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Bioengineering

Une puce microfluidique pour l'analyse chimique polyvalente de cellules isolées

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l'analyse d'une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l'aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence.

Abstract

On présente un dispositif microfluidique qui permet la détermination quantitative de plusieurs biomolécules intracellulaires dans des cellules individuelles en parallèle. A cette fin, les cellules sont piégées dans passivement au milieu d'une microchambre. Lors de l'activation de la couche de contrôle, la cellule est isolée du volume entourant dans une petite chambre. Le volume entourant peut alors être échangé sans affecter la cellule isolée. Toutefois, à la courte ouverture et la fermeture de la chambre, la solution dans la chambre peut être remplacé à quelques centaines de millisecondes. En raison de la réversibilité des chambres, les cellules peuvent être exposées à des solutions différentes de manière séquentielle dans un mode hautement contrôlable, par exemple pour l'incubation, le lavage, et finalement, la lyse des cellules. Les microchambres hermétiques permettent le maintien du lysat, réduire et contrôler la dilution après lyse cellulaire. Depuis la lyse et l'analyse se produisent au même endroit, haute sensibilité est conservée, car aucune autre dilution ou de la perte des analytes se produit pendant le transport. La conception de la microchambre permet donc l'analyse fiable et reproductible de très petits nombres de copies de molécules intracellulaires (attomoles, zeptomoles) libérés à partir de cellules individuelles. En outre, de nombreuses chambres miniatures peuvent être disposés dans un format de réseau, ce qui permet l'analyse de plusieurs cellules à la fois, étant donné que les instruments optiques appropriés sont utilisés pour la surveillance. Nous avons déjà utilisé la plate-forme pour les études de preuve de concept pour analyser les protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs et des seconds messagers manière quantifiable soit relative ou absolue.

Introduction

De nombreuses études dans le passé ont révélé des différences de cellule à cellule dans une grande population de cellules 1-3, en particulier les processus de signalisation 4, ou les quantités de biomolécules telles que les protéines intracellulaires 5,6, des métabolites et des cofacteurs 7,8. Ces hétérogénéités sont considérés comme d'une importance fondamentale pour l'adaptation de la cellule et de l'évolution 9, mais aussi jouer un rôle clé dans l'émergence et le traitement de maladies telles que le cancer 10-13. Par conséquent, les études sur le niveau de la cellule sont d'un grand intérêt dans la recherche biologique et pharmacologique, en particulier si ces études révèlent les différentes réponses cellulaires après traitement avec des substances chimiques bioactives.

Au cours des dernières années, plusieurs plates-formes d'analyse ont été mises au point qui facilite l'analyse des cellules vivantes simples ou la composition chimique du contenu des cellules. Bien cellulaire activé par fluorescence (FACS) est l'or standard pour analyse à très haut débit de cellules vivantes individuelles, le procédé ne peut pas être utilisé pour la quantification des composés intracellulaires ou sécrétées. L'émergence de plates-formes microfluidiques a promis stratégies d'analyse nouveaux pour le positionnement, le traitement et l'observation des cellules individuelles. Une étape importante dans la microfluidique a été conclu avec l'intégration des vannes flexibles PDMS réalisés par Quake et collègues 14,15. Ces vannes sont utiles car ils peuvent isoler des régions sur la puce, par exemple séparer deux cultures 16. En outre, ils sont particulièrement applicable pour l'analyse d'une seule cellule et d'aider à réduire les problèmes de dilution analyte donc. La puissance de cette approche pour l'analyse unicellulaire a été démontré récemment par Hansen et ses collègues, qui ont analysé l'expression des gènes de centaines de cellules uniques en parallèle 17.

Lorsque le ciblage des protéines et des métabolites, l'analyse est très difficile en raison de l'absence d'un convenableModes de mplification, le grand nombre de différents composés présents, et de leurs variations de nature chimique. En outre, la plupart des biomolécules intracellulaires sont tenus d'être présents à faible nombre de copies de l'ordre de quelques dizaines de milliers 18, où la méthode d'analyse utilisée doit avoir une haute sensibilité. Des dosages plus puissants, tels que des dosages immunologiques et des dosages immunoenzymatiques (ELISA) sont difficiles à intégrer dans des dispositifs microfluidiques, car ils nécessitent plusieurs étapes de lavage et d'incubation ainsi que l'immobilisation de surface.

En raison de ces défis, il n'est pas surprenant que seuls quelques exemples ont été signalés où des protéines ou des métabolites ont été quantifiés sur le niveau de la cellule. Par exemple, des études sur la sécrétion de composés fluorescents ont été rapportés 19,20. Récemment, la mise en œuvre par ELISA a été présenté pour l'analyse des sécrétées (non fluorescentes) des protéines à partir d'une culture cellulaire (cellules THP-1) 21 et seul (immune) cellules 10. Le ciblage des protéines intracellulaires, Shi et al. Mis au point un dispositif microfluidique qui a facilité l'identification des protéines intracellulaires pour l'analyse des voies de signalisation des cellules tumorales au moyen d'un immuno-essai 11. Cependant, seules des quantités relatives de protéines ont été déterminées et aucune amplification enzymatique a été utilisée pour augmenter le signal pour les protéines de faible abondance.

