Summary
この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。
Abstract
私たちは、並行して複数の単一細胞における細胞内の生体分子の測定を可能とマイクロ流体デバイスを提供する。この目的のために、細胞を、受動的にマイクロチャンバーの中央に閉じ込められている。制御層の活性化の際に、細胞は、小さなチャンバ内の周囲の容積から隔離される。周囲の容積は、次いで、単離された細胞に影響を与えることなく交換することができる。しかしながら、チャンバの短い開閉時に、チャンバー内の溶液が数百ミリ秒以内に交換することができる。によるチャンバの可逆性のために、細胞は、インキュベーション、洗浄、そして最後に、細胞溶解のために、例えば、高度に制御可能な様式で異なる溶液を順次に露光することができる。密閉マイクロチャンバは、細胞溶解後の希釈を最小限にし、制御し、溶解物の保持を可能にする。溶解および分析は、同じ場所で発生しているため、高感度が、それ以上のDので保持されている分析物のilutionまたは損失は、輸送中に発生します。マイクロチャンバーの設計は、したがって、個々の細胞から放出され、細胞内の分子の非常に小さなコピー数（アトモル、ゼプトモル）の信頼性と再現性の分析を可能にします。さらに、多くのマイクロチャンバは、適切な光学機器を監視するために使用されることを考えると、一度に多くの細胞の分析を可能にするアレイ形式に配置することができる。我々はすでに、細胞内タンパク質、酵素、補因子および相対または絶対定量化可能な方法で、セカンドメッセンジャーを分析するための概念実証研究のためのプラットフォームを使用しています。
Introduction
過去の多くの研究は、特定のシグナル伝達プロセス4、またはこのようなタンパク質は、5,6、代謝産物、および補因子7,8のような細胞内の生体分子の量で、大きな細胞集団1-3内の細胞間の差異を明らかにした。これらの不均一性は、細胞適応と進化9根本的に重要であるが、また、例えば10-13癌などの疾患の出現および治療 に重要な役割を果たすと考えられている。したがって、単一細胞レベルでの研究は、これらの研究は、生物活性化学物質を用いた治療後の異なる細胞応答を明らかにする場合は特に、生物学的および薬理学的研究において高い関心が持たれている。
近年では、多くの分析プラットフォームは、単一の生細胞の分析または細胞内容物の化学組成を容易に開発されている。蛍光活性化細胞選別（FACS）がゴールドSTですがandard単一の生細胞の非常にハイスループット分析のために、この方法は、細胞内または分泌された化合物の定量に用いることができない。マイクロ流体プラットフォームの出現は、単セルの配置、治療および観察のための新規な分析的な戦略を約束した。マイクロ流体中のマイルストーンはクエイクや同僚14,15によって実現フレキシブルなPDMSバルブの統合に達した。これらのバルブは、彼らは例えば、二つの文化16を分離、チップ上の領域を分離することができるので便利です。さらに、それらは、単一細胞解析に特に適用可能であり、したがって、検体の希釈の問題を低減するのに役立つ。単一細胞分析のためのこのアプローチの電力は、最近ハンセンと平行な17の単一の細胞から数百の遺伝子発現を分析した共同研究者によって実証されている。
タンパク質および代謝産物を標的とする場合、分析は、適切なαの欠如のために非常に困難であるmplification方法、様々な本発明の化合物、および化学的性質におけるそのバリエーション多数。さらに、ほとんどの細胞内生体分子は、従って使用される分析方法は、高い感度を持っている必要があり、数千、数10 18のために、低コピー数で存在することが予想される。そのようなイムノアッセイおよび酵素結合免疫測定法（ELISA）のようなより強力なアッセイは、それらがいくつかの洗浄およびインキュベーション工程、ならびに表面固定化を必要とするため、マイクロ流体デバイスに統合することが困難である。
これらの課題に起因し、それは、タンパク質または代謝産物が単一細胞レベルで定量したところ、わずか数例が報告されていることは驚くべきことではない。例えば、蛍光化合物の分泌の研究は19,20が報告されている。近年、ELISAによる実装は、細胞培養物から分泌された（非蛍光）、タンパク質（THP-1細胞）の分析21と、単一の（iについて提示されたmmune）細胞10。細胞内タンパク質を標的とする、市らは、イムノアッセイ11によって腫瘍細胞におけるシグナル伝達経路の解析のための細胞内タンパク質の同定を容易にするマイクロ流体デバイスを開発した。しかし、タンパク質の相対量のみを測定し、まだ酵素的増幅は、低存在量タンパク質に対するシグナルを増加させるために使用されなかった。
