Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

Abstract

אנו מציגים מכשיר microfluidic המאפשר קביעת כמותית של ביומולקולות תאית בתאים בודדים מרובים במקביל. לצורך כך, התאים לכודים באופן פסיבי באמצע microchamber. עם ההפעלה של שכבת הבקרה, התא מבודד מהנפח שמסביב בחדר קטן. הנפח המקיף לאחר מכן ניתן להחליף מבלי להשפיע על התאים המבודדים. עם זאת, על פתיחה וסגירה קצרות של החדר, הפתרון בתא יכול להיות מוחלף בתוך כמה מאה אלפיות שנייה. בשל ההפיכות של התאים, יכול להיחשף לתאים ברצף פתרונות שונים באופנה לשליטה מאוד, למשל עבור דגירה, כביסה, ולבסוף, תמוגה תא. Microchambers הסגור היטב יאפשר השמירה של lysate, למזער ולשלוט בדילול לאחר תמוגה תא. מאז תמוגה וניתוח להתרחש באותו המיקום, רגישות גבוהה נשמר משום שאין ד נוסףilution או אובדן analytes מתרחש במהלך הובלה. עיצוב microchamber לכן מאפשר ניתוח אמין לשחזור של מספרי עותק קטנים מאוד של מולקולות תאיים (attomoles, zeptomoles) שוחררו מהתאים בודדים. יתר על כן, ניתן לארגן microchambers רבים בפורמט מערך, המאפשר הניתוח של תאים רבים בבת אחת, בהתחשב בעובדה שמכשירים אופטיים מתאימים המשמשים לניטור. יש לנו כבר השתמשתי בפלטפורמה למחקרי הוכחה של הקונספט לנתח חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors ושליחים שני באופן כימות או יחסי או מוחלט.

Introduction

מחקרים רבים בעבר חשפו הבדלי תא אל התא בתוך אוכלוסיית תאים גדולה 1-3, בפרט איתות מעבדת 4, או הכמויות של ביומולקולות תאית כגון חלבונים 5,6, מטבוליטים, וcofactors 7,8. heterogeneities אלה נחשבים חשובים ביסודו להסתגלות תאים והתפתחות 9, אבל גם לשחק תפקיד מרכזי בהופעתה וטיפול במחלות כגון סרטן 10-13. לכן, מחקרים ברמת התא הבודד הם עניין גבוה במחקר ביולוגי ותרופתי, במיוחד אם מחקרים אלה חושפים את תגובות תאים השונות לאחר טיפול עם חומרים כימיים ביו.

בשנים האחרונות, רבות פלטפורמות אנליטיים פותחו המאפשרות ניתוח של תאי חיים בודדים או את ההרכב הכימי של התוכן הסלולרי. בעוד תא ניאון מיון מופעל (FACS) הוא הזהב standard לניתוח מאוד תפוקה גבוהה של תאי חיים בודדים, השיטה לא יכולה להיות מועסק לכימות של תרכובות תאיים או מופרשים. הופעתה של פלטפורמות microfluidic הבטיחה אסטרטגיות אנליטיות חדשניות למיצוב, טיפול ומעקב של תאים בודדים. אבן דרך במיקרופלואידיקה הושגה עם השילוב של שסתומים PDMS גמישים הבינו ידי Quake ועמיתים לעבודה 14,15. שסתומים אלו יעילים מכיוון שהם יכולים לבודד אזורים בשבב, לדוגמא להפריד בין שתי תרבויות 16. יתר על כן, הם רלוונטיים במיוחד לניתוח תא בודד, ולכן לעזור להפחית בעיות דילול אנליטי. כוחה של גישה זו לניתוח תא בודד הודגם לאחרונה על ידי הנסן ועמיתים לעבודה, שניתח את ביטוי גנים ממאה תאים בודדים ב17 מקבילים.

כאשר מיקוד חלבונים ומטבוליטים, הניתוח קשה מאוד עקב חוסר המתאיםשיטות mplification, המספר הגדול של תרכובות שונות בהווה ובווריאציות שלהם בטבע כימי. יתר על כן, רוב ביומולקולות תאית צפויות להיות נוכח במספרים נמוכים עותק בסדר הגודל של כמה עשרות אלף 18, ולכן השיטה אנליטית המשמשת חייבת להיות רגישות גבוהה. מבחני יותר חזקים כגון immunoassays וimmunoassays צמודת אנזים (ELISA) קשים להשתלב במכשירי microfluidic כי הם דורשים כמה כביסה ושלבי דגירה, כמו גם חוסר תנועת פני השטח.

בשל אתגרים אלה, אין זה מפתיע שרק כמה דוגמאות שדווחו בו חלבונים או מטבוליטים היו לכמת ברמת התא הבודד. לדוגמא, מחקרים על ההפרשה של תרכובות ניאון דווחו 19,20. לאחרונה, היישום עם ELISA הוצג לניתוח חלבונים מופרשים (nonfluorescent) מתרבית תאים (THP-1 תאים) 21 ויחידה (immune) תאים 10. מיקוד חלבונים תאיים, שי et al. פיתח מכשיר microfluidic שאפשר זיהוי של חלבונים תאיים לניתוח של מסלולי איתות בתאים סרטניים באמצעות immunoassay 11. עם זאת, רק כמויות יחסי של חלבונים שהיו נחושות ולא הגברה אנזימטית שימשה כדי להגדיל את האות לחלבוני שפע נמוך.