Récemment, nous avons été en mesure de combiner un micro-dispositif de piégeage seule cellule avec des essais de fluorescence 8 et immunoessais 22 (Figure 1). Les cellules sont passivement piégés dans des structures de haies micronisée, qui permettent l'approvisionnement et l'échange de milieu et d'autres agents chimiques, sans aucun mouvement des cellules (rapide). Une soupape en forme d'anneau autour de chaque piège permet l'isolement de la cellule dans un très petit volume ("la microchambre"). Cette vanne est actionné immédiatement après l'introduction d'un tampon de lyse cellulaire (hypoosmolaire), ilnce prévenir molécules intracellulaires ou molécules sécrétées à diffuser à distance. Plus important, en raison de la petite taille du volume (625 pl) à grande dilution des molécules est évitée. En outre, étant donné que la lyse et l'analyse sont effectuées dans la même position dans la puce, il n'y a pas de perte d'analytes dues au transport. La conception de la puce décrite ici comprend 8 rangées alternées de soit 7 ou 8 microchambres, totalisant 60 microchambres. Les chambres sont actionnés en rangées, de sorte que la contamination croisée le long d'une ligne est exclue.

La plate-forme peut être utilisée en combinaison avec des essais de fluorescence, ainsi que des dosages immunologiques (figure 1d). Dans ce dernier cas, nous avons établi des protocoles pour l'immobilisation des anticorps, qui sont compatibles avec la production de puces et le processus d'assemblage. D'où la plate-forme ouvre la voie à des méthodes sensibles, fiables et quantifiables au niveau de la cellule unique. Jusqu'à maintenant, nous avons utilisé le dispositif pour l'analyse des ienzymes sécrétées (ntracellular et quantification relative par dosages enzymatiques), des cofacteurs intracellulaires, des protéines et des petites molécules (de quantification absolue par des analyses de point de terminaison ou ELISA). Dans ce qui suit, nous décrirons le processus de fabrication de puces au moyen de la lithographie molle multicouche et les protocoles pour la structuration des anticorps au moyen de l'impression par microcontact et la chimie de surface. De plus, quelques exemples d'utilisation de la puce et les opérations sont donnés.

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Protocol

Une. SU-8 de fabrication de Maître

Préparer deux moules maîtres pour les canaux (fluidiques et de contrôle, pour les schémas et les dimensions, voir la figure 2) avec le protocole suivant, mais avec des schémas de masquage. Le procédé est représenté sur la figure 3a.

  1. Commencer par chauffage d'une tranche de silicium de 4 pouces pendant 10 min à 180 ° C. Chargez la plaquette déshydraté sur un spin-coater et utiliser le protocole suivant pour spin-coating SU-8 2015:
    1. Spin plaquette à 100 tours par minute pendant 20 s (couvercle ouvert de spin-coater, distribuer SU-8 au cours de cette étape, fermer le couvercle après la distribution).
    2. Spin plaquette à 500 rpm pendant 10 secondes (cela se généralise la résine sur toute la plaquette).
    3. Spin tranche à 1750 tpm pendant 30 sec (définit la hauteur de la résistance à 20 um).
  2. Retirer résister à partir du bord de la plaquette avec de l'acétone (utiliser un coton-tige) comme ce sera contraire s'en tenir à la plaque de cuisson à l'étape suivante. Transférer la tranche de ahotplate à 95 ° C et de la chaleur pendant 4 min. Après la cuisson douce, exposer la résine photosensible à travers un photomasque collé sur le verre sodocalcique dans un aligneur de masque avec une lumière UV (150 mJ / cm 2, mesurée à 365 nm).
  3. Après l'exposition, la plaquette chauffer à nouveau à 95 ° C pendant 5 minutes sur une plaque chauffante. Refroidir la plaquette à température ambiante et ensuite, plonger dans un bain de SU-8 développeur pendant 4 min. Secouer doucement pour enlever non exposée SU-8. Laver la tranche avec salle blanche classe isopropanol et sécher avec de l'azote. Vérifiez sous un microscope si le développement a été un succès (en particulier les pièges de cellules). Si les cellules piégées sont complètement développés, la réflexion de la tranche de silicium doit être visible. Si nécessaire, de développer de nouveau sur la plaquette pendant quelques minutes.
  4. Faire cuire la plaquette dans un four pendant 2 heures à 180 ° C pour éliminer tout solvant résiduel. Vérifiez la hauteur des canaux avec un profileur de l'étape. Si la hauteur est différente de la hauteur désirée, répéter ce protocole à partir de l'étape 1.1 avec une nouvelle plaquette etchanger le spin-vitesse (étape 1.1.3). Finaliser la fabrication du moule maître par silanisation avec la plaquette 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodécyl-dimethylchloro-silane dans un dessiccateur pendant une nuit.

2. Fabrication de maître pour l'impression par microcontact

  1. Afin de préparer des moules maîtres pour l'impression par microcontact, déshydrater une plaquette de silicium pendant 10 min à 180 ° C. Spin-manteau 1 ml HDMS sur cette plaquette à 7500 tours par minute pendant 30 secondes (la résine adhère mieux sur une surface silanisée). Spin-manteau 2 ml de AZ1518 résistent positive avec ce protocole:
    1. Distribution statique du résist sur la plaquette.
    2. Spin tranche de 5 secondes à 500 rpm.
    3. Spin tranche de 60 sec à 4000 rpm.
  2. Après une cuisson douce 50 sec à 100 ° C sur une plaque chauffante, d'exposer la résine photosensible à la lumière UV (21 mJ / cm 2 à 365 nm) à travers un photomasque et sur ​​un aligneur de masque. Développer la résistance dans un bain de AZ 726 pour 75 sec. Rincer la plaquette développé avec de l'eau déminéralisée et coup dry avec de l'azote. Éliminer le solvant résiduel par chauffage de la plaquette à 115 ° C pendant 50 sec. Silaniser la plaquette sous vide pendant une nuit.

