Summary
In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.
Abstract
Presentiamo un dispositivo microfluidico che consente la determinazione quantitativa di biomolecole intracellulari in più celle singole in parallelo. A questo scopo, le cellule sono passivamente intrappolati nel mezzo di una microcamera. All'attivazione del livello di controllo, la cella è isolato dal volume circostante in una piccola camera. Il volume circostante può quindi essere scambiati senza compromettere la cellula isolata. Tuttavia, dopo breve apertura e la chiusura della camera, la soluzione nella camera può essere sostituito entro poche centinaia di millisecondi. A causa della reversibilità delle camere, le cellule possono essere esposti a soluzioni diverse sequenzialmente in un modo altamente controllabile, ad esempio per incubazione, lavaggio, infine, lisi cellulare. I microchambers ermeticamente chiusi consentono il mantenimento del lisato, minimizzare e controllare la diluizione dopo lisi cellulare. Poiché lisi e analisi avvengono nello stesso luogo, l'alta sensibilità viene mantenuta perché senza ulteriori dilution o la perdita degli analiti avviene durante il trasporto. Il design microcamera consente pertanto l'analisi affidabile e riproducibile di piccolissimi numeri di copie di molecole intracellulari (attomoli, zeptomoles) rilasciate dalle cellule singole. Inoltre, molti microchambers possono essere organizzati in un formato matrice, consentendo l'analisi di molte celle contemporaneamente, dato che gli strumenti ottici adatti vengono utilizzati per il monitoraggio. Abbiamo già utilizzato la piattaforma per proof-of-concept studi per analizzare le proteine intracellulari, enzimi, cofattori e secondi messaggeri in maniera quantificabile sia relativo o assoluto.
Introduction
Molti studi in passato hanno rivelato cellula-cellula differenze all'interno di una vasta popolazione di cellule 1-3, in particolare segnalazione elabora 4 o la quantità di biomolecole come proteine intracellulari 5,6, metaboliti e cofattori 7,8. Queste eterogeneità sono considerati di fondamentale importanza per l'adattamento delle cellule e l'evoluzione 9, ma anche svolgere un ruolo chiave nella nascita e nel trattamento di malattie come il cancro 10-13. Pertanto, studi sul livello di singola cellula sono di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, soprattutto se questi studi rivelano le diverse risposte delle cellule dopo trattamento con sostanze chimiche bioattive.
Negli ultimi anni, molte piattaforme analitiche sono state sviluppate che facilitano l'analisi di cellule viventi singole o la composizione chimica del contenuto cellulare. Mentre fluorescente delle cellule attivate (FACS) è l'oro stAndard per analisi molto alto-capacità di singole cellule viventi, il metodo non può essere impiegato per la quantificazione di composti intracellulari o secrete. L'emergere di piattaforme microfluidica ha promesso nuove strategie analitiche per il posizionamento, il trattamento e l'osservazione delle singole cellule. Una pietra miliare nella microfluidica è stato raggiunto con l'integrazione di PDMS valvole flessibili realizzate da Quake e collaboratori 14,15. Queste valvole sono utili poiché possono isolare regioni sul chip, ad esempio separare due culture 16. Inoltre, sono particolarmente applicabile per l'analisi di singole cellule e quindi contribuire a ridurre i problemi di diluizione degli analiti. La potenza di questo approccio per l'analisi singola cellula è stato recentemente dimostrato da Hansen e colleghi, che hanno analizzato l'espressione genica da centinaia di singole cellule in parallelo 17.
Quando il targeting proteine e metaboliti, l'analisi è molto difficile a causa della mancanza di un adeguatometodi mplification, il gran numero di diversi composti presenti, e le loro variazioni di natura chimica. Inoltre, la maggior parte delle biomolecole intracellulari dovrebbero essere presenti in basso numero di copie nell'ordine di qualche decina di migliaia 18, da cui il metodo analitico utilizzato deve avere una elevata sensibilità. Saggi più potenti come immunosaggi e immunoenzimatici (ELISA) sono difficili da integrare in dispositivi microfluidici quanto richiedono vari lavaggi e le fasi di incubazione e immobilizzazione superficie.
A causa di questi problemi, non è sorprendente che solo alcuni esempi sono stati riportati in cui le proteine o metaboliti sono stati quantificati a livello di singola cellula. Per esempio, studi sulla secrezione di composti fluorescenti sono stati segnalati 19,20. Recentemente, l'implementazione con ELISA è stata presentata per l'analisi di secrete (non fluorescente) proteine da una coltura cellulare (cellule THP-1) 21 e singolo (immune) cellule 10. Targeting proteine intracellulari, Shi et al. Sviluppato un dispositivo microfluidico che ha facilitato l'identificazione di proteine intracellulari per l'analisi delle vie di segnalazione nelle cellule tumorali mediante un immunodosaggio 11. Tuttavia, solo quantità relative di proteine sono stati determinati e nessuna amplificazione enzimatica è stato utilizzato per aumentare il segnale per le proteine a bassa abbondanza.
