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Bioengineering

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Abstract

Wir stellen eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die quantitative Bestimmung der intrazellulären Biomoleküle in mehreren Einzelzellen parallel ermöglicht. Zu diesem Zweck werden die Zellen passiv in der Mitte eines Mikrokammer gefangen. Nach der Aktivierung des Steuerungsschicht wird die Zelle von der umgebenden Volumen in einer kleinen Kammer isoliert. Die umgebende Volumen kann dann ohne die isolierte Zelle ausgetauscht werden. Jedoch nach kurzer Öffnen und Schließen der Kammer, wobei die Lösung in der Kammer in ein paar hundert Millisekunden ersetzt werden. Aufgrund der Reversibilität der Kammern, die Zellen können an verschiedenen Lösungen nacheinander in einer hoch steuerbar, z. B. für die Inkubation, Waschen und schließlich Zelllyse ausgesetzt werden. Die dicht verschlossenen Kleinst ermöglichen die Retention des Lysats, zu minimieren und die Verdünnung zu steuern, nachdem Zell-Lyse. Seit Lyse und Analyse an der gleichen Stelle auftreten, wird eine hohe Empfindlichkeit beibehalten, da keine weitere dilution oder Verlust der Analyten erfolgt während des Transports. Die Mikrokammer-Design ermöglicht somit die zuverlässige und reproduzierbare Analyse sehr kleiner Kopienzahlen von intrazellulären Molekülen (attomol, zeptomoles) aus einzelnen Zellen freigesetzt wird. Darüber hinaus können viele Mikrokammern in einem Array-Format angeordnet werden, wodurch die Analyse von vielen Zellen gleichzeitig, da die geeignete optische Geräte für die Überwachung verwendet wird. Wir haben bereits die Plattform für den Proof-of-Concept-Studien verwendet, um intrazelluläre Proteine, Enzyme, Cofaktoren und Botenstoffe in relativ oder absolut quantifizierbare Weise zu analysieren.

Introduction

Viele Studien haben in der Vergangenheit Zell-zu-Zell-Unterschiede innerhalb einer großen Zellpopulation 1-3, insbesondere Signalprozesse 4 oder die Mengen an intrazelluläre Biomoleküle wie Proteine ​​5,6, Metaboliten, und Cofaktoren 7,8 ergab. Diese Heterogenitäten werden als grundlegend wichtig für die Zell Anpassung und Evolution 9 zu sein, aber auch eine Schlüsselrolle in der Entstehung und Behandlung von Krankheiten wie Krebs 13.10. Daher Studien über die Einzelzellebene sind von hohem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung, insbesondere, wenn diese Studien zeigen die verschiedenen Zell-Reaktionen nach der Behandlung mit bioaktiven chemischen Substanzen.

In den letzten Jahren haben viele analytische Plattformen entwickelt worden, die die Analyse von einzelnen lebenden Zellen oder die chemische Zusammensetzung des Zellinhalts zu erleichtern. Während die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist der Gold standard für sehr hohe Durchsatzanalyse von einzelnen lebenden Zellen, wobei das Verfahren nicht für die Bestimmung von intrazellulären und sekretierten Verbindungen eingesetzt werden. Die Entstehung von mikrofluidischen Plattformen hat neuartige analytische Strategien für die Positionierung, Behandlung und Beobachtung von Einzelzellen versprochen. Ein Meilenstein in der Mikrofluidik wurde mit der Integration der flexiblen PDMS Ventile von Quake und Mitarbeiter realisiert 14,15 erreicht. Diese Ventile sind nützlich, da sie Regionen auf dem Chip zu isolieren, z. B. zwei Kulturen trennen 16. Darüber hinaus sind sie besonders geeignet für Einzelzellanalyse und helfen, Probleme zu reduzieren Analyten Verdünnung daher. Die Kraft dieser Ansatz für die Einzelzellanalyse wurde kürzlich von Hansen und Mitarbeiter, die die Genexpression von Hunderten von Einzelzellen parallel analysiert 17 demonstriert.

Wenn Targeting-Proteinen und Metaboliten ist die Analyse sehr schwierig aufgrund des Fehlens von geeigneten einmplification Methoden, die große Anzahl von verschiedenen Verbindungen enthalten, und ihre Variationen in der chemischen Natur. Darüber hinaus sind die meisten intrazelluläre Biomoleküle erwartet in geringer Kopienzahlen in der Größenordnung von einigen zehntausend 18 anwesend zu sein, daher der verwendeten analytischen Methode muss eine hohe Empfindlichkeit. Stärker Assays wie Immunoassays und Enzym-Immunoassays (ELISA) sind schwer in mikrofluidischen Systemen zu integrieren, da sie erfordern mehrere Wasch-und Inkubationsschritte sowie Oberflächen Immobilisierung.

Aufgrund dieser Herausforderungen ist es nicht verwunderlich, dass nur ein paar Beispiele berichtet, bei denen Proteine ​​oder Metabolite wurden auf der Ebene einzelner Zellen quantifiziert. Beispielsweise wurden Studien über die Sekretion von fluoreszierenden Verbindungen wurde berichtet 19,20. Kürzlich wurde die Umsetzung mit ELISA zur Analyse von sezerniertem (nicht fluoreszierenden) Proteine ​​aus der Zellkultur (THP-1-Zellen) und 21 Einzel (i präsentiertmmune) Zellen 10. Targeting intrazellulären Proteinen, Shi et al. Entwickelten eine Mikrofluidik-Vorrichtung, welche die Identifikation von intrazellulären Proteinen für die Untersuchung von Signalwegen in Tumorzellen mittels eines Immunoassays 11 erleichtert. Aber nur die relativen Mengen von Proteinen bestimmt und keine enzymatische Amplifikation wurde verwendet, um das Signal für niedrige vorhandenen Proteine ​​zu erhöhen.