לאחרונה, הצלחנו לשלב microdevice השמנה תא בודד עם מבחני הקרינה 8 וimmunoassays 22 (איור 1). תאים לכודים באופן פסיבי במבני משוכת microsized, המאפשרים אספקה ​​והחלפה (מהירה) של מדיום וחומרים כימיים אחרים ללא כל תנועה של התאים. שסתום בצורת טבעת סביב כל מלכודת מאפשר בידוד של התא בנפח קטן מאוד ("microchamber"). שסתום זה מונע מייד לאחר החדרת חיץ תא lysing (hypoosmolar), שהואNCE מניעת מולקולות תאיים או מולקולות מופרשים כדי לפזר משם. והכי חשוב, בשל גודלו הקטן של הנפח (625 pl) דילול גדול של המולקולות הוא התחמק. יתר על כן, מאז תמוגה וניתוח מבוצעים באותה התנוחה בשבב, אין אובדן של analytes בשל תחבורה. תכנון השבבים המתוארים כאן כולל 8 שורות לסירוגין של או 7 או 8 microchambers, בהיקף של 60 microchambers. התאים הם מופעלים בשורות, כך שזיהום צולב לאורך קו מנועה.

הפלטפורמה יכולה לשמש בשילוב עם מבחני הקרינה, כמו גם מבחני חיסוניים (1D איור). באפשרות השנייה, הקמנו פרוטוקולים לחוסר תנועה של הנוגדנים, אשר עולים בקנה אחד עם ייצור השבבים ותהליך ההרכבה. לפיכך הפלטפורמה פותחת את הדרך למבחנים רגישים, אמינים וכמותיים ברמת התא הבודד. עד עכשיו, יש לנו השתמשתי במכשיר לניתוח של iאנזימי ntracellular והמופרשים (כימות יחסי על ידי מבחני האנזימטית), cofactors תאיים, חלבונים ומולקולות קטנות (כימות מוחלטת על ידי מבחני נקודת סיום או ELISA). בחלק הבא, אנו מתארים את תהליך ייצור שבבים באמצעות יתוגרפיה רב שכבתית רכה והפרוטוקולים לדפוסים של הנוגדנים באמצעות הדפסת microcontact וכימיה של פני השטח. בנוסף, כמה דוגמאות לשימוש בשבב ופעולות מקבלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU-8 ייצור מאסטר

הכן שני תבניות ההורים לערוצים (fluidic ובקרה, לשרטוטים וממדים ראו איור 2) עם הפרוטוקול הבא אבל עם דפוסי מסכה שונים. התהליך מוצג באיור 3 א.

  1. התחל על ידי חימום פרוסות סיליקון 4 אינץ 10 דקות ב 180 ° C. טען את רקיק מיובש על ספין coater ולהשתמש בפרוטוקול לציפוי ספין SU-8 שינה 2015:
    1. ספין רקיק ב100 סל"ד 20 שניות (מכסה פתוח של ספין coater, לוותר SU-8 במהלך השלב, מיכסה קרובה זאת לאחר מחלק).
    2. רקיק ספין ב500 סל"ד 10 שניות (זה יתפשט להתנגד על פני כל רקיק).
    3. רקיק ספין על 1,750 סל"ד במשך 30 שניות (מגדיר את הגובה של להתנגד ל20 מיקרומטר).
  2. הסר להתנגד מהקצה של פרוסות סיליקון עם אצטון (להשתמש בספוגית) כמו זה אחרת ידבק פלטה חשמלית בשלב הבא. מעביר את פרוסות לאהotplate ב 95 מעלות צלזיוס וחום למשך 4 דקות. לאחר softbake, לחשוף את להתנגד באמצעות photomask מודבק sodalime זכוכית בaligner מסכה עם אור האולטרה סגול (150 mJ / 2 סנטימטר, הנמדד ב365 ננומטר).
  3. לאחר החשיפה, לחמם את פרוסות שוב על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על פלטה חמה. לצנן את רקיק RT ולאחר מכן לטבול אותו לתוך אמבטיה של SU-8 מפתח למשך 4 דקות. ללחוץ בעדינות כדי להסיר SU-8 שלא נחשפו. שטוף את רקיק עם isopropanol הכיתה חדר הנקי ומכה יבשה עם חנקן. בדוק תחת מיקרוסקופ אם הפיתוח היה מוצלח (במיוחד מלכודות התא). אם מלכודות התא מפותחות לחלוטין, ההשתקפות של פרוסות סיליקון צריכה להיות גלויה. במידת צורך, לפתח את רקיק שוב במשך כמה דקות.
  4. אופים את פרוסות בתנור במשך שעה 2 ב 180 ° C כדי להסיר את כל הממס שיורית. בדוק את הגובה של הערוצים עם מאבחן אחר צעד. אם הגובה שונה מהגובה הרצוי, חזור על פרוטוקול זה מתחיל בשלב 1.1 עם רקיק חדש ולשנות את הספין במהירות (1.1.3 צעד). לסיים את הייצור של עובש האב ידי silanizing רקיק עם 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane בייבוש למשך הלילה.

2. ייצור אב להדפסת microcontact

  1. על מנת להכין תבניות הורים להדפסת microcontact, מייבש את פרוסות סיליקון עבור 10 דקות ב180 ° C. ספין מעיל 1 HDMS מיליליטר גבי פרוסות סיליקון זה ב7,500 סל"ד 30 שניות (להתנגד שומרת טוב יותר על משטח silanized). ספין מעיל 2 מיליליטר של AZ1518 חיובי להתנגד עם פרוטוקול זה:
    1. לוותר סטטי של להתנגד לרקיק.
    2. ספין רקיק למשך 5 שניות ב500 סל"ד.
    3. ספין רקיק ל60 שניות ב 4,000 סל"ד.
  2. לאחר softbake שניות 50 ב100 ° C על פלטה חמה, לחשוף את להתנגד לקרינת UV-אור (21 mJ / 2 סנטימטר ב365 ננומטר) דרך photomask ועל aligner מסכה. לפתח להתנגד באמבט של AZ 726 ל75 שניות. שוטפים את פרוסות פיתחו עם DI-מים וד המכהר"י עם חנקן. הסר ממס שיורי על ידי חימום רקיק ב115 מעלות צלזיוס במשך 50 שניות. Silanize רקיק תחת ואקום הלילה.