最近では、蛍光アッセイ8とイムノアッセイ22（ 図1）とのシングルセルトラップマイクロデバイスを結合することができました。細胞を受動的に供給し、細胞のあらゆる動きのない媒体および他の化学物質の（急速）の交換を可能にするマイクロサイズハードル構造にトラップされる。各トラップの周囲にリング状の弁は、非常に少量（「マイクロチャンバー」）で、細胞を単離することができます。この弁は、彼、細胞溶解（低浸透圧）のバッファを導入した直後に作動するNCE離れて拡散する細胞内分子または分泌される分子を防止することができる。最も重要なことに起因する体積（plの625）のサイズが小さい分子の大きな希釈が回避される。溶解および分析は、チップの同じ位置で行われるので、輸送に起因する分析物の損失はない。ここに記載のチップ設計は、60マイクロチャンバー合計7または8のいずれかのマイクロチャンバ8の交互の行を含む。線に沿った相互汚染が排除されるように、チャンバは、列に作動される。
プラットフォームは、蛍光アッセイ、ならびに免疫学的ア ッセイ（ 図1d）と組み合わせて使用することができる。後者に関しては、チップ製造および組立工程と適合性である抗体の固定化のためのプロトコルを確立した。したがって、プラットフォームは、単一細胞レベルで、信頼性の高い感受性および定量化アッセイのための道を開く。これまで、我々は、iの分析のために装置を使用しているntracellularと分泌される酵素（酵素アッセイによる相対定量化）、細胞内の補因子、タンパク質と小分子（エンドポイントアッセイやELISAによる絶対定量）。以下では、マイクロコンタクト·プリンティングおよび界面化学を用いて多層ソフトリソグラフィーおよび抗体のパターニングのためのプロトコルを用いて、チップ製造プロセスを説明。さらに、チップの使用および操作のいくつかの例が示されている。
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Protocol
1。 SU-8マスター作製
以下のプロトコルが異なるマスクパターンで（回路図や寸法は、図2を参照してください、流体および制御）チャネルの両方のマスター金型を準備します。プロセスは、 図3aに示されている。
- 180℃で10分間、4インチのシリコンウェハを加熱することによって開始するスピンコーター上で脱水ウェハをロードし、スピンコート法、SU-8 2015年に次のプロトコルを使用します。
- （分注の後、このステップ、開閉蓋の間にSU-8を分配、スピンコーターのオープン蓋）20秒間100rpmでウエハを回転。
- 10秒500でスピンウエハ（これはウエハ全体上にレジストを広がっていく）。
- 30秒間、1,750 rpmでスピンウエハ（20ミクロンにレジストの高さを定義します）。
- これがそうでない場合、次の手順でホットプレートに固執するようにアセトン（綿棒を使用）と、ウエハのエッジからレジストを除去。ああにウエハを搬送4分間95℃、熱でotplate。ソフトベーク後に、（365nmで測定された150ミリジュール/ cm 2で）UV光でマスクアライナにおいてソーダ石灰ガラスをテーピングするフォトマスクを介してレジストを露光する。
- 露光後、ホットプレート上で95℃で5分間再度ウェハを加熱する。 RTにウェーハを冷却した後、4分間のSU-8現像液のお風呂にそれを浸す。未露光SU-8を削除するにはやさしく振る。クリーンルームグレードのイソプロパノールでウェーハを洗浄し、窒素でブロー乾燥。開発は（特に細胞トラップ）成功した場合、顕微鏡下で確認してください。細胞トラップが完全に開発されている場合は、シリコンウェハの反射が見えるはずです。必要に応じて、数分間、再びウェハを開発しています。
- 全ての残留溶媒を除去し、180℃で2時間、オーブン内でウェハを焼く。ステッププロファイラを有するチャネルの高さを確認してください。高さが所望の高さと異なる場合は、新たなウェハとステップ1.1から始めて、このプロトコルを繰り返し、スピン速度（ステップ1.1.3）を変更。 1H、1H、2H、一晩デシケーター内2H-パーフルオロ-ジメチルクロロシランとのウェハをシラン化によってマスター型の製作を最終決定。
2。マイクロコンタクトプリント用のマスター作製
- マイクロコンタクトプリンティングのためのマスターモールドを製造するために、180℃で10分間、シリコンウェハを脱水（レジストシラン化表面に良く付着）30秒間、7,500 rpmで、このウェハ上に1ミリリットルのHDMSをコートにスピン。 AZ1518のスピンコート2ミリリットルを正、このプロトコルのレジスト：
- ウェハに上のレジストの静的注する。
- 500 rpmで5秒間ウェハを回転。
- 4000 rpmで60秒間ウェハを回転。
- ホットプレート上で100℃で50秒間ソフトベークした後、フォトマスクを介して、マスクアライナ上にUV光（21ミリジュール/ 365 nmでのcm 2）のレジストを露光する。 75秒間AZ 726の浴槽にレジストを開発しています。 DI水とブローdで開発されたウェーハをリンス窒素でRY。 50秒間115℃でウェハを加熱して残留溶媒を除去。真空下で一晩ウェハSilanize。
3。マイクロ流体チップの作製
二層デバイスの設計は、これらの実験のために使用される。チップは最終的にガラススライド（ 図3b）上に接合される前に、二つの層は、別々に調製され、接合されている。このステップは、PDMS層の製造およびマイクロコンタクトプリント用PDMSスタンプを説明しています。