Kürzlich waren wir in der Lage, ein Single-Cell-Trapping Kleinst mit Fluoreszenz-Assays 8 und 22 Immunoassays (Abbildung 1) zu kombinieren. Die Zellen werden passiv in mikrofeinen Hürde Strukturen, die Angebot und (schnelle) Austausch von mittel-und andere chemische Mittel ohne jede Bewegung der Zellen zu ermöglichen gefangen. Ein ringförmiger Ventil um jede Falle ermöglicht Isolierung der Zelle in einem sehr kleinen Volumen ("der Mikrokammer"). Dieses Ventil wird sofort nach Einführung einer Zell-Lyse (hypoosmolare)-Puffer, er betätigtnce Verhinderung intrazelluläre Moleküle oder Moleküle diffundieren abgesondert entfernt. Vor allem wegen der kleinen Größe des Volumens (625 pl) große Verdünnung der Moleküle verhindert wird. Da Lyse und Analyse sind in an der gleichen Position auf dem Chip durchgeführt wird, gibt es keinen Verlust von Analyten durch Transport. Die hier beschriebene Chip-Design besteht aus 8 Zeilen abwechselnd entweder 7 oder 8 Kleinst, insgesamt 60 Kleinst. Die Kammern sind in Reihen angesteuert, so dass eine Kreuzkontamination entlang einer Linie ausgeschlossen wird.

Die Plattform kann in Kombination mit Fluoreszenz-Assays und immunologische Assays (1d) verwendet werden. Für letztere haben wir Protokolle zur Immobilisierung der Antikörper, die mit der Chip-Herstellung-und Montageprozess kompatibel sind. Daher die Plattform öffnet den Weg für empfindliche, zuverlässige und quantifizierbare Assays auf Einzelzellebene. Bis jetzt haben wir das Gerät für die Analyse von i verwendetntracellular und sezernierten Enzyme (relative Quantifizierung durch enzymatische Assays), intrazellulären Cofaktoren, Proteinen und kleinen Molekülen (absolute Quantifizierung von Endpunkt-Assays oder ELISA). Im Folgenden beschreiben wir den Prozess der Chipherstellung durch Mehrschicht-Weichlithographie und Protokolle zur Strukturierung der Antikörper durch Mikrokontaktdruck und Oberflächenchemie. Darüber hinaus werden einige Beispiele für den Einsatz und Betrieb Chip gegeben.

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Protocol

1. SU-8 Master Fabrication

Bereiten Sie die beiden Master-Formen für die Kanäle (fluidische und Kontrolle, für Schaltpläne und Abmessungen siehe Abbildung 2) mit dem folgenden Protokoll, aber mit unterschiedlichen Maskenmustern. Das Verfahren wird in Fig. 3a gezeigt.

  1. Beginnen, indem eine 4-Zoll-Siliciumwafer 10 min lang bei 180 ° C Laden Sie die dehydriert Wafer auf einem Spin-Coater und verwenden Sie die folgende Protokoll für Spin-Coating-SU-8 2015:
    1. Spin-Wafer bei 100 Upm für 20 sec (offene Deckel des Spin-Coater, verzichten SU-8 in diesem Schritt, Deckel schließen nach der Ausgabe).
    2. Spin-Wafer bei 500 rpm für 10 sec (das wird weiterwider über den gesamten Wafer).
    3. Schleuderscheibe bei 1750 Upm für 30 sec (definiert die Höhe des Resists zu 20 um).
  2. Entfernen Resist vom Rand des Wafers mit Aceton (mit einem Tupfer), da dies sonst zu der Kochplatte im nächsten Schritt zu halten. Übertragen Sie die Wafer ahotplate bei 95 ° C und Wärme für 4 min. Nach dem Softbake, setzen durch eine Photomaske mit Klebeband an der Resist Glas in einem Mask Aligner mit UV-Licht (150 mJ / cm 2, gemessen bei 365 nm) Kalk-Natron.
  3. Nach der Belichtung wird der Wafer wieder erwärmen auf 95 ° C für 5 min auf einer Heizplatte. Kühlen Sie den Wafer auf RT und dann eintauchen in ein Bad aus SU-8-Entwickler für 4 min. Schütteln Sie vorsichtig, um nicht belichteten SU-8 zu entfernen. Waschen des Wafers mit Reinraum-Klasse Isopropanol und trocken blasen mit Stickstoff. Prüfen unter einem Mikroskop, wenn die Entwicklung erfolgreich (vor allem die Zellfallen) war. Wenn die Zelle Fallen vollständig entwickelt, sollte die Reflexion des Silizium-Wafers sichtbar. Falls notwendig, die Entwicklung der Wafer wieder für ein paar Minuten.
  4. Backen des Wafers in einem Ofen für 2 Stunden bei 180 ° C, um alle Restlösungsmittel zu entfernen. Überprüfen Sie die Höhe der Kanäle mit einer Schritt-Profiler. Wenn die Höhe unterscheidet sich von der gewünschten Höhe, wiederholen dieses Protokoll ab Schritt 1.1 mit einem neuen Wafer undändern Sie die Spin-Geschwindigkeit (Schritt 1.1.3). Schließen Sie die Herstellung der Urform durch Silanisierung des Wafers mit 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluordecyl-dimethylchloro-Silan in einem Exsikkator über Nacht.

2. Meister Fertigung für Mikrokontaktdruck

  1. Um Master-Formen für Mikrokontakt-Drucken vorbereiten, dehydrieren einen Silizium-Wafer für 10 min bei 180 ° C Spin-Coat 1 ml HDMS auf diesem Wafer bei 7.500 rpm für 30 sec (das Resist haftet besser auf einen silanisierten Oberfläche). Spin-Coat 2 ml AZ1518 positiven Resist mit diesem Protokoll:
    1. Statische Abgabe des Resists auf dem Wafer.
    2. Spin-Wafer für 5 Sekunden bei 500 Umdrehungen pro Minute.
    3. Spin-Wafer für 60 Sekunden bei 4000 Umdrehungen pro Minute.
  2. Nach einer 50 Sekunden Softbake bei 100 ° C auf einer Heizplatte, setzen die wider UV-Licht (21 mJ / cm 2 bei 365 nm) durch eine Photomaske und auf einem Mask Aligner. Entwicklung des Resists in einem Bad von AZ 726 für 75 Sekunden. Mit DI-Wasser und Schlag d spülen entwickelte Waferry mit Stickstoff. Entfernen restlichen Lösungsmittels durch Erwärmen des Wafers auf 115 ° C für 50 sek. Silanisieren den Wafer unter Vakuum über Nacht.

