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Bioengineering

एकल कक्षों के बहुमुखी रासायनिक विश्लेषण के लिए एक microfluidic चिप

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

इस लेख में हम एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एक microfluidic चिप प्रस्तुत करते हैं. यह अनुमति देता है intracellular प्रोटीन, एंजाइमों, cofactors, और फ्लोरोसेंट assays या immunoassays के माध्यम से दूसरे दूतों की मात्रा का ठहराव.

Abstract

हम समानांतर में एकाधिक एकल कक्षों में intracellular biomolecules के मात्रात्मक निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है कि एक microfluidic युक्ति उपस्थित थे. इस प्रयोजन के लिए, कोशिकाओं निष्क्रिय एक microchamber के बीच में फंस रहे हैं. नियंत्रण परत की सक्रियता पर, सेल एक छोटे से कक्ष में आसपास मात्रा से अलग है. आसपास मात्रा तो अलग सेल को प्रभावित किए बिना विमर्श किया जा सकता है. हालांकि, चैंबर के कम उद्घाटन और समापन पर, कक्ष में समाधान कुछ सौ मिसे के भीतर बदला जा सकता है. कारण कक्षों के उलटने के लिए, कोशिकाओं ऊष्मायन, कपड़े धोने, और अंत में, सेल के लिए उदाहरण के लिए एक अत्यधिक चलाया फैशन में अलग अलग समाधान क्रमिक रूप से उजागर करने के लिए किया जा सकता है. कसकर बंद microchambers, lysate के प्रतिधारण सक्षम कम करने और सेल के बाद कमजोर पड़ने नियंत्रित करते हैं. सेल और विश्लेषण को एक ही स्थान पर होते हैं के बाद से, उच्च संवेदनशीलता को बनाए रखा है और आगे नहीं घ क्योंकिanalytes की ilution या नुकसान परिवहन के दौरान होता है. microchamber डिजाइन इसलिए व्यक्ति की कोशिकाओं से जारी intracellular अणुओं (attomoles, zeptomoles) के बहुत छोटे प्रतिलिपि संख्या के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण में सक्षम बनाता है. इसके अलावा, कई microchambers उपयुक्त ऑप्टिकल उपकरण निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है, यह देखते हुए एक बार में कई कोशिकाओं का विश्लेषण की अनुमति, एक सरणी स्वरूप में व्यवस्थित किया जा सकता है. हम पहले से ही intracellular प्रोटीन, एंजाइमों, cofactors और सापेक्ष या निरपेक्ष या तो quantifiable तरीके से दूसरे दूतों का विश्लेषण करने के लिए सबूत की अवधारणा अध्ययन के लिए मंच का इस्तेमाल किया है.

Introduction

अतीत में कई अध्ययनों सेल करने वाली सेल एक बड़ी सेल आबादी 1-3 भीतर मतभेद, विशेष रूप से संकेत दे 4 प्रक्रियाओं, या इस तरह के प्रोटीन 5,6, मेटाबोलाइट्स, और cofactors 7,8 रूप में intracellular biomolecules की मात्रा का पता चला है. इन विषमताओं के सेल अनुकूलन और विकास 9 के लिए मूल रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, लेकिन यह भी इस तरह के कैंसर के 10-13 जैसे रोगों के उद्भव और उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा माना जाता है. इसलिए, एकल कोशिका स्तर पर अध्ययन के लिए इन अध्ययनों bioactive रासायनिक पदार्थों के साथ उपचार के बाद अलग सेल प्रतिक्रिया प्रकट करते हैं, खासकर यदि जैविक और औषधीय अनुसंधान के क्षेत्र में उच्च ब्याज की हैं.

हाल के वर्षों में, कई विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों एकल जीवित कोशिकाओं का विश्लेषण या सेल सामग्री की रासायनिक संरचना की सुविधा है कि विकसित किया गया है. छँटाई फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल (FACS) सोना सेंट हैandard एकल जीवित कोशिकाओं की बहुत उच्च throughput विश्लेषण के लिए, विधि intracellular या स्रावित यौगिकों की मात्रा का ठहराव के लिए नियोजित नहीं किया जा सकता. microfluidic प्लेटफार्मों के उद्भव स्थिति, इलाज और एकल कक्षों का अवलोकन के लिए उपन्यास विश्लेषणात्मक रणनीतियों का वादा किया है. Microfluidics में एक मील का पत्थर भूकंप और सहकर्मियों 14,15 द्वारा एहसास लचीला PDMS वाल्व के एकीकरण के साथ पहुँच गया था. वे चिप पर क्षेत्रों को अलग कर सकते हैं क्योंकि ये वाल्व उपयोगी होते हैं, जैसे दो संस्कृतियों अलग 16. इसके अलावा, वे एकल कोशिका विश्लेषण के लिए विशेष रूप से लागू कर रहे हैं और इसलिए analyte कमजोर पड़ने की समस्याओं को कम करने में मदद. एकल कोशिका विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण की शक्ति हाल ही में हैनसेन और समानांतर 17 में एकल कक्षों के सैकड़ों से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण किया जो सहकर्मियों द्वारा प्रदर्शन किया गया है.

प्रोटीन और मेटाबोलाइट्स को लक्ष्य करते समय विश्लेषण के कारण उपयुक्त एक की कमी के कारण बहुत मुश्किल हैmplification तरीकों, विभिन्न मौजूद यौगिकों, और रासायनिक प्रकृति में उनकी विविधताओं के बड़ी संख्या में. इसके अलावा, सबसे intracellular biomolecules कुछ दस हजार 18 के क्रम में कम प्रतिलिपि संख्या में उपस्थित होने की उम्मीद कर रहे हैं, इसलिए इस्तेमाल किया विश्लेषणात्मक विधि एक उच्च संवेदनशीलता होनी चाहिए. ऐसे immunoassays और एंजाइम से जुड़ी immunoassays (एलिसा) के रूप में और अधिक शक्तिशाली assays वे कई धोने और ऊष्मायन कदम के साथ ही सतह स्थिरीकरण की आवश्यकता के बाद से microfluidic उपकरणों में एकीकृत करने के लिए मुश्किल हैं.