- 10時01 PDMSの混合物と硬化剤を準備します。 （私たちのデザインを使用して、これは10チップになります）、合計で約80グラムのPDMSを準備します。積極的に両方の部分を混合し、混合物は、バブルフリー（〜30分）になるまで、PDMSを脱ガス。
- シャーレとテープそれを底部に内部の制御層ウエハを配置します。次に、上にPDMSの約50グラム入れて完全な保証するために80℃のオーブンで少なくとも2時間、ウェハを置くPDMSの硬化。この〜20グラムのPDMSが必要なため、マイクロコンタクトプリント用ウエハに対して同じ手順を繰り返します。
- スピンコートウェーハ上にPDMSを2000回転の回転速度で流体層と約40μmの高PDMS層を形成した。 80℃で少なくとも1時間オーブンにPDMSを治す
- 両方の部分が硬化されると、ウエハから制御層を除去し、カミソリの刃を有する小片に切断した。 1mmの生検パンチャーを用いて圧力接続穴パンチ。ストレージのためには、チャネルを介してテープ片を置くことをお勧めします。
- 二つの層を接合するには、スピンコートされたウェハおよび上部を取り、プラズマクリーナー23に配置します。プラズマ処理後、速やかに大きな作動距離を有する顕微鏡下で両方の部品を整列させる。設置されたトップ部分の周りにいくつかの予備のPDMSを追加します。このステップは、しかし、それは、ウェハからPDMSの除去を容易に、必須ではありません。少なくとも1時間80℃のオーブン中にウェハを置き。
- 慎重にウェハからPDMSを除去し、マイクロチップをカットするメスを使用してください。 1.5ミリメートル生検パンチャーと流体接続のためのアクセスホールパンチ。
- PDMSチップは完了し、ヶ月間保存することができる。オプション：チップ貯水池で使用されている場合は、200μlのピペットチップの上部をカットし、その上に、それを接着するためにいくつかの予備、半硬化PDMSを使用しています。少なくとも1時間、80℃で再びオーブンにチップを置きます。
4。スライドガラスに接着
直接酵素アッセイ用のデバイスを使用するには、接合後に必要な唯一のステップでは、表面のブロックしています。このプロトコルでは、イムノアッセイまたはELISAのためのマイクロ流体チップを使用するように、しかしAに進み、唯一の（ つまり全反射顕微鏡またはSPR用）ガラススライドに結合部位を制限するプロトコルBを参照してください。この制限が重要でない場合は、Aを参照してください。ただし、手順4.3でビオチン化複合体を使用し、ステップ4.8に進んでプロトコルBで完全に機能面を作成します。
プロトコルAとBを実行する前に：それはチップにそれらを導入する前に使用したタンパク質のソリューションのすべてをフィルタリングすることをお勧めします。デブリおよびタンパク質凝集体は、そうでなければ、それによって分析のために使用することができるチャンバの数を減少させる、細胞トラップをブロックすることができる。この目的のために、チャネルにそれらを導入する前にすべてのソリューションをフィルタリングする非タンパク質吸着フィルターユニットを使用する。
プロトコルA（酵素アッセイ）
- マイクロ流体デバイスを完成させるために、スライドガラス上にPDMS部分を接着。これを行うには、まず、石鹸、蒸留水とエタノールでガラススライドを清掃してください。窒素気流を用いてスライドを乾燥させる。スコッチテープでのPDMS部分を清掃してください。
- PDMS部分と洗浄されたガラススライドはタイトな結合を保証するために18 W.にて45秒間、プラズマクリーナーに入れ、5分間、ホットプレート（100°C）上のチップを置く。
- 接合後、F、チップを埋めるLUIDは。これを達成する簡単な方法は、遠心力を使用することである。 200μlのピペットチップの下の部分をカットします。流体チャネルは、ブロッキング溶液でそれらを埋める（ウシ血清アルブミン（4％w / v）の、またはポリ-L-リジン）グラフト化ポリエチレングリコール（0.05％w / v）のおよび入口に先端を配置する。のいずれかで、水または等張液、 例えば PBSで制御層入口を埋める。 5分間遠心（800×g）でにチップを置きます。チャンネルは、現在は完全に流体を充填する必要があります。いない場合は、この手順を繰り返します。
- 室温で少なくとも30分間ブロッキング溶液をインキュベートする。シリンジポンプを用いて10μL/分の流速でPBSで流体層の外溶液を洗浄する。デバイスは現在、細胞実験の準備ができています。
プロトコルB（イムノアッセイ）
以降のステップ4.7からの表面改質の完全な概要については、 表1を参照してください。
- でBBSA / BSA溶液（ 例えば 1-100）とマイクロコンタクトプリント用cubate PDMSスタンプ。 30分後、蒸留水で十分にスタンプをきれいにし、窒素気流下でスタンプを乾燥させる。すぐに洗浄したガラススライドさせます（ 図4）にスタンプを配置します。