3. Fabrication de la puce microfluidique

Une conception d'un dispositif à deux couches est utilisé pour ces expériences. Les deux couches sont préparées séparément et sont liés ensemble, avant que la puce est enfin collé sur une lame de verre (Figure 3b). Cette étape décrit la production de couches de PDMS et le timbre de PDMS pour l'impression par microcontact.

  1. Préparer un mélange 10:01 de PDMS et d'agent de durcissement. Préparez environ 80 g PDMS au total (en utilisant nos conceptions, cela se traduira par 10 jetons). Mélanger vigoureusement les deux parties et dégazer le PDMS jusqu'à ce que le mélange soit sans bulles (~ 30 minutes).
  2. Placez la tranche de la couche de contrôle à l'intérieur d'une boîte de Pétri avec du ruban adhésif sur le fond. Ensuite, versez ~ 50 g de PDMS sur le dessus et mettre la plaque pendant au moins 2 heures dans un four à 80 ° C pour assurer complètedurcissement du PDMS. Répétez la même procédure pour la tranche d'impression par microcontact, pour cette ~ 20 g PDMS est nécessaire.
  3. Spin-manteau PDMS sur la plaquette avec la couche de fluide à une vitesse de rotation de 2000 tours par minute pour former une couche d'environ 40 um à haute PDMS. Guérir les PDMS dans un four pendant au moins 1 heure à 80 ° C.
  4. Lorsque les deux parties sont guéris, enlever la couche de contrôle de la plaquette et les couper en morceaux avec une lame de rasoir. Percer des trous de connexion de la pression à l'aide d'un perforateur de biopsie de 1 mm. Pour le stockage, il est conseillé de mettre un morceau de ruban adhésif sur les canaux.
  5. Pour lier les deux couches, prendre la tranche de spin-enduit et la partie supérieure et les placer dans un nettoyeur de plasma 23. Après un traitement au plasma, aligner rapidement les deux parties sous un microscope avec une grande distance de travail. Ajouter des PDMS de rechange autour des parties supérieures placées. Cette étape n'est pas obligatoire, mais il facilite l'élimination des PDMS à partir de la plaquette. Placer la plaquette dans une étuve à 80 ° C pendant au moins 1 h.
  6. Utiliser un scalpel pour enlever soigneusement les PDMS de la plaquette et de couper les puces. Poinçonner des trous d'accès pour les connexions fluidiques avec une biopsie poinçon de 1,5 mm.
  7. La puce PDMS est maintenant terminée et peut être stocké pendant des mois. Facultatif: Si la puce est utilisée avec un réservoir, couper la partie supérieure d'un embout de pipette 200 pi et d'utiliser certaines de rechange, PDMS semi-durci à coller sur le dessus. Mettre la puce à nouveau dans le four à 80 ° C pendant au moins 1 heure.

4. Collage de verre diaporama

Pour utiliser le dispositif pour les essais enzymatiques directs, la seule étape nécessaire après le collage est le blocage de surfaces. Pour ce protocole, procédez à A. Toutefois, pour utiliser la puce microfluidique pour des dosages immunologiques ou ELISA, s'il vous plaît se référer à protocole B à restreindre les sites de liaison seulement à la lame de verre (pour la microscopie TIRF ou SPR). Si cette restriction n'est pas important, reportez-vous à A, mais utiliser conjugués biotinylés à l'étape 4.3 et passez à l'étape 4.8dans le protocole B pour créer une surface entièrement fonctionnel.

Avant d'effectuer le protocole A et B: Il est conseillé de filtrer toutes les solutions de protéines utilisés avant de les introduire dans la puce. Débris et de protéines agrégats peuvent sinon bloquer pièges cellulaires, réduisant ainsi le nombre de chambres qui peuvent être utilisés pour l'analyse. Pour ce faire, utiliser un appareil de filtre d'adsorption non protéique pour filtrer toutes les solutions avant de les introduire dans les canaux.

Protocole A (tests enzymatiques)

  1. Pour finaliser le dispositif microfluidique, lier les parties PDMS sur une lame de verre. Pour ce faire, d'abord nettoyer une lame de verre avec du savon, de l'eau distillée et d'éthanol. Sécher la lame à l'aide d'un courant d'azote. Nettoyer la partie PDMS avec du scotch.
  2. Mettez la partie PDMS et la lame de verre nettoyé dans le filtre à plasma pendant 45 secondes à 18 W. Pour assurer une liaison étanche, mettre la puce sur une plaque chaude (100 ° C) pendant 5 min.
  3. Après collage, remplissez la puce avec fLUID. Un moyen facile d'y parvenir est d'utiliser la force centrifuge. Couper la partie inférieure de 200 pi pointe de la pipette. Pour les canaux fluidiques, les remplir avec la solution de blocage (albumine de sérum bovin (4% p / v) ou la poly-L-lysine) de polyéthylène glycol greffé (0,05% p / v) et de placer les pointes dans les entrées. Remplissez les entrées de la couche de contrôle avec de l'eau ou avec une solution iso-osmotique, par exemple PBS. Placer la puce dans la centrifugeuse (800 x g) pendant 5 min. Les chaînes doivent être maintenant remplis de liquide complètement. Si pas, répétez cette étape.
  4. Incuber la solution de blocage pendant au moins 30 min à température ambiante. Laver la solution hors de la couche de fluide avec du PBS à un débit de 10 ul / min en utilisant une pompe à seringue. Le dispositif est maintenant prêt pour des expériences cellulaires.