3. Herstellung der Mikrofluid-Chip

Ein Zweischicht-Einrichtung Entwurf wird für diese Experimente verwendet. Die beiden Schichten werden getrennt hergestellt und miteinander verbunden werden, bevor der Chip wird schließlich auf einen Glasträger (3b) verbunden ist. Dieser Schritt ist die Herstellung der Schichten und die PDMS PDMS-Stempel für Mikrokontaktdruck.

  1. Bereiten Sie eine 10:1-Mischung von PDMS und Härter. Bereiten Sie etwa 80 g PDMS insgesamt (unter Verwendung unserer Designs, wird dies in 10 Chips führen). Mischen Sie die beiden Teile kräftig und entgast PDMS, bis die Mischung blasenfrei ist (~ 30 min).
  2. Setzen Sie den Wafer mit der Kontrollschicht in einer Petri-Schale und kleben Sie es auf den Boden. Weiter, gießen ~ 50 g PDMS auf und legte die Scheibe für mindestens 2 Stunden in einem Ofen bei 80 ° C und gewährleisten eine vollständigeHärten der PDMS. Wiederholen Sie den Vorgang für den Mikrokontaktdruck-Wafer, dafür ~ 20 g PDMS benötigt wird.
  3. Schleuderbeschichtungs PDMS auf dem Wafer mit der Fluidschicht mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2.000 UpM, um eine etwa 40 um hohen PDMS-Schicht zu bilden. Härten des PDMS in einem Ofen mindestens 1 h bei 80 ° C.
  4. Wenn beide Teile ausgehärtet ist, entfernen Sie die Schutzschicht von der Wafer-und in Stücke schneiden mit einer Rasierklinge. Punch-Druckanschluss Löcher durch die Verwendung eines 1 mm Biopsie Puncher. Für die Lagerung, ist es ratsam, ein Stück Klebeband über die Kanäle setzen.
  5. Um die beiden Schichten zu verbinden, nehmen Sie die Spin-beschichtete Wafer und das Oberteil und legen Sie sie in einem Plasmafilter 23. Nach der Plasmabehandlung, beide Teile schnell unter einem Mikroskop mit großem Arbeitsabstand auszurichten. Fügen Sie einige Ersatz PDMS um die oberen Teile gelegt. Dieser Schritt ist nicht zwingend, aber es die Entfernung der PDMS von dem Wafer ermöglicht. Platzieren des Wafers in einem Ofen bei 80 ° C für mindestens 1 h.
  6. Verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig die PDMS von der Wafer-und die Mikrochips geschnitten. Punch-Zugang Löcher für die fluidischen Anschlüsse mit einem 1,5 mm-Biopsie Puncher.
  7. Die PDMS-Chip ist nun fertig und kann über Monate gelagert werden. Optional: Wenn der Chip mit einem Reservoir verwendet, schneiden Sie den oberen Teil einer 200 ul Pipettenspitze und verwenden einige Ersatz, halb ausgehärteten PDMS, um sie oben zu kleben. Setzen Sie den Chip im Backofen wieder auf 80 ° C für mindestens 1 Stunde.

4. Die Bindung an Glas Slide

Um das Gerät für den direkten enzymatischen Assays verwenden, ist der einzige Schritt, nach der Verklebung erforderlich die Sperrung von Oberflächen. Aus diesem Protokoll, A. gehen jedoch die Mikrofluidik-Chip für Immunoassays oder ELISAs verwenden Sie bitte Protokoll B beziehen sich auf die Bindungsstellen nur auf den Glasobjektträger (dh für die TIRF-Mikroskopie oder SPR) zu beschränken. Wenn diese Einschränkung nicht wichtig ist, beziehen sich auf A, sondern verwenden biotinylierte Konjugate in Schritt 4.3 und fahren Sie mit Schritt 4.8in Protokoll B, um eine voll funktionsfähige Oberfläche.

Vor der Durchführung Protokoll A und B: Es wird empfohlen, alle verwendeten Proteinlösungen vor der Einbringung in den Chip auswählen. Schutt und Proteinaggregate anderweitig zu blockieren Zellfallen, wodurch die Anzahl der Kammern, die für die Analyse verwendet werden können, verringert wird. Zu diesem Zweck, verwenden Sie eine nicht-Protein-Adsorptions-Filtereinheit, die alle Lösungen vor Aufnahme in die Kanäle zu filtern.

Protokoll A (enzymatische Assays)

  1. Um die Mikrofluid-Vorrichtung abzuschließen, verbinden die PDMS-Teile auf einem Glasträger. Um dies zu tun, zuerst reinigen einen Glasobjektträger mit Seife, destilliertem Wasser und Ethanol. Trocknen Sie die Folie mit einem Stickstoffstrom. Reinigen Sie die PDMS Teil mit Klebeband.
  2. Setzen Sie die PDMS-Teil und die gereinigte Glasobjektträger in die Plasmareiniger für 45 Sekunden bei 18 W. Um eine feste Bindung zu gewährleisten, setzen Sie den Chip auf einer heißen Platte (100 ° C) für 5 min.
  3. Nach dem Verkleben, füllen Sie den Chip mit fLUID. Eine einfache Möglichkeit, dies zu erreichen, ist die Zentrifugalkraft zu verwenden. Schneiden Sie den unteren Teil von 200 ul Pipettenspitze. Für die Fluidkanäle, füllen sie mit der Blockierungslösung (Rinderserumalbumin (4% w / v) oder Poly-L-Lysin) gepfropfte Polyethylenglykol (0,05% w / v) und setzen die Spitzen in die Einlässe. Füllen Sie die Steuerschicht Buchten entweder mit Wasser oder mit einer isosmotischen Lösung, zB PBS. Legen Sie die Chips in die Zentrifuge (800 × g) für 5 min. Die Kanäle sollen nun mit Flüssigkeit vollständig gefüllt sein. Wenn nicht, wiederholen Sie diesen Schritt.
  4. Inkubieren der Blockierungslösung für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Waschen der Lösung aus dem Flüssigkeitsschicht mit PBS bei einer Flussrate von 10 &mgr; l / min unter Verwendung einer Spritzenpumpe. Das Gerät ist nun bereit für die Zellexperimente.

Protokoll B (Immunoassays)

Für eine komplette Übersicht über die Oberflächenmodifikation von Schritt ab 4.7 finden Sie in Tabelle 1 beziehen.