- プラズマクリーナーの最大電力で45秒（18 W）の酸素プラズマにマイクロ流体チップの上の部分と一緒にスタンプをガラススライドを公開します。プラズマ処理後、スタンプを削除して、デバイスのマイクロチャンバーの下に印刷面を合わせます。 50℃のホットプレート上で30分間チップを配置
- 残りの表面をブロックするには、遠心分離器を有するチップに滅菌ろ過したBSA溶液（4％（w / v）のPBS中）（ステップ4.2を参照）を導入。 1時間インキュベートし、PBSで流体層（ステップ4.3参照）から解決策を洗う。チップは、次いで、湿ったボックス内に4℃で直接使用するか、最大2週間保存することができる。
- 完全に機能的結合surfac用電子、リザーバ内アビジン（0.025％（w / v）のPBS中）を導入する。流体チャネルを介してアビジン溶液を引き出すために、30分間に5μl/分の流速を使用する。その後、10分間、PBSをフラッシュします。徹底的に貯水池をすすぐ。
- その後、プロテインG（0.0025％（w / v）のPBS）で、さらに30分間のフラッシュを追加する。その後さらに10分間PBSで洗浄します。次に、10分間、目的の抗体（0.0001％（w / v）のPBS中）を添加する。 10分後、結合を可能にする15分間の流れを止める。次に、10分間、PBSで洗浄する。
5。細胞実験
プロトコルは、可能性があるため、種々のアッセイの一般的な用語で書かれています。一例としてG6PDH毒性アッセイに必要な試薬が挙げられる。デバイスの初期細胞捕捉効率、 すなわち 200個の細胞のう ち5がトラップされ、約2.5％です。細胞トラップの最終的な占有率が強く使用される細胞株、サスペンドするプロトコルに依存し細胞株および細胞がチャネルを通ってフラッシュされる時間。天然に（例えば、U937など）、懸濁液中で増殖する細胞は、単一細胞は、数分後にチャンバの約75％において見出され得る。他の室のいずれかを充填し、2種類以上のセルによって占有されていない。一般に、単一のセル占有率は、接着細胞株についても小さい。ここに提示むしろ軽度の懸濁化プロトコルを使用する場合、割合は約30％（HEK、MLT細胞）に減少する。単一セルの占有率は、細胞のトリプシン処理によって改善することができるが、これはまた、実験の結果を変化させることができる。
標的分子に依存して、PDMSへの吸着または吸収が結果に影響を与えることができる。吸着は、BSA又はPLL-gの-PEGで表面を遮断することによって低減することができる。吸収はほとんどの親水性生体分子のための可能性は低いですが、それは（小）親油性の細胞成分を確認する必要があります。
- 特定のプロトコルに従って細胞を調製（ 例えば
- シリンジポンプと順方向の流れを使用してチップ上に細胞をロードするのではなく、細胞懸濁液を撤回する。チャネル壁上への細胞の非特異的付着を低減するため、接着剤の懸濁細胞株および10〜20μlの/分の高い流量のために5μl/分の流速を使用する。
- トラップが満たされると、チャンバーを閉じます。多くの細胞が表面に非特異的に付着すると、10から30μL/分の流速で細胞解離緩衝液でそれらを洗い流すようにしてください。
プロトコルA（酵素アッセイ）
- チップを通して溶解バッファーを撤回。この例では、この緩衝液を加えツイーン20（10mMトリス-HCl、10と低浸透圧緩衝液であるのKCl、1.5mMのMgCl 2、1％（v / v）のツイーン20）。溶解のための、すぐに開いたり閉じ室（10〜50μL/分7,21の流量のためのすなわち 500ミリ秒）。 G6PDHアッセイのために、2mMのグルコース-6 - リン酸、0.5mMのNADP、0.5 U / mlのジアホラーゼ、溶解緩衝液に0.3mMのレサズリンを加える。すぐに溶解後、運動反応の監視を開始。
注意 ：アッセイに適した任意のバッファを選択して、（トリトン、SDSのような）強い洗剤を溶解する細胞は直ちに室開口時の分析物の損失につながることを念頭に置いたが、裸。
プロトコルB（イムノアッセイ）
ELISA細胞実験（流量、チャンバー状態など ）の簡単な説明については、 表1を参照してください。
- ELISAのために、直接溶解バッファーに必要な検出試薬（ 例えば二次抗体、標識抗原）を追加します。ここには、気取っを追加しましたN 20は、非特異的吸着を低減します。ステップ5.4に従った細胞を溶解。 （使用される抗原および抗体に応じてインキュベーション時間）に結合できるように、10〜15分間混合物をインキュベートする。
- チャンネル壁に非特異的に吸着した抗体酵素複合体は、リザーバおよびチャネル内部で既に検出試薬の転換につながることができます。この吸着による問題を低減するために、（チャンバは検出試薬を添加する前に、閉じた状態）インキュベーション時間の間、チップに使用される検出酵素の永久的な阻害剤を洗い流す。 HRPの、永続的に非特異的に吸着した酵素を不活性化するために、水に20 mMの塩酸を使用しています。