3. ייצור של השבב microfluidic

עיצוב מכשיר דו שכבתי המשמש לניסויים אלה. שתי שכבות מוכנות בנפרד ומחוברות יחד, לפני שהשבב סוף הסוף מלוכדים על גבי זכוכית (3 ב איור). שלב זה מתאר את הייצור של שכבות PDMS וחותמת PDMS להדפסת microcontact.

  1. הכן תערובת 10:01 של PDMS וסוכן ריפוי. הכן כ 80 PDMS גרם בסך הכל (באמצעות העיצובים שלנו, זה יגרום 10 שבבים). מערבבים את שני החלקים במרץ והדגה PDMS עד לקבלת תערובת בועה חופשית (~ 30 דקות).
  2. מניחים את פרוסות בשכבה מלאה בתוך צלחת פטרי וקלטת אותו על התחתית. , הבא לשפוך ~ 50 גרם של PDMS על גבי והכניס את רקיק לפחות 2 שעות בתנור בחום של C ° 80 כדי להבטיח מלאריפוי של PDMS. חזור על אותו התהליך עבור רקיק הדפסת microcontact, בשביל זה ~ יש צורך 20 PDMS גרם.
  3. ספין המעיל PDMS על פרוסות סיליקון עם שכבת fluidic במהירות סיבוב של 2,000 סל"ד ליצירת כ 40 מיקרומטר שכבה הגבוה PDMS. Cure PDMS בתנור במשך שעה לפחות 1 ב 80 ° C.
  4. כאשר שני החלקים נרפאים, להסיר את שכבת השליטה מהרקיק ולחתוך לחתיכות בסכין גילוח. אגרוף חורי חיבור לחץ באמצעות אגרופן ביופסיה 1 מ"מ. לאחסון, מומלץ לשים חתיכת הסרט על הערוצים.
  5. האג"ח שתי שכבות, קח רקיק הספין מצופה ואת החלק העליון ומניח אותם בשואב פלזמה 23. לאחר טיפול פלזמה, ליישר את שני החלקים במהירות תחת מיקרוסקופ עם מרחק עבודה גדול. הוסף כמה PDMS חילוף סביב החלקים העליונים ממוקמים. שלב זה אינו חובה, אבל זה מקל על הסרת PDMS מפרוסות סיליקון. מניחים את פרוסות בתנור על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.
  6. השתמש באזמל כדי להסיר בזהירות את PDMS מהרקיק ולחתוך את השבבים. אגרוף חורי גישה לחיבורי fluidic עם אגרופן ביופסיה 1.5 מ"מ.
  7. שבב PDMS הוא עכשיו סיים והוא יכול להיות מאוחסן במשך חודשים. אופציונאלי: אם השבב משמש עם מאגר, לחתוך את החלק העליון של קצה פיפטה 200 μl ולהשתמש בחלק החילוף, PDMS נרפא למחצה כדי להדביק אותו על גבי. שים את השבב בתנור שוב ב80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.

4. מליטה לשקופיות זכוכית

כדי להשתמש במכשיר עבור מבחני האנזימטית ישירים, הצעד היחיד שנדרש לאחר המליטה הוא החסימה של משטחים. עבור פרוטוקול זה, המשך א עם זאת, כדי להשתמש בשבב microfluidic לimmunoassays או ELISAs, עיין בפרוטוקול B כדי להגביל את האתרים מחייבים רק לשקופית הזכוכית (כלומר למיקרוסקופיה TIRF או SPR). אם מגבלה זו אינה חשובה, עיין, אבל להשתמש conjugates biotinylated בשלב 4.3 והמשיכו בשלב 4.8בפרוטוקול B כדי ליצור משטח מתפקד במלואה.

קודם לביצוע הפרוטוקול A ו-B: מומלץ לסנן את כל פתרונות חלבון בשימוש לפני החדרתם לשבב. אגרגטים פסולת וחלבון אחרים עלולים לחסום את מלכודות תא, ובכך להפחית את מספרם של תאים שיכולים לשמש לצורך הניתוח. לצורך כך, יש להשתמש ביחידת מסנן adsorbing nonprotein כדי לסנן את כל הפתרונות לפני שמציג אותם לערוצים.

פרוטוקול (מבחני האנזימטית)

  1. כדי לסיים את מכשיר microfluidic, אג"ח חלקי PDMS על גבי זכוכית. כדי לעשות זאת, לנקות ראשון שקופיות זכוכית עם סבון, מים מזוקקים ואתנול. ייבש את השקופית באמצעות זרם חנקן. נקה את חלק PDMS עם נייר דבק.
  2. לשים את חלק PDMS ושקופיות הזכוכית ניקו לתוך שואב הפלזמה ל45 שניות ב18 וו כדי להבטיח מליטה חזק, לשים את השבב על פלטה חשמלית (100 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.
  3. לאחר מליטה, למלא את השבב עם fluids. דרך קלה ביותר להשיג זאת היא להשתמש בכוח הצנטריפוגלי. חותכים את החלק התחתון של 200 קצה פיפטה μl. עבור ערוצי fluidic, למלא אותם בפתרון החסימה (אלבומין בסרום שור (4% w / v) או פולי-L-ליזין) פוליאתילן גליקול מורכב (0.05% w / v) ולמקם את הטיפים לפתחי הכניסה. מלא את פתחי הכניסה שכבה מלאה עם מים או עם פתרון מליחות, למשל PBS. הנח את השבב לצנטריפוגות (800 XG) במשך 5 דקות. הערוצים צריכים להיות החברה מלאים בנוזל לחלוטין. אם לא, חזור על שלב זה.
  4. דגירה פתרון החסימה לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. שטוף את הפתרון מחוץ לשכבת הנוזל עם PBS בקצב זרימה של 10 μl / דקה באמצעות משאבת מזרק. המכשיר מוכן לניסויי תא עכשיו.

פרוטוקול B (immunoassays)

לסקירה מלאה של שינוי פני השטח מצעד 4.7 ואילך מלאה, אנא עיינו בטבלת 1.