कारण इन चुनौतियों के लिए, यह प्रोटीन या मेटाबोलाइट्स एकल कोशिका स्तर पर मात्रा निर्धारित किया गया है, जहां केवल कुछ उदाहरण सूचित किया गया है कि आश्चर्य की बात नहीं है. उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट यौगिकों के स्राव पर पढ़ाई 19,20 सूचित किया गया है. हाल ही में, एलिसा के साथ कार्यान्वयन एक सेल संस्कृति से स्रावित (nonfluorescent) प्रोटीन (THP-1 कोशिकाओं) 21 और एकल (मैं के विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया गया थाmmune सेल) 10. Intracellular प्रोटीन का लक्ष्य शि एट अल. एक immunoassay 11 के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं में संकेत दे रास्ते के विश्लेषण के लिए intracellular प्रोटीन की पहचान में मदद की है कि एक microfluidic डिवाइस विकसित की है. हालांकि, प्रोटीन के ही रिश्तेदार मात्रा निर्धारित किया गया है और कोई enzymatic प्रवर्धन कम बहुतायत प्रोटीन के लिए संकेत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

हाल ही में, हम प्रतिदीप्ति assays 8 और immunoassays 22 के साथ एक एकल कक्ष फँसाने microdevice (चित्रा 1) गठबंधन करने में सक्षम थे. कोशिकाओं निष्क्रिय आपूर्ति और कोशिकाओं के किसी भी आंदोलन के बिना मध्यम और अन्य रासायनिक एजेंटों की (तेजी) के विनिमय की अनुमति जो microsized बाधा संरचनाओं में फंस रहे हैं. प्रत्येक जाल चारों ओर एक अंगूठी के आकार का वाल्व एक बहुत छोटी मात्रा ("microchamber") में सेल के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. यह वाल्व तुरंत वह एक सेल lysing (hypoosmolar) बफर शुरू करने के बाद actuated हैnce दूर फैलाना intracellular अणुओं या स्रावित अणुओं को रोकने. सबसे महत्वपूर्ण बात, देय मात्रा (625 पी एल) के छोटे आकार के अणुओं की बड़ी कमजोर पड़ने से बचा है. सेल और विश्लेषण चिप में एक ही स्थिति में में प्रदर्शन कर रहे हैं, क्योंकि इसके अलावा, परिवहन के कारण analytes का कोई नुकसान नहीं है. यहाँ वर्णित चिप डिजाइन 60 microchambers कुल 7 या 8 या तो microchambers के 8 बारी पंक्तियाँ शामिल हैं. एक रेखा के साथ पार संदूषण रोका जाता है ताकि कक्षों, पंक्तियों में actuated हैं.

मंच प्रतिदीप्ति assays के साथ ही प्रतिरक्षा assays (चित्रा -1) के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है. बाद के लिए, हम चिप उत्पादन और विधानसभा की प्रक्रिया के साथ संगत कर रहे हैं जो एंटीबॉडी के स्थिरीकरण के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की. इसलिए मंच एकल कोशिका के स्तर पर, संवेदनशील विश्वसनीय और quantifiable assays के लिए रास्ता खुल जाता है. अब तक, हम मैं के विश्लेषण के लिए डिवाइस का इस्तेमाल किया हैntracellular और स्रावित एंजाइमों (enzymatic assays के द्वारा रिश्तेदार मात्रा का ठहराव), intracellular cofactors, प्रोटीन और छोटे अणुओं (endpoint assays या एलिसा द्वारा पूर्ण मात्रा का ठहराव). बाद में, हम microcontact मुद्रण और सतह के रसायन शास्त्र के माध्यम से बहुपरत नरम लिथोग्राफी और एंटीबॉडी के patterning के लिए प्रोटोकॉल के माध्यम से चिप निर्माण की प्रक्रिया का वर्णन. इसके अतिरिक्त, चिप का उपयोग और संचालन के कुछ उदाहरण दिए गए हैं.

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Protocol

1. SU-8 मास्टर निर्माण

निम्नलिखित प्रोटोकॉल के साथ, लेकिन अलग मुखौटा पैटर्न के साथ (schematics और आयाम देखें चित्र 2 के लिए, fluidic और नियंत्रण) चैनलों के लिए दोनों मास्टर molds तैयार करें. प्रक्रिया चित्रा 3 ए में दिखाया गया है.

  1. 180 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर हीटिंग द्वारा प्रारंभ एक स्पिन coater पर निर्जलित वेफर लोड और स्पिन कोटिंग SU-8 2015 के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करें:
    1. (वितरण के बाद यह कदम, बंद ढक्कन दौरान SU-8 बांटना, स्पिन coater के खुले ढक्कन) 20 सेकंड के लिए 100 rpm पर वेफर स्पिन.
    2. 10 सेकंड के लिए 500 rpm पर स्पिन वेफर (इस पूरे वेफर अधिक विरोध फैल जाएगा).
    3. 30 सेकंड के लिए 1750 rpm पर स्पिन वेफर (20 माइक्रोन के लिए विरोध की ऊंचाई को परिभाषित करता है).
  2. इस अन्यथा अगले कदम में hotplate रहना होगा के रूप में एसीटोन (एक झाड़ू का उपयोग) के साथ वेफर के किनारे से विरोध निकालें. आह को वेफर स्थानांतरण4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और गर्मी में otplate. Softbake के बाद, (365 एनएम पर मापा 150 MJ / 2 सेमी,) पराबैंगनी प्रकाश के साथ एक मुखौटा aligner में कांच sodalime को टेप एक photomask के माध्यम से विरोध बेनकाब.
  3. प्रदर्शन के बाद, एक hotplate पर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर फिर वेफर गर्मी. आर टी के लिए वेफर नीचे और फिर शांत 4 मिनट के लिए SU-8 डेवलपर के एक स्नान में विसर्जित कर दिया. Unexposed SU-8 को दूर करने के लिए धीरे से मिलाने. साफ कमरे ग्रेड isopropanol मे से धो लें और नाइट्रोजन के साथ सूखी झटका. विकास (विशेष रूप से सेल जाल) सफल रहा था अगर एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें. सेल जाल पूरी तरह से विकसित कर रहे हैं, सिलिकॉन वेफर का प्रतिबिंब दिखाई जानी चाहिए. यदि आवश्यक हो, कुछ मिनट के लिए फिर वेफर का विकास.
  4. सभी अवशिष्ट विलायक दूर करने के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक ओवन में वेफर सेंकना. एक कदम प्रोफाइलर साथ चैनलों की ऊंचाई की जाँच करें. ऊंचाई वांछित ऊंचाई से अलग है, तो इस प्रोटोकॉल एक नई वेफर के साथ 1.1 कदम पर शुरू दोहराने औरस्पिन गति (चरण 1.1.3) बदल जाते हैं. 1H, 1h, 2H, रात भर एक desiccator में 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane साथ वेफर silanizing द्वारा मास्टर मोल्ड के निर्माण को अंतिम रूप.

2. Microcontact मुद्रण के लिए मास्टर निर्माण

  1. Microcontact मुद्रण के लिए मास्टर नए नए साँचे को तैयार करने के लिए, 180 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक सिलिकॉन वेफर निर्जलीकरण (विरोध एक silanized सतह के लिए बेहतर पालन करता है) 30 सेकंड के लिए 7500 rpm पर इस वेफर पर 1 मिलीलीटर HDMS कोट स्पिन. AZ1518 के स्पिन कोट 2 मिलीलीटर सकारात्मक इस प्रोटोकॉल के साथ विरोध:
    1. के स्टेटिक बग़ैर वेफर करने पर विरोध.
    2. 500 rpm पर 5 सेकंड के लिए वेफर स्पिन.
    3. 4000 rpm पर 60 सेकंड के लिए वेफर स्पिन.
  2. एक hotplate पर 100 डिग्री सेल्सियस पर एक 50 सेकंड softbake के बाद बेनकाब एक photomask के माध्यम से और एक मुखौटा aligner पर यूवी प्रकाश (365 एनएम पर 21 MJ / 2 सेमी) करने का विरोध. 75 सेकंड के लिए AZ 726 के एक स्नान में विरोध का विकास करना. डि पानी और झटका डी के साथ विकसित वेफर कुल्लानाइट्रोजन के साथ ry. 50 सेकंड के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर वेफर हीटिंग द्वारा अवशिष्ट विलायक निकालें. रात भर वैक्यूम के अंतर्गत वेफर Silanize.