- インキュベーション時間の後、チップへの検出試薬（ 例えば、アンプレックスレッドとHRPのための過酸化水素）を導入する。離れて非結合二次抗体を洗浄するためにすぐにもう一度室を開き、検出試薬を追加する。すぐに運動反応の監視を開始。
- キャリブレーション：固定化し目的の標的に対する抗体。閉じる室。バッファ内またはオフチップ細胞溶解液中の分析物の異なる濃度を準備します。チップに濃度を適用し、迅速室（開放時間500ミリ秒）内の容積を交換します。この開放時間は、追加の蓄積が検体フラッシングから発生せず、マイクロチャンバーの容積からの分子の特定の数が検出されることを保証するのに十分に短い。ソリューション内部の抗原の既知濃度と室の容量（625 PL）から、室内に金額を計算します。その後、ステップ5.5を続行し、検出部分を紹介します。
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Representative Results
当社のプラットフォームは、細胞内の様々なだけでなく、中に存在するか、単一の細胞によって産生され分泌される分子を分析することができます。ここで、我々は可能な様々なアッセイを強調するために、異なる例の研究を紹介したいと思います。我々は、分泌酵素（ 図5a）だけでなく、細胞内の酵素（ 図5b）とタンパク質（ 図5CおよびD）のための例を与える。このような補因子または小分子などのより多くの例については、Eyer ら （2012）およびEyer ら （2013）を参照してください。
まず、分泌された酵素（ 図5a）のためのアッセイを提供する。ホルボールミリステートアセテート（PMA）による活性化の際に、ヒト単球、リゾチーム分泌、細菌の細胞溶解を誘導する酵素を誘導する。このアッセイのために、セルバッファは、4 - メチルβ-D-N、N'-diacetylchitobioside、lysoz弱蛍光基質が含まれていますYME。酵素によって糖残基の切断の際に、フルオロフォアが遊離され、チャンバの内部に検出することができる。ここで、マイクロチャンバの利点は、短い時間期間内の低酵素濃度の検出を可能にする、分泌された酵素の希釈を最小化である。 図5aにおいて、いくつかの例示的な曲線は、単一の刺激U937細胞から分泌されたリゾチームの酵素的代謝回転を表す示す。 U937細胞株は、組織球性リンパ腫を有する患者に由来し、端末単球分化を誘導することができる。細胞株は、PMAで刺激した後、TNFα、リゾチーム、β2-マイクログロブリンを生成します。いいえ売上高は、オープンチャンバまたは無細胞室（破線）で検出可能ではありません。
図5bは、細胞内酵素、ここではグルコース-6 -リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）の相対定量化を示す。 G6PDHは、ハウスキーピングタンパク質であり、同じ組織起源の細胞はいけないそのG6PDH濃度24で大きく変化。ここで、U937細胞をチャンバー内に閉じ込められていた、我々は、溶解緩衝液と一緒にG6PDHの検出のための蛍光アッセイを供給する。これは、グルコース-6 - リン酸、NADPH、酵素ジアホラーゼおよびG6PDHが存在する場合、蛍光レゾルフィンに変換される基質レサズリンからなる。経時的な蛍光の増加率はG6PDHの量に対応する。マイクロチップは、さらに、定義された時間（60分）毒素（ここカンプトテシン）で細胞をインキュベートすることによって、例えば毒性化合物の効果についての研究を容易にする。この処理の後、放出された酵素が洗い流さし、細胞を溶解し、G6PDHのレベルを測定した。実際、細胞内酵素の含有量の有意な損失は、蛍光のより遅い増加（ 図5bに赤い線と列）に表示されていた。本試験の詳細は、Eyer らで見つけることができます。8
e_content」は>さらに、本発明者らは、細胞内のGFP量の分析のための免疫アッセイからの結果を示す。誘導性発現のために、T-REX発現系でトランスフェクトしたHEK293細胞を、このシステムでは、GFP発現がテトラサイクリンの添加によって誘導することができるインキュベーションの8時間後、細胞を懸濁したチップ上に流し、捕捉され、その後、溶解し、抗GFP抗体を細胞から放出GFPを結合するためにここに提示プロトコールに従って、ガラス表面上に固定したキャプチャー。 図5cに抗体へのGFPの結合動態を示し、この例では、GFPに直接起因したタンパク質の蛍光に全内部蛍光顕微鏡によって測定することができる。我々は、非蛍光性タンパク質はまた、サンドイッチELISA又は類似の方法を使用することによって検出することができることを強調したいフォーマットが、この場合、必要なアッセイ成分は、洗浄工程の後に導入することができる。ELISAの利点は、信号の増幅である酵素に、マイクロチャンバー内に蓄積された蛍光生成物を得た。最後に、我々は、標的タンパク質としてGAPDHを有する単一セルのサンドイッチELISAを提示したいと思います。我々は、U937懸濁細胞におけるGAPDHならびに付着HEK293細胞（ 図5d）を決定した。このために、我々は、抗GAPDH抗体（捕捉抗体）を固定化した。