Recentemente, siamo stati in grado di combinare una cella singola cattura Microdevice con saggi di fluorescenza 8 e immunoassays 22 (Figura 1). Le cellule sono passivamente intrappolati in strutture ostacolo microsized, che permettono di alimentazione e (rapido) scambio di medie e di altri agenti chimici senza alcun movimento delle cellule. Una valvola ad anello attorno a ciascuna trappola consente l'isolamento della cella in un volume molto piccolo ("microcamera"). Questa valvola viene attivata subito dopo aver introdotto una cella-lisi (hypoosmolar) tampone, eglince prevenire molecole intracellulari o molecole secrete a diffondere via. Ancora più importante, a causa delle ridotte dimensioni del volume (625 pl) è evitata grande diluizione delle molecole. Inoltre, poiché lisi e analisi vengono eseguite nella stessa posizione nel chip, non vi è alcuna perdita di analiti dovuti al trasporto. La progettazione di chip qui descritto comprende 8 righe alterne di 7 o 8 microchambers, per un totale di 60 microchambers. Le camere sono azionati in file, in modo che la contaminazione incrociata lungo una linea è preclusa.
La piattaforma può essere utilizzata in combinazione con saggi di fluorescenza e test immunologici (Figura 1D). Per questi ultimi, abbiamo stabilito protocolli per l'immobilizzazione degli anticorpi, che sono compatibili con la produzione di chip e processo di assemblaggio. Quindi la piattaforma apre la strada a test sensibile, affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l'analisi di ienzimi ntracellular e secrete (quantificazione relativa da saggi enzimatici), cofattori intracellulari, proteine e piccole molecole (quantificazione assoluta mediante saggi endpoint o ELISA). Nel seguito si descrive il processo di fabbricazione di chip mediante multistrato litografia morbida e protocolli per patterning degli anticorpi tramite stampa microcontact e chimica di superficie. Inoltre, alcuni esempi di utilizzo del chip e le operazioni sono dati.
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Protocol
1. SU-8 master Fabrication
Preparare entrambe stampi principali per i canali (fluidici e di controllo, per schemi e dimensioni vedere Figura 2) con il seguente protocollo ma con differenti modelli di maschera. Il processo è mostrato nella figura 3a.
- Inizia riscaldando un wafer di silicio da 4 pollici per 10 min a 180 ° C. Caricare il wafer disidratato in uno spin-torre di verniciatura e utilizzare il seguente protocollo per spin-coating SU-8 2015:
- Spin wafer a 100 rpm per 20 sec (coperchio aperto di spin-coater, dispensare SU-8 durante questa fase, chiudere il coperchio dopo la dispensazione).
- Spin wafer a 500 rpm per 10 sec (estenderebbe l'resistere sull'intero wafer).
- Spin wafer a 1.750 rpm per 30 sec (definisce l'altezza del resist a 20 micron).
- Rimuovere resistere dal bordo del wafer con acetone (utilizzare un tampone) poiché ciò altrimenti aderire alla piastra nella fase successiva. Trasferire il wafer ahotplate a 95 ° C e calore per 4 min. Dopo la softbake, esporre il resist attraverso un fotomaschera attaccata al vetro sodalime in un allineatore maschera con luce UV (150 mJ / cm 2, misurata a 365 nm).
- Dopo l'esposizione, riscaldare il wafer di nuovo a 95 ° C per 5 min su una piastra. Raffreddare il wafer di RT e poi immergerlo in un bagno di SU-8 sviluppatore per 4 min. Agitare delicatamente per rimuovere impressionate SU-8. Lavare il wafer con clean-room grado isopropanolo e asciugare con azoto. Controllare al microscopio se lo sviluppo ha avuto successo (soprattutto le trappole cellulari). Se le trappole cellulari sono completamente sviluppati, il riflesso del wafer di silicio dovrebbe essere visibile. Se necessario, sviluppare nuovamente il wafer per alcuni minuti.
- Cuocere il wafer in stufa per 2 ore a 180 ° C per rimuovere tutto il solvente residuo. Controllare l'altezza dei canali con un profiler passo. Se l'altezza differisce dalla altezza desiderata, ripetere questo protocollo partendo dal punto 1.1 con una nuova wafer ecambiare lo spin-velocità (fase 1.1.3). Finalizzare la fabbricazione di stampo master silanizzante la cialda con 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silano in un essiccatore durante la notte.
2. Fabrication Master stampa microcontact
- Per preparare maestri stampi per la stampa microcontact, disidratare un wafer di silicio per 10 min a 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS su questo wafer a 7.500 rpm per 30 sec (resist aderisce meglio alla superficie silanizzata). Spin-cappotto 2 ml di AZ1518 positivo resistono con questo protocollo:
- Erogazione statica del resist al wafer.
- Spin wafer per 5 secondi a 500 giri al minuto.
- Spin wafer per 60 sec a 4000 giri.
- Dopo un secondo softbake 50 a 100 ° C su una piastra, esporre il resist di luce UV (21 mJ / cm 2 a 365 nm) attraverso una fotomaschera ed un allineatore maschera. Sviluppare il resist in un bagno di AZ 726 per 75 sec. Sciacquare il wafer sviluppato con acqua demineralizzata e colpo dry con azoto. Rimuovere il solvente residuo riscaldando il wafer a 115 ° C per 50 sec. Silanizzazione wafer sottovuoto durante la notte.
3. Realizzazione della Microfluidic Chip
Un disegno dispositivo a due strati viene utilizzato per questi esperimenti. I due strati sono preparati separatamente e sono legati insieme, prima che il chip viene finalmente incollato su un vetrino (Figura 3b). Questo passaggio descrive la produzione dei PDMS strati e il timbro PDMS per la stampa microcontact.