3. Microfluidic चिप का निर्माण

एक दो परत डिवाइस डिजाइन इन प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है. चिप अंत में एक गिलास स्लाइड (चित्रा 3 बी) पर बंधुआ है पहले दो परतों, अलग से तैयार कर रहे हैं और एक साथ बंधुआ रहे हैं. यह कदम PDMS परतों के उत्पादन और microcontact मुद्रण के लिए PDMS स्टांप का वर्णन करता है.

  1. एक 10:1 PDMS के मिश्रण और इलाज एजेंट तैयार करें. कुल में लगभग 80 ग्राम PDMS तैयार (हमारे डिजाइन का उपयोग कर, यह 10 चिप्स में परिणाम होगा). मिश्रण मुक्त बुलबुला (~ 30 मिनट) है जब तक सख्ती और देगास दोनों भागों PDMS मिश्रण.
  2. तल पर एक पेट्री डिश और टेप यह अंदर नियंत्रण परत के साथ वेफर रखें. अगला, शीर्ष पर PDMS की ~ 50 ग्राम डालना और पूर्ण आश्वस्त करने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में कम से कम 2 घंटे के लिए वेफर डालPDMS के इलाज. ~ 20 ग्राम PDMS की जरूरत है इसके लिए microcontact मुद्रण वेफर के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ.
  3. स्पिन कोट वफ़र पर PDMS 2,000 आरपीएम की घूर्णी गति पर fluidic परत के साथ एक लगभग 40 माइक्रोन उच्च PDMS परत के रूप में. 80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए एक ओवन में PDMS इलाज
  4. दोनों भागों ठीक हो रहे हैं, वेफर से नियंत्रण परत को हटाने और एक रेजर ब्लेड के साथ टुकड़ों में काट लें. एक 1 मिमी बायोप्सी छेदने का उपयोग करके दबाव कनेक्शन छेद पंच. भंडारण के लिए, यह चैनलों पर टेप का एक टुकड़ा डाल करने के लिए सलाह दी जाती है.
  5. दो परतों बंधन को, स्पिन में लिपटे वेफर और शीर्ष भाग लेने के लिए और एक प्लाज्मा क्लीनर 23 में उन्हें जगह है. प्लाज्मा उपचार के बाद, जल्दी से बड़े काम की दूरी के साथ एक खुर्दबीन के नीचे दोनों भागों संरेखित. रखा शीर्ष भागों के आसपास कुछ अतिरिक्त PDMS जोड़ें. यह कदम हालांकि यह वेफर से PDMS को हटाने की सुविधा, अनिवार्य नहीं है. कम से कम 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में वेफर रखें.
  6. ध्यान से वेफर से PDMS को दूर करने और माइक्रोचिप्स में कटौती करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें. एक 1.5 मिमी बायोप्सी शस्र साथ fluidic कनेक्शन के लिए पहुँच छेद पंच.
  7. PDMS चिप अब समाप्त हो गया है और महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. वैकल्पिक: चिप एक जलाशय के साथ प्रयोग किया जाता है, तो एक 200 μl विंदुक टिप के ऊपरी हिस्से में कटौती और शीर्ष पर यह गोंद के लिए कुछ अतिरिक्त, अर्द्ध ठीक PDMS का उपयोग करें. कम से कम 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर फिर ओवन में चिप डाल दिया.

4. कांच स्लाइड के बंध

प्रत्यक्ष enzymatic assays के लिए उपकरण का उपयोग करने के लिए, संबंध के बाद आवश्यक ही कदम सतहों के अवरुद्ध है. इस प्रोटोकॉल के लिए, immunoassays या ELISAs लिए microfluidic चिप का उपयोग करने के लिए, लेकिन ए के लिए आगे बढ़ना है, केवल (यानी TIRF माइक्रोस्कोपी या SPR के लिए) गिलास स्लाइड पर बाध्यकारी साइटों को प्रतिबंधित करने के लिए प्रोटोकॉल बी को देखें. इस प्रतिबंध महत्वपूर्ण नहीं है, एक का उल्लेख है, लेकिन 4.3 चरण में biotinylated conjugates का उपयोग करें और कदम 4.8 के साथ जारीप्रोटोकॉल बी में एक पूरी तरह कार्यात्मक सतह बनाने के लिए.

पिछले प्रोटोकॉल ए और बी प्रदर्शन करने के लिए: यह पिछले चिप में उन्हें शुरू करने के लिए खेतों में प्रोटीन समाधान के लिए सभी को फिल्टर करने के लिए सलाह दी जाती है. मलबे और प्रोटीन समुच्चय अन्यथा जिससे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कक्षों की संख्या को कम करने, सेल जाल ब्लॉक कर सकते हैं. इस प्रयोजन के लिए चैनलों में उन्हें शुरू करने से पहले सभी समाधान फिल्टर करने के लिए एक nonprotein adsorbing फिल्टर यूनिट का उपयोग करें.

प्रोटोकॉल (enzymatic assays)

  1. Microfluidic डिवाइस को अंतिम रूप देने के लिए, एक गिलास स्लाइड पर PDMS भागों बांड. ऐसा करने के लिए, पहले साबुन, आसुत जल और इथेनॉल के साथ एक गिलास स्लाइड साफ. एक नाइट्रोजन धारा का उपयोग कर स्लाइड सूखी. स्कॉच टेप के साथ PDMS हिस्सा साफ करें.
  2. एक तंग संबंध आश्वस्त करने के लिए 18 व 45 सेकंड के लिए प्लाज्मा क्लीनर में PDMS हिस्सा और साफ कांच स्लाइड रखो, 5 मिनट के लिए एक गर्म प्लेट (100 डिग्री सेल्सियस) पर चिप डाल दिया.
  3. संबंध के बाद, च के साथ चिप भरनेluids. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए एक आसान तरीका है केन्द्रापसारक बल का उपयोग करने के लिए है. 200 μl विंदुक टिप के निचले हिस्से में कटौती. Fluidic चैनलों के लिए, अवरुद्ध समाधान के साथ उन्हें भरने (गोजातीय सीरम albumin (4% w / v) या पाली एल lysine) grafted पॉलीथीन ग्लाइकॉल (0.05% w / v) और inlets में सुझावों जगह है. पानी के साथ या तो या एक isosmotic समाधान, जैसे पीबीएस के साथ नियंत्रण परत inlets भरें. 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र (800 XG) में चिप रखें. चैनल अब पूरी तरह से तरल पदार्थ से भरा जाना चाहिए. यदि नहीं, तो इस चरण को दोहराएँ.
  4. कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान सेते हैं. एक सिरिंज पंप का उपयोग कर 10 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर पीबीएस के साथ तरल पदार्थ की परत के बाहर समाधान धो लें. युक्ति अब सेल प्रयोगों के लिए तैयार है.

प्रोटोकॉल बी (immunoassays)

बाद कदम 4.7 से सतह संशोधन की एक पूरी अवलोकन के लिए, 1 टेबल देखें.

