesloten microchambers staat het behoud van het lysaat, minimaliseren en de controle van de verdunning na cellysis. Aangezien lysis en analyse plaatsvinden op dezelfde locatie, is hoge gevoeligheid behouden omdat geen verdere dilution of verlies van de analyten optreedt tijdens het transport. De microkamer ontwerp maakt daarom de betrouwbare en reproduceerbare analyse van zeer kleine kopie-aantallen van intracellulaire moleculen (attomol, zeptomol) vrijgelaten uit individuele cellen. Bovendien kunnen vele microchambers worden opgesteld in een matrix format, waarbij de analyse van vele cellen tegelijk, aangezien geschikte optische instrumenten worden gebruikt voor bewaking. We hebben al gebruik van het platform voor proof-of-concept studies naar intracellulaire eiwitten, enzymen, co-factoren en second messengers in zowel relatieve of absolute meetbare wijze te analyseren.
Introduction
Vele studies in het verleden cel tot cel verschillen binnen een grote celpopulatie 1-3, in het bijzonder signalering verwerkt 4 of de hoeveelheden intracellulaire biomoleculen zoals eiwitten 5,6, metabolieten en cofactoren 7,8 geopenbaard. Deze heterogeniteit wordt geacht fundamenteel belang voor de aanpassing en evolutie 9 cellen toe, maar spelen ook een belangrijke rol bij het ontstaan en behandeling van ziekten zoals kanker 10-13. Daarom studies over de eencellige niveau van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek, vooral als deze studies tonen de verschillende celreacties na behandeling met bioactieve chemicaliën.
De laatste jaren zijn veel analytische platforms ontwikkeld die de analyse van afzonderlijke levende cellen of de chemische samenstelling van de celinhoud vergemakkelijken. Terwijl fluorescent geactiveerde cel sortering (FACS) is de gouden stAndard voor hoge-doorvoer analyse van afzonderlijke levende cellen, de methode niet worden toegepast voor de kwantificering van intracellulaire of uitgescheiden verbindingen. De opkomst van microfluïdische platforms heeft nieuwe analytische strategieën voor de positionering, de behandeling en observatie van enkele cellen beloofd. Een mijlpaal in microfluidics werd bereikt met de integratie van flexibele PDMS kleppen gerealiseerd door Quake en collega's 14,15. Deze kleppen zijn nuttig omdat ze regio's kunnen isoleren op chip, bijv. scheiden twee culturen 16. Bovendien zijn ze bijzonder toepasbaar voor single cell analyse en daarom bijdragen aan analyt verdunning te verminderen. De kracht van deze aanpak voor single-cell analyse is onlangs aangetoond door Hansen en collega's, die de genexpressie geanalyseerd uit honderden individuele cellen in parallel 17.
Bij targeting eiwitten en metabolieten, de analyse moeilijk door het ontbreken van een geschiktemplification methoden, het grote aantal verschillende verbindingen aanwezig zijn, en de verschillen in chemische aard. Bovendien zijn de meeste intracellulaire biomoleculen verwacht aanwezig in lage kopie-aantallen in de orde van enkele tienduizenden 18 te zijn, vandaar de gebruikte analysemethode moet een hoge gevoeligheid hebben. Krachtiger testen zoals immunoassays en enzym-linked immunoassays (ELISA) zijn moeilijk te integreren in microfluïdische apparaten omdat ze vereisen een aantal wassen en incubatie stappen evenals oppervlak immobilisatie.
Als gevolg van deze uitdagingen, is het niet verwonderlijk dat slechts een paar voorbeelden zijn gemeld waar eiwitten of metabolieten werden gekwantificeerd op de single-cell niveau. Zo hebben studies naar de uitscheiding van fluorescerende verbindingen gemeld 19,20. Onlangs heeft de uitvoering met ELISA werd voor de analyse van uitgescheiden (niet-fluorescerende) eiwitten van een celkweek (THP-1-cellen) 21 en single (immune) cellen 10. Targeting intracellulaire eiwitten, Shi et al.. Ontwikkelde een microfluïdische apparaat dat de identificatie van intracellulaire eiwitten voor de analyse van signaal transductie in tumorcellen door middel van een immunoassay 11 vergemakkelijkt. Slechts relatieve hoeveelheden eiwitten werden bepaald en geen enzymatische amplificatie werd gebruikt om het signaal voor lage abundantie proteïnen verhogen.
Onlangs waren we in staat om een single-cell trapping microdevice met fluorescentie-assays 8 en immunoassays 22 (figuur 1) te combineren. Cellen worden passief gevangen in microsized hindernis structuren, die het aanbod en (snelle) uitwisseling van middelgrote en andere chemische middelen zonder enige beweging van de cellen mogelijk te maken. Een ringvormige klep rond elke val maakt isolatie van de cel in een zeer klein volume ("de microkamer"). Deze klep wordt geactiveerd direct na de invoering van een cel-lyseren (hypoosmolar) buffer, hijNVU voorkomen intracellulaire moleculen of uitgescheiden moleculen weg te diffunderen. Het belangrijkste is, vanwege de kleine grootte van het volume (625 pl) grote verdunning van de moleculen wordt vermeden. Aangezien lysis en analyse uitgevoerd op dezelfde positie in de chip, is er geen verlies van analyten door transport. Het ontwerp van de chip hier beschreven bestaat uit 8 afwisselend rijen van 7 of 8 microchambers, in totaal 60 microchambers. De kamers worden bediend in rijen, zodat kruisbesmetting langs een lijn is uitgesloten.