細胞溶解後、第二の酵素標識抗体（検出抗体）を導入した。室が開かれ、流れに起因して、結合していない検出抗体を洗い流したとアンプレックスレッドたチャンバーに導入されました。 HRP（検出抗体）を蛍光性レソルフィンするアンプレックスレッドの変換は、同時にすべてのマイクロチャンバー60内の経時的にモニターした。反応の直線部分の傾きから決定した。この勾配は、直接、分析物の濃度に、従って、酵素の濃度に相関している。単一U937細胞からの結果は、GAPDHの平均を示した2.0と3.2アトモルの最小と最大値で2.6アトモルの量は、それぞれ。 46 HEK細胞のデータ分析は、これらの細胞は、平均2.5アトモルのGAPDH（;最大4.1アトモル最小限0.9アトモル）に含まれていることを明らかにした。
図1。異なるアッセイのマイクロデバイスと回路図を提示した。A）組み立てマイクロデバイス。ここでは、チャンバは、可視化のために、フルオレセイン（緑色蛍光）で充填される。また、目に見えるリザーバは、制御層（バック内の圧力、2×4コネクタは右に左とフロント）およびシリンジポンプ（前面）に接続するための接続です。B）マイクロチャンバー領域を拡大。これらのチャンバの多くは、アレイ状に配置することができる。可視化のために、オレンジ色の食用色素が、一方、チャンバーの内部に単離された緑色食品色素はチャネルを通じてフラッシュされます。圧力制御層は水で満たされている。c）の拡大は、単一マイクロチャンバーにするd）デバイスの動作の概略図。マイクロチャンバー（側面図）の中に、単一細胞を捕捉され、単離される。細胞は、刺激インキュベートし、洗浄し、最後にチップ内で溶解することができる。携帯コンテンツは、蛍光部分が反応（左）の際に発生される酵素や補酵素についてのアッセイを直接分析することができます。他のタンパク質については、表面は、標的タンパク質（右）に特異的に結合する抗体で修飾することができる。抗原が表面に結合されているので、溶解物を洗い流すことができ、そのような二次抗体である検出分子は、標的タンパク質を定量するために添加することができる。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2。流体層のチャネルシステムとマイクロチャンバーの寸法の概略。A）マスク設計。流体層は、（左から右へ）アウトレット、チャンバ領域は、粒子と細胞クラスターを保持するためのフィルタと入口で構成されています。ウェーハ内の4は10のチップを製造するための構造を抱くことができます。対応する制御層のB）マスク設計。アライメントに必要なスペースに、ウエハ4が5チップの生産のための構造が含まれています。Cにより）整列層の回路図（左）と細胞トラップ（右）、長さスケールとの両方を示す拡大。 見るにはここをクリックしてください拡大表示 。
図3。 SU-8処理およびPDMSの産生の概略であって、a）SU-8加工プロトコルの概略図。シリコンウエハーにスピンコートSU-8で4分間、95℃でソフトベークされる。所望のマイクロ流体チャネルの設計は、フォトマスクとUV光露光を用いたSU-8上に転写される。露光後ベーク（95°C、5分間）した後、SU-8を現像すると、ハードベーク2時間180℃でマイクロ流体チップ製造のb）の模式図。 PDMSオリゴマーと硬化剤の混合物をスピンコート流体チャネルのマスターフォーム上にあり、制御層にマスターフォーム上に注いだ。チャンネルネガはピンクで描かれている。両層は、オーブン内で硬化される。制御層のチップ部品は、ウエハ（青色における制御チャネル）から分解され、圧力接続用の穴が（白）打ち抜く。部品·制御の両方と流体層-は酸素プラズマ中に入れ、その後、それらが整列して接合されている。 （白）、チップ全体は、その後、流体マスターフォーム（赤の流体流路）から分解され、流体アクセス孔が打ち抜かれる。最後に、チップとガラススライドを酸素プラズマ中で表面活性化した後に接着されている。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。ソフトリソグラフィ用のマイクロコンタクトプリントの概略。A）マスター製作。 （1）PDMSスタンプはタンパク質（BBSA）溶液と共にインキュベートする。 （2）溶液が除去され、スタンプを洗浄し、タンパク質の単分子層は、スタンプ上に残っている。 （3）タイムスタンプ、それによってタンパク質が、ガラスシュールに転送され、スライドガラス上に配置される顔。この時間の間に、ガラス上のスタンプと一緒にマイクロチップを酸素プラズマにさらされている。 （4）スタンプが除去され、マイクロチップ、ガラススライドに接合されている。可視化のため、2例の構造は、示されている蛍光BSA-フルオレセイン結合体で印刷された。室あたりのB）マイクロコンタクト印刷領域。印刷室が揃っていないので、我々は、3つの異なるチップ（番号1-3）およびすべての60マイクロチャンバー上の結合スポット（印刷領域）のバリエーションを評価した。これにより、チャンバ間ばらつきが比較的小さい（<2.5％）およびチップ間変動性がチャンバにプリント構造を位置合わせする必要が確かに存在しないことを実証し（<1％）ごくわずかであった。 安心ここで拡大画像を表示します 。