Protocole B (immunoessais)

Pour un aperçu complet de la modification de surface de l'étape 4.7 partir, s'il vous plaît se référer au tableau 1.

  1. DansPDMS cubate timbres pour l'impression par microcontact avec une solution BBSA / BSA (par exemple 1-100). Après 30 minutes, nettoyer les timbres avec de l'eau distillée et sécher le timbre sous un courant d'azote. Placez rapidement les timbres sur une lame de verre nettoyée (figure 4).
  2. Exposer la lame de verre avec le tampon en même temps que la partie supérieure de la puce microfluidique à un plasma d'oxygène pendant 45 secondes à la puissance maximale (18 W) dans un filtre à plasma. Après le traitement de plasma, retirez le timbre et aligner la surface imprimée sous les microchambres de l'appareil. Placez la puce pendant 30 min sur une plaque chaude à 50 ° C.
  3. Pour bloquer la surface restante, introduire une solution stérilisée par filtration de BSA (4% (p / v) dans du PBS) dans la puce avec une centrifugeuse (voir étape 4.2). Incuber pendant 1 heure et laver la solution de la couche de fluide avec du PBS (voir l'étape 4.3). La puce peut alors être utilisé directement ou stocké pendant jusqu'à 2 semaines à 4 ° C dans une boîte humide.
  4. Pour un surfactant liaison entièrement fonctionnele, introduire l'avidine (0,025% (p / v) dans du PBS) dans le réservoir. Utiliser un débit de 5 ul / min pendant 30 minutes pour retirer la solution de l'avidine par l'intermédiaire des canaux de fluide. Ensuite, rincez PBS pendant 10 min. Rincer soigneusement le réservoir.
  5. Ensuite, ajouter la protéine G (0,0025% (p / v) dans du PBS) et rincer pendant 30 minutes supplémentaires. Laver avec du PBS pendant 10 minutes supplémentaires après. Ensuite, ajouter l'anticorps d'intérêt (0,0001% (p / v) dans du PBS) pendant 10 min. Après 10 min, arrêter l'écoulement pendant 15 min pour permettre la liaison. Ensuite, laver avec du PBS pendant 10 min.

5. expériences sur les cellules

Le protocole est écrit d'une manière générale en raison de la variété de dosages possibles. A titre d'exemple les réactifs nécessaires pour le test de toxicité sont donnés G6PDH. Le rendement initial de piégeage de cellule de l'appareil est d'environ 2,5%, soit 5 sur 200 cellules seront pris au piège. L'occupation définitive des cellules piégées dépend fortement de la lignée cellulaire utilisée, le protocole de suspendrela lignée cellulaire et le moment où les cellules sont vidées par l'intermédiaire du canal. Pour les cellules qui poussent naturellement en suspension (telles que U937), des cellules individuelles peuvent être trouvés dans environ 75% des chambres au bout de quelques minutes. Les autres chambres sont soit pas remplies, ou occupés par deux ou plusieurs cellules. En général, le taux d'occupation à cellule unique est plus petite pour les lignées cellulaires adhérentes. Lors de l'utilisation du protocole de mise en suspension plutôt légère présentée ici, le pourcentage diminue à environ 30% (HEK, les cellules MLT). Le maximum de l'unité de cellules peut être amélioré par traitement à la trypsine des cellules, mais ce peut également modifier les résultats des expériences.

En fonction de la molécule cible, l'adsorption ou l'absorption de PDMS peuvent influencer les résultats. L'adsorption peut être réduite par les surfaces de blocage avec BSA ou PLL-g-PEG. L'absorption est peu probable pour la plupart des biomolécules hydrophiles, mais il doit être vérifié pour les (petits) composants cellulaires lipophiles.

  1. Préparer les cellules selon le protocole spécifique (par exemple,
  2. Charger les cellules sur la puce en utilisant une pompe à seringue et l'écoulement vers l'avant, plutôt que de retirer la suspension de cellules. Utiliser un débit de 5 pl / min pour des lignées de cellules en suspension et des débits plus élevés de 10 à 20 pl / min pour les cellules adhérentes car écoulement pour réduire la fixation non spécifique des cellules sur les parois du canal.
  3. Lorsque les pièges sont remplis, fermez les chambres. Si de nombreuses cellules adhèrent non spécifique à la surface, essayez de les laver avec un tampon de dissociation cellulaire à un débit de 10-30 l / min.

Protocole A (tests enzymatiques)

  1. Retirer le tampon de lyse par la puce. Pour cet exemple, ce tampon est un tampon hypo-osmolaire ajoutée avec du Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1% (v / v) de Tween 20). Pour la lyse, les chambres s'ouvrent et se ferment rapidement (soit 500 ms pour les débits de 10-50 l / min 7,21). Pour le dosage de la G6PDH, ajouter 2 mM de glucose-6-phosphate, NADP mM 0,5, 0,5 U / ml de diaphorase et de 0,3 mM de la résazurine dans le tampon de lyse. Commencer à surveiller la réaction cinétique immédiatement après la lyse.

Remarque: Choisir tout tampon qui est adapté pour le dosage, cependant nu à l'esprit que des détergents forts (tels que Triton, SDS) lyser les cellules seront immédiatement et conduire à une perte de l'analyte lors de l'ouverture de la chambre.

Protocole B (immunoessais)

Pour une brève description des expériences ELISA cellulaires (débits, l'état de la chambre, etc), s'il vous plaît se référer au tableau 1.