Het platform kan gebruikt worden in combinatie met fluorescentie assays en immunologische assays (figuur 1d). Voor deze laatste, hebben we protocollen voor immobilisatie van de antilichamen, die met de chip productie en assemblage proces. Vandaar het platform opent de weg voor de gevoelige, betrouwbare en kwantificeerbare assays op de enkele cel niveau. Tot nu toe hebben we de inrichting voor de analyse van intracellular en uitgescheiden enzymen (relatieve kwantificatie door enzymatische assays), intracellulaire cofactoren, eiwitten en kleine moleculen (absolute kwantificatie door eindpunt assays of ELISA). Hieronder beschrijven we de werkwijze chip fabricage door middel van zachte meerlaagslithografie en protocollen voor patroonvorming van de antilichamen via microcontact printen en oppervlaktechemie. Daarnaast is een aantal voorbeelden van de chip gebruik en behandelingen worden gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SU-8 master Fabrication
Bereid zowel de master vormen voor de kanalen (vloeibare en controle voor schema en afmetingen zie figuur 2) met het volgende protocol maar met verschillende maskerpatronen. Het proces is weergegeven in figuur 3a.
- Begin met het verwarmen van een 4 inch siliciumwafel gedurende 10 minuten bij 180 ° C. Laad de gedehydrateerde wafer op een spin-coater en gebruik de volgende protocol voor spin-coating SU-8 2015:
- Spin wafer bij 100 rpm gedurende 20 sec (open deksel van spin-coater, afzien SU-8 tijdens deze stap, sluit het deksel na het afgeven).
- Spin wafer bij 500 rpm gedurende 10 seconden (dit zal verspreiden de resist over de gehele wafer).
- Spin wafer bij 1.750 rpm gedurende 30 seconden (definieert de hoogte van de resist tot 20 urn).
- Verwijder weerstand van de rand van de wafel met aceton (gebruik een staafje), aangezien dit anders blijft plakken aan de warmhoudplaat in de volgende stap. Breng de wafer te ahotplate bij 95 ° C en verwarm gedurende 4 minuten. Na de softbake, bloot het weerstaan door een photomask geplakt is aan glas in een masker aligner Sodalime met UV-licht (150 mJ / cm 2, gemeten bij 365 nm).
- Na de belichting Verhit de wafer opnieuw bij 95 ° C gedurende 5 minuten op een kookplaat. Afkoelen van de wafer tot kamertemperatuur en vervolgens ondergedompeld in een bad van SU-8 ontwikkelaar voor 4 min. Schud zachtjes om onbelicht SU-8 te verwijderen. Was de wafer met cleanroom kwaliteit isopropanol en droog blazen met stikstof. Controleer onder een microscoop als de succesvolle ontwikkeling (vooral de cel vallen) was. Als de cel vallen volledig ontwikkeld, moet de reflectie van de siliciumwafel zichtbaar. Eventueel de ontwikkeling van de wafer weer enkele minuten.
- Bak de wafer in een oven gedurende 2 uur bij 180 ° C om alle achtergebleven oplosmiddel te verwijderen. Controleer de hoogte van de kanalen met een stap profiler. Als de hoogte afwijkt van de gewenste hoogte, herhaal dit protocol te beginnen bij stap 1.1 een nieuwe wafer ende spin-snelheid (stap 1.1.3) veranderen. Afronding van de fabricage van de meester mal door silaniseren de wafer met 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silaan in een exsiccator overnachten.
2. Master Fabrication voor Microcontact Printing
- Om meester mallen bereiden microcontact drukken, gedehydreerd een silicium wafer gedurende 10 minuten bij 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS op dit wafer bij 7.500 tpm gedurende 30 seconden (de resist hecht beter om een gesilaniseerd oppervlak). Spin-coat 2 ml AZ1518 positieve weerstaan met dit protocol:
- Statische afgifte van de resist op de wafer.
- Spin wafer gedurende 5 seconden bij 500 tpm.
- Spin wafer gedurende 60 seconden bij 4000 tpm.
- Na 50 seconden softbake bij 100 ° C op een kookplaat, bloot de resist aan UV-licht (21 mJ / cm 2 bij 365 nm) door een fotomasker en een masker aligner. Ontwikkel de resist in een bad van AZ 726 voor 75 sec. Spoel de ontwikkelde wafer met DI-water en blaas dry met stikstof. Resten oplosmiddel door verhitting van de wafer bij 115 ° C gedurende 50 sec. Silaniseren de wafer onder vacuüm gedurende de nacht.
3. Fabricage van de Microfluidic Chip
Een tweelaags apparaat ontwerp wordt gebruikt voor deze experimenten. De twee lagen worden afzonderlijk bereid en aan elkaar gehecht voordat de chip eindelijk gebonden op een glasplaatje (figuur 3b). Deze stap beschrijft de productie van de PDMS lagen en PDMS stempel voor microcontact afdrukken.
- Bereid een 10:01 mengsel van PDMS en verharder. Bereid ongeveer 80 g PDMS in totaal (met behulp van onze ontwerpen, zal dit resulteren in 10 chips). Meng beide delen krachtig en ontgassen het PDMS tot het mengsel is luchtbel vrij (~ 30 min).