  1. मेंएक bBSA / बीएसए समाधान (जैसे 1-100) के साथ microcontact मुद्रण के लिए cubate टिकटों PDMS. 30 मिनट के बाद, आसुत जल के साथ अच्छी तरह से टिकटों को साफ और नाइट्रोजन की एक धारा के तहत स्टांप सूखी. जल्दी से एक साफ ग्लास स्लाइड (चित्रा 4) पर टिकटों जगह है.
  2. एक साथ एक प्लाज्मा क्लीनर में अधिकतम शक्ति (18 डब्ल्यू) में 45 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा को microfluidic चिप के शीर्ष भाग के साथ टिकट के साथ कांच स्लाइड बेनकाब. प्लाज्मा उपचार के बाद, दुनिया भर के टिकट हटाने और डिवाइस के microchambers नीचे मुद्रित सतह संरेखित. 50 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर 30 मिनट के लिए चिप रखें
  3. शेष सतह को ब्लॉक करने के लिए, एक अपकेंद्रित्र साथ चिप में बाँझ फ़िल्टर बीएसए समाधान (4% (w / v) पीबीएस में) (4.2 कदम देखें) परिचय. 1 घंटे के लिए सेते हैं और पीबीएस के साथ तरल पदार्थ परत (4.3 चरण देखें) से बाहर समाधान धो लो. चिप तो एक नम बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर सीधे इस्तेमाल किया या करने के लिए 2 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  4. एक पूरी तरह कार्यात्मक बंधन surfac के लिएई, जलाशय में avidin (0.025% (w / v) पीबीएस में) परिचय. द्रव चैनलों के माध्यम से avidin समाधान वापस लेने के लिए 30 मिनट के लिए 5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर का प्रयोग करें. बाद में, 10 मिनट के लिए पीबीएस फ्लश. अच्छी तरह से जलाशय कुल्ला.
  5. बाद में, प्रोटीन जी (0.0025% (w / v) पीबीएस में) और एक और 30 मिनट के लिए फ्लश जोड़ें. बाद में एक और 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धोएं. इसके बाद, 10 मिनट के लिए ब्याज की प्रतिरक्षी (0.0001% (w / v) पीबीएस में) जोड़ें. 10 मिनट के बाद, बंधन अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए प्रवाह को रोकने के. इसके बाद, 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धो लो.

5. सेल प्रयोगों

प्रोटोकॉल क्योंकि संभव assays के विभिन्न प्रकार के सामान्य शब्दों में लिखा है. एक उदाहरण के रूप G6PDH विषाक्तता परख के लिए आवश्यक अभिकर्मकों दिया जाता है. डिवाइस की प्रारंभिक सेल फँसाने दक्षता यानी 200 कोशिकाओं के बाहर 5 फंस जाएगा, लगभग 2.5% है. सेल जाल के अंतिम अधिभोग दृढ़ता से इस्तेमाल किया सेल लाइन, निलंबित करने के लिए प्रोटोकॉल पर निर्भर करता हैसेल लाइन और समय कोशिकाओं चैनल के माध्यम से प्लावित कर रहे हैं. स्वाभाविक रूप से (जैसे U937 के रूप में) निलंबन में बढ़ कोशिकाओं के लिए, एकल कक्षों के कुछ ही मिनट के बाद कक्षों के बारे में 75% में पाया जा सकता है. अन्य कक्षों या तो भरा है, या दो या अधिक कोशिकाओं के कब्जे में नहीं कर रहे हैं. सामान्य में, एकल कोशिका अधिभोग पक्षपाती सेल लाइनों के लिए छोटा है. यहाँ प्रस्तुत बल्कि हल्के निलंबित प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, प्रतिशतता (HEK एल टी कोशिकाओं) के बारे में 30% तक कम हो जाती है. एकल कक्ष अधिभोग कोशिकाओं की trypsin उपचार द्वारा सुधार किया जा सकता है, लेकिन यह भी प्रयोगों के परिणामों को बदल सकता है.

लक्ष्य अणु पर निर्भर करता है, PDMS को सोखना या अवशोषण के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. सोखना बीएसए या पीएलएल-G-खूंटी के साथ सतहों को अवरुद्ध करके कम किया जा सकता है. अवशोषण सबसे हाइड्रोफिलिक biomolecules के लिए संभावना नहीं है, लेकिन यह (छोटे) lipophilic सेल घटकों के लिए जाँच की जानी चाहिए.

  1. विशिष्ट प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं को तैयार है (उदाहरण के लिए
  2. एक सिरिंज पंप और आगे प्रवाह का उपयोग कर चिप पर कोशिकाओं लोड, बजाय सेल निलंबन वापस लेने के लिए. चैनल दीवारों पर कोशिकाओं की अविशिष्ट लगाव को कम करने के बाद से चिपकने वाला कोशिकाओं के लिए निलंबन सेल लाइनों और 10-20 μl / मिनट की उच्च प्रवाह दरों के लिए 5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर का प्रयोग करें.
  3. जाल भर रहे हैं, मंडलों को बंद करें. कई कोशिकाओं की सतह के लिए nonspecifically पालन करना है, तो 10-30 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर सेल हदबंदी बफर के साथ उन्हें दूर धोने के लिए प्रयास करें.

प्रोटोकॉल (enzymatic assays)

  1. चिप के माध्यम से lysis बफर वापस ले लें. इस उदाहरण के लिए, इस बफर गयी बीच 20 (10 मिमी Tris-एचसीएल, 10 के साथ एक hypoosmolar बफर हैमिमी KCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 1% (v / v) के बीच 20). सेल के लिए, जल्दी से खुला और करीब कक्षों (यानी 10-50 μl / मिनट 7,21 के प्रवाह की दर के लिए 500 मिसे). G6PDH परख के लिए, 2 मिमी ग्लूकोज 6 फॉस्फेट, 0.5 मिमी NADP, 0.5 यू / मिलीलीटर diaphorase और lysis बफर करने resazurin 0.3 मिमी जोड़ें. तुरंत सेल के बाद गतिज प्रतिक्रिया निगरानी शुरू.

नोट: परख के लिए उपयुक्त है जो किसी भी बफर चुनें, (ट्राइटन, एसडीएस) की तरह मजबूत डिटर्जेंट lyse कोशिकाओं तुरंत और कक्ष खोलने के दौरान analyte की हानि करने के लिए नेतृत्व करेंगे कि मन में हालांकि नंगे.

प्रोटोकॉल बी (immunoassays)

एलिसा सेल प्रयोगों (प्रवाह दरों, चैम्बर स्थिति, आदि) का एक संक्षिप्त विवरण के लिए, 1 टेबल देखें.