  1. Pour ELISA, ajouter le réactif de détection requis (par exemple l'anticorps secondaire, un antigène marqué) directement vers le tampon de lyse. Le présent document a ajouté Tween 20 réduit l'adsorption non spécifique. Lyse des cellules selon l'étape 5.4. Incuber le mélange pendant 10-15 minutes pour permettre la liaison (temps d'incubation en fonction de l'antigène et de l'anticorps utilisé).
  2. Conjugués enzymatiques d'anticorps qui adsorbées de façon non spécifique pour les parois des canaux peuvent conduire à une conversion du réactif de détection déjà à l'intérieur du réservoir et les canaux. Pour réduire les problèmes de cette adsorption, rincer un inhibiteur de l'enzyme permanent de détection utilisée par la puce pendant la période d'incubation (chambres fermées, avant d'ajouter le réactif de détection). Pour HRP, utiliser HCl 20 mM dans l'eau pour inactiver les enzymes en permanence non spécifiquement adsorbées.
  3. Après le temps d'incubation, à introduire le réactif de détection (par exemple Amplex Red et du peroxyde d'hydrogène pour HRP) à la puce. Ouvrez les chambres peu nouveau pour laver l'anticorps secondaire nonbound loin et d'ajouter le réactif de détection. Commencer à surveiller la réaction cinétique immédiatement.
  4. Calibration: Immobiliserl'anticorps dirigé contre la cible d'intérêt. Fermer chambres. Préparer différentes concentrations de l'analyte dans un tampon ou dans un lysat de cellules hors de la puce. Appliquer une concentration de la puce et échanger rapidement le volume à l'intérieur des chambres (500 ms de temps d'ouverture). Ce temps d'ouverture est suffisamment courte pour assurer que se produit pas d'accumulation supplémentaire de rinçage analyte, et seulement un nombre spécifique de molécules à partir du volume de la microchambre est détectée. De la concentration connue de l'antigène à l'intérieur de la solution et le volume de la chambre (625 pl), de calculer le montant à l'intérieur de la chambre. Ensuite, passez à l'étape 5.5 et introduire le fragment de détection.

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Representative Results

Notre plate-forme est capable d'analyser une série de intracellulaire ainsi que des molécules sécrétées présentes dans ou produit par des cellules individuelles. Ici, nous aimerions vous présenter les différentes études d'exemple pour souligner la variété des tests possibles. Nous donnerons un exemple pour une enzyme sécrétée (figure 5a) ainsi que d'une enzyme intracellulaire (Figure 5b) et de la protéine (Figures 5c et d). Pour d'autres exemples, comme cofacteurs ou de petites molécules, s'il vous plaît se référer à Eyer et al. (2012) et Eyer et al. (2013).

Tout d'abord, nous présentons une analyse pour une enzyme sécrétée (figure 5a). Lors de l'activation avec du phorbol myristate acétate (PMA), des monocytes humains induisent la sécrétion de lysozyme, une enzyme qui provoque la lyse cellulaire bactérienne. Pour ce dosage, la mémoire tampon de cellules contient 4-Methylumbelliferyl β-DN, N '-diacetylchitobioside, un substrat faiblement fluorescent pour lysozYME. Lors du clivage des résidus de sucre par l'enzyme, le fluorophore est libéré et peut être détecté à l'intérieur de la chambre. Ici, l'avantage de la microchambre est minimisée la dilution de l'enzyme sécrétée, ce qui permet la détection de faibles concentrations d'enzymes au sein d'une courte période de temps. Dans la figure 5a, plusieurs courbes exemple sont présentés représentant le chiffre d'affaires enzymatique du lysozyme sécrété par les cellules U937 stimulées simples. La lignée cellulaire U937 dérive d'un patient souffrant d'un lymphome histiocytaire, et peut être induite à la différenciation monocytaire terminale. La lignée cellulaire produit le TNFa, le lysozyme et la β2-microglobuline, après stimulation par le PMA. Pas de chiffre d'affaires est détectable dans des chambres ouvertes ou des chambres sans cellules (ligne pointillée).

La figure 5b montre la quantification relative d'une enzyme intracellulaire, ici le glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PDH). G6PDH est une protéine de ménage et les cellules de la même origine de tissus ne doivent pas varier largement dans leur concentration en G6PDH 24. Ici, les cellules U937 ont été piégés dans la chambre, et nous avons fourni un dosage par fluorescence pour la détection du G6PDH conjointement avec le tampon de lyse. Il se compose de glucose-6-phosphate, le NADPH, l'enzyme diaphorase et la résazurine de substrat, qui est convertie en résorufine fluorescente lorsque la G6PDH est présent. Le taux d'augmentation de la fluorescence au cours du temps correspond à la quantité de G6PDH. La puce facilite en outre des études sur l'effet de composés toxiques, par exemple par l'incubation des cellules avec une toxine (ici la camptothécine) pendant un temps défini (60 min). Après ce traitement, l'enzyme libérée a été balayé à une distance, et les cellules ont été lysées, et le niveau de G6PDH a été mesurée. En effet, une perte significative de la teneur en enzyme intracellulaire était visible en raison d'une augmentation plus lente de la fluorescence (lignes rouges et des colonnes de la Figure 5b). Les détails de cette étude peuvent être trouvés dans Eyer et al. 8

e_content "> En outre, on montre les résultats d'un test immunologique pour l'analyse de quantités de GFP intracellulaire. Pour une expression induite, les cellules HEK293 où transfectées avec le système d'expression T-Rex. Dans ce système, l'expression de GFP peuvent être induites par l'addition de tetracycline . Après 8 h d'incubation, les cellules ont été mises en suspension, rincés sur la puce, piégés, et ensuite lysées. Capture d'anticorps anti-GFP ont été immobilisés sur la surface du verre en suivant le protocole présenté ici d'engager la GFP libérée par la cellule. figure 5c montre la cinétique de liaison de la GFP à l'anticorps. Dans cet exemple, la GFP peut être directement mesurée par le total microscopie de fluorescence interne due à la fluorescence de la protéine. Nous tenons à souligner que les protéines non fluorescents peuvent également être détectés à l'aide d'un test ELISA sandwich ou similaire formats. Pour cela, les composants de dosage nécessaires peuvent être introduits après les étapes de lavage. L'avantage de la méthode ELISA est l'amplification du signal duepour l'enzyme, ce qui donne un produit fluorescent qui est accumulée à l'intérieur de la microchambre.