- Plaats de wafer met de besturingslaag in een petrischaaltje tape op de bodem. Vervolgens giet ~ 50 g PDMS boven en zet de wafer gedurende minstens 2 uur in een oven bij 80 ° C volledig te verzekerenuitharden van de PDMS. Herhaal dezelfde procedure voor de microcontact afdrukken wafer, voor dit ~ 20 g PDMS nodig is.
- Spin-coat PDMS op de wafer met de vloeibare laag bij een rotatiesnelheid van 2000 rpm tot een ongeveer 40 urn hoog PDMS laag. Hard de PDMS in een oven gedurende ten minste 1 uur bij 80 ° C.
- Wanneer beide delen uitgehard, verwijder de laag van de wafel en in stukken gesneden met een scheermesje. Punch druk aansluiting gaten met behulp van een 1 mm biopsie puncher. Voor opslag, is het raadzaam om een stuk tape over de kanalen zetten.
- De twee lagen te binden, nemen de spin beklede wafer en het bovenste gedeelte en plaats ze in een plasma reiniger 23. Na plasma behandeling, snel uitlijnen beide onderdelen onder een microscoop met grote werkafstand. Voeg wat extra PDMS rond de geplaatste bovenste delen. Deze stap is niet verplicht, maar het de verwijdering van de PDMS van de wafel vergemakkelijkt. Plaats de wafer in een oven bij 80 ° C gedurende ten minste 1 uur.
- Gebruik een scalpel aan de PDMS voorzichtig uit de wafer en de microchips te snijden. Punch toegang gaten voor de vloeibare verbindingen met een 1,5 mm biopsie puncher.
- De PDMS chip is nu klaar en kan worden opgeslagen voor maanden. Optioneel: Als de chip wordt gebruikt met een reservoir, snijd het bovenste deel van een 200 ul pipet tip en gebruik wat extra, semi-uitgeharde PDMS te lijmen op de top. Plaats de chip in de oven opnieuw bij 80 ° C gedurende tenminste 1 uur.
4. Bonding naar Glass Slide
Om het apparaat te gebruiken voor directe enzymatische assays, de enige stap vereist na hechting is het blokkeren van oppervlakken. Voor dit protocol, ga dan naar A. Echter, om de microfluïdische chip voor immunoassays of ELISA's gebruiken, verwijzen wij u naar het protocol B om de bindingsplaatsen alleen om het glaasje (dwz voor TIRF microscopie of SPR) te beperken. Als deze beperking is niet van belang, zie A, maar gebruik gebiotinyleerde conjugaten in stap 4.3 en ga verder met stap 4.8in protocol B om een volledig functionele oppervlak te creëren.
Voorafgaand aan het uitvoeren van protocol A en B: Het is raadzaam om alle gebruikte eiwitoplossingen voor het inzetten in de chip filteren. Vuil en eiwitcomplexen kunnen anders cel vallen blokkeren, waardoor het aantal kamers die kunnen worden gebruikt voor analyse verminderen. Hiervoor gebruikt u een nonprotein adsorberende filterinstallatie om alle oplossingen te filteren voordat de introductie ervan in de kanalen.
Protocol A (enzymatische assays)
- Om de microfluïdische apparaat af te ronden, bond de PDMS onderdelen op een glasplaatje. Om dit te doen, eerst te reinigen een glasplaatje met zeep, gedestilleerd water en ethanol. Droog de dia met behulp van een stikstofstroom. Reinig het PDMS deel met plakband.
- Doe de PDMS deel en de gereinigde glazen dia in het plasma reiniger voor 45 sec bij 18 W. Om een strakke binding te verzekeren, zet de chip op een hete plaat (100 ° C) gedurende 5 minuten.
- Na het plakken, vul de chip met fLUID. Een gemakkelijke manier om dit te bereiken is de centrifugale kracht te gebruiken. Snijd het onderste deel van 200 ul pipet tip. Voor de vloeibare kanalen vullen met de blockingbuffer (runderserumalbumine (4% w / v) of poly-L-lysine) geënt polyethyleenglycol (0,05% w / v) en plaats de uiteinden in de inlaten. Vul het besturingslaag inlaten met water of met een oplossing isosmotisch, bijv. PBS. Plaats de chip in de centrifuge (800 xg) gedurende 5 minuten. De kanalen moeten nu worden gevuld met vloeistof volledig. Zo niet, herhaal deze stap.
- Incubeer de blokkerende oplossing gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Was de oplossing van de vloeistoflaag met PBS bij een stroomsnelheid van 10 pl / min met een injectiepomp. Het apparaat is nu klaar voor celexperimenten.
Protocol B (immunoassays)
Voor een compleet overzicht van de oppervlakte modificatie van stap 4.7 verder wordt verwezen naar Tabel 1.
- Incubate PDMS postzegels voor microcontact afdrukken met een BBSA / BSA-oplossing (bijvoorbeeld 1-100). Na 30 min Reinig de stempels grondig met gedestilleerd water en droog het stempel onder een stikstofstroom. Plaats snel de stempels op een gereinigde glasplaatje (figuur 4).
- Expose het glasplaatje met de stempel samen met het bovenste deel van de microfluïdische chip zuurstofplasma gedurende 45 seconden bij maximum vermogen (18 W) in een plasma schoner. Na plasma behandeling, verwijder de stempel en lijn de bedrukte oppervlak onder de microchambers van het apparaat. Plaats de chip gedurende 30 minuten op een hete plaat bij 50 ° C.