- Preparare una miscela di PDMS 10:01 e agente indurente. Preparare circa 80 g di PDMS in totale (usando le nostre idee, questo si tradurrà in 10 gettoni). Mescolare le due parti vigorosamente e degassarla PDMS finché il composto è bolla libera (~ 30 min).
- Posizionare il wafer con lo strato di controllo all'interno di una capsula di Petri e nastro sul fondo. Successivamente, versare ~ 50 g di PDMS sulla parte superiore e mettere il wafer per almeno 2 ore in un forno a 80 ° C per assicurare la completaindurimento delle PDMS. Ripetere la stessa procedura per il wafer stampa microcontact, per questo è necessario ~ 20 g PDMS.
- Spin-coat PDMS sul wafer con lo strato fluidico ad una velocità di rotazione di 2.000 rpm per formare uno strato di circa 40 micron alta PDMS. Curare le PDMS in un forno per almeno 1 ora a 80 ° C.
- Quando entrambe le parti sono guariti, rimuovere lo strato di controllo dal wafer e tagliato a pezzi con una lama di rasoio. Perforare connessione pressione utilizzando una biopsia perforatore ad 1 mm. Per lo stoccaggio, si consiglia di mettere un pezzo di nastro sui canali.
- Per legare i due strati, prendere l'ostia spin-rivestito e la parte superiore e metterli in un pulitore del plasma 23. Dopo il trattamento al plasma, allineare rapidamente entrambe le parti sotto un microscopio con grande distanza di lavoro. Aggiungere alcuni pezzi di PDMS intorno alle parti superiori collocati. Questo passaggio non è obbligatorio, tuttavia facilita la rimozione dei PDMS dal wafer. Posizionare il wafer in un forno a 80 ° C per almeno 1 ora.
- Utilizzare un bisturi per rimuovere con attenzione le PDMS dal wafer e tagliare i microchip. Punch fori di accesso per i collegamenti fluidici con biopsia perforatore 1,5 millimetri.
- Il chip PDMS è terminata e può essere conservato per mesi. Facoltativo: Se il chip è utilizzato con un serbatoio, tagliare la parte superiore di una punta di pipetta 200 microlitri e utilizzare alcune ricambio, PDMS semi-indurito per incollarla sopra. Mettere il chip in forno nuovamente a 80 ° C per almeno 1 ora.
4. Bonding per vetrino
Per utilizzare il dispositivo per saggi enzimatici diretti, l'unico passo necessario dopo l'incollaggio è il blocco di superfici. Per questo protocollo, procedere ad A. Tuttavia, per utilizzare il chip microfluidica per test immunologici o ELISA, si prega di fare riferimento al protocollo B per limitare i siti di legame solo al vetrino (vale a dire per la microscopia TIRF o SPR). Se questa limitazione non è importante, fare riferimento ad A, ma utilizzare coniugati biotinilato in fase 4.3 e continuare con la fase 4.8nel protocollo B per creare una superficie completamente funzionale.
Prima di eseguire protocollo A e B: Si consiglia di filtrare tutte le soluzioni proteiche utilizzato prima di introdurli nel chip. Detriti e aggregati proteici possono altrimenti bloccare trappole cellulari, riducendo così il numero di camere che possono essere utilizzati per l'analisi. A questo scopo, utilizzare un nonprotein unità filtro assorbente per filtrare tutte le soluzioni prima di introdurli nei canali.
Protocollo A (saggi enzimatici)
- Per finalizzare il dispositivo microfluidica, legare le parti PDMS su un vetrino. Per fare questo, prima pulire un vetrino con sapone, acqua distillata ed etanolo. Essiccare vetrino utilizzando un flusso di azoto. Pulire la parte PDMS con lo scotch.
- Mettere la parte PDMS e il vetrino pulito nel pulitore plasma per 45 sec a 18 W. Per garantire un legame stretto, mettere il chip su una piastra calda (100 ° C) per 5 min.
- Dopo l'incollaggio, riempire il chip con fLUID. Un modo semplice per raggiungere questo obiettivo è quello di utilizzare la forza centrifuga. Tagliare la parte inferiore della punta di 200 microlitri pipetta. Per i canali fluidici, riempirli con la soluzione di saturazione (albumina di siero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicole polietilene innestato (0.05% w / v) e posizionare le punte nelle prese. Riempire le insenature livello di controllo con acqua o con una soluzione isosmotic, ad esempio PBS. Posizionare il chip nella centrifuga (800 xg) per 5 min. I canali dovrebbero essere ora pieni di liquido completamente. In caso contrario, ripetere questo passaggio.
- Incubare la soluzione di saturazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare la soluzione di strato di fluido con PBS ad una portata di 10 microlitri / min utilizzando una pompa a siringa. Il dispositivo è ora pronto per esperimenti sulle cellule.
Protocollo B (i dosaggi)
Per una panoramica completa della modifica della superficie dal punto 4.7 in poi, si prega di fare riferimento alla Tabella 1.
- InPDMS cubate Stamp per la stampa microcontact con una soluzione bBSA / BSA (es 1-100). Dopo 30 min, pulire i francobolli accuratamente con acqua distillata e asciugare il timbro in corrente di azoto. Introdurre rapidamente i francobolli su un vetrino pulito (Figura 4).