  1. एलिसा के लिए, सीधे lysis बफर करने के लिए आवश्यक पता लगाने अभिकर्मक (जैसे माध्यमिक एंटीबॉडी, लेबल प्रतिजन) जोड़ें. इस के साथ साथ Twee गयीN 20 अविशिष्ट सोखना कम कर देता है. 5.4 कदम के अनुसार lyse कोशिकाओं. (प्रयुक्त प्रतिजन और एंटीबॉडी के आधार पर ऊष्मायन समय) बाध्यकारी अनुमति देने के लिए 10-15 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं.
  2. चैनल दीवारों को nonspecifically adsorbed कि एंटीबॉडी एंजाइम conjugates पहले से ही जलाशय और चैनलों के अंदर का पता लगाने अभिकर्मक के एक रूपांतरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. , इस सोखना से मुद्दों को कम (पता लगाने अभिकर्मक जोड़ने से पहले, कक्षों बंद) ऊष्मायन समय के दौरान चिप के माध्यम से इस्तेमाल किया पता लगाने एंजाइम की एक स्थायी अवरोध करनेवाला फ्लश करने के लिए. एचआरपी के लिए, स्थायी रूप से nonspecifically adsorbed एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए पानी में 20 मिमी एचसीएल का उपयोग करें.
  3. ऊष्मायन समय के बाद, चिप को पता लगाने अभिकर्मक (जैसे Amplex लाल और एचआरपी के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड) परिचय. दूर nonbound माध्यमिक एंटीबॉडी धोने के लिए शीघ्र ही फिर से कक्षों खुला और पता लगाने अभिकर्मक जोड़ने के लिए. तुरंत गतिज प्रतिक्रिया निगरानी शुरू.
  4. कैलिब्रेशन: स्थिरब्याज के लक्ष्य के विरुद्ध एंटीबॉडी. बंद कोठरियों. बफर में बंद या चिप सेल lysate में analyte के विभिन्न सांद्रता तैयार करें. चिप को एक एकाग्रता लागू करें और जल्दी कक्षों (समय खोलने 500 मिसे) के अंदर मात्रा का आदान प्रदान. इस उद्घाटन के समय कोई अतिरिक्त संचय analyte निस्तब्धता से होता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से कम है, और microchamber की मात्रा से अणुओं की केवल एक विशिष्ट संख्या का पता लगाया जाता है. समाधान के अंदर प्रतिजन के ज्ञात एकाग्रता और कक्ष की मात्रा (625 पी एल) से, चैम्बर के अंदर राशि की गणना. बाद में, कदम 5.5 के साथ जारी है और पता लगाने आधा भाग परिचय.

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Representative Results

हमारे मंच में उपस्थित या एकल कोशिकाओं द्वारा निर्मित एक intracellular की विविधता के रूप में अच्छी तरह से स्रावित अणुओं का विश्लेषण करने में सक्षम है. यहाँ, हम संभव assays की विविधता को रेखांकित करने के लिए विभिन्न उदाहरण पढ़ाई पेश करना चाहते हैं. हम एक secreted एंजाइम (चित्रा 5A) के साथ ही एक intracellular एंजाइम (चित्रा 5 ब) और प्रोटीन (आंकड़े 5C और डी) के लिए एक उदाहरण दे देंगे. ऐसे cofactors या छोटे अणुओं के रूप में और अधिक उदाहरण के लिए, Eyer एट अल. Eyer एट अल (2012) का उल्लेख है और कृपया. (2013).

सबसे पहले, हम एक secreted एंजाइम (चित्रा 5A) के लिए एक परख उपस्थित थे. Phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) के साथ सक्रियण पर, मानव monocytes लाइसोजाइम का स्राव, बैक्टीरियल सेल लाती है कि एक एंजाइम को प्रेरित. इस परख के लिए, सेल बफर 4-Methylumbelliferyl β-डी.एन., n 'diacetylchitobioside, lysoz के लिए एक कमजोर फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट शामिलyme. एंजाइम द्वारा चीनी अवशेषों की दरार पर, फ्लोरोफोरे मुक्त है और सदन के अंदर पाया जा सकता है. इधर, microchamber का लाभ एक कम समय अवधि के भीतर कम एंजाइम सांद्रता का पता लगाने की अनुमति, secreted एंजाइम का छोटा कमजोर पड़ने है. चित्रा 5A में, कई उदाहरण घटता ही उत्तेजित U937 कोशिकाओं से स्रावित लाइसोजाइम के enzymatic कारोबार का प्रतिनिधित्व दिखाए जाते हैं. U937 सेल लाइन histiocytic लिंफोमा के साथ एक रोगी से निकला है, और टर्मिनल monocytic भेदभाव करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है. सेल लाइन पीएमए के साथ उत्तेजना के बाद TNFα, लाइसोजाइम और β2-माइक्रोग्लोब्युलिन पैदा करता है. कोई कारोबार खुला कक्षों या सेल मुक्त कक्षों (धराशायी लाइन) में detectable है.

चित्रा 5 ब एक intracellular एंजाइम, यहां ग्लूकोज 6 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (G6PDH) के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव से पता चलता है. G6PDH एक ही ऊतक मूल से एक हाउसकीपिंग प्रोटीन और कोशिकाओं है नहीं करना चाहिए उनके G6PDH एकाग्रता 24 में काफी हद तक बदलती हैं. इधर, U937 कोशिकाओं कक्ष में फंस गए थे, और हम lysis बफर के साथ एक साथ G6PDH का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति परख की आपूर्ति की. यह ग्लूकोज 6 फॉस्फेट, NADPH, एंजाइम diaphorase और G6PDH मौजूद है जब फ्लोरोसेंट resorufin में बदल जाती है जो सब्सट्रेट resazurin, के होते हैं. समय के साथ प्रतिदीप्ति में वृद्धि की दर G6PDH की राशि से मेल खाती है. माइक्रोचिप आगे एक निर्धारित समय (60 मिनट) के लिए एक विष (यहाँ camptothecin) के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन द्वारा जैसे जहरीले यौगिकों के प्रभाव पर अध्ययन की सुविधा. इस इलाज के बाद जारी किया एंजाइम दूर प्लावित किया गया था और कोशिकाओं lysed थे, और G6PDH का स्तर मापा गया था. दरअसल, intracellular एंजाइम का एक बड़ा नुकसान के कारण प्रतिदीप्ति की धीमी वृद्धि (चित्रा 5 ब में लाल लाइनों और स्तंभों) को दिखाई दे रहा था. इस अध्ययन का विवरण Eyer एट अल में पाया जा सकता है. 8

e_content "> इसके अलावा, हम intracellular GFP मात्रा का विश्लेषण करने के लिए एक immunoassay से परिणाम दिखाते हैं. प्रेरित अभिव्यक्ति के लिए, जहां टी रेक्स अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं. इस प्रणाली में, GFP अभिव्यक्ति टेट्रासाइक्लिन के अलावा द्वारा प्रेरित किया जा सकता है . ऊष्मायन के 8 घंटे के बाद, कोशिकाओं को निलंबित कर दिया गया चिप पर प्लावित, फंस, और बाद में विरोधी GFP एंटीबॉडी सेल से रिहा GFP बाध्य करने के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बाद कांच की सतह पर स्थिर थे कैप्चरिंग. lysed. 5C चित्रा एंटीबॉडी के लिए GFP के बंधन कैनेटीक्स से पता चलता है. इस उदाहरण में, GFP सीधे कारण प्रोटीन की प्रतिदीप्ति के लिए कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से मापा जा सकता है. हम उस nonfluorescent प्रोटीन भी एक सैंडविच एलिसा या इसी तरह का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है पर जोर देना चाहते हैं प्रारूपों. इसके लिए आवश्यक परख घटकों धोने कदम के बाद पेश किया जा सकता है. एलिसा के लाभ की वजह से संकेत प्रवर्धन हैएंजाइम को, microchamber अंदर संचित है कि एक फ्लोरोसेंट उत्पाद उपज.