- Om de resterende oppervlakte blokkeren, introduceren steriel gefiltreerde BSA-oplossing (4% (w / v) in PBS) in de chip met een centrifuge (zie stap 4.2). Incubeer gedurende 1 uur en was de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS (zie stap 4.3). De chip kan dan rechtstreeks worden toegepast of opgeslagen tot 2 weken bij 4 ° C in een vochtige doos.
- Voor een volledig functionele binding oppere introduceren avidine (0.025% (w / v) in PBS) in het reservoir. Gebruik een stroomsnelheid van 5 pl / min gedurende 30 min naar het avidine oplossing trekken via de fluïdumkanalen. Daarna spoelen PBS gedurende 10 minuten. Spoel het reservoir grondig.
- Daarna voeg Proteïne G (0.0025% (w / v) in PBS) en spoel nog eens 30 minuten. Wassen met PBS gedurende nog 10 minuten daarna. Voeg vervolgens het interessante antilichaam (0,0001% (g / v) in PBS) gedurende 10 minuten. Na 10 min, stop de stroom gedurende 15 minuten om binding mogelijk. Vervolgens wassen met PBS gedurende 10 minuten.
5. Celexperimenten
Het protocol is in het algemeen vanwege de verscheidenheid van mogelijke assays. Als voorbeeld wordt de reagentia nodig voor het G6PDH toxiciteit test gegeven. De eerste cel trapping efficiëntie van het apparaat is ongeveer 2,5%, dwz 5 van de 200 cellen zullen worden opgesloten. De definitieve bezetting van de cel vallen sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn, het protocol op te schortende cellijn en het moment dat de cellen worden gespoeld door het kanaal. Voor cellen die van nature groeien in suspensie (bijvoorbeeld U937), kunnen enkele cellen worden gevonden in ongeveer 75% van de kamers na enkele minuten. De andere kamers zijn ofwel niet gevuld of bezet door twee of meer cellen. In het algemeen, de eencellige bezetting is kleiner voor hechtende cellijnen. Bij gebruik van de eerder mild suspendeerfase protocol hier gepresenteerde, het percentage af tot ongeveer 30% (HEK, MLT-cellen). De eencellige bezetting kan worden verbeterd door trypsine behandeling van de cellen, maar dit kan ook de resultaten van de experimenten veranderen.
Afhankelijk van het doelmolecuul kan adsorptie of absorptie PDMS de resultaten beïnvloeden. Adsorptie kan worden verminderd door het blokkeren van de oppervlakken met BSA of PLL-g-PEG. Absorptie is het onwaarschijnlijk voor de meeste hydrofiele biomoleculen, maar het moet worden gecontroleerd voor (kleine) lipofiele cel componenten.
- Bereid de cellen volgens het specifieke protocol (bijv.
- Plaats de cellen op de chip met behulp van een injectiepomp en forward flow, in plaats van de celsuspensie trekken. Gebruik een stroomsnelheid van 5 ul / min voor suspensie cellijnen en hogere stroomsnelheden van 10-20 pl / min voor lijm cellen aangezien niet-specifieke hechting van de cellen te verminderen op de kanaalwanden.
- Wanneer de vallen gevuld, sluit de kamers. Als veel cellen hechten niet-specifiek aan het oppervlak, proberen ze weg te wassen met celdissociatiebuffer met een stroomsnelheid van 10-30 pl / min.
Protocol A (enzymatische assays)
- Trekken lysebuffer door de chip. Voor dit voorbeeld, deze buffer is een hypoosmolar buffer toegevoegd Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v / v) Tween 20). Voor lysis, snel open en dicht kamers (dwz 500 msec voor debieten van 10-50 pl / min 7,21). Voor de bepaling G6PDH, voeg 2 mM glucose-6-fosfaat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml diaforase en 0,3 mM resazurin de lysisbuffer. Beginnen met het monitoren van de kinetische reactie direct na lysis.
Opmerking: Kies een buffer die geschikt is voor de test, maar kaal in het achterhoofd dat sterke reinigingsmiddelen (zoals Triton, SDS) Lyse cellen onmiddellijk en zal leiden tot een verlies van analyt tijdens kamer opening.
Protocol B (immunoassays)
Voor een korte beschrijving van de ELISA celexperimenten (debieten, kamer-status, etc.) wordt verwezen naar Tabel 1.
- Voor ELISA, voegt de gewenste detectie reagens (bijv. secundair antilichaam, gemerkt antigeen) rechtstreeks aan de lysisbuffer. De hierin toegevoegde Tween 20 vermindert de niet-specifieke adsorptie. Lyseren van de cellen volgens stap 5.4. Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten binding (incubatietijd afhankelijk van het gebruikte antigeen en antilichaam) mogelijk.
- Antilichaam enzym conjugaten die niet-specifiek geadsorbeerde de kanaalwanden kan leiden tot een omzetting van de detectiereagens reeds in het reservoir en kanalen. Om problemen te verminderen van deze adsorptie, spoelen een permanente remmer van de gebruikte detectie enzym via de chip tijdens de incubatietijd (kamers gesloten, voordat u de detectiereagens). Voor de HRP, gebruiken 20 mM HCl in water om het niet-specifiek geadsorbeerd enzymen permanent te inactiveren.
- Na incubatietijd introduceren detectie reagens (bijv. Amplex Red en waterstofperoxide voor HRP) aan de chip. Open de kamers binnenkort weer te wassen van de niet-gebonden secundair antilichaam weg en de detectie reagens toe te voegen. Beginnen met het monitoren van de kinetische reactie onmiddellijk.