  1. בתוךבולי PDMS cubate להדפסת microcontact עם פתרון bBSA / BSA (למשל 1-100). לאחר 30 דקות, לנקות את החותמות ביסודיות עם מים מזוקקים ולייבש את החותמת תחת זרם של חנקן. במהירות למקום החותמות בשקופית זכוכית ניקתה (איור 4).
  2. לחשוף את שקופיות זכוכית עם החותמת יחד עם החלק העליון של השבב microfluidic לפלזמת חמצן במשך 45 שניות בכוח מרבי (18 W) בשואב פלזמה. לאחר טיפול פלזמה, להסיר את החותמת וליישר את המשטח המודפס מתחת microchambers של המכשיר. הנח את השבב ל30 דקות על פלטה חשמלית ב50 ° C.
  3. כדי לחסום את פני השטח שנותר, להציג פתרון מסונן סטרילי BSA (4% (w / v) ב-PBS) לתוך השבב עם צנטריפוגות (ראה שלב 4.2). דגירה עבור שעה 1 ולשטוף את הפתרון מחוץ לשכבת הנוזל עם PBS (ראה שלב 4.3). השבב לאחר מכן ניתן להשתמש בם ישירות או לאחסן עד 2 שבועות על 4 מעלות צלזיוס בתיבה לחה.
  4. לsurfac מחייב מתפקד במלואהדואר, להציג avidin (0.025% (w / v) ב-PBS) לתוך המאגר. השתמש בקצב זרימה של 5 μl / min למשך 30 דקות למשוך את פתרון avidin דרך ערוצי נוזל. לאחר מכן, שטוף את PBS עבור 10 דקות. יש לשטוף את המאגר באופן יסודי.
  5. לאחר מכן, להוסיף חלבון G (0.0025% (w / v) ב-PBS) וסומק ל30 דקות נוספות. לשטוף עם PBS עוד 10 דקות לאחר מכן. לאחר מכן, להוסיף את הנוגדן של עניין (0.0001% (w / v) ב-PBS) במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לעצור את הזרימה ל15 דקות, כדי לאפשר מחייב. בשלב בא, לשטוף עם PBS עבור 10 דקות.

5. ניסויי תא

הפרוטוקול כתוב באופן כללי בגלל המגוון של מבחני אפשריים. כדוגמא ניתנים ריאגנטים דרושים עבור assay רעילות G6PDH. יעילות תא לכידה הראשונית של המכשיר היא סביב 2.5%, כלומר 5 מתוך 200 תאים יהיו לכוד. התפוסה הסופית של מלכודות התא מאוד תלויה בקו הסלולרי בשימוש, בפרוטוקול להשעותשורת התאים וזמן התאים נשטפים דרך התעלה. לתאים הגדלים באופן טבעי בהשעיה (כגון U937), ניתן למצוא תאים בודדים בכ 75% מהתאים אחרי כמה דקות. התאים האחרים או לא מלאים, או שנכבשו על ידי שני תאים או יותר. באופן כללי, תפוסת התא הבודד היא קטנה יותר עבור שורות תאים חסיד. בעת שימוש בפרוטוקול מתלה קל למדי שהוצג כאן, האחוז יורד ל% כ -30 (HEK, תאי MLT). תפוסת התא הבודד ניתן לשפר על ידי טיפול טריפסין של התאים, אבל זה יכול גם לשנות את התוצאות של הניסויים.

בהתאם למולקולת המטרה, ספיחה או ספיגה לPDMS יכולה להשפיע על התוצאות. ספיחה יכולה להיות מופחתת על ידי חסימת המשטחים עם BSA או PLL-G-PEG. הקליטה היא סבירה עבור רוב ביומולקולות הידרופילי, אבל זה צריך להיבדק על מרכיבי תא (קטנים) lipophilic.

  1. הכן את התאים בהתאם לפרוטוקול הספציפי (לדוגמא:
  2. טען את התאים על גבי השבב באמצעות משאבת מזרק וזרימה קדימה, ולא למשוך את ההשעיה התא. השתמש בקצב זרימה של 5 μl / min לשורות תאי השעיה וספיקות גבוהות של 10-20 μl / min לתאי דבק מאז להפחית קובץ מצורף לא ספציפי של התאים על גבי קירות הערוץ.
  3. כאשר המלכודות מלאות, סגור את הלשכה. אם תאים רבים לדבוק nonspecifically אל פני השטח, נסה לשטוף אותם עם חיץ ניתוק תא בקצב זרימה של 10-30 μl / min.

פרוטוקול (מבחני האנזימטית)

  1. לסגת מאגר תמוגה דרך השבב. בדוגמה זו, החיץ הזה הוא חיץ hypoosmolar עם Tween הוסיף 20 (10 מ"מ טריס-HCl, 10מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 1% (v / v) Tween 20). להתפרקות תאים במהירות פתיחה וסגירה (כלומר 500 אלפיות שני עבור ספיקות של 10-50 μl / min 7,21). עבור assay G6PDH, להוסיף 2 מ"מ glucose-6-phosphate, 0.5 מ"מ NADP, 0.5 U / diaphorase מיליליטר ו0.3 מ"מ resazurin למאגר תמוגה. התחל ניטור התגובה הקינטית מייד לאחר תמוגה.

הערה: בחר בכל חיץ אשר מתאים לassay, לעומת זאת חשוף לזכור כי בדטרגנטים חזקים (כמו טריטון, SDS) תאי lyse מייד ויובילו לאובדן של אנליטי בתא פתיחה.

פרוטוקול B (immunoassays)

לתיאור קצר של ניסויי ELISA תא (ספיקות, חדר מצב, וכו '), אנא עיין בטבלת 1.