  1. Incubate PDMS-Stempel für Mikrokontakt-Drucken mit einer BBSA / BSA-Lösung (z. B. 1-100). Nach 30 Minuten, reinigen Sie die Briefmarken gründlich mit destilliertem Wasser und trocknen Sie den Stempel unter einem Strom von Stickstoff. Platzieren schnell die Stempel auf einem gereinigten Glasobjektträger (4).
  2. Setzen Sie die Glasobjektträger mit dem Stempel zusammen mit dem oberen Teil des mikrofluidischen Chips Sauerstoffplasma für 45 sec bei maximaler Leistung (18 W) in einem Plasma-Reiniger. Nach der Plasmabehandlung, entfernen Sie den Stempel, und richten Sie die bedruckte Oberfläche unter den Kleinst des Gerätes. Platzieren der Chip für 30 Minuten auf einer Heizplatte bei 50 ° C
  3. Um die verbleibende Fläche zu blockieren, führen sterilfiltriert BSA-Lösung (4% (w / v) in PBS) in den Chip mit einer Zentrifuge (siehe Schritt 4.2). Inkubation für 1 Stunde und waschen Sie die Lösung aus der Fluidschicht mit PBS (siehe Schritt 4.3). Der Chip kann dann direkt oder bei 4 ° C in einer feuchten Box verwendet für bis zu 2 Wochen gelagert werden.
  4. Für eine voll funktionsfähige Bindungs ​​surface, einzuführen Avidin (0,025% (w / v) in PBS) in den Vorratsbehälter. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 5 &mgr; l / min für 30 min, um die Avidin-Lösung durch die Fluidkanäle zu entziehen. Danach spülen PBS für 10 min. Spülen Sie den Behälter gründlich.
  5. Anschließend fügen Protein G (0,0025% (w / v) in PBS) und bündig für weitere 30 min. Danach Waschen mit PBS für weitere 10 min. Anschließend fügen Sie den Antikörper von Interesse (0,0001% (w / v) in PBS) für 10 min. Nach 10 min, stoppen den Fluss für 15 min Bindung zu ermöglichen. Weiter, waschen mit PBS für 10 min.

5. Zellexperimente

Das Protokoll wird im Allgemeinen wegen der Vielzahl der möglichen Tests geschrieben. Als Beispiel werden die Reagenzien für den Assay benötigt G6PDH Toxizität angegeben. Die anfängliche Zellrückhalteleistung der Vorrichtung etwa 2,5%, das heißt 5 von 200 Zellen eingefangen werden. Die endgültige Belegung der Zelle Fallen hängt stark von der verwendeten Zelllinie, das Protokoll zu unterbrechendie Zelllinie und die Zeit, die Zellen werden durch den Kanal gespült. Für Zellen in Suspension (wie U937) natürlich wachsenden, können einzelne Zellen in etwa 75% der Kammern nach wenigen Minuten gefunden werden. Die anderen Kammern sind entweder nicht gefüllt ist, oder durch zwei oder mehr Zellen besetzt. Im allgemeinen ist die Einzelzellbelegung kleiner für adhärente Zelllinien. Bei Verwendung des hier vorgestellten eher milde Suspensions Protokoll nimmt der Anteil auf etwa 30% (HEK, MLT Zellen). Die Einzelzellbelegung kann durch Trypsin-Behandlung der Zellen verbessert werden, aber dies kann auch die Ergebnisse der Experimente zu ändern.

Abhängig von dem Zielmolekül, kann die Adsorption oder Absorption an PDMS die Ergebnisse beeinflussen. Adsorption kann durch Blockieren der Oberflächen mit BSA oder PLL-g-PEG reduziert werden. Absorption ist unwahrscheinlich, für die meisten hydrophilen Biomoleküle, aber es sollte für (Klein-) lipophilen Zellkomponenten überprüft werden.

  1. Vorbereitung der Zellen gemäß dem spezifischen Protokoll (zB
  2. Laden der Zellen auf dem Chip unter Verwendung einer Spritzenpumpe und Vorlauf, statt der Zellsuspension zurückziehen. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 5 &mgr; l / min für Suspensionszelllinien und höhere Durchflussraten von 10-20 &mgr; l / min für Haftzellen, da unspezifische Bindung der Zellen auf den Kanalwänden zu reduzieren.
  3. Wenn die Fallen gefüllt sind, schließen die Kammern. Wenn viele Zellen anhaften unspezifisch an der Oberfläche, versuchen, sie mit einer Fließgeschwindigkeit von 10-30 ml / min abzuwaschen mit Zelldissoziationspuffer.

Protokoll A (enzymatische Assays)

  1. Ziehen Lyse-Puffer durch den Chip. In diesem Beispiel ist dies ein Puffer hypoosmolar Puffer mit Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1% (v / v) Tween 20). Für die Lyse, schnell öffnen und schließen Kammern (dh 500 ms für Flussraten von 10-50 ml / min 7,21). Assay für die G6PDH, add 2 mM Glucose-6-Phosphat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml Diaphorase und 0,3 mM Resazurin dem Lysepuffer. Starten Sie die Überwachung der kinetischen Reaktion sofort nach der Lyse.

Hinweis: Wählen Sie eine beliebige Puffer, die sich für den Test ist, beachten jedoch, dass nackten starke Reinigungsmittel (wie Triton, SDS) lysiert Zellen sofort und wird zu einem Verlust von Analyten in Kammeröffnung führen.

Protokoll B (Immunoassays)

Für eine kurze Beschreibung der ELISA Zellexperimenten (Durchflussmengen-, Kammer-Status, etc.), bitte die Tabelle 1 verwiesen.