- Kalibratie: Immobiliserenhet antilichaam tegen het doelwit van belang. Sluiten kamers. Bereid verschillende concentraties van de stof in buffer of in cellysaat off-chip. Breng een concentratie naar de chip en snel wisselen van het volume in de kamers (500 msec openingstijd). Deze opening is voldoende kort om te voorkomen dat extra ophoping van analyt spoelen slechts een bepaald aantal moleculen van het volume van de microkamer gedetecteerd. Van de bekende concentratie van het antigeen in de oplossing en het volume van de kamer (625 pl) Bereken de hoeveelheid binnen de kamer. Daarna verder met stap 5.5 en de invoering van de detectie-eenheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het platform kan een aantal intracellulaire en afgescheiden moleculen in of geproduceerd door enkele cellen te analyseren. Hier willen we ander voorbeeld studies aan de verscheidenheid van mogelijke tests onderstrepen. We zullen een voorbeeld voor een uitgescheiden enzym (figuur 5a) en een intracellulair enzym (figuur 5b) en eiwit (Figuren 5c en d). Voor meer voorbeelden, zoals co-factoren of kleine moleculen, verwijzen wij u naar Eyer et al.. (2012) en Eyer et al.. (2013).
Eerst geven we een test voor een uitgescheiden enzym (Figuur 5a). Bij activering met forbolmyristaatacetaat (PMA), humane monocyten induceren secretie van lysozym, een enzym dat bacteriële cellyse veroorzaakt. Voor deze test, de cel buffer bevat 4-methylumbelliferyl β-DN, N'-diacetylchitobioside, een zwak fluorescent substraat voor lysozYme. Na splitsing van de suikerresiduen door het enzym, wordt de fluorofoor bevrijd en kan worden gedetecteerd in de kamer. Hier is het voordeel van de microkamer de geminimaliseerde verdunning van het uitgescheiden enzym, waardoor de detectie van lage concentraties enzym binnen een korte tijdsperiode. In figuur 5a zijn bijvoorbeeld verschillende curven weergegeven die de enzymatische omzet van lysozym afgescheiden uit een gestimuleerde U937 cellen. De U937 cellijn afgeleid van een patiënt met histiocytair lymfoom, en kunnen worden geïnduceerd op klem monocytische differentiatie. De cellijn produceert TNFa, lysozym en β2-microglobuline na stimulatie met PMA. Geen omzet is detecteerbaar in de open kamers of cel-vrije kamers (stippellijn).
Figuur 5b toont de relatieve kwantificatie van een intracellulair enzym, hier glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PDH). G6PDH is een huishouding eiwitten en cellen uit hetzelfde weefsel oorsprong mag niet variëren sterk in hun G6PDH concentratie 24. Hier werden U937 cellen opgesloten in de kamer, en leverden we een fluorescentie-assay voor de detectie van G6PDH met de lysisbuffer. Het bestaat uit glucose-6-fosfaat, NADPH, het enzym diaforase en het substraat Resazurin, dat wordt omgezet in fluorescerende resorufine wanneer G6PDH aanwezig is. De snelheid van toename in fluorescentie in de tijd overeenkomt met het bedrag van G6PDH. De microchip maakt verder onderzoek naar het effect van toxische verbindingen, bijv. door incubatie van de cellen met een toxine (hier camptothecine) gedurende een vastgestelde tijd (60 min.). Na deze behandeling werd de vrijgekomen enzym weggespoeld en de cellen werden gelyseerd en het niveau van G6PDH gemeten. Inderdaad, een aanzienlijk verlies van intracellulaire enzymgehalte was zichtbaar door een langzamere toename van de fluorescentie (rode lijnen en kolommen in figuur 5b). Details van dit onderzoek zijn te vinden in Eyer et al.. 8
e_content "> Voorts tonen we de resultaten van een immunotest voor de analyse van intracellulaire GFP bedragen. Bij geïnduceerde expressie, HEK293-cellen getransfecteerd waarbij de T-Rex expressiesysteem. In dit systeem GFP expressie kan worden geïnduceerd door toevoeging van tetracycline . Na 8 uur incuberen werden de cellen gesuspendeerd, gespoeld op de chip, opgesloten, vervolgens gelyseerd. vastleggen anti-GFP antilichamen geïmmobiliseerd op het glazen oppervlak volgens het protocol hier gepresenteerd aan de GFP vrijgegeven uit de cel binden. Figuur 5c toont de bindingskinetiek van GFP aan het antilichaam. In dit voorbeeld zou GFP rechtstreeks worden gemeten door totale interne fluorescentiemicroscopie door de fluorescentie van het eiwit. We willen benadrukken dat niet-fluorescerende eiwitten kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van een sandwich ELISA of soortgelijk formaten. Hiervoor kan de benodigde test onderdelen worden ingevoerd na het stappen wassen. Het voordeel van ELISA is de signaalversterking te wijtenhet enzym, waardoor een fluorescent product dat wordt geaccumuleerd in de microkamer.Tot slot willen we graag een eencellige sandwich-ELISA met GAPDH presenteren als het doelwit eiwit. We bepaalden GAPDH in U937 suspensie cellen evenals hechtende HEK293-cellen (Figuur 5d). Hiervoor hebben we geïmmobiliseerde anti-GAPDH antilichaam (capture antilichaam). Na cellysis werd het tweede enzym-gelabeld antilichaam (detecterende antilichaam) geïntroduceerd. De kamers werden geopend en door de stroom, werden ongebonden detectie antilichamen weggewassen en Amplex Red werd geïntroduceerd in de kamer. De omzetting van Amplex rood naar resorufine fluorescentie door HRP (detectie-antilichaam) werd in de tijd gevolgd in alle 60 microchambers tegelijk. De helling van het lineaire gedeelte van de reactie bepaald. Deze helling is direct gecorreleerd aan de concentratie van het enzym en dus de concentratie van analyt. De resultaten uit een U937-cellen vertoonden een gemiddelde GAPDHhoeveelheid van 2,6 attomol, met minimale en maximale waarden van 2,0 en 3,2 attomol respectievelijk. De gegevensanalyse van 46 HEK cellen onthulde dat die cellen in gemiddeld 2,5 attomol GAPDH (minimaal 0,9 attomol, maximaal 4,1 attomol).