Enfin, nous tenons à présenter un ELISA en sandwich une seule cellule avec GAPDH que la protéine cible. Nous avons déterminé la GAPDH dans les cellules U937 de suspension ainsi que les cellules adhérentes HEK293 (Figure 5d). Pour cela, nous immobilisé anticorps anti-GAPDH (anticorps de capture). Après lyse des cellules, le deuxième anticorps marqué par une enzyme (anticorps de détection) a été introduit. Les chambres ont été ouvertes et en raison de l'écoulement, des anticorps de détection non liées ont été emportés et Amplex Rouge a été introduit à la chambre. La conversion de l'Amplex Red de résorufine fluorescente par HRP (anticorps de détection) a été suivie au cours du temps dans les chambres miniatures 60 en même temps. La pente de la partie linéaire de la réaction a été déterminée. Cette pente est directement corrélée à la concentration de l'enzyme et, par conséquent, à la concentration de l'analyte. Les résultats de cellules U937 simples ont montré une moyenne GAPDHquantité de 2,6 attomol, avec des valeurs minimale et maximale de 2,0 et 3,2 attomol, respectivement. L'analyse des données de 46 cellules HEK ont révélé que ces cellules contiennent en moyenne de 2,5 GAPDH attomol (minimal de 0,9 attomol; attomol maximale de 4,1).

Figure 1
Figure 1. Le micro-dispositif et des schémas des différents essais présentés. A) Le micro-dispositif assemblé. Ici, les chambres sont remplies avec de la fluorescéine pour la visualisation (fluorescence verte). Est également visible le réservoir, les connexions pour la couche de contrôle (pression, connecteurs 2x4 dans l'arrière gauche et avant droite) et la connexion à la pompe de la seringue (avant). B) Zoom sur la zone de microchambre. Un grand nombre de ces chambres peut être disposé dans un tableau. Pour la visualisation, colorant alimentaire orange a été isolé à l'intérieur des chambres, alors que colorant alimentaire vert est balayé par les canaux. La couche de régulation de pression est rempli d'eau. C) Zoom sur une seule microchambre. D) Schéma du fonctionnement du dispositif. Dans un microchambre (vue de côté), une seule cellule est emprisonné et isolé. La cellule peut être stimulée, incubé, on le lave et enfin lysées à l'intérieur de la puce. Le contenu cellulaire peut être analysé directement avec des dosages pour des enzymes ou des coenzymes, où un fragment fluorescent est généré lors de la réaction (à gauche). Pour d'autres protéines, la surface peut être modifié avec des anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine cible (à droite). Depuis l'antigène est lié à la surface, le lysat peut être lavé et molécules de détection tels que des anticorps secondaires peut être ajouté à quantifier la protéine cible. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 2. Schéma des systèmes et des dimensions de la microchambre canal. A) Conception de masque de la couche fluidique. La couche de fluide est constitué de (de gauche à droite) d'une sortie, la zone de chambre, un filtre pour retenir les particules et les agrégats de cellules et une entrée. A 4 dans la plaquette peut abriter les structures pour la production de 10 jetons. B) Conception de masque de la couche de contrôle correspondant. En raison de l'espace nécessaire pour l'alignement, un 4 dans la plaquette contient les structures pour la production de 5 jetons. C) Schéma de couches alignées (à gauche) et l'élargissement montrant un piège cellulaire (à droite), tous deux avec des échelles de longueur. Cliquez ici pour voir agrandir l'image .