- Esporre il vetrino con il timbro insieme alla parte superiore del chip microfluidica di plasma di ossigeno per 45 sec a potenza massima (18 W) e un detersivo plasma. Dopo il trattamento al plasma, rimuovere il timbro e allineare la superficie stampata sotto le microchambers del dispositivo. Posizionare il chip per 30 min su una piastra calda a 50 ° C.
- Per bloccare la rimanente superficie, introdurre soluzione filtrata sterile BSA (4% (w / v) in PBS) nel chip con una centrifuga (vedi fase 4.2). Incubare per 1 ora e lavare la soluzione fuori dello strato di fluido con PBS (vedi passo 4.3). Il chip può essere utilizzato direttamente o conservata fino a 2 settimane a 4 ° C in un contenitore umido.
- Per un tensioattivo vincolante completamente funzionalee, introdurre avidina (0,025% (w / v) in PBS) nel serbatoio. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per 30 min a ritirare la soluzione avidina attraverso i canali del fluido. Successivamente, lavare PBS per 10 min. Sciacquare accuratamente il serbatoio.
- Successivamente, aggiungere proteine G (0,0025% (w / v) in PBS) e filo per altri 30 min. Lavare con PBS per altri 10 min dopo. Successivamente, aggiungere l'anticorpo di interesse (0,0001% (w / v) in PBS) per 10 min. Dopo 10 minuti, fermare il flusso per 15 minuti per consentire il legame. Successivamente, lavare con PBS per 10 min.
5. Esperimenti cellulari
Il protocollo è scritto in termini generali, a causa della varietà di possibili saggi. Come esempio i reagenti necessari per il saggio di tossicità G6PDH sono dati. La cella cattura efficienza iniziale del dispositivo è di circa 2,5%, vale a dire 5 di 200 cellule saranno intrappolati. L'occupazione finale delle trappole cellula dipende fortemente dalla linea cellulare utilizzata, il protocollo di sospenderela linea cellulare e il tempo le cellule sono irrigati attraverso il canale. Per le cellule naturalmente crescono in sospensione (ad esempio U937), singole cellule possono essere trovati in circa il 75% delle camere dopo pochi minuti. Le altre camere non sono o pieni, o occupati da due o più celle. In generale, l'occupazione cella singola è minore per linee cellulari aderenti. Quando si utilizza il protocollo di sospensione piuttosto mite qui presentato, la percentuale diminuisce a circa il 30% (HEK, cellule MLT). L'occupazione singola cellula può essere migliorata mediante trattamento con tripsina delle cellule, ma puo anche alterare i risultati degli esperimenti.
A seconda della molecola bersaglio, adsorbimento o assorbimento di PDMS possono influenzare i risultati. Adsorbimento può essere ridotta bloccando le superfici con BSA o PLL-g-PEG. L'assorbimento è improbabile che la maggior parte delle biomolecole idrofile, ma dovrebbe essere controllato per (piccoli) componenti cellulari lipofile.
- Preparare le cellule secondo il protocollo specifico (ad esempio
- Caricare le cellule sul chip mediante una pompa a siringa e portata avanti, piuttosto che di ritirare la sospensione cellulare. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per linee cellulari sospensione e portate maggiori di 10-20 ml / min per le cellule adesive da ridurre attaccamento aspecifica delle cellule sulle pareti del canale.
- Quando le trappole sono pieni, chiudere le camere. Se molte cellule aderiscono non specifico alla superficie, cercare di lavarli via con tampone di dissociazione cellulare ad una portata di 10-30 ml / min.
Protocollo A (saggi enzimatici)
- Prelevare tampone di lisi attraverso il chip. Per questo esempio, questo buffer è un buffer hypoosmolar con aggiunta di Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1% (v / v) di Tween 20). Per lisi, camere rapidamente aprire e chiudere (cioè 500 msec per portate di 10-50 ml / min 7,21). Per il saggio G6PDH, aggiungere 2 mM di glucosio-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml diaforasi e 0,3 mM resazurin al tampone di lisi. Avviare il monitoraggio della cinetica di reazione subito dopo la lisi.
Nota: Scegliere una tampone che è adatto per il test, ma nudo in mente che detergenti aggressivi (come Triton, SDS), le cellule Lisare immediatamente e porterà ad una perdita di analita durante l'apertura della camera.
Protocollo B (i dosaggi)
Per una breve descrizione degli esperimenti ELISA cellulari (le portate, stato da camera, ecc), si prega di fare riferimento alla Tabella 1.
- Per ELISA, aggiungere il reagente di rilevamento richiesto (es anticorpo secondario, antigene marcato) direttamente al tampone di lisi. Il presente documento ha aggiunto Tween 20 riduce l'adsorbimento non specifico. Lisare le celle in base al punto 5.4. Incubare la miscela per 10-15 minuti per consentire la rilegatura (tempo di incubazione a seconda dell'antigene utilizzato e anticorpo).
- Coniugati anticorpo enzimatico che adsorbiti aspecifico alle pareti del canale possono portare ad una conversione del reagente di rilevamento già all'interno del serbatoio e canali. Per ridurre i problemi di questa adsorbimento, lavare un inibitore permanente dell'enzima rilevamento utilizzato attraverso il chip durante il tempo di incubazione (camere chiuse, prima di aggiungere il reagente di rilevamento). Per HRP, usare HCl 20 mM in acqua per inattivare gli enzimi aspecifico definitivamente assorbiti.