  1. Für ELISA, fügen Sie die erforderlichen Nachweis-Reagens (z. B. sekundäre Antikörper, markierte Antigen) direkt an der Lyse-Puffer. Die hierin aufgenommen Tween 20 reduziert die unspezifische Adsorption. Lyse der Zellen nach Schritt 5.4. Inkubieren der Mischung für 10-15 Minuten Bindung (Inkubation je nach dem verwendeten Antigen und Antikörper) zu ermöglichen.
  2. Antikörper-Enzym-Konjugate, die spezifisch an den Kanalwänden adsorbiert kann bis zu einem Umsatz des Nachweisreagenz schon innerhalb des Reservoirs und Kanäle führen. Um Probleme dieser Adsorption reduzieren, spülen eine dauerhafte Inhibitor des Enzyms verwendet Erkennung durch den Chip während der Inkubationszeit (Kammern geschlossen, vor der Zugabe des Detektions-Reagenz). Für HRP, verwenden Sie 20 mM HCl in Wasser, um die Enzyme unspezifisch adsorbiert dauerhaft zu inaktivieren.
  3. Nach der Inkubationszeit, stellen die Nachweisreagenz (zB Amplex Red und Wasserstoffperoxid für HRP) auf dem Chip. Öffnen Sie die Kammern in Kürze erneut, um die nicht gebundenen sekundären Antikörper abzuwaschen und die Detektions-Reagenz hinzufügen. Start sofort die Überwachung der kinetischen Reaktion.
  4. Kalibrierung: UnbeweglichkeitseffektDer Antikörper gegen das Ziel von Interesse. Schließen Kammern. Bereiten unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten in Puffer oder in Zelllysat Off-Chip. Tragen Sie eine Konzentration auf den Chip und tauschen das Volumen innerhalb der Kammern (500 ms Öffnungszeit) schnell. Diese Öffnungszeit kurz genug ist, um sicherzustellen, dass keine zusätzliche Ansammlung von Analyten Spülen auftritt, und nur eine bestimmte Anzahl von Molekülen aus dem Volumen der Mikrokammer detektiert werden. Aus der bekannten Konzentration des Antigens in der Lösung und das Volumen der Kammer (625 pl), die Berechnung der Menge in der Kammer. Anschließend mit Schritt 5.5 fort und die Einführung der Nachweiseinheit.

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Representative Results

Unsere Plattform ist in der Lage, eine Vielzahl von intrazellulären und sekretierten Molekülen in Gegenwart oder durch einzelne Zellen produziert analysieren. Hier möchten wir beispielsweise verschiedene Studien, um die Vielfalt der möglichen Tests unterstreichen präsentieren. Wir werden ein Beispiel für ein sezerniertes Enzym (5a) sowie ein intrazelluläres Enzym (Fig. 5b) und Protein (Fig. 5c und d) erhalten wird. Weitere Beispiele, wie Cofaktoren oder kleine Moleküle, wenden Sie sich bitte an Eyer et al verweisen. (2012) und Eyer et al. (2013).

Zuerst stellen wir einen Assay für ein sezerniertes Enzym (Fig. 5a). Nach Aktivierung mit Phorbolmyristatacetat (PMA), menschliche Monozyten induziert die Sekretion von Lysozym, ein Enzym, das Lyse der Bakterienzellen induziert. Für diesen Test enthält der Zellenpuffer 4-Methylumbelliferyl-β-DN, N'-diacetylchitobioside, eine schwach fluoreszierende Substrat für lysozyme. Nach Abspaltung der Zuckerreste durch das Enzym wird der Fluorophor freigesetzt und kann in der Kammer festgestellt werden. Hier ist der Vorteil der Mikrokammer der minimierten Verdünnung des sekretierten Enzyms, was die Detektion von geringen Enzymkonzentrationen innerhalb kurzer Zeit. In Fig. 5a sind beispielsweise mehrere Kurven, die den enzymatischen Umsatz von Lysozym aus einem stimulierten U937 Zellen sezerniert gezeigt. Die U937-Zelllinie stammt von einem Patienten mit histiozytärem Lymphom, und dem Anschluß monozytäre Differenzierung induziert werden. Die Zelllinie produziert TNF, Lysozym und β2-Mikroglobulin nach Stimulation mit PMA. Kein Umsatz in offenen Kammern oder zellfreie Kammern (gestrichelte Linie) nachweisbar.

Figur 5b zeigt die relative Quantifizierung eines intrazellulären Enzyms, hier Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH). G6PDH ist ein Housekeeping-Protein und Zellen aus dem gleichen Ursprungsgewebe sollte nicht variieren weitgehend in ihrer Konzentration G6PDH 24. Hier wurden U937 Zellen in der Kammer gefangen ist, und wir mit dem Lyse-Puffer zugeführt wird ein Fluoreszenzassay zum Nachweis von G6PDH zusammen. Es besteht aus Glucose-6-phosphat, NADPH, das Enzym Diaphorase und dem Substrat Resazurin, die fluoreszierende Resorufin umgewandelt wird, wenn G6PDH vorliegt. Die Geschwindigkeit der Zunahme der Fluoreszenz über die Zeit entspricht der Menge an G6PDH. Der Mikrochip weiter erleichtert Studien über die Wirkung von toxischen Verbindungen, z. B. durch Inkubation der Zellen mit einem Toxin (hier Camptothecin) für eine definierte Zeit (60 min). Nach dieser Behandlung wurde das freigesetzte Enzym weggespült, und die Zellen wurden lysiert, und die Höhe der G6PDH wurde gemessen. Tatsächlich war ein signifikanter Verlust der intrazellulären Enzymgehalt sichtbar durch eine langsamere Zunahme der Fluoreszenz (rot Zeilen und Spalten in Fig. 5b). Details zu dieser Studie finden Sie in Eyer et al. 8

e_content "> Darüber hinaus zeigen wir die Ergebnisse von einem Immunoassay für die Analyse der intrazellulären GFP-Mengen. Für induzierte Expression, HEK293 Zellen, in denen die T-REx-Expressionssystems transfiziert. In diesem System GFP-Expression kann durch die Zugabe von Tetracyclin induziert werden . Nach 8 h Inkubation wurden die Zellen suspendiert, auf den Chip gespült, gefangen und anschließend lysiert. Erfassen anti-GFP-Antikörper wurden auf der Glasoberfläche nach dem hier vorgestellten, um die GFP-Freigabe aus der Zelle binden Protokoll immobilisiert. 5C zeigt die Bindungskinetik von GFP an den Antikörper. In diesem Beispiel GFP könnte direkt durch totale interne Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der Fluoreszenz des Proteins gemessen werden. Wir möchten betonen, dass nicht-fluoreszierenden Proteine ​​können auch unter Verwendung eines Sandwich-ELISA oder ähnliches erfasst werden Formate. Hierzu können die erforderlichen Assaykomponenten nach den Waschschritten eingeführt werden. Der Vorteil der ELISA ist die Signalverstärkung durchdem Enzym, ein fluoreszierendes Produkt ergibt, das im Inneren der Mikrokammer angesammelt wird.