Figure 3 Figure 3. Schéma de SU-8 de traitement et de production de PDMS. A) Représentation schématique du protocole de traitement SU-8. Une tranche de silicium est revêtue par centrifugation avec SU-8 et molle cuite au four à 95 ° C pendant 4 min. La conception microfluidique de canal désiré est transféré sur le SU-8 en utilisant un masque photographique et l'exposition à la lumière UV. Après une cuisson post-exposition (95 ° C, 5 min), SU-8 est développé et dur cuit à 180 ° C pendant 2 heures. B) Schéma de la fabrication de puces microfluidiques. Un mélange de PDMS oligomère et agent de durcissement est appliquée par centrifugation sur la forme principale pour les canaux fluidiques, et versé sur la forme principale pour la couche de contrôle. Les négatifs de canal sont représentés en rose. Les deux couches sont durcies dans un four. La partie de la puce de la couche de contrôle est démonté à partir de la tranche (de canal de commande dans le bleu), et des trous pour les raccords de pression sont poinçonnés (blanc). Les deux parties de contrôle etcouche de fluide sont placés dans un plasma d'oxygène, et ensuite, ils sont alignés et collée. L'ensemble puce est ensuite démonté de la forme de maître fluidique (canal de fluide en rouge) et accès fluidique est perforé (blanc). Enfin, la puce et une lame de verre sont liés après l'activation de surface dans un plasma d'oxygène. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4
Figure 4. Schéma de l'impression par microcontact. A) la fabrication de maître pour la lithographie douce. (1) Un timbre de PDMS est incubé avec la protéine (BBSA) solution. (2) La solution est retirée, le tampon est lavé et une monocouche de protéine reste sur le timbre. (3) Le timbre est placé sur une lame de verre, de ce fait, les protéines sont transférées sur le verre visage. Pendant ce temps, la puce conjointement avec le tampon sur le verre est exposé à un plasma d'oxygène. (4) Le tampon est éliminé et la puce est collée sur la lame de verre. Pour la visualisation, deux structures exemple sont présentés, imprimés avec fluorescent conjugué BSA-fluorescéine. B) zone microcontact imprimé par chambre. Depuis impression et chambres ne sont pas alignés, nous avons évalué les variations sur les points de liaison (zone imprimée) sur trois puces différentes (numéros 1-3) et les 60 microchambres. En conséquence, la variabilité de chambre à chambre est relativement faible (<2,5%) et de la variabilité puce-à-puce était négligeable (<1%), ce qui démontre qu'il n'y a en effet pas nécessaire d'aligner les structures imprimées aux chambres. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 5. Résultats de G6PDH, le lysozyme, la GFP et des essais de GAPDH. Les résultats représentatifs. A) la sécrétion d'enzymes à partir de cellules simples. A gauche: schéma du dosage pour une enzyme sécrétée, ici lysozyme. Le lysozyme est sécrétée par les cellules U937 simples, activés par PMA et s'accumule à l'intérieur des chambres miniatures fermés, où elle catalyse la production de la 4-méthylumbelliférone fluorescent. Droite: Données obtenues à partir d'une expérience de sécrétion. Les courbes vertes reprennent l'intensité de la fluorescence au cours du temps pour les chambres occupées par une cellule, est également représentée une chambre sans cellules (noir, la ligne pointillée) à titre de comparaison. B) La détection d'enzymes intracellulaires dans des cellules individuelles. A gauche: Schéma de l'analyse de la G6PDH enzymatique intracellulaire. Après lyse des cellules, la G6PDH intracellulaire est libéré dans la chambre, où les autres composants pour une cascade de réactions enzymatiques sont présentes. Droite: courbes types et des données représentatives. Simple U937les cellules ont été analysées pour leur teneur en enzyme (noir). Lors de l'influence toxique de la camptothécine, qui perméabilise la membrane, les deux tiers de l'enzyme a été perdu (orange). C) Dosage immunologique des protéines intracellulaires des cellules individuelles. Gauche: Schéma d'un dosage immunologique, ici pour la protéine GFP intracellulaire. Les anticorps anti-GFP ont été immobilisés sur la surface selon le protocole décrit ci-après. Les cellules ont ensuite été lysées sur puce et les points de liaison ont été suivis dans le temps en utilisant la microscopie TIRF. Droite: Graphique d'une telle expérience montrant la cinétique de liaison de la GFP aux anticorps immobilisés. 1 point de temps marque l'introduction du tampon de lyse. Au point 2 de temps, GFP commence à s'accumuler sur la surface, ce qui signifie que la lyse des cellules s'est produite. La liaison de la GFP aux anticorps est terminé à l'instant 3. D) Sandwich ELISA des protéines intracellulaires de cellules individuelles. Gauche: Schéma d'un ELISA en sandwich, ici pour la GADPH des protéines intracellulaires. Contreanticorps-GAPDH ont été immobilisés sur la surface selon le protocole décrit ci-après. Les cellules ont ensuite été lysées sur puce et incubées. GPADH libérée liée à l'anticorps, la chambre a été lavée et l'anticorps de détection (HRP-couplé) a été introduit. Dans une dernière étape, l'anticorps de détection nonbound a été éliminé par lavage, le réactif de détection a été introduit et la réaction a été suivie au cours du temps. Droite:. Quantification de GAPDH dans les cellules U937 et HEK293 Cliquez ici pour agrandir l'image .

Surface protocole de modification pour ELISA

Étape Temps Concentration Débit Temps d'incubation écoulement libre Chambre ouvert / fermé
[Min] (P / v)% [Ul / min] [Min] </ Td>
BSA 30 4 - Ouvrir
PBS 10 5 Ouvrir
Avidin 30 0,025 5 Ouvrir
PBS 10 5 Ouvrir
La protéine G, la biotine 30 0,0025 5 Ouvrir
PBS 10 5 Ouvrir
Anticorps 20 0,0001 5 15 Ouvrir
PBS 10 5 Ouvrir
Cellules
(300 000 cellules / ml) 		~ 5 30 Fermez lorsque les pièges sont occupés.
tampon de lyse 5 30 Ouvrir peu
Inhibiteur (par exemple HCl 20 mM) 15 10 Fermé
PBS 2 30 Fermé
réactif de détection 5 30 Ouvrir peu
Commencer à surveiller les réactions

Tableau 1. Modificatio de surfacen protocole pour le test ELISA. Pour une explication, voir le texte.