Figuur 1. De micro-inrichting en schema's van de verschillende assays gepresenteerd. A) De samengestelde microdevice. Hier worden de kamers gevuld met fluoresceïne voor visualisatie (groene fluorescentie). Ook zichtbaar is het reservoir, de aansluitingen voor de besturingslaag (druk 2x4 connectors links achter en rechts) en de verbinding met de injectiepomp (voor). B) vergroten de microkamer gebied. Veel van deze kamers kunnen worden opgesteld in een matrix. Voor visualisatie, werd voedsel kleurstof oranje geïsoleerd in de kamers, terwijl groen voedsel kleurstof wordt gespoeld door de kanalen. De drukregeling laag wordt met water gevuld. C) Zoom op een microkamer. D) Schematische voorstelling van de werking van het apparaat. Binnen een microkamer (zijaanzicht), is een enkele cel opgesloten en geïsoleerd. De cel kan worden gestimuleerd, geïncubeerd, gewassen en tenslotte gelyseerd in de chip. De cellulaire inhoud kan direct worden geanalyseerd assays voor enzymen of co-enzymen waarbij een fluorescerende groep wordt gegenereerd na reactie (links). Voor andere eiwitten, kan het oppervlak worden gemodificeerd met antilichamen die specifiek binden aan het doeleiwit (rechts). Aangezien het antigeen wordt gebonden aan het oppervlak, kan het lysaat worden weggespoeld en detectie moleculen zoals secundaire antilichamen kunnen worden toegevoegd aan het doeleiwit te kwantificeren. Klik hier voor grotere afbeelding .
e 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 2. Schematische voorstelling van channel systemen en de afmetingen van de microkamer. A) ontwerp van het Masker van de vloeibare laag. De vloeibare laag bestaat uit (van links naar rechts) een stopcontact, de kamer regio, een filter voor deeltjes en celgroepen te behouden en een inlaat. A 4 wafer kunnen de structuur haven voor de productie van 10 chips. B) Masker ontwerp van de corresponderende besturingslaag. Vanwege de benodigde ruimte uitgelijnd, een 4 in wafer bevat de structuur voor de productie van chips 5. C) Schematische uitgelijnde lagen (links) en uitbreiding die een cel trap (rechts), beide met lengteschalen. Klik hier om te bekijken Afbeelding vergroten .
Figuur 3. Schema van SU-8 verwerking en PDMS productie. A) Schema van de SU-8 processing protocol. Een silicium wafer is roterend bedekken met SU-8 en zacht gebakken bij 95 ° C gedurende 4 minuten. De gewenste microfluïdische kanaal ontwerp wordt overgebracht op de SU-8 met behulp van een fotomasker en UV-blootstelling aan licht. Na bakken na belichting (95 ° C, 5 min), SU-8 ontwikkeld en hard gebakken bij 180 ° C gedurende 2 uur. B) Schematische voorstelling van de microfluïdische chip fabricage. Een mengsel van PDMS oligomeer en verharder gespincoat op de master-formulier voor de vloeibare kanalen, en gegoten op de master-formulier voor de controle laag. Het kanaal negatieven zijn afgebeeld in het roze. Beide lagen worden uitgehard in een oven. De besturingslaag chip part demontage van de wafer (besturingskanaal blauw) en gaten voor de drukaansluitingen gestanst (wit). Beide delen controle envloeistoflaag-worden in zuurstofplasma, en daarna worden ze uitgelijnd en verbonden. De hele chip wordt vervolgens gedemonteerd uit de vloeibare meester formulier (vloeistofkanaal in rood) en vloeibare toegang gaten worden geponst (wit). Tot slot, de chip en een glasplaatje gebonden na oppervlakte activering in zuurstof plasma. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Schematische voorstelling van de microcontact afdrukken. A) Master fabricage voor zachte lithografie. (1) Een PDMS stempel wordt geïncubeerd met eiwit (BBSA) oplossing. (2) De oplossing wordt verwijderd, de stempel wordt gewassen en een monolaag van eiwit blijft de stempel. (3) Het stempel wordt op een glasplaatje, waardoor de eiwitten overgebracht naar het glasoppervlak gezicht. Gedurende deze tijd, de microchip met de stempel op het glas wordt blootgesteld aan een zuurstofplasma. (4) Het stempel wordt verwijderd en de microchip is verbonden met het glaasje. Voor visualisatie, zijn twee voorbeeld structuren getoond, gedrukt met fluorescerende BSA-fluoresceïneconjugaat. B) Microcontact gedrukte oppervlakte per kamer. Omdat het afdrukken en kamers niet zijn uitgelijnd, we de varianten beoordeeld op binding plekken (gedrukt gebied) op drie verschillende chips (nummer 1-3) en alle 60 microchambers. Hierdoor kamer naar kamer variabiliteit is relatief klein (<2,5%) en chip-to-chip variatie was verwaarloosbaar (<1%), waaruit blijkt dat er inderdaad geen noodzaak om de afgedrukte structuren om de kamers te lijnen. Instructies hier voor grotere afbeelding .