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図5。 G6PDH、リゾチーム、GFP及びGAPDHアッセイからの結果 。単一細胞からの代表的な結果。A）酵素の分泌。左：ここに分泌された酵素のアッセイの概略図、リゾチーム。リゾチームは、単一の、PMA-活性化されたU937細胞によって分泌され、それは、蛍光4 - メチルウンベリフェロンの生成を触媒する場合、閉じたマイクロチャンバーの内部に蓄積される。右：分泌実験から得られたデータ。緑の曲線も、細胞を含まないチャンバー（黒、点線）が図示され、比較のため、1セルの占有室のための経時的な蛍光強度を示しています。つの細胞における細胞内の酵素のb）の検出。左：細胞内酵素のG6PDHためのアッセイの概略図。細胞溶解の際に、細胞内のG6PDHは、酵素反応カスケードのための他の成分が存在するチャンバ内に放出される。右：例の曲線と、代表的なデータ。シングルU937細胞は、それらの酵素含量（黒）について分析した。単一細胞の細胞内タンパク質の膜透過化カンプトテシンの毒性影響されると、酵素の三分の二が（オレンジ色）を失った。C）イムノアッセイ。左：イムノアッセイの図、ここでは細胞内タンパク質GFPについて。抗GFP抗体は、本明細書に記載のプロトコルに従って、表面上に固定化した。次いで、細胞をチップ上に溶解し、結合スポットをTIRF顕微鏡を用いて経時的にモニターした。右：固定化抗体にGFPの結合動態を示すような実験からグラフ。時点1は、溶解緩衝液の導入をマークする。時点2において、GFPは、細胞溶解が発生したことを意味し、表面に蓄積し始めている。抗体へのGFPの結合は、時点3 d）の単一細胞の細胞内タンパク質のサンドイッチELISAで完了する。左：細胞内タンパク質GADPHはこちらサンドイッチELISAの概略。反-GAPDH抗体は、本明細書に記載の表面記載のプロトコル上に固定化した。次いで、細胞を溶解し、チップ上でインキュベートした。抗体に結合した遊離GPADHは、チャンバーを洗浄し、検出抗体（HRP結合）を導入した。最後のステップにおいて、非結合検出抗体を洗い流した検出試薬を導入し、反応を経時的にモニターした。右：U937およびHEK293細胞内のGAPDHの定量拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
ELISA用の表面改質プロトコル
| ステップ | 時間 | 濃度 | 流量 | 流れのないインキュベーション時間 | 室オープン/クローズ | ||
| [分] | （w / v）の％ | [μL/分] | [分] | </ TD> | |||
| BSA | 30 | 4 | - | オープン | |||
| PBS | 10 | 5 | オープン | ||||
| アビジン | 30 | 0.025 | 5 | オープン | |||
| PBS | 10 | 5 | オープン | ||||
| プロテインG、ビオチン | 30 | 0.0025 | 5 | オープン | |||
| PBS | 10 | 5 | オープン | ||||
| 抗体 | 20 | 0.0001 | 5 | 15 | オープン | ||
| PBS | 10 | 5 | オープン | ||||
| 細胞 （300,000細胞/ ml） | 〜5 | 30 | トラップが占有されたら、[閉じる。 | ||||
| 溶解バッファー | 5 | 30 | オープン間もなく | ||||
| 阻害剤（ 例えば 20mMの塩酸） | 15 | 10 | 閉じた | ||||
| PBS | 2 | 30 | 閉じた | ||||
| 検出試薬 | 5 | 30 | オープン間もなく | ||||
| 反応の監視を開始 | |||||||
表1。表面modificatioELISA用Nプロトコル。説明については、テキストを参照してください。
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Discussion
マイクロフルイディクス技術は、単一細胞分析のための新しい魅力的な可能性を開いた。具体的には、トラップする可能性と、マイクロ流体ツールで個別に細胞を固定は、単一セルのプロパティと対応に関する体系的な短期的および長期的な研究を可能にした。また、マイクロチップ上に発生した高周波微小液滴、中の細胞のカプセル化は、従来のフローサイトメトリー装置を用いて実施することができない単一の細胞分泌の研究を可能にした。インキュベーションおよび洗浄工程が分析プロトコルに必要とされるときに微小液滴のアプローチは、しかしながら、いくつかの制限がある。我々のアプローチは、細胞捕捉および分離の両方の概念を結合し、したがって、それは、表面固定化抗体に基づく免疫アッセイを含む、より複雑なアッセイを実施することが容易になる。さらに、この方法は、アプリケーションとターゲット分析物に対して非常に柔軟である。