अंत में, हम लक्ष्य प्रोटीन के रूप में GAPDH साथ एक एकल कोशिका सैंडविच एलिसा पेश करना चाहते हैं. हम U937 निलंबन कोशिकाओं में GAPDH के रूप में अच्छी तरह से पक्षपाती HEK293 कोशिकाओं (चित्रा 5D) निर्धारित की. इस के लिए, हम विरोधी GAPDH एंटीबॉडी (कब्जा एंटीबॉडी) immobilized. सेल के बाद, दूसरा एंजाइम लेबल एंटीबॉडी (पता लगाने एंटीबॉडी) शुरू की गई थी. कक्षों खोला गया और कारण प्रवाह करने के लिए, अबाध पता लगाने एंटीबॉडी धुल गया और Amplex लाल चैम्बर के लिए पेश किया गया था. एचआरपी (पता लगाने एंटीबॉडी) द्वारा resorufin फ्लोरोसेंट Amplex लाल का रूपांतरण एक ही समय में सभी 60 microchambers में समय पर नजर रखी थी. प्रतिक्रिया के रैखिक भाग से ढलान निर्धारित किया गया था. इस ढलान सीधे analyte की एकाग्रता के लिए, इसलिए एंजाइम की एकाग्रता और के लिए सहसंबद्ध है. एकल U937 कोशिकाओं से परिणाम एक औसत GAPDH दिखायाक्रमश: 2.0 और 3.2 attomol, का न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों के साथ 2.6 attomol की राशि. 46 HEK कोशिकाओं के डेटा विश्लेषण उन कोशिकाओं औसत 2.5 attomol GAPDH (; अधिक से अधिक 4.1 attomol न्यूनतम 0.9 attomol) में निहित है कि पता चला.

चित्रा 1
चित्रा 1. अलग assays के microdevice और schematics. एक) इकट्ठे microdevice प्रस्तुत किया. इधर, कक्षों दृश्य (हरी प्रतिदीप्ति) के लिए fluorescein से भर रहे हैं. इसके अलावा दिखाई जलाशय है, नियंत्रण परत के लिए कनेक्शन (दबाव, पीठ में 2x4 कनेक्टर्स छोड़ दिया और सामने सही) और सिरिंज पंप (सामने) के लिए कनेक्शन. ख) microchamber क्षेत्र पर ज़ूम. इन कक्षों में से कई एक सरणी में व्यवस्थित किया जा सकता है. दृश्य के लिए, नारंगी भोजन डाई, जबकि कक्षों के अंदर पृथक किया गया हरी भोजन डाई चैनलों के माध्यम से प्लावित है. दबाव नियंत्रण परत डिवाइस ऑपरेशन का एक भी microchamber. डी) योजनाबद्ध पर पानी. ग) ज़ूम के साथ भरा है. एक microchamber (पक्ष देखें) के भीतर, एक एकल कक्ष फँस गया और अलग है. सेल, उत्तेजित incubated, धोया और अंत में चिप के भीतर lysed किया जा सकता है. सेलुलर सामग्री एंजाइमों या एक फ्लोरोसेंट आधा भाग प्रतिक्रिया (बाएं) पर उत्पन्न होता है जहां सहएंजाइमों के लिए assays के साथ सीधे विश्लेषण किया जा सकता है. अन्य प्रोटीन के लिए, सतह लक्ष्य प्रोटीन (दाएं) के लिए विशेष रूप से बाध्य है कि एंटीबॉडी के साथ संशोधित किया जा सकता है. प्रतिजन सतह के लिए बाध्य किया जाता है, lysate दूर धोया जा सकता है और इस तरह के माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में पता लगाने के अणुओं लक्ष्य प्रोटीन यों को जोड़ा जा सकता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

ई 2 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg 5in "चौड़ाई =" 500px "/>
चित्रा 2. Fluidic परत के चैनल सिस्टम और microchamber के आयामों के योजनाबद्ध. एक) मुखौटा डिजाइन. fluidic परत (बाएं से दाएं) एक दुकान, चैम्बर क्षेत्र, कणों और सेल समूहों को बनाए रखने के लिए एक फिल्टर और एक प्रवेश के होते हैं. वेफर में एक 4 10 चिप्स के उत्पादन के लिए संरचनाओं बंदरगाह कर सकते हैं. इसी नियंत्रण परत के ख) मुखौटा डिजाइन. कारण संरेखण के लिए आवश्यक स्थान के लिए, वेफर में एक 4 5 चिप्स गठबंधन परतों की. ग) योजनाबद्ध (बाएं) के उत्पादन के लिए संरचनाओं में शामिल है और एक सेल जाल (दाएं), दोनों तराजू लंबाई के साथ दिखा वृद्धि. देखने के लिए यहां क्लिक करें बड़ी छवि .

चित्रा 3 चित्रा 3. SU-8 प्रसंस्करण और PDMS उत्पादन की योजनाबद्ध. एक) SU-8 प्रसंस्करण प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध. एक सिलिकॉन वेफर स्पिन में लिपटे SU-8 के साथ और 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नरम सुखा हुआ है. वांछित microfluidic चैनल डिजाइन एक photomask और यूवी प्रकाश जोखिम का उपयोग SU-8 पर स्थानांतरित किया है. 2 घंटे के लिए एक के बाद जोखिम सेंकना (95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) के बाद, SU-8 विकसित की है और 180 डिग्री सेल्सियस पर मुश्किल में सुखा हुआ. Microfluidic चिप निर्माण की बी) योजनाबद्ध. PDMS oligomer और इलाज एजेंट का एक मिश्रण स्पिन में लिपटे fluidic चैनलों के लिए मास्टर फार्म पर है, और नियंत्रण परत के लिए मास्टर फार्म पर डाल दिया. चैनल नकारात्मक गुलाबी में चित्रित कर रहे हैं. दोनों परतें एक ओवन में ठीक हो रहे हैं. नियंत्रण परत चिप हिस्सा (नीले रंग में नियंत्रण चैनल) मे से disassembled है और दबाव कनेक्शन के लिए छेद (सफेद) छिद्रित हैं. भागों नियंत्रण और दोनोंतरल पदार्थ परत रहे हैं ऑक्सीजन प्लाज्मा में रखा, और बाद में, वे गठबंधन कर रहे हैं और बंधुआ. पूरे चिप फिर (लाल रंग में तरल पदार्थ चैनल) fluidic मास्टर फार्म से disassembled है और fluidic पहुँच छेद (सफेद) छिद्रित हैं. अंत में, चिप और एक गिलास स्लाइड ऑक्सीजन प्लाज्मा में सतह सक्रियण के बाद बंधुआ रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. मुलायम लिथोग्राफी के लिए microcontact मुद्रण के योजनाबद्ध. एक) मास्टर निर्माण. (1) एक PDMS स्टांप प्रोटीन (bBSA) समाधान के साथ incubated है. (2) समाधान निकाल दिया जाता है स्टाम्प धोया जाता है और प्रोटीन की एक monolayer के टिकट पर बनी हुई है. (3) स्टाम्प जिससे प्रोटीन कांच सुर को स्थानांतरित कर रहे हैं, एक गिलास स्लाइड पर रखा गया है चेहरा. इस समय के दौरान, कांच पर टिकट के साथ एक साथ माइक्रोचिप एक ऑक्सीजन प्लाज्मा के संपर्क में हैं. (4) के टिकट निकाल दिया जाता है और माइक्रोचिप गिलास स्लाइड को बंधुआ है. दृश्य के लिए, दो उदाहरण संरचनाओं दिखाए जाते हैं, फ्लोरोसेंट बीएसए-fluorescein संयुग्म के साथ छपी. चैम्बर प्रति ख) microcontact मुद्रित क्षेत्र. मुद्रण और कक्षों गठबंधन नहीं कर रहे हैं, हम बाध्यकारी तीन अलग चिप्स (1-3 नंबर) पर धब्बे (मुद्रित क्षेत्र) और सभी 60 microchambers में बदलाव का मूल्यांकन किया. नतीजतन, कक्ष से कक्ष परिवर्तनशीलता (2.5% <) अपेक्षाकृत छोटा है और चिप करने वाली चिप परिवर्तनशीलता कक्षों को मुद्रित संरचनाओं के लिए पंक्ति में कोई जरूरत नहीं है कि वहाँ वास्तव प्रदर्शन (<1%) नगण्य था. क्लिक करें यहां बड़ी छवि को देखने के लिए .