18/50618fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 5. Resultaten van G6PDH, lysozym, GFP en GAPDH assays. Representatieve resultaten. A) Enzyme afscheiding van enkelvoudige cellen. Links: schema van de assay voor een uitgescheiden enzym, hier lysozym. Lysozym wordt afgescheiden bij een enkele, PMA-geactiveerde U937 cellen en zich ophoopt in de gesloten microchambers, waar katalyseert de productie van fluorescerende 4-methylumbelliferon. Rechts: Gegevens verkregen uit een afscheiding experiment. De groene curven tonen de fluorescentie-intensiteit in de tijd voor de kamers bezet door een cel, ook getoond is een kamer zonder cellen (zwart, stippellijn) voor de vergelijking. B) Detectie van intracellulaire enzymen in enkele cellen. Links: Schematische voorstelling van de test voor de intracellulaire enzym G6PDH. Na cellysis wordt intracellulair G6PDH vrij in de ruimte, waar de andere componenten voor een enzymatische reactie cascade aanwezig zijn. Rechts: Voorbeeld bochten en representatieve gegevens. Single U937cellen werden geanalyseerd op hun enzymgehalte (zwart). Bij de toxische invloed van camptothecine, waarvan het membraan permeabilizes tweederde van het enzym verloren (oranje). C) Immunoassay van intracellulaire proteïnen van enkele cellen. Links: Schematische voorstelling van een immunoassay, hier voor de intracellulaire eiwit GFP. Anti-GFP antilichamen werden geïmmobiliseerd op het oppervlak volgens protocol hierin beschreven. Cellen werden vervolgens gelyseerd op de chip en de verbindingsplaatsen tijd werd gevolgd via TIRF microscopie. Rechts: Grafiek van dergelijk experiment toont de bindingskinetiek van GFP aan de geïmmobiliseerde antilichamen. Tijdstip 1 markeert de introductie van de lysisbuffer. Op tijdstip 2, GFP begint te accumuleren op het oppervlak, waardoor cellysis opgetreden. Binding van GFP aan de antilichamen is voltooid op tijdstip 3. D) Sandwich ELISA van intracellulaire proteïnen van enkele cellen. Links: Schematische voorstelling van een sandwich ELISA, hier voor de intracellulaire eiwit GADPH. AntiGAPDH-antilichamen geïmmobiliseerd op het oppervlak volgens protocol hierin beschreven. Cellen werden vervolgens gelyseerd chip en geïncubeerd. Liberated GPADH gebonden aan het antilichaam, werd de kamer gewassen en detectie antilichaam (HRP-gekoppelde) geïntroduceerd. Als laatste werd niet-gebonden detecterende antilichaam weggewassen, de detectie reagens werd ingevoerd en de reactie werd gevolgd in de tijd. Rechts:. Kwantificering van GAPDH binnen U937 en HEK293 cellen Klik hier voor grotere afbeelding .
Modificatie van het oppervlak protocol voor ELISA
| Stap | Tijd | Concentratie | Debiet | Flow gratis incubatietijd | Chamber open / dicht | ||
| [Min] | (W / v)% | [Pl / min] | [Min] | </ Td> | |||
| BSA | 30 | 4 | - | Open | |||
| PBS | 10 | 5 | Open | ||||
| Avidine | 30 | 0.025 | 5 | Open | |||
| PBS | 10 | 5 | Open | ||||
| Proteïne G, biotine | 30 | 0.0025 | 5 | Open | |||
| PBS | 10 | 5 | Open | ||||
| Antilichaam | 20 | 0.0001 | 5 | 15 | Open | ||
| PBS | 10 | 5 | Open | ||||
| Cellen (300.000 cellen / ml) | ~ 5 | 30 | Sluiten wanneer vallen worden bezet. | ||||
| Lysisbuffer | 5 | 30 | Open kort | ||||
| Inhibitor (bijv. 20 mM HCl) | 15 | 10 | Gesloten | ||||
| PBS | 2 | 30 | Gesloten | ||||
| Detectiereagens | 5 | 30 | Open kort | ||||
| Beginnen met de monitoring reactie | |||||||
Tabel 1. Surface WIJZIGIn protocol voor ELISA. Voor uitleg, zie tekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microfluidics technologie heeft nieuwe en fascinerende mogelijkheden voor single-cell analyse. In het bijzonder, heeft de mogelijkheid te vangen en te immobiliseren cellen individueel microfluïdische gereedschappen toegestaan systematische korte en lange-termijn studies over eencellige eigenschappen en de respons. Bovendien inkapselen van cellen in hoogfrequente microdruppeltjes, gegenereerd op een microchip heeft enkele cel secretie studies, die niet kan worden uitgevoerd met gebruikelijke cytometrie inrichtingen ingeschakeld. De microdruppels benadering heeft echter een aantal beperkingen bij incubatie-en wasstappen vereist voor de analytische protocol. Onze benadering combineert begrippen cel vangen en isolatie en derhalve vergemakkelijkt het uitvoeren complexer assays waaronder immunoassays gebaseerd op oppervlakte-geïmmobiliseerde antilichamen. Bovendien is de werkwijze zeer flexibel met betrekking tot de toepassing en doelanalyten.