Schließlich möchten wir, um eine Einzelzelle Sandwich-ELISA mit GAPDH als Zielprotein zu präsentieren. Wir bestimmten GAPDH in U937 Suspensionszellen sowie adhärenten HEK293-Zellen (Abbildung 5d). Hierzu immobilisiert wir anti-GAPDH-Antikörper (capture antibody). Nach der Zelllyse wurde die zweite Enzym-markierten Antikörper (Nachweisantikörper) eingeführt. Die Kammern wurden geöffnet, und aufgrund der Strömung wurden ungebundene Antikörper entfernt Erfassungs gewaschen und Amplex Red wurde in die Kammer eingeführt. Die Umwandlung von Amplex Red durch HRP (Detektionsantikörper) Fluoreszenz Resorufin wurde über die Zeit in allen 60 Mikrokammern gleichzeitig überwacht. Die Steigung des linearen Teils der Reaktion wurde bestimmt. Diese Steigung ist direkt mit der Konzentration des Enzyms und damit korreliert, um die Konzentration des Analyten. Die Ergebnisse aus den einzelnen U937-Zellen zeigten eine durchschnittliche GAPDHMenge von 2,6 Attomol mit Minimal-und Maximalwerte von 2,0 und 3,2 Attomol sind. Die Analyse der Daten von 46 HEK-Zellen zeigten, dass diese Zellen im Mittel 2,5 attomol GAPDH (minimal 0,9 attomol; maximal 4,1 attomol) enthalten ist.

Figur 1
Fig. 1 ist. Die Kleinst und Schaltpläne der verschiedenen Tests vorgestellt. A) Die Kleinst montiert. Hier werden die Kammern mit Fluorescein zur Visualisierung (grüne Fluoreszenz) gefüllt. Ebenfalls zu sehen ist das Reservoir, die Anschlüsse für die Steuerschicht (Druck, 2x4-Anschlüsse auf der Rückseite links und vorne rechts) und die Verbindung zu der Spritzenpumpe (vorne). B) Vergrößern Sie die Mikrokammer-Bereich. Viele dieser Kammern können in einem Array angeordnet sein. Zur Visualisierung wurde Orange Lebensmittelfarbe in den Kammern getrennt, während grüne Lebensmittelfarbe wird durch die Kanäle gespült. Das Druckregel Schicht wird mit Wasser. C) Zoom auf einem einzigen Mikrokammer. D) Schematische Darstellung des Gerätebetriebs gefüllt. Innerhalb einer Mikrokammer (Seitenansicht), wird eine einzelne Zelle eingefangen und isoliert. Die Zelle stimuliert werden kann, inkubiert, gewaschen und schließlich in dem Chip lysiert. Der Zellgehalt kann direkt mit Tests für Enzyme oder Coenzyme, wo eine fluoreszierende Gruppe wird bei der Reaktion (links) erzeugt analysiert werden. Für andere Proteine, kann die Oberfläche mit Antikörpern, die spezifisch an das Zielprotein (rechts) binden modifiziert werden. Da das Antigen an die Oberfläche gebunden ist, kann das Lysat entfernt und gewaschen werden Detektionsmoleküle wie Sekundärantikörper zugegeben werden, um das Zielprotein zu quantifizieren. Hier klicken, um größeres Bild .

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2. Schematische Darstellung der Kanalsysteme und die Abmessungen der Mikrokammer. A) Maskenentwurf des Fluidschicht. Der fluidische Schicht aus (von links nach rechts) einen Auslass, der Kammerbereich, ein Filter, um Partikel und Zellhaufen zu halten und eine Einlass. A 4 in Wafer, die Strukturen für die Produktion von 10 Chips beherbergen. B) Maskenentwurf des entsprechenden Kontrollschicht. Aufgrund der Platzbedarf für die Ausrichtung, ein 4-in-Wafer enthält die Strukturen für die Produktion von 5-Chips. C) Schematische Darstellung der Schichten ausgerichtet (links) und der Erweiterung, die eine Zelle Falle (rechts), beide mit Längenskalen. Klicken Sie hier zur Ansicht größeres Bild .

Fig. 3 3. Schematische Darstellung der SU-8-Verarbeitung und PDMS-Produktion. A) Schematische Darstellung des SU-8-Verarbeitungsprotokoll. Ein Siliciumwafer aufgeschleudert mit SU-8 und bei 95 ° C für 4 min sanft eingebrannt. Die gewünschte mikrofluidischen Kanal Design wird auf die SU-8 mit einer Photomaske und UV-Licht-Exposition übertragen. Nach einem Post-Exposure Bake (95 ° C, 5 min), SU-8 entwickelt und bei 180 ° C hart gebacken für 2 Stunden. B) Schematische Darstellung des mikrofluidischen Chipherstellung. Eine Mischung von PDMS Oligomer und Härter Schleuderbeschichtung auf dem Urmodell für die Fluidkanäle und gießt auf der Master-Form für die Steuerschicht. Die Kanal Negative werden in rosa dargestellt. Beide Schichten werden in einem Ofen gehärtet. Die Steuerschicht Chip-Teil von dem Wafer (Steuerkanal in blau) zerlegt und Bohrungen für die Druckanschlüsse gestanzt sind (weiß). Beide Teile-Steuerungs-undFlüssigkeitsschicht-in Sauerstoffplasma gelegt und danach, sie ausgerichtet sind und verklebt. Die gesamte Chip wird dann von dem Fluid Urmodell (Fluidkanal in rot) zerlegt und Fluidzugangslöcher gestanzt (weiß). Schließlich werden der Chip und ein Glasobjektträger nach der Oberflächenaktivierung im Sauerstoffplasma gebunden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 4
4. Schematische Darstellung des Mikrokontaktdruck. A) Master-Fertigung für weiche Lithographie. (1) Ein PDMS-Stempel mit Protein (BBSA)-Lösung inkubiert. (2) Die Lösung wird entfernt, der Stempel wird gewaschen und eine Monoschicht von Protein auf dem Stempel verbleibt. (3) Der Stempel wird auf einen Objektträger gelegt, wodurch die Proteine ​​auf die Glasoberfläche übertragen Gesicht. Während dieser Zeit werden die Mikrochip zusammen mit dem Stempel auf dem Glas zu einem Sauerstoffplasma ausgesetzt. (4) der Stempel entfernt wird und der Mikrochip auf dem Glasobjektträger gebunden. Zur Visualisierung werden zwei Beispiel-Strukturen gezeigt, mit fluoreszierenden BSA-Fluorescein-Konjugat gedruckt. B) Das Mikro bedruckte Fläche pro Kammer. Da der Druck und Kammern nicht ausgerichtet sind, untersuchten wir die Veränderungen auf die Bindung Flecken (Druckfläche) auf drei verschiedene Chips (Nummern 1-3) und alle 60 Kleinst. Als Ergebnis ist von Kammer zu Kammer Variabilität relativ klein (<2,5%) und die Chip-zu-Chip-Variabilität war gering (<1%), was zeigt, dass es tatsächlich keine Notwendigkeit, die gedruckten Strukturen mit den Kammern ausgerichtet sind. Klicken hier für eine größere Ansicht .