  1. לELISA, מוסיף את המגיב נדרש זיהוי (נוגדן למשל המשני אנטיגן שכותרתו,) ישירות למאגר תמוגה. במסמך זה הוסיף Tween 20 מפחית את ספיחה לא הספציפית. Lyse התאים פי צעד 5.4. דגירה את תערובת ל10-15 דקות כדי לאפשר מחייב (זמן דגירה בהתאם לאנטיגן ונוגדן בשימוש).
  2. conjugates אנזים נוגדן שadsorbed nonspecifically לקירות הערוץ יכול להוביל להמרה של מגיב לגילוי כבר בתוך המאגר והערוצים. לצמצום בעיות מספיחה זה, שטוף את מעכב קבוע של האנזים המשמש לזיהוי דרך השבב בזמן הדגירה (תאים סגורים, לפני הוספה מגיב לגילוי). לHRP, השתמש 20 מ"מ HCl במים כדי להשבית באופן קבוע אנזימי adsorbed nonspecifically.
  3. לאחר זמן דגירה, להציג מגיב לגילוי (לדוגמא Amplex האדומה ומי חמצן לHRP) לשבב. פתח את תאי זמן קצר שוב כדי לשטוף את הנוגדנים משני nonbound משם ולהוסיף מגיב לגילוי. התחל ניטור התגובה קינטית באופן מיידי.
  4. כיול: לשתקהנוגדנים נגד היעד של ריבית. תאים סגורים. הכן ריכוזים שונים של חומר אנליטי במאגר או בתא lysate את השבב. החל ריכוז לשבב ובמהירות להחליף את הנפח בתוך התאים (500 msec פתיחת זמן). זמן פתיחה זו הוא קצר מספיק כדי לוודא ששום הצטברות נוספת מתרחשת משטיפת אנליטי, ומספר מסוים בלבד של מולקולות מהיקף microchamber מזוהים. מהריכוז הידוע של האנטיגן בתוך הפתרון והנפח של החדר (625 pl), לחשב את הסכום בתוך החדר. לאחר מכן, המשך בשלב 5.5 ולהציג מחצית זיהוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפלטפורמה שלנו היא מסוגלת לנתח מגוון של תאיים, כמו גם מולקולות מופרשים בהווה באו המיוצר על ידי תאים בודדים. כאן, אנו רוצים להציג מחקרי ירושלים שונים כדי להדגיש את המגוון של מבחני אפשריים. אנו נותנים דוגמא לאנזים מופרש (איור 5 א), כמו גם אנזים תאיים (איור 5) וחלבון (5c דמויות וד). לדוגמאות נוספות, כגון cofactors או מולקולות קטנות, עיינו Eyer et al. (2012) וEyer et al. (2013).

ראשית, אנו מציגים assay לאנזים מופרש (איור 5 א). עם הפעלה עם אצטט Myristate phorbol (PMA), מונוציטים האנושיים לגרום להפרשה של ליזוזים, אנזים שגורם תמוגה תא חיידק. עבור assay זה, חיץ התא מכיל 4-Methylumbelliferyl β-DN, N'-diacetylchitobioside, מצע בחולשה ניאון לlysozyme. על המחשוף של שאריות סוכר על ידי האנזים, fluorophore משוחרר וניתן לאתרם בתוך החדר. כאן, היתרון של microchamber הוא הדילול הממוזער של האנזים המופרש, המאפשר זיהוי של ריכוזי אנזים נמוכים בתוך פרק זמן קצר. בציור 5a, כמה עקומות דוגמא מוצגות המייצגות את המחזור האנזימטית של ליזוזים המופרש מתאי U937 מגורה אחת. שורת תאי U937 נובעת מחולה עם לימפומה histiocytic, ויכולה להיגרם לבידול monocytic מסוף. שורת התאים מייצרת TNFα, ליזוזים וβ2-microglobulin לאחר גירוי עם PMA. אין תחלופה היא לזיהוי בתאים פתוחים או תאים ללא תאים (קו מקווקו).

איור 5 מראה את כימות היחסית של אנזים תאיים, כאן דהידרוגנז גלוקוז 6 פוספט (G6PDH). G6PDH הוא חלבון משק ותאים מאותו המוצא הרקמות לא צריך להשתנות במידה רבה בריכוז G6PDH 24. הנה, תאי U937 היו לכודים בתא, ואנו מסופקים assay הקרינה לצורך זיהוי של G6PDH יחד עם מאגר תמוגה. הוא מורכב מגלוקוז 6 פוספט, NADPH, diaphorase האנזים וresazurin המצע, אשר מומרת resorufin ניאון כאשר G6PDH הוא הווה. שיעור הגידול בקרינה לאורך הזמן מתאים לכמות G6PDH. השבב נוסף מאפשר מחקרים על ההשפעה של תרכובות רעילות, למשל על ידי דגירה של התאים עם רעלן (כאן camptothecin) במשך זמן מוגדר (60 דקות). לאחר טיפול זה, האנזים שפורסם היה סמוק משם והתאים היו lysed, ורמת G6PDH נמדדה. ואכן, לאובדן משמעותי של תוכן אנזים תאיים היה גלוי בשל עלייה איטית יותר של הקרינה (קווים אדומים ועמודות באיור 5 ב). ניתן למצוא את פרטים של מחקר זה בEyer et al. 8

e_content "> יתר על כן, אנו מציגים התוצאות מimmunoassay לניתוח של כמויות ה-GFP תאית. לביטוי מושרה, HEK293 תאים בי transfected עם מערכת ביטוי T-Rex. במערכת זו, ביטוי של GFP יכולים להיגרם על ידי התוספת של טטרציקלין . לאחר 8 שעות של דגירה, התאים היו מושעים, סמוק על השבב, לכודים, ולאחר מכן lysed. לכידת נוגדנים אנטי-GFP היו משותקים על משטח הזכוכית הבאה הפרוטוקול המובא כאן כדי לחייב את ה-GFP שוחררה מהתא. איור 5c מציגה את קינטיקה מחייבת של ה-GFP לנוגדן. בדוגמא זו, GFP ניתן היה למדוד באופן ישיר על ידי סך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפנימי בשל הקרינה של החלבון. אנו רוצים להדגיש יכולים גם להתגלות כי חלבוני nonfluorescent באמצעות כריך ELISA או דומה פורמטים. לשם כך, ניתן הציגו רכיבי assay נדרשו לאחר צעדי הכביסה. היתרון של ELISA הוא ההגברה האות בשללאנזים, מניב מוצר ניאון שהצטבר בתוך microchamber.