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Discussion

technologie microfluidique a ouvert des possibilités nouvelles et fascinantes pour l'analyse unicellulaire. En particulier, la possibilité de piéger et d'immobiliser les cellules individuellement par des outils microfluidiques a permis des études systématiques à court et à long terme sur les propriétés unicellulaires et réponse. De plus, l'encapsulation des cellules dans des micro-gouttelettes de fréquences élevées, générées sur une puce, a permis des études de sécrétion des cellules simples, qui ne peuvent pas être effectuées avec des dispositifs de cytométrie classiques. L'approche de microgouttelettes, cependant, a quelques limitations quand incubation et de lavage des mesures sont nécessaires pour le protocole d'analyse. Notre approche combine deux concepts de piégeage de cellule et l'isolement et par conséquent, il facilite l'exécution des analyses plus complexes, y compris des dosages immunologiques utilisant des anticorps de surface immobilisée. En outre, la méthode est très flexible à l'égard de l'application et les cibles à analyser.

La conception de la puce permet de (i) l'efficace piégeage de cellule, (ii) la fourniture de divers tampons et réactifs, et (iii) l'isolement fiable dans un très petit volume si nécessaire. De cette manière, la dilution des molécules cibles est évitée. Soixante (des centaines) de microchambres sont positionnés sur un dispositif unique permettant de nombreuses expériences en parallèle. Les vannes de fermeture de forme ronde les chambres miniatures peuvent être traités ensemble ou séparément par des lignes ou des colonnes, ce qui est important lors de la contamination croisée de chambres adjacentes doit être empêchée. Avec les chambres miniatures fermées, les canaux peuvent être traitées avec des solutions nocifs tels que l'acide chlorhydrique à des fins de nettoyage, sans affecter les cellules piégées. D'autre part, l'échange rapide du volume à l'intérieur de la microchambre est possible. Actuellement, un minimum de temps de 200 ms est nécessaire pour ouvrir entièrement la chambre et pour introduire de nouveaux réactifs (pour l'échange complet du volume de la microchambre, le débit doit être considéré).

Bien que notre méthode est très reliable et reproductible, il faut garder à l'esprit qu'il ya deux principaux points critiques dans le protocole de fabrication de puces et de fonctionnement. En premier lieu, le collage des deux couches de puces après activation par plasma doit être fait rapidement. L'alignement est essentiel, sinon certaines chambres ou même l'ensemble de la puce n'est pas utilisable, car la liaison est irréversible. Cette étape pourrait être difficile pour les utilisateurs inexpérimentés, cependant, après une formation des travailleurs, même les moins expérimentés de laboratoire obtiennent généralement de bons résultats. Le deuxième point critique est la propreté pendant le montage et l'utilisation de la puce électronique. Si les particules de poussière sont présents sur la surface de la puce, ils peuvent compromettre les canaux de commande et les soupapes ou même conduire à une rupture du PDMS-PDMS liaison ou PDMS-verre. Nous passons donc beaucoup d'attention aux procédures de nettoyage. Il convient de noter que, outre le formulaire maître fabrication (effectué en salle blanche), nous produisons et utilisons les puces dans un environnement de laboratoire normal, où la poussière unee particules sont présentes.

Malgré tous les soins, si les chambres ne ferment pas correctement, il se pourrait que soit lignes de pression sont bloqués ou le processus de spin coating ne fournissent pas l'épaisseur de la membrane droite. En outre, de temps à autre, nous avons observé une liaison insuffisante, entraînant la rupture de la liaison entre les deux couches de PDMS. Si beaucoup de jetons d'un même lot montrent ce problème, il est possible que le temps entre l'activation du plasma et l'alignement est trop long. Parfois, nous avons connu PDMS collantes sur les tranches qui pourraient ne pas être correctement éliminés et était un résultat de silanisation insuffisante de la plaquette.

Une fois que le procédé de production est mis en place, la plate-forme microfluidique peut être utilisé pour de nombreuses études sur différentes au niveau de la cellule unique. Ici, nous avons montré la détection d'agents intracellulaires et sécrétées avec différents dosages, mais de nombreux autres dosages sont possibles sur la puce. La plupart des protéines ne sont pas fluorescent et de leurprotection par immunoessais n'est pas simple. La mise en œuvre de l'ELISA dans la puce apportera de nombreux avantages. En premier lieu, le dosage peut être conçue de façon très précise pour la protéine désirée (lorsque des anticorps appropriés sont présents). En second lieu, des informations de test ELISA peut être quantifiée, même à des limites de concentration faible, ce qui donne le nombre de protéines ou de molécules d'exemplaires présents dans la cellule.

Notre puce de courant est conçu pour l'analyse des cellules de mammifères uniques. Cependant, la modification de la puce pour d'autres cellules telles que les bactéries, les algues et les levures, devrait être possible. Jusqu'à présent, la seule limitation pour les expériences est la nécessité d'un dosage basé sur la fluorescence. Cependant, nous étudions actuellement la mise en œuvre de la spectrométrie de masse comme une technique de détection. Une fois cela établi, l'ensemble des problèmes analytiques qui peuvent être étudiés avec la plate-forme sera encore plus large. En outre, étant donné que pas toutes les analyses est possible en présence de tampons de lyse cellulaire, noussont en train d'évaluer également d'autres techniques de lyse sur la plate-forme. Nous sommes convaincus que la plate-forme microfluidique polyvalent présenté ici fournit la base pour de nouvelles études unicellulaires sur le protéome, métabolome et sécrétome niveau.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Tom Robinson pour la relecture du manuscrit, C. Bärtschi et H. Benz pour la construction du système de contrôle de pression sur mesure. Nous tenons également à souligner l'utilisation de la salle blanche PREMIER et le Centre de microscopie lumineuse (LMC), à la fois à l'ETH Zürich. Le travail a été financé par Merck Serono et le Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du 7ème programme-cadre (ERC Starting Grant, projet no. 203428, nμLIPIDs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

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Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

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