- Dopo il tempo di incubazione, introdurre il reagente di rilevamento (es Amplex rosso e perossido di idrogeno per HRP) al chip. Aprire le camere di nuovo brevemente per lavare l'anticorpo secondario nonbound distanza e aggiungere il reagente di rilevamento. Avviare il monitoraggio della reazione cinetica immediatamente.
- Calibrazione: Immobilizzarel'anticorpo contro il bersaglio di interesse. Chiudere camere. Preparare diverse concentrazioni di analita in tampone o in lisato cellulare off-chip. Applicare una concentrazione al chip e scambiare rapidamente il volume all'interno delle camere (500 msec tempo di apertura). Questo tempo di apertura è sufficientemente breve per evitare un ulteriore accumulo si verifica da analita lavaggio, e solo un numero specifico di molecole dal volume della microcamera vengono rilevati. Dal noto concentrazione dell'antigene all'interno della soluzione e il volume della camera (625 pl), calcolare la quantità all'interno della camera. Successivamente, continuare con il passo 5.5 e introdurre la parte di rivelazione.
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Representative Results
La nostra piattaforma è in grado di analizzare una varietà di intracellulare nonché molecole secrete o produce da singole cellule. Ecco, vorremmo presentare diversi studi di esempio per sottolineare la varietà di possibili saggi. Daremo un esempio di un enzima secreto (Figura 5a), così come un enzima intracellulare (Figura 5b) e proteine (figure 5c e d). Per altri esempi, come cofattori o piccole molecole, consultare Eyer et al. (2012) e Eyer et al. (2013).
Primo, presentiamo un saggio per un enzima secreto (figura 5a). All'attivazione con forbolo miristato acetato (PMA), monociti umani indurre secrezione di lisozima, un enzima che induce la lisi delle cellule batteriche. Per questo test, la memoria di cella contiene 4 Methylumbelliferyl β-DN, N'-diacetylchitobioside, un substrato debolmente fluorescente per lysozYME. Su clivaggio dei residui di zucchero dall'enzima, il fluoroforo viene liberato e può essere rilevata all'interno della camera. Qui, il vantaggio della microcamera è la diluizione ridotte delle enzima secreto, permettendo il rilevamento di concentrazioni enzimatiche basse entro un breve periodo di tempo. In Figura 5a, più curve di esempio sono riportati rappresentano il fatturato enzimatica di lisozima secreta da cellule singole U937 stimolate. La linea cellulare U937 deriva da un paziente con linfoma istiocitico, e può essere indotto a terminale differenziazione monocitica. La linea cellulare produce TNFa, lisozima e β2-microglobulina dopo stimolazione con PMA. Nessun turnover è rilevabile in camere aperte o camere cell-free (linea tratteggiata).
Figura 5b mostra la quantificazione relativa di un enzima intracellulare, qui glucosio 6-fosfato deidrogenasi (G6PDH). G6PDH è una proteina di pulizia e cellule dalla stessa origine tessuto non dovrebbe variano ampiamente nella loro concentrazione G6PDH 24. Qui, U937 sono state intrappolate nella camera, e abbiamo fornito un saggio di fluorescenza per la rivelazione di G6PDH insieme al tampone di lisi. È costituita da glucosio-6-fosfato, NADPH, la diaforasi enzima e il substrato resazurin, che viene convertito in resorufina fluorescente quando G6PDH è presente. Il tasso di aumento della fluorescenza nel tempo corrisponde alla quantità di G6PDH. Il microchip facilita ulteriormente studi sugli effetti di composti tossici, ad esempio mediante incubazione delle cellule con una tossina (qui camptotecina) per un tempo definito (60 min). Dopo questo trattamento, l'enzima è stato rilasciato lavata via e le cellule sono state lisate, e il livello di G6PDH è stato misurato. Infatti, una significativa perdita di contenuto intracellulare dell'enzima era visibile a causa di un aumento lento di fluorescenza (linee rosse e colonne in Figura 5b). Dettagli di questo studio possono essere trovati in Eyer et al. 8
e_content "> Inoltre, mostriamo i risultati di un saggio immunologico per l'analisi di quantità GFP intracellulari. Per l'espressione indotta, cellule HEK293 trasfettate con cui il sistema di espressione T-Rex. In questo sistema, l'espressione della GFP può essere indotta mediante l'aggiunta di tetraciclina . Dopo 8 ore di incubazione, le cellule sono state sospese, lavati sul chip, intrappolati, e successivamente lisate. Cattura di anticorpi anti-GFP sono stati immobilizzati sulla superficie di vetro seguente protocollo presentato qui di impegnare la GFP rilasciati dalla cellula. Figura 5c mostra le cinetiche di legame del GFP all'anticorpo. In questo esempio, GFP potrebbe essere misurata direttamente dagli totale microscopia a fluorescenza interna a causa della fluorescenza della proteina. Vogliamo sottolineare che le proteine non fluorescente possono essere rilevati anche utilizzando un sandwich ELISA o simili formati. Per questo, i componenti del saggio richiesti possono essere introdotte dopo le fasi di lavaggio. Il vantaggio di ELISA è l'amplificazione del segnale dovutaall'enzima, dando un prodotto fluorescente che si accumula all'interno della microcamera.Infine, vorremmo presentare un ELISA a sandwich a cella singola con GAPDH come la proteina bersaglio. Abbiamo determinato GAPDH in cellule in sospensione U937 così come cellule aderenti HEK293 (Figura 5d). Per questo, abbiamo immobilizzato anticorpo anti-GAPDH (anticorpo di cattura). Dopo lisi cellulare, è stato introdotto il secondo anticorpo marcato con enzima (anticorpo). Le camere sono state aperte e grazie al flusso, gli anticorpi non legati rilevamento sono stati spazzati via e Amplex Red è stato introdotto alla camera. La conversione di Amplex Red a fluorescente resorufina da HRP (anticorpo) è stata monitorata nel tempo in tutti i 60 microchambers contemporaneamente. La pendenza della parte lineare della reazione è stata determinata. Tale pendenza è direttamente correlata alla concentrazione dell'enzima e, quindi, alla concentrazione di analita. I risultati di cellule U937 singole mostrato un GAPDH mediaquantità di 2,6 attomol, con valori minimi e massimi di 2.0 e 3.2 attomol rispettivamente. L'analisi dei dati di 46 HEK cellule ha rivelato che le cellule contenute nel medio GAPDH 2.5 attomol (minimo 0,9 attomol; massima 4.1 attomol).