לבסוף, ברצוננו להציג ELISA כריך תא בודד עם GAPDH כחלבון המטרה. אנחנו נקבע GAPDH בתאי ההשעיה U937, כמו גם תאים חסיד HEK293 (5D איור). לשם כך, אנחנו משותקים נוגדן אנטי GAPDH (נוגדן ללכוד). לאחר תמוגה תא, הנוגדן השני שכותרתו אנזים (נוגדן זיהוי) הוצג. התאים נפתחו ובשל הזרימה, נוגדני זיהוי מאוגדים נשטפו וAmplex האדום הוצג לחדר. המרה של Amplex אדום לניאון resorufin ידי HRP (נוגדן זיהוי) הייתה פיקוח לאורך זמן בכל 60 microchambers באותו הזמן. המדרון מהחלק ליניארי של התגובה היה נחוש. מדרון זה בקורלציה ישירה לריכוז של האנזים ולכן, לריכוז של חומר אנליטי. התוצאות מתאי U937 אחת הראו GAPDH ממוצעכמות 2.6 attomol, עם ערכים מינימאליים ומקסימאליים של 2.0 ו3.2 attomol, בהתאמה. ניתוח נתונים של 46 HEK תאים גילה כי תאים אלה כלולים בGAPDH הממוצע 2.5 attomol (attomol 0.9 המינימלי; attomol 4.1 מקסימאלי).

איור 1
איור 1. Microdevice והשרטוטים של מבחני השונים שהוצגו.) Microdevice התאסף. הנה, את התאים מלאים ובהעמסה להדמיה (הקרינה ירוקה). כמו כן גלוי הוא המאגר, חיבורים לשכבת הבקרה (לחץ, מחברים 2x4 בחלק האחורי שמאליים וימניים קדמי) ואת החיבור למשאבת המזרק (הקדמי). ב) קרב על אזור microchamber. רבים של תאים אלה יכולים להיות מסודרים במערך. להדמיה, לצבוע מזון כתום היה מבודד בתוך התאים, ואילו צבע מאכל ירוק הוא הסמיק בין הערוצים. שכבת השליטה בלחץ מלאה במים. ג) זום בmicrochamber אחת. ד) סכמטי של פעולת המכשיר. בתוך microchamber (צד תצוגה), תא בודד הוא לכוד ומבודד. התא יכול להיות מגורה, מודגרות, שטף וסוף סוף lysed בתוך השבב. התוכן הסלולרי יכול להיות מנותח באופן ישיר עם מבחני לאנזימים או coenzymes בי מחצית ניאון נוצרה על תגובה (משמאל). לחלבונים אחרים, פני השטח יכולים להיות שונה עם נוגדנים הנקשרים באופן ספציפי לחלבון המטרה (מימין). מאז אנטיגן קשור אל פני השטח, lysate יכול להישטף וניתן להוסיף מולקולות זיהוי כגון נוגדנים משני לכמת את חלבון המטרה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

דואר 2 "עבור: תוכן width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "width =" "/> 500px
איור 2. סכמטי של מערכות ערוץ וממדים של microchamber.) עיצוב מסכה של שכבת fluidic. שכבת fluidic מורכבת (משמאל לימין) לשקע, האזור קאמרי, מסנן כדי לשמור על חלקיקים וצבירי תאים וכניסה. 4 ברקיק יכולים נמל המבנים לייצור שבבים 10. ב) עיצוב מסכה של שכבת הבקרה המתאימה. בשל השטח הדרוש ליישור, 4 ברקיק מכיל מבנים לייצור השבבים 5. ג) סכמטי של שכבות מיושרות (משמאל) והגדלה מראה מלכודת תא (מימין), שניהם עם סולמות אורך. לחצו כאן לצפייה תמונה גדולה יותר.

איור 3 איור 3. סכמטי של של SU-8 עיבוד והפקת PDMS.) סכמטי של פרוטוקול עיבוד SU-8. פרוסות סיליקון היא עם SU-8 ורכים אפוי ב95 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ספין מצופה. עיצוב ערוץ microfluidic הרצוי מועבר על SU-8 באמצעות photomask וחשיפה לקרינה UV-אור. לאחר לאפות לאחר חשיפה (95 מעלות צלזיוס, 5 דקות), SU-8 הוא פיתח וקשה אפוי ב180 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. ב) סכמטי של ייצור שבבי microfluidic. תערובת של oligomer PDMS וסוכן ריפוי היא על גבי טופס האב לערוצי fluidic ספין מצופה, ושפכה על טופס האב לשכבת השליטה. תשלילי הערוץ מתוארים בורוד. שני השכבות נרפאות בתנור. חלק שבב שכבה מלאה הוא מפורק מהרקיק (ערוץ בקרה בכחול) וחורים לחיבורי לחץ הם אגרוף (לבן). שני חלקי שליטה ושכבה הם נוזל ממוקמת בפלזמת חמצן, ולאחר מכן, הם מיושרים ומלוכד. כל השבב אז מפורק מטופס fluidic הראשי (ערוץ נוזל בצבע אדום) וחורי גישת fluidic הם אגרוף (לבן). לבסוף, השבב ושקופיות זכוכית מודבקים לאחר הפעלת משטח בפלזמת חמצן. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. סכמטי של הדפסת microcontact.) ייצור אב ליתוגרפיה רכה. (1) PDMS חותמת הודגרו עם פתרון חלבון (bBSA). (2) הפתרון מוסר, החותמת היא שטפה וmonolayer של חלבון נשאר בחותמת. (3) החותמת ממוקמת בשקופית זכוכית, ובכך החלבונים מועברים לsur הזכוכית פנים. במהלך תקופה זו, השבב יחד עם החותמת על הזכוכית חשוף לפלזמת חמצן. (4) החותמת מוסרת והשבב האלקטרוני הוא ערובה לשקופית הזכוכית. להדמיה, שני מבני דוגמא מוצגים, מודפסים עם הצמוד BSA-והעמסת ניאון. ב) אזור microcontact מודפס לכל תא. מאז ההדפסה ותאים לא מיושרים, הערכנו וריאציות על כתמים מחייבים (אזור מודפס) על שלושה שבבים שונים (מספרי 1-3) וכל 60 microchambers. כתוצאה מכך, השתנות תא לתא קטנות יחסית (<2.5%) והשתנות שבב לשבב היו זניחות (<1%), הוכחת כי אכן אין צורך ליישר את המבנים המודפסים לתאי. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