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5. Ergebnisse von G6PDH, Lysozym, GFP und GAPDH-Assays. Repräsentative Ergebnisse. A) Enzym-Sekretion aus einzelnen Zellen. Links: schematische Darstellung des Assay für ein sezerniertes Enzym, Lysozym hier. Lysozym wird von Einzel-, PMA-aktivierten Zellen sezerniert U937 und sammelt sich innerhalb der geschlossenen Kleinst, wo es katalysiert die Produktion von fluoreszierenden 4-Methylumbelliferon. Rechts: aus einem Sekret Experiment erhaltenen Daten. Die grünen Kurven zeigen die Fluoreszenzintensität über der Zeit für Kammern durch eine Zelle besetzt ist, auch eine Kammer ohne Zellen (schwarze gepunktete Linie) zum Vergleich gezeigt ist. B) Nachweis von intrazellulären Enzymen in einzelne Zellen. Links: Schematische Darstellung des Assays für die intrazelluläre Enzym G6PDH. Nach Zelllyse wird intrazellulär G6PDH in die Kammer, wobei die anderen Komponenten für eine enzymatische Reaktion Kaskade vorhanden sind freigegeben. Rechts: Beispiel Kurven und repräsentative Daten. Einzel-U937Zellen wurden auf ihre Enzymgehalt (schwarz) analysiert. Bei dem toxischen Einfluss von Camptothecin, die die Membran permeabel wurden zwei Drittel des Enzyms verloren (orange). C) Immunoassay von intrazellulären Proteinen von Einzelzellen. Links: Schematische Darstellung eines Immunoassays, hier für das intrazelluläre Protein GFP. Anti-GFP-Antikörper wurden auf die hierin beschriebenen Oberflächen nach Protokoll immobilisiert. Die Zellen wurden dann auf dem Chip lysiert und die Bindungsstellen wurden im Laufe der Zeit mit TIRF-Mikroskopie überwacht. Rechts: Diagramm von einem solchen Experiment, das die Bindungskinetik von GFP an die immobilisierten Antikörper. Zeitpunkt 1 markiert die Einführung des Lyse-Puffer. Zum Zeitpunkt 2, GFP beginnt sich an der Oberfläche ansammeln, was bedeutet, dass Zelllyse stattgefunden hat. Bindung von GFP an die Antikörper wird zum Zeitpunkt 3. D) Sandwich-ELISA von intrazellulären Proteinen von Einzelzellen abgeschlossen. Links: Schematische Darstellung eines Sandwich-ELISA, hier für das intrazelluläre Protein GADPH. AntiGAPDH-Antikörper wurden auf die hierin beschriebenen Oberflächen nach Protokoll immobilisiert. Zellen wurden dann lysiert und auf dem Chip inkubiert. Befreiten GPADH an den Antikörper gebunden wurde die Kammer gewaschen und Detektions-Antikörper (HRP-gekoppelten) eingeführt wurde. In einem letzten Schritt wurde nicht gebundenen Nachweis-Antikörper weggewaschen, das Nachweisreagenz eingeführt wurde und die Reaktion wurde über die Zeit überwacht. Rechts:. Quantifizierung von GAPDH innerhalb U937 und HEK293-Zellen Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Oberflächenmodifizierung Protokoll für ELISA

Schritt Zeit Konzentration Durchfluss Strömungsfreien Inkubationszeit Kammer offen / geschlossen
[Min] (W / v)% [Ul / min] [Min] </ Td>
BSA 30 4 - Öffnen
PBS 10 5 Öffnen
Avidin 30 0,025 5 Öffnen
PBS 10 5 Öffnen
Protein G, Biotin 30 0,0025 5 Öffnen
PBS 10 5 Öffnen
Antikörper 20 0,0001 5 15 Öffnen
PBS 10 5 Öffnen
Cells
(300.000 Zellen / ml) 		~ 5 30 Schließen Sie, wenn Fallen besetzt sind.
Lyse-Puffer 5 30 Kurz öffnen
Inhibitor (z. B. 20 mM HCl) 15 10 Geschlossen
PBS 2 30 Geschlossen
Nachweisreagenz 5 30 Kurz öffnen
Starten Sie die Überwachung Reaktions

Tabelle 1. Oberflächen modification für ELISA-Protokoll. Erklärung siehe Text.

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Discussion

Mikrofluidik-Technologie hat neue und faszinierende Möglichkeiten für die Einzelzellanalyse eröffnet. Insbesondere hat die Möglichkeit, zu fangen und zu immobilisieren Zellen einzeln von Mikrofluidik-Tools systematische Kurz-und Langzeitstudien auf Einzelzelleigenschaften und der Reaktion erlaubt. Zusätzlich Verkapselung von Zellen in hoher Frequenz Mikrotröpfchen auf einem Mikrochip erzeugt hat einzelne Zelle Sekretion Studien, die mit herkömmlichen Vorrichtungen durchgeführt werden Zytometrie kann aktiviert. Die Mikrotröpfchen Ansatz hat jedoch einige Einschränkungen bei der Inkubation und Waschschritte werden für die Analyseprotokoll erforderlich. Unser Ansatz vereint beide Konzepte der Zell Einfangen und Isolation und daher erleichtert es die Durchführung komplexer Untersuchungen, wie Immunoassays basierend auf der Oberfläche immobilisierten Antikörpern. Darüber hinaus ist das Verfahren sehr flexibel im Hinblick auf die Anwendung und Zielanalyten.