Figura 1. Il microdispositivo e agli schemi dei vari saggi presentati. A) Il microdispositivo assemblato. Qui, le camere vengono riempite con fluoresceina per la visualizzazione (fluorescenza verde). Inoltre è visibile il serbatoio, i collegamenti per il livello di controllo (pressione, 2x4 connettori nella parte posteriore sinistra e anteriore destro) e il collegamento alla pompa siringa (anteriore). B) zoom di una zona microcamera. Molte di queste camere possono essere organizzati in un array. Per visualizzare, arancio colorante alimentare è stato isolato all'interno delle camere, mentre colorante alimentare verde viene lavata attraverso i canali. Lo strato di controllo della pressione viene riempito con acqua. C) Zoom su un singolo microcamera. D) Schema del funzionamento del dispositivo. All'interno di una microcamera (vista laterale), una singola cellula è intrappolata e isolata. La cella può essere stimolata, incubato, lavato ed infine lisato all'interno del chip. Il contenuto cellulare può essere analizzato direttamente con saggi di enzimi o coenzimi in cui si genera una frazione fluorescente in seguito a reazione (a sinistra). Per altre proteine, la superficie può essere modificato con anticorpi che si legano specificamente alla proteina bersaglio (a destra). Poiché l'antigene è legato alla superficie, il lisato può essere lavato, molecole di rivelazione come anticorpi secondari può essere aggiunto per quantificare la proteina bersaglio. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 2. Schema di sistemi di canali e le dimensioni del microcamera. A) progettazione maschera dello strato fluido. Lo strato fluidico consiste di (da sinistra a destra) una presa, la regione della camera, un filtro per trattenere particelle e gruppi di cellule ed un ingresso. A 4 in wafer può porto le strutture per la produzione di 10 chip. B) progettazione Maschera dello strato di controllo corrispondente. A causa dello spazio necessario per l'allineamento, un 4 in cialda contiene le strutture per la produzione di 5 gettoni. C) Schema di strati allineati (a sinistra) e l'allargamento mostrando una trappola cella (a destra), entrambi con scale di lunghezza. Clicca qui per vedere ingrandisci .
Figura 3. Schema di SU-8 di lavorazione e produzione PDMS. A) Schema del protocollo trasformazione SU-8. Un wafer di silicio è spin-rivestito con SU-8 e morbido in forno a 95 ° C per 4 min. Il disegno desiderato canale microfluidico viene trasferito sul SU-8 utilizzando una fotomaschera e l'esposizione a luce UV. Dopo una cottura di post-esposizione (95 ° C, 5 min), SU-8 è sviluppato e duro cotto a 180 ° C per 2 h. B) Schema della fabbricazione di chip microfluidica. Una miscela di PDMS oligomeri e indurente è spin-rivestito nel form principale per i canali fluidici, e versò sul modulo master per il livello di controllo. Gli aspetti negativi di canale sono raffigurati in rosa. Entrambi gli strati sono curati in un forno. La parte di chip livello di controllo viene smontato dal wafer (canale di controllo in blu) e fori per le connessioni di pressione sono un pugno (bianco). Entrambe le parti-controllo estrato-sono fluidi messo in plasma di ossigeno, e poi, si sono allineati e legato. L'intero chip è poi smontato dalla forma principale fluidica (canale del fluido in rosso) e fori di accesso fluido sono punzonati (bianco). Infine, il chip e un vetrino sono legati dopo l'attivazione della superficie in plasma di ossigeno. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Schematica della stampa microcontact. A) di fabbricazione master per litografia soft. (1) Un timbro PDMS viene incubato con una soluzione proteica (bBSA). (2) La soluzione viene rimossa, il timbro viene lavata e un monostrato di proteina rimane sul timbro. (3) Il timbro è posto su un vetrino, così le proteine vengono trasferite al vetro sur faccia. Durante questo tempo, il microchip con timbro sul vetro sono esposti a un plasma di ossigeno. (4) Il timbro viene rimosso e il microchip è legato al vetrino. Per la visualizzazione, due strutture di esempio vengono mostrati, stampate con fluorescente coniugato BSA-fluoresceina. B) Area Microcontatto stampata per ogni camera. Dal momento che la stampa e le camere non sono allineati, abbiamo valutato le variazioni sui punti di legame (area stampata) su tre diversi chip (numeri 1-3) e tutte le 60 microchambers. Come risultato, la variabilità camera a camera è relativamente piccola (<2,5%) e la variabilità chip-to-chip era trascurabile (<1%), dimostrando che esiste la necessità di allineare le strutture stampate alle