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चित्रा 5. G6PDH, लाइसोजाइम, GFP और GAPDH assays से परिणाम. एकल कक्षों से प्रतिनिधि परिणाम है. एक) एंजाइम स्राव. वाम: एक secreted एंजाइम के लिए परख के योजनाबद्ध, यहाँ लाइसोजाइम. Lysozyme एकल, पीएमए सक्रिय U937 कोशिकाओं द्वारा secreted और यह फ्लोरोसेंट 4-methylumbelliferone का उत्पादन catalyzes जहां बंद microchambers अंदर जम जाता है. अधिकार: एक स्राव प्रयोग से प्राप्त आंकड़ों. हरी घटता भी कोशिकाओं के बिना एक कक्ष (काला, डॉटेड लाइन) है दिखाया तुलना के लिए, एक सेल के कब्जे में कक्षों के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाते हैं. एकल कक्षों में intracellular एंजाइमों के ख) जांच. वाम: intracellular एंजाइम G6PDH के लिए परख के योजनाबद्ध. सेल पर, intracellular G6PDH एक enzymatic प्रतिक्रिया झरना के लिए अन्य घटक मौजूद हैं जहां चैम्बर, में जारी की है. अधिकार: उदाहरण घटता है और प्रतिनिधि डेटा. सिंगल U937कोशिकाओं को उनके एंजाइम सामग्री (काला) के लिए विश्लेषण किया गया. एकल कक्षों के intracellular प्रोटीन की झिल्ली permeabilizes जो camptothecin, के जहरीले प्रभाव पर, एंजाइम की दो तिहाई (नारंगी) खो गया था. ग) आमापन. वाम: एक immunoassay के योजनाबद्ध, यहाँ intracellular प्रोटीन GFP के लिए. विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ साथ वर्णित सतह अनुसार प्रोटोकॉल पर स्थिर थे. कोशिकाओं तो चिप पर lysed थे और बाध्यकारी स्पॉट TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग समय के साथ निगरानी की गई. अधिकार: immobilized एंटीबॉडी के लिए GFP के बंधन कैनेटीक्स दिखा इस तरह के प्रयोग से ग्राफ. समय बिंदु 1 lysis बफर की शुरूआत का प्रतीक है. समय बिंदु 2 में, GFP सेल हुई है जिसका अर्थ है कि सतह पर जमा करने के लिए शुरू कर रहा है. एंटीबॉडी के लिए GFP की बाइंडिंग समय बिंदु 3. डी) एकल कक्षों के intracellular प्रोटीन की सैंडविच एलिसा में पूरा हो गया है. वाम: intracellular प्रोटीन GADPH के लिए यहां एक सैंडविच एलिसा, योजनाबद्ध. एंटी-GAPDH एंटीबॉडी के साथ साथ वर्णित सतह अनुसार प्रोटोकॉल पर स्थिर थे. कोशिकाओं तो चिप पर lysed और incubated रहे थे. एंटीबॉडी के लिए बाध्य मुक्त GPADH, कक्ष धोया गया था और पहचान एंटीबॉडी (एचआरपी युग्मित) शुरू की गई थी. एक अंतिम चरण में, nonbound पता लगाने एंटीबॉडी, धुल गया था पता लगाने अभिकर्मक पेश किया गया था और प्रतिक्रिया समय के साथ नजर रखी थी. अधिकार:. U937 और HEK293 कोशिकाओं के अंदर GAPDH की मात्रा बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

एलिसा के लिए भूतल संशोधन प्रोटोकॉल

चरण समय एकाग्रता प्रवाह की दर फ्लो मुक्त ऊष्मायन समय चैंबर खुला / बंद
[मिनट] (W / v)% [Μl / मिनट] [मिनट] </ P>
बीएसए 30 4 - खुला
पीबीएस 10 5 खुला
Avidin 30 0.025 5 खुला
पीबीएस 10 5 खुला
प्रोटीन जी, बायोटिन 30 0.0025 5 खुला
पीबीएस 10 5 खुला
प्रतिरक्षी 20 0.0001 5 15 खुला
पीबीएस 10 5 खुला
प्रकोष्ठों
(300,000 कोशिकाओं / एमएल) 		~ 5 30 जाल कब्जा कर रहे हैं जब बंद करें.
Lysis बफर 5 30 ओपन शीघ्र ही
एफडीए (जैसे 20 मिमी एचसीएल) 15 10 बंद
पीबीएस 2 30 बंद
पता लगाने अभिकर्मक 5 30 ओपन शीघ्र ही
प्रतिक्रिया की निगरानी शुरू

तालिका 1. भूतल modificatioएलिसा के लिए एन प्रोटोकॉल. स्पष्टीकरण के लिए, पाठ देखते हैं.

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Discussion

Microfluidics प्रौद्योगिकी एकल कोशिका विश्लेषण के लिए नए और आकर्षक संभावनाएं खोल दिया गया है. विशेष रूप से, फंसाने के लिए संभावना और microfluidic उपकरणों के द्वारा अलग - अलग कक्षों स्थिर एकल कक्ष गुण और प्रतिक्रिया पर व्यवस्थित छोटी और लंबी अवधि के अध्ययन की अनुमति दी है. इसके अतिरिक्त, एक माइक्रोचिप पर उत्पन्न उच्च आवृत्ति microdroplets, में कोशिकाओं के encapsulation, पारंपरिक cytometry उपकरणों के साथ नहीं की जा सकती है, जो एकल कक्ष स्राव पढ़ाई, सक्षम है. microdroplet दृष्टिकोण, हालांकि, ऊष्मायन और धोने कदम विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक हैं जब कुछ सीमाएँ हैं. हमारा दृष्टिकोण सेल फँसाने और अलगाव के दोनों अवधारणाओं को जोड़ती है और इसलिए, यह सतह immobilized एंटीबॉडी के आधार पर immunoassays सहित अधिक जटिल assays के प्रदर्शन की सुविधा. इसके अतिरिक्त, विधि आवेदन और लक्ष्य analytes के लिए सम्मान के साथ बहुत लचीला है.