Das Design der Mikrochip ermöglicht (i) Wirkungsziente Zelle Trapping, (ii) Lieferung von verschiedenen Puffern und Reagenzien, und (iii) die sichere Trennung in einem sehr kleinen Volumen, wenn erforderlich. Auf diese Weise wird die Verdünnung der Zielmoleküle vermieden wird. Sechzig (Hunderte) von Mikrokammern auf einer einzigen Vorrichtung ermöglicht viele Versuche parallel angeordnet. Die runden Schließen der Ventile Kleinst durch Zeilen oder Spalten gemeinsam oder getrennt behandelt werden, was wichtig ist, wenn eine Kreuzkontamination zu benachbarten Kammern verhindert werden soll. Bei geschlossener Mikrokammern können die Kanäle mit schädlichen Lösungen wie Salzsäure zur Reinigung ohne die eingeschlossenen Zellen behandelt werden. Andererseits ist schneller Austausch des Volumens innerhalb der Mikrokammer möglich. Derzeit wird ein minimaler Zeit von 200 ms benötigt, um die Kammer vollständig zu öffnen und neue Reagenzien einzuführen (für die komplette Austausch der Mikrokammervolumen hat die Strömungsgeschwindigkeit zu berücksichtigen).

Während unsere Methode ist sehr reliable und reproduzierbar, sollte man im Hinterkopf behalten, dass es zwei Hauptkritikpunkte in dem Protokoll der Chipherstellung und Betrieb. Zunächst wird die Verbindung der beiden Chip-Schichten nach der Plasmaaktivierung zu schnell durchgeführt werden. Die Ausrichtung ist wichtig, da sonst einige Kammern oder sogar der ganze Chip ist nicht nutzbar, da die Bindung irreversibel ist. Dieser Schritt könnte für unerfahrene Benutzer schwierig sein, aber nach einigem Training auch weniger erfahrene Laborarbeiter erhalten in der Regel gute Ergebnisse. Der zweite kritische Punkt ist die Sauberkeit bei der Montage und Verwendung des Mikrochips. Wenn Staubpartikel auf der Oberfläche des Chips vorhanden sind, können sie Steuerkanäle und die Ventile gefährden oder sogar zu einem Bruch des PDMS-PDMS oder PDMS-Glasbindung führen. Wir verbringen also eine Menge Aufmerksamkeit auf Reinigung. Es ist zu beachten, dass neben dem Hauptform Fabrication (in einem Reinraum durchgeführt), wir produzieren und nutzen die Mikrochips in einem normalen Labor-Umgebung, in der eine Staub werdennd Partikel vorhanden sind.

Trotz aller Sorgfalt, wenn die Kammern nicht vollständig schließen, kann es sein, dass entweder Druckleitung blockiert oder die Spin-Coating-Verfahren hat nicht die richtigen Membrandicke. Auch von Zeit zu Zeit haben wir beobachtet unzureichende Bindung, was zum Bruch der Bindung zwischen den beiden Schichten PDMS. Wenn viele Chips aus der gleichen Charge, die dieses Problem ist es möglich, dass die Zeit zwischen Plasmaaktivierung und Ausrichtung ist zu lang. Manchmal erfahren wir klebrig PDMS auf den Wafern, die nicht richtig entfernt werden konnte und ein Ergebnis ungenügender Silanisierung des Wafers.

Sobald die Produktionsmethode hergestellt wurde, können die mikrofluidische Plattform für viele verschiedene Studien auf Einzelzellebene verwendet werden. Hier zeigten wir den Nachweis von intrazellulären und sekretierten Mittel mit verschiedenen Assays, aber viele andere Assays sind auf dem Chip möglich. Die meisten Proteine ​​sind nicht fluoreszierend und deren deSchutz über Immunoassays ist nicht einfach. Die Umsetzung der ELISA in den Chip wird viele Vorteile bringen. Erstens kann der Test sehr spezifisch für das gewünschte Protein konstruiert werden (wenn geeignete Antikörper vorliegen). Zweitens kann Informationen von ELISA auch bei niedrigen Konzentrationsgrenzen quantifiziert werden, was die Anzahl der Protein oder Molekül Kopien in der Zelle vorliegt.

Unsere aktuellen Chip ist für die Analyse der einzelnen Säugerzellen ausgelegt. Jedoch Modifikation der Chip für andere Zellen, wie Bakterien, Algen und Hefen, sollte möglich sein. Bis jetzt ist die einzige Beschränkung für die Experimente die Notwendigkeit eines Assays auf Fluoreszenzbasis. Wir sind jedoch derzeit die Umsetzung der Massenspektrometrie als Detektionstechnik. Sobald dies festgestellt, wird der Bereich der analytischen Problemen, die mit der Plattform untersucht werden kann, auch breiter sein. Da nicht jede Analyse in Gegenwart von Zell-Lyse-Puffer möglich ist, haben wirwerden derzeit auch die Beurteilung verschiedene andere Techniken Lyse auf der Plattform. Wir sind sicher, dass der vielseitige mikrofluidischen Plattform hier vorge bietet die Grundlage für neue Ein-Zellstudien auf der Proteom-, Metabolom-und Sekretom Ebene.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Die Autoren danken Tom Robinson für das Korrekturlesen des Manuskripts, C. Bärtschi und H. Benz für den Bau des custom-built Druck-Kontrollsystem. Wir möchten auch auf die Verwendung des Reinraum FIRST und der Lichtmikroskopie Center (LMC), die beide an der ETH Zürich zu bestätigen. Die Arbeit wurde von Merck Serono und des Europäischen Forschungsrates (ERC) im 7. Rahmenprogramm (ERC Starting Grant, Projekt-Nr. 203428, nμLIPIDs) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie Mikrofluidik Proteomik Systembiologie Einzelzellanalyse Immunoassays Lab on a Chip chemische Analyse
Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen
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Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S.,… More

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

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