camere. clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 5. I risultati di G6PDH, lisozima, GFP e saggi GAPDH. Risultati rappresentativi. A) Enzima secrezione dalle cellule singole. A sinistra: schema del test per un enzima secreto, qui lisozima. Il lisozima è secreta da PMA, attivate singole cellule U937 e si accumula all'interno delle microchambers chiusi, dove catalizza la produzione di fluorescente 4-metilumbelliferone. A destra: I dati ottenuti da un esperimento di secrezione. Le curve verdi mostrano l'intensità di fluorescenza nel tempo per camere occupate da una cella, anche mostrata è una camera senza cellule (nero, linea tratteggiata) per confronto. B) Rilevazione degli enzimi intracellulari in cellule singole. Sinistra: Schema del saggio per l'enzima G6PDH intracellulare. Su lisi cellulare, G6PDH intracellulare viene rilasciato nella camera, dove sono presenti altri componenti per una cascata reazione enzimatica. A destra: curve esempio e dati rappresentativi. Singolo U937cellule sono state analizzate per il loro contenuto enzimatico (nero). Sull'influenza tossico della camptotecina, che permeabilizes la membrana, due terzi dell'enzima è stato perso (arancione). C) immunoenzimatico di proteine intracellulari di cellule singole. Sinistra: Schema di un test immuno, qui per la proteina GFP intracellulare. Gli anticorpi anti-GFP sono stati immobilizzati sulla superficie secondo protocollo qui descritto. Le cellule sono state lisate on chip e le macchie di legame sono stati monitorati nel tempo utilizzando microscopia TIRF. A destra: Grafico da un esperimento che mostra la cinetica vincolanti GFP agli anticorpi immobilizzati. Punto temporale 1 segna l'introduzione del tampone di lisi. Al punto di tempo 2, GFP inizia ad accumularsi sulla superficie, significa che si è verificato lisi cellulare. Il legame di GFP agli anticorpi è completato nel punto temporale 3. D) Sandwich ELISA di proteine intracellulari di cellule singole. A sinistra: Schema di un panino ELISA, qui per la proteina GADPH intracellulare. Antianticorpi-GAPDH erano immobilizzati sulla superficie secondo protocollo qui descritto. Le cellule sono state lisate sul chip e incubate. GPADH liberato legato all'anticorpo, la camera è stata lavata ed è stato introdotto anticorpo di rilevazione (HRP-accoppiati). In un ultimo passaggio, anticorpo di rilevazione nonbound stato lavato via, il reagente di rilevamento è stato introdotto e la reazione è stata monitorata nel tempo. A destra:. Quantificazione dei GAPDH all'interno delle cellule U937 e HEK293 Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Protocollo di modifica della superficie per ELISA
| Passo | Tempo | Concentrazione | Portata | Tempo di incubazione free-flow | Sezione aperto / chiuso | ||
| [Min] | (W / v)% | [Microlitri / min] | [Min] | </ Td> | |||
| BSA | 30 | 4 | - | Aperto | |||
| PBS | 10 | 5 | Aperto | ||||
| Avidina | 30 | 0.025 | 5 | Aperto | |||
| PBS | 10 | 5 | Aperto | ||||
| Proteina G, biotina | 30 | 0.0025 | 5 | Aperto | |||
| PBS | 10 | 5 | Aperto | ||||
| Anticorpo | 20 | 0.0001 | 5 | 15 | Aperto | ||
| PBS | 10 | 5 | Aperto | ||||
| Celle (300.000 cellule / ml) | ~ 5 | 30 | Chiudere quando le trappole sono occupati. | ||||
| Tampone di lisi | 5 | 30 | Aperto a breve | ||||
| Inhibitor (ad esempio HCl 20 mM) | 15 | 10 | Chiuso | ||||
| PBS | 2 | 30 | Chiuso | ||||
| Reagente di rilevamento | 5 | 30 | Aperto a breve | ||||
| Avviare il monitoraggio di reazione | |||||||
Tabella 1. Modificatio Surfaceprotocollo n per ELISA. Per le spiegazioni, vedi testo.
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Discussion
La tecnologia microfluidica ha aperto nuove e affascinanti possibilità per l'analisi singola cellula. In particolare, la possibilità di intrappolare e immobilizzare le cellule singolarmente dagli strumenti di microfluidica ha permesso studi sistematici a breve e lungo termine sulle proprietà monocellulari e la risposta. Inoltre, incapsulamento di cellule in microgocce alta frequenza, generati su un microchip, ha consentito studi di secrezione di cellule singole, che non possono essere eseguite con dispositivi citometria convenzionali. L'approccio microdroplet, tuttavia, ha alcune limitazioni quando sono necessarie fasi di incubazione e lavaggio per il protocollo analitico. Il nostro approccio unisce i concetti di intrappolamento delle cellule e isolamento e quindi facilita l'esecuzione di saggi più complessi tra cui saggi immunologici basati su anticorpi-superficie immobilizzato. Inoltre, il metodo è molto flessibile rispetto alle applicazioni e analiti bersaglio.