マイクロチップのデザインは、（i）効率を可能にする効率の良い細胞捕捉、種々の緩衝液および試薬の（II）の供給、そして非常に少量（III）信頼性の高いアイソレーションが必要です。このようにして、標的分子の希釈が回避される。六十マイクロチャンバーの（数百）は、並行して多くの実験を可能にする単一のデバイス上に配置されている。マイクロチャンバを閉鎖円形バルブは、隣接するチャンバへのクロスコンタミネーションを防止する必要があるときに重要である、行または列によって一緒にまたは別々にアドレス指定することができる。マイクロチャンバを閉じた状態で、チャネルは、捕捉された細胞に影響を与えることなく目的を洗浄するための塩酸などの有害な溶液で処理することができる。一方、マイクロチャンバー内の体積の迅速な交換が可能です。現在、200ミリ秒の最小時間は、（マイクロチャンバー容積の完全な交換のために、流量を考慮しなければならない）完全にチャンバを開くために、新たな試薬を導入するために必要とされる。
私たちの方法は非常にRELですがiableで再現性のある、1は、主に2つの重要な点は、チップ製造やオペレーションのプロトコルであることを覚えておいてください。まず、プラズマ活性化後の2つのチップ層の接合を迅速に行わなければならない。アライメントは、そうでなければ、いくつかの室が重要であるか、結合が不可逆的であることからしても、チップ全体では、使用できません。このステップは、しかし、いくつかの訓練の後であっても経験の少ない研究室の労働者は通常、良好な結果を得る、経験の浅いユーザーのために困難である可能性があります。第2の臨界点は、組み立てとマイクロチップの使用中に清浄である。ダスト粒子は、チップの表面上に存在する場合、それらは、制御チャネルおよびバルブを損なう、あるいはPDMS-PDMS又はPDMS-ガラス結合の破壊につながる可能性がある。したがって、我々は、清掃手順に注意の多くを費やす。それは、（クリーンルームで行う）マスターフォームの製造のほかに、私たちが生産し、通常の実験室環境、粉塵Aのマイクロチップを使用することに留意すべきであるND粒子が存在している。
チャンバが正しく閉じていない場合、すべてのケアにもかかわらず、それが圧力ラインのいずれかがブロックされるか、またはスピンコート法が右の膜厚を提供しなかったことであり得る。また、時々、我々は2のPDMS層の間の結合の切断で、その結果、不十分な結合を観察した。同じバッチからの多数のチップは、この問題を示している場合には、プラズマ活性化と配向との間の時間が長すぎる可能性がある。時々、我々は適切に除去することができなかったウェハ上に粘着性のPDMSを経験し、ウェハの不十分なシラン化の結果であった。
製造法が確立されると、マイクロ流体プラットフォームは、単一細胞レベルでの多くの異なる研究のために使用することができる。ここでは、様々なアッセイと細胞内および分泌される物質の検出を示したが、他の多くのアッセイは、チップ上で可能です。ほとんどのタンパク質は、蛍光ではなく、そのデイムノアッセイ経由tectionは簡単ではありません。チップにELISA法の実装では、多くの利益をもたらすでしょう。第一に、アッセイは、（適切な抗体が存在する場合）は、所望のタンパク質を非常に特異的に設計することができる。第二に、ELISAからの情報は、細胞中に存在するタンパク質または分子コピー数を与え、たとえ低濃度限界で定量することができる。
我々の現在のチップは、単一の哺乳動物細胞の分析のために設計されている。しかしながら、このような細菌、藻類および酵母などの他の細胞のためのチップの変形が可能であるべきである。これまでの実験のための唯一の制限は、蛍光に基づくアッセイの必要性である。しかし、我々は現在、検出技術などの質量分析の実施を検討しています。これが確立されると、プラットフォームを調べることができる分析の問題の範囲はさらに広いとなります。さらに、必ずしもすべての分析は、細胞溶解緩衝液の存在下で可能であるので、我々現在、プラットフォーム上の他の様々な溶解技術を評価している。我々はここに提示され汎用性の高いマイクロ流体プラットフォームはプロテオーム、メタボロームとセクレトームレベルでの新たな単一細胞研究のための基礎を提供すると確信しています。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
作者は感謝して特注の圧力制御システムの構築のために原稿の校正のためのトム·ロビンソン、C.BärtschiおよびH.ベンツを認める。我々はまた、両方のスイス連邦工科大学チューリッヒ、クリーンルーム施設FIRST光学顕微鏡センター（LMC）の使用を承認したいと思います。作業は第7次フレームワークプログラム（ERCの開始グラント、プロジェクト番号203428、nμLIPIDs）の下でメルクセローノと欧州研究会議（ERC）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
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