Het ontwerp van de microchip kunnen (i) efficiënt cel opsluiten, (ii) de levering van verschillende buffers en reagentia, en (iii) de veilige scheiding in een zeer klein volume wanneer dat nodig is. Hierdoor wordt de verdunning van de doelmoleculen wordt vermeden. Zestig (honderden) van microchambers zijn geplaatst op een enkel apparaat waardoor vele experimenten in parallel. De ronde kleppen sluiten de microchambers kunnen samen of afzonderlijk worden rijen of kolommen, wat belangrijk is wanneer kruisbesmetting aangrenzende kamer moet worden voorkomen. Met gesloten microchambers kunnen de kanalen worden behandeld met schadelijke oplossingen zoals zoutzuur om te reinigen zonder dat de gevangen cellen. Anderzijds, snelle uitwisseling van het volume binnen de microkamer mogelijk. Nog een minimale tijd van 200 msec nodig om de kamer volledig open en nieuwe reagentia voeren (voor volledige uitwisseling van de microkamer volume, het debiet moet worden beschouwd).
Terwijl onze methode is zeer reliable en reproduceerbaar, moet men in gedachten houden dat er twee belangrijke kritische punten in het protocol van de chip fabricage en de werking. Ten eerste, de hechting van de twee lagen chip na plasma-activering moet snel gebeuren. De uitlijning is kritisch omdat anders sommige kamers of zelfs de hele chip is niet bruikbaar, omdat de binding onomkeerbaar. Deze stap kan moeilijk zijn voor onervaren gebruikers, maar na wat training nog minder ervaren laboranten krijgen meestal goede resultaten. De tweede kritieke punt is de netheid tijdens montage en het gebruik van de microchip. Indien stofdeeltjes op het oppervlak van de chip, kunnen ze besturingskanalen en de kleppen beschadigen of zelfs tot een breuk van de PDMS-PDMS of PDMS-glas binding. We hebben daarom veel aandacht besteden aan het schoonmaken procedures. Opgemerkt wordt dat naast de master formulier fabricage (uitgevoerd in een clean room), produceren en gebruiken microchips in een normale laboratoriumomgeving, waar stof eennd deeltjes aanwezig zijn.
Ondanks alle zorg indien de kamers niet correct sluiten, kan het zijn dat ofwel drukleidingen worden geblokkeerd of de spin coatingproces niet over een juiste membraandikte. Ook van tijd tot tijd we waarnamen onvoldoende hechting, waardoor breuk van de binding tussen de twee PDMS lagen. Als veel chips uit dezelfde partij tonen dit probleem, is het mogelijk dat de tijd tussen plasma activering en uitlijning te lang. Soms ervaren we kleverige PDMS op wafers die niet goed kon worden verwijderd en was een gevolg van onvoldoende silanisatie van de wafel.
Zodra de productiemethode is vastgesteld, kunnen de microfluïdische platform worden gebruikt voor verschillende studies over de enkele cel. Hier toonden we de detectie van intracellulaire en uitgescheiden agenten met verschillende assays, maar veel andere testen mogelijk op de chip. De meeste eiwitten zijn niet fluorescerend en hun debescherming via immunoassays is niet eenvoudig. Uitvoering van ELISA in de chip zal brengen vele voordelen. Ten eerste kan de test zeer specifiek zijn ontworpen voor het gewenste eiwit (bij geschikte antilichamen aanwezig zijn). Ten tweede kan informatie van ELISA gekwantificeerd zelfs bij lage concentratiegrenzen, waardoor het aantal kopieën eiwit of molecuul in de cel.
Onze huidige chip is ontworpen voor de analyse van afzonderlijke zoogdiercellen. Echter, wijziging van de chip voor andere cellen zoals bacteriën, algen en gisten, mogelijk zijn. Tot nu toe de enige beperking voor experimenten is de noodzaak van een assay op basis van fluorescentie. Wij zijn echter momenteel de uitvoering van massaspectrometrie als detectie techniek. Zodra dit is vastgesteld, zal het bereik van de analytische problemen die kunnen worden onderzocht met het platform nog breder zijn. Aangezien niet elke analyse mogelijk in aanwezigheid van cellysis buffers, wezijn op dit moment ook de evaluatie van diverse andere lysis technieken op het platform. Wij zijn ervan overtuigd dat de veelzijdige microfluïdische platform hierin gepresenteerd vormt de basis voor nieuwe single-cell studies op het proteoom, metabolome en secretome niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs zeer erkentelijk voor Tom Robinson voor het proeflezen van het manuscript, C. Bärtschi en H. Benz voor de bouw van de custom-built drukregelsysteem. We willen ook graag het gebruik van de clean room faciliteit FIRST en het Licht Microscopie Centrum (LMC), zowel bij ETH Zürich erkennen. Het werk werd gefinancierd door Merck Serono en de European Research Council (ERC) in het kader van het 7e Kaderprogramma (ERC Starting Grant, project geen. 203.428, nμLIPIDs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
- Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
- Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
- Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
- Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
- Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
- Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
- White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
- Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
- Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
- Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
- Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).