Il disegno del microchip consente (i) effitrapping cellule ciente, (ii) la fornitura di varie tamponi e reagenti, e (iii) un isolamento sicuro in un volume molto piccolo quando richiesto. In questo modo si evita la diluizione delle molecole bersaglio. Sixty (a centinaia) di microchambers sono posizionati su un unico dispositivo che permette molti esperimenti in parallelo. Le valvole di forma circolare che chiudono le microchambers possono essere affrontate insieme o separatamente da righe o colonne, che è importante quando la contaminazione incrociata con camere adiacenti deve essere evitata. Con le microchambers chiusi, i canali possono essere trattati con l'acido come acido cloridrico per la pulizia senza intaccare le cellule intrappolate. D'altra parte, rapido scambio di volume interno alla microcamera è possibile. Attualmente un tempo minimo di 200 msec è necessaria per aprire completamente la camera e per introdurre nuovi reagenti (per sostituzione completa del volume microcamera, la portata deve essere considerato).
Mentre il nostro metodo è molto reliAble e riproducibile, si dovrebbe tenere a mente che ci sono due principali punti critici del protocollo di fabbricazione di chip e di funzionamento. In primo luogo, il legame dei due strati di chip dopo l'attivazione plasma deve essere fatto rapidamente. L'allineamento è critica, altrimenti alcune camere o addirittura l'intero chip non è utilizzabile, in quanto il legame è irreversibile. Questo passo potrebbe essere difficile per gli utenti inesperti, però, dopo qualche allenamento anche meno esperti tecnici di laboratorio di solito ottengono buoni risultati. Il secondo punto critico è la pulizia durante il montaggio e l'uso del microchip. Se le particelle di polvere sono presenti sulla superficie del chip, possono compromettere canali di controllo e le valvole o addirittura portare ad una rottura del PDMS-PDMS o legame PDMS-vetro. Abbiamo quindi spendere un sacco di attenzione alle procedure di pulizia. Va notato che, oltre la maschera master fabbricazione (eseguita in una camera pulita), prodotta ed utilizzata microchip in un ambiente di laboratorio normale, dove una polverend particelle sono presenti.
Nonostante tutte le cure, se le camere non chiudono correttamente, è possibile che sia linee di pressione sono bloccati o il processo di spin coating non hanno fornito lo spessore della membrana di destra. Inoltre, di volta in volta abbiamo osservato legame insufficiente, con conseguente rottura del legame tra i due strati PDMS. Se molti chip dallo stesso lotto mostrano questo problema, è possibile che il tempo tra l'attivazione del plasma e l'allineamento è troppo lungo. A volte, abbiamo sperimentato PDMS adesive sui wafer che non potevano essere adeguatamente rimossi ed era il risultato di un insufficiente silanizzazione del wafer.
Una volta stabilito il metodo di produzione, la piattaforma microfluidica può essere utilizzato per vari studi differenti sul livello di singola cellula. Qui, abbiamo dimostrato la rivelazione di agenti intracellulari e secreti con diversi dosaggi, ma molti altri saggi sono possibili sul chip. La maggior parte delle proteine non sono fluorescenti e la loro deprotezione tramite test immunologici non è semplice. Attuazione del ELISA nel chip porterà molti benefici. In primo luogo, il saggio può essere progettato in modo specifico per la proteina desiderata (quando sono presenti anticorpi adatti). In secondo luogo, le informazioni da ELISA può essere quantificata anche a limiti di concentrazione bassa, dando il numero di proteine o molecole copie presenti nella cellula.
La nostra attuale chip è progettato per l'analisi di cellule di mammifero singoli. Tuttavia, la modifica del chip per altre cellule come batteri, alghe e lievito, dovrebbe essere possibile. Fino ad ora, l'unica limitazione per gli esperimenti è la necessità di un saggio basato sulla fluorescenza. Tuttavia, stiamo attualmente studiando l'applicazione della spettrometria di massa come tecnica di rilevazione. Una volta stabilito questo, la gamma di problemi analitici che possono essere studiati con la piattaforma sarà ancora più ampio. Inoltre, poiché non ogni analisi è possibile in presenza di buffer di lisi cellulare, abbiamoattualmente valutando anche varie altre tecniche di lisi sulla piattaforma. Siamo sicuri che la piattaforma microfluidica versatile qui presentata costituisce la base per nuovi studi monocellulari sul proteoma, metaboloma e secretoma livello.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Tom Robinson per la lettura delle bozze del manoscritto, C. Bärtschi e H. Benz per la realizzazione del sistema di controllo della pressione custom-built. Vorremmo inoltre ringraziare l'uso della funzione stanza pulita prima e la microscopia ottica Center (LMC), sia presso l'ETH di Zurigo. Il lavoro è stato finanziato dalla Merck Serono e dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del 7 ° Programma Quadro (ERC Starting Grant, progetto n. 203.428, nμLIPIDs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
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