"Width =" 18/50618fig5.jpg "/> 500px
איור 5. תוצאות מG6PDH, ליזוזים, GFP ומבחני GAPDH. נציג תוצאות.) הפרשת אנזימים מהתאים בודדים. משמאל: סכמטי של assay לאנזים מופרש, כאן ליזוזים. ליזוזים מופרש על ידי תאים בודדים, הופעלו-PMA U937 ומצטבר בתוך microchambers הסגור, שבו הוא מזרז הייצור של 4 methylumbelliferone-הניאון. מימין: נתונים שהתקבלו מניסוי הפרשה. העקומות הירוקות מראות את עוצמת הקרינה לאורך זמן עבור תאים שנכבשו על ידי תא אחד, המוצגות גם הוא חדר ללא תאים (שחורה, קו מקווקו) להשוואה. ב) איתור של אנזימים תאיים בתאים בודדים. משמאל: סכמטי של assay לG6PDH האנזים תאיים. על תמוגה תא, G6PDH תאיים משתחרר לתוך התא, שבו הרכיבים האחרים למפל תגובה האנזימטית נוכחים. מימין: עקומות דוגמא ונתונים מייצגים. U937 יחידתאים נותחו לתוכן שלהם האנזים (השחור). Immunoassay על ההשפעה רעילה של camptothecin, שpermeabilizes הקרום, שני שלישים של האנזים אבדו (כתומה). ג) של חלבונים תאיים של תאים בודדים. משמאל: סכמטי של immunoassay, כאן לGFP החלבון תאיים. נוגדני Anti-GFP היו משותקים על הפרוטוקול לפי פני השטח המתואר במסמך זה. תאים אז היו lysed על שבב והכתמים מחייבים היו במעקב לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה TIRF. מימין: גרף מניסוי כזה מראה קינטיקה מחייבת של ה-GFP לנוגדנים משותקים. 1 נקודת הזמן מסמנת את כניסתה של מאגר תמוגה. בזמן נקודה 2, ה-GFP מתחילה להצטבר על פני השטח, כלומר תמוגה התא התרחשה. כריכה של ה-GFP לנוגדנים הושלמה בנקודת זמן 3. ד) כריך ELISA של חלבונים תאיים של תאים בודדים. משמאל: סכמטי של כריך ELISA, כאן לGADPH החלבון תאית. נגד-GAPDH נוגדנים היו משותקים על הפרוטוקול לפי פני השטח המתואר במסמך זה. תאים אז היו lysed על שבב וטופחו. GPADH המשוחרר חייב הנוגדן, החדר נשטף ונוגדן זיהוי (יחד-HRP) הוצג. בשלב אחרון, נוגדן זיהוי nonbound נשטף, מגיב לגילוי הוצג והתגובה הייתה פיקוח לאורך זמן. מימין:. כימות GAPDH בתוך תאי U937 וHEK293 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

פרוטוקול שינוי פני השטח לELISA

שלב זמן התרכזות קצב זרימה זמן דגירה ללא זרימה הלשכה פתוחה / סגור
[דקות] % (/ V w) [Μl / min] [דקות] </ Td>
ארגון ה-BSA 30 4 - פתוח
PBS 10 5 פתוח
Avidin 30 0.025 5 פתוח
PBS 10 5 פתוח
חלבון G, ביוטין 30 0.0025 5 פתוח
PBS 10 5 פתוח
נוגדן 20 0.0001 5 15 פתוח
PBS 10 5 פתוח
תאים
(300,000 תאים / מיליליטר) 		~ 5 30 סגור כאשר מלכודות תפוסות.
מאגר תמוגה 5 30 פתוח זמן קצר
מעכב (למשל 20 מ"מ HCl) 15 10 סגור
PBS 2 30 סגור
מגיב לגילוי 5 30 פתוח זמן קצר
התחל ניטור תגובה

טבלת 1. Modificatio Surfaceפרוטוקול n לELISA. להסבר ראה טקסט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכנולוגית מיקרופלואידיקה פתחה אפשרויות חדשות ומרתקות לניתוח תא בודד. בפרט, את האפשרות למלכודת ולשתק את התאים בנפרד על ידי כלים microfluidic אפשרה מחקרים לטווח קצר וארוך שיטתיים על מאפייני תא בודד ותגובה. בנוסף, אנקפסולציה של תאים בmicrodroplets תדירות גבוהה, שנוצר על שבב אלקטרוני, אפשרה מחקרי הפרשת תא בודדים, שלא ניתן לבצע עם מכשירי cytometry קונבנציונליים. גישת microdroplet, לעומת זאת, יש כמה מגבלות, כאשר שלבי דגירה ושטיפה נדרשים לפרוטוקול אנליטית. הגישה שלנו משלבת את שני המושגים של השמנה תא ובידוד, ולכן, זה מקל על ביצוע מבחני מורכבים יותר, כולל immunoassays מבוססת על נוגדנים משותקי פני השטח. בנוסף, השיטה היא מאוד גמישה ביחס לanalytes היישום והיעד.