माइक्रोचिप के डिजाइन (मैं) effi सक्षम बनाता हैcient सेल फँसाने, विभिन्न buffers और अभिकर्मकों (द्वितीय) की आपूर्ति, और एक बहुत छोटी मात्रा में (तृतीय) विश्वसनीय अलगाव की आवश्यकता है. इस तरह लक्ष्य अणुओं के कमजोर पड़ने से बचा है. साठ microchambers के (सैकड़ों करने के लिए) समानांतर में कई प्रयोगों की अनुमति एक ही डिवाइस पर तैनात हैं. microchambers समापन दौर के आकार का वाल्व आसन्न कक्षों को पार संदूषण रोका जाना चाहिए जो महत्वपूर्ण है जब, पंक्तियों या स्तंभों द्वारा एक साथ या अलग से संबोधित किया जा सकता है. Microchambers बंद के साथ, चैनलों में इस तरह फंस कोशिकाओं को प्रभावित किए बिना उद्देश्यों की सफाई के लिए हाइड्रोक्लोरिक एसिड के रूप में हानिकारक समाधान के साथ इलाज किया जा सकता है. दूसरी ओर, microchamber अंदर मात्रा का तेजी से आदान प्रदान संभव है. वर्तमान में 200 मिसे के एक कम से कम समय में पूरी तरह से कक्ष खोलने के लिए और (microchamber मात्रा की पूरी आदान प्रदान के लिए, प्रवाह की दर पर विचार किया जाना है) नई अभिकर्मकों शुरू करने की जरूरत है.

हमारे विधि बहुत रिलायंस एनर्जी हैiable और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, एक चिप निर्माण और संचालन के प्रोटोकॉल में दो मुख्य महत्वपूर्ण बिंदु होते हैं कि दिमाग में रखना चाहिए. सबसे पहले, प्लाज्मा सक्रियण के बाद दो चिप परतों के संबंध में जल्दी से किया जा सकता है. संरेखण संबंध अपरिवर्तनीय है क्योंकि अन्यथा कुछ कक्षों या यहाँ तक कि पूरे चिप, प्रयोग करने योग्य नहीं है, महत्वपूर्ण है. यह कदम कुछ प्रशिक्षण के बाद भी कम अनुभवी प्रयोगशाला कार्यकर्ताओं आमतौर पर अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए, तथापि, अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए मुश्किल हो सकता है. दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु संयोजन और माइक्रोचिप का उपयोग करने के दौरान पवित्रता है. धूल कणों चिप की सतह पर मौजूद हैं, वे नियंत्रण चैनलों और वाल्व समझौता या भी PDMS-PDMS या PDMS गिलास बंधन के एक तोड़ने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए हम सफाई प्रक्रियाओं को ध्यान की एक बहुत खर्च करते हैं. यह (एक साफ कमरे में प्रदर्शन) मास्टर फार्म निर्माण के अलावा, हम उत्पादन और एक सामान्य प्रयोगशाला वातावरण, जहां धूल एक में माइक्रोचिप्स का उपयोग किया जाना चाहिएएन डी कणों मौजूद हैं.

कक्षों को सही ढंग से बंद नहीं कर रहे हैं सभी सावधानी के बावजूद, यह दबाव लाइनों या तो अवरुद्ध कर रहे हैं या स्पिन कोटिंग प्रक्रिया सही झिल्ली मोटाई प्रदान नहीं किया जा सकता है. इसके अलावा, समय - समय पर हम दो PDMS परतों के बीच बंधन का टूटना, जिसके परिणामस्वरूप अपर्याप्त संबंध मनाया. एक ही बैच से कई चिप्स इस समस्या को दिखा रहे हैं, यह प्लाज्मा सक्रियण और संरेखण के बीच समय बहुत लंबा है कि संभव है. कभी कभी, हम ठीक से नहीं निकाला जा सकता है कि वेफर्स पर चिपचिपा PDMS अनुभवी और वेफर की अपर्याप्त silanization का परिणाम था.

उत्पादन पद्धति स्थापित हो जाने के बाद, मंच microfluidic एकल कोशिका के स्तर पर कई अलग अलग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम विभिन्न assays के साथ intracellular और स्रावित एजेंटों का पता लगाने से पता चला है, लेकिन कई अन्य assays चिप पर संभव हो रहे हैं. सबसे अधिक प्रोटीन फ्लोरोसेंट नहीं कर रहे हैं और उनके डेimmunoassays माध्यम tection सीधा नहीं है. चिप में एलिसा का कार्यान्वयन कई लाभ लाएगा. सबसे पहले, परख (उपयुक्त एंटीबॉडी मौजूद हैं) वांछित प्रोटीन के लिए बहुत विशेष रूप से डिजाइन किया जा सकता है. दूसरे, एलिसा से जानकारी सेल में मौजूद प्रोटीन या अणु प्रतियों की संख्या दे रही है, यहां तक ​​कि कम एकाग्रता की सीमा पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

हमारे वर्तमान चिप एक स्तनधारी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए बनाया गया है. हालांकि, इस तरह के बैक्टीरिया, शैवाल और खमीर के रूप में अन्य कोशिकाओं के लिए चिप का संशोधन, संभव होना चाहिए. अब तक, प्रयोगों के लिए केवल सीमा प्रतिदीप्ति पर आधारित एक परख की जरूरत है. हालांकि, वर्तमान में हम एक पहचान तकनीक के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री के कार्यान्वयन का अध्ययन कर रहे हैं. इस स्थापित हो जाने के बाद मंच के साथ जांच की जा सकती है कि विश्लेषणात्मक समस्याओं की सीमा भी व्यापक हो जाएगा. इसके अलावा, नहीं हर विश्लेषण सेल बफ़र्स की उपस्थिति में ही संभव है, जब से हमवर्तमान में भी मंच पर विभिन्न अन्य सेल तकनीक मूल्यांकन कर रहे हैं. हम यहां प्रस्तुत बहुमुखी microfluidic मंच proteome, metabolome और secretome स्तर पर नए एकल कोशिका के अध्ययन के लिए आधार प्रदान करता है कि सुनिश्चित कर रहे हैं.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता पांडुलिपि, कस्टम निर्मित दबाव नियंत्रण प्रणाली के निर्माण के लिए सी. Bärtschi और एच. बेंज के सबूत पढ़ने के लिए टॉम रॉबिन्सन को स्वीकार करते हैं. हम यह भी साफ कमरे सुविधा पहले और दोनों ETH ज्यूरिख में प्रकाश माइक्रोस्कोपी सेंटर (एलएमसी) के उपयोग को स्वीकार करना होगा. काम 7 फ्रेमवर्क कार्यक्रम (ईआरसी अनुदान शुरू, परियोजना नहीं. 203428, nμLIPIDs) के तहत मर्क Serono और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

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References

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Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

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