העיצוב של השבב מאפשר אפי (i)ההשמנה cient תא, (ii) אספקת מאגרים וחומרים כימיים שונים, וכן (iii) בידוד אמין בנפח קטן מאוד בעת צורך. בדרך זו הדילול של מולקולות המטרה הוא להימנע מכך. שישים (מאות) של microchambers ממוקמים על אחת מכשיר אחד המאפשר ניסויים רבים במקביל. השסתומים בצורה עגולות סגירת microchambers ניתן לטפל ביחד או בנפרד על ידי שורות או עמודות, וזה חשוב כאשר הזיהום צולב לתאי סמוכים יש למנוע. עם microchambers סגור, ניתן לטפל בערוצים עם פתרונות מזיקים כגון חומצה הידרוכלורית לניקוי מטרות מבלי להשפיע על התאים הלכודים. מצד השני, החלפה מהירה של הנפח בתוך microchamber אפשרית. נכון לעכשיו יש צורך בזמן מינימאלי של 200 אלפיות שניים כדי לפתוח באופן מלא את החדר ולהציג את חומרים כימיים חדשים (לחילופי microchamber הנפח מלאים, קצב הזרימה צריכה להיחשב).

בעוד שהשיטה שלנו היא מאוד reliable ושחזור, אחד צריך לזכור שיש שתי נקודות קריטיות עיקריות בפרוטוקול של ייצור שבבים ותפעול. ראשית, המליטה של ​​שתי שכבות השבב לאחר הפעלת פלזמה צריכה להיעשות במהירות. היישור הוא קריטי, אחרת חלק מהתאים או אפילו את כל השבב הוא לא שמיש, שכן המליטה היא בלתי הפיכה. צעד זה יכול להיות קשה עבור משתמשים לא מנוסים, לעומת זאת, אחרי כמה אימונים אפילו פחות מנוסה עובדי מעבדה להשיג תוצאות טובות בדרך כלל. הנקודה הקריטית השנייה היא הניקיון במהלך הרכבה ושימוש בשבב האלקטרוני. אם חלקיקי אבק נמצאים על פני השטח של השבב, הם יכולים להתפשר ערוצי בקרה וסתומה או אפילו להוביל לשבירת PDMS-PDMS או אג"ח PDMS זכוכית. לפיכך, אנו מבלים הרבה תשומת לב לתהליכי ניקוי. יש לציין כי מלבד ייצור הטופס השני (שבוצע בחדר נקי), אנחנו מייצרים ומשתמשים בשבבים בסביבת מעבדה רגילה, שבו אבקnd חלקיקים הם הווה.

למרות כל הטיפול, אם התאים לא סוגרים בצורה נכונה, זה יכול להיות ששני קווי לחץ חסומים או תהליך ציפוי ספין לא ספק את עובי הקרום הנכון. כמו כן, מהעת לעת שצפינו מליטה לא מספיק, וכתוצאה מהשבירה של הקשר בין שתי שכבות PDMS. אם שבבים רבים מאותה אצווה מראים את הבעיה הזו, זה אפשרי, כי הזמן בין הפעלת פלזמה ויישור הוא ארוך מדי. לפעמים, אנחנו חווים PDMS הדביק על הוופלים שלא ניתן להסירו כראוי והיה תוצאה של silanization מספיק של פרוסות סיליקון.

ברגע ששיטת הייצור הוא הקים, פלטפורמת microfluidic יכולה לשמש למחקרים רבים ושונים ברמת התא הבודד. כאן, אנו הראיתי זיהוי של סוכנים תאיים ומופרשים עם מבחני שונים, אך רבים מבחני אחרים אפשריים על גבי השבב. רוב החלבונים אינם ניאון ודהtection באמצעות immunoassays הוא לא פשוט. יישום ELISA לתוך השבב יביא תועלת רבות. ראשית, assay יכול להיות מתוכנן באופן ספציפי מאוד לחלבון הרצוי (כאשר הנוגדנים מתאימים נוכחים). שנית, מידע מELISA ניתן לכמת גם בגבולות ריכוז נמוכים, נותן את מספר העותקים של חלבון או מולקולה הנמצאים בתא.

השבב הנוכחי שלנו מיועד לניתוח של תאי יונקים יחיד. עם זאת, שינוי של השבבים לתאים אחרים, כגון חיידקים, אצות ושמרים, צריך להיות אפשרי. עד עכשיו, המגבלה היחידה לניסויים היא הצורך של assay המבוסס על הקרינה. עם זאת, אנחנו כרגע לומדים את היישום של ספקטרומטריית מסה כטכניקת זיהוי. ברגע שזה נקבע, בטווח של בעיות אנליטיות שיכול להיחקר עם הפלטפורמה יהיה אפילו רחב יותר. יתר על כן, מאחר שלא כל ניתוח אפשרי בנוכחות מאגרי תמוגה תא, אנחנוכיום גם הערכת טכניקות תמוגה שונות אחרות על הרציף. אנו בטוחים כי פלטפורמת microfluidic צדדי המוצגת כאן מספקת בסיס למחקרי תא הבודד חדשים על proteome, metabolome וsecretome רמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים בתודה טום רובינסון לקריאה הוכחה של כתב היד, ג Bärtschi וה 'בנץ להקמת מערכת בקרת לחץ שהותקן. אנחנו רוצים גם להכיר בשימוש במתקן חדר הנקי הראשון ומרכז האור מיקרוסקופית (LMC), שניהם במכון הטכנולוגי של ציריך. העבודה מומנה על ידי חברת מרק סרונו והמועצה האירופית למחקר (ERC) תחת תכנית המסגרת ה -7 (ERC החל גרנט, פרויקט לא. 203,428, nμLIPIDs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

Tags

אימונולוגיה גיליון 80 מיקרופלואידיקה פרוטאומיקה ביולוגיה של מערכות ניתוח תא בודד Immunoassays מעבדה על שבב אנליזה כימית
שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S.,… More

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter