Summary
이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.
Abstract
우리는 병렬로 복수의 단일 세포에서 세포 내 생체 분자의 정량적 측정을 가능하게하는 미세 유체 장치를 제시한다. 이를 위해, 세포는 수동적 microchamber의 중간에 갇혀있다. 제어 층의 활성화시에, 셀은 작은 챔버에서 주변 볼륨으로부터 분리된다. 주변 음량은 고립 셀에 영향을주지 않고 교환 될 수있다. 그러나, 챔버의 짧은 개방 및 폐쇄시에, 챔버 내 용액을 몇 백 밀리 초 내에서 대체 될 수있다. 때문에 실의 가역성에, 세포 배양, 세척, 및 최종적으로, 세포 용해 예 : 고도로 제어 가능한 방식으로 다른 솔루션을 순차적으로 노출 할 수있다. 단단히 밀봉 microchambers은 해물의 유지를 가능하게 최소화하고 세포 용해 후 희석을 제어 할 수 있습니다. 용해 및 분석은 동일한 위치에서 발생하기 때문에, 고감도가 유지되어 더 이상의 D보기 때문에분석의 ilution 또는 손실이 운송 중에 발생합니다. microchamber 디자인 따라서 각각의 세포에서 방출 세포 내 분자 (아토 몰, zeptomoles)의 매우 작은 크기의 숫자의 신뢰성과 재현성 분석을 가능하게한다. 또한, 많은 microchambers 적합한 광학 기기가 모니터링을 위해 사용되는 관련 한번에 많은 세포의 분석을 가능하게 배열 형식으로 배열 될 수있다. 우리는 이미 세포 내 단백질, 효소, 보조 인자 및 상대 또는 절대 하나를 정량화 할 수있는 방법으로 두 번째 메신저를 분석하기 위해 개념 증명 연구를위한 플랫폼을 사용하고 있습니다.
Introduction
과거의 많은 연구는 세포에 세포 대 세포 인구 1-3 이내의 차이, 특히 신호 4를 처리, 또는 단백질 5,6, 대사 및 보조 인자 7,8 세포 내 생체 분자의 양을 제시했습니다. 이러한 이질성은 세포의 적응과 진화 9 근본적으로 중요 할뿐만 아니라, 암과 10-13과 같은 질병의 출현 및 치료에 중요한 역할을하는 것으로 간주됩니다. 따라서, 단일 세포 수준에서의 연구는 이러한 연구는 생리 활성 화학 물질로 처리 한 후 다른 세포 반응을 표시하는 경우 특히, 생물학적, 약리학 적 연구에 높은 관심이다.
최근, 많은 분석 플랫폼은 하나의 살아있는 세포의 분석이나 세포 함량의 화학 성분을 용이하게 개발되었다. 형광 활성 세포 정렬 (FACS)는 금 성 동안andard 단일 살아있는 세포의 매우 높은 처리량 분석을 위해,이 방법은 세포 내 또는 분비 화합물의 정량에 이용 될 수 없다. 미세 유체 플랫폼의 출현 위치, 치료 및 단일 세포의 관찰에 대한 새로운 분석 전략을 약속했다. 미세 유체의 이정표가 지진 및 동료 (14, 15)에 의해 실현 유연한 PDMS 밸브의 통합에 도달 하였다. 그들은 칩 영역을 분리 할 수 있기 때문에이 밸브가 유용합니다, 예를 들어, 두 문화 (16)를 분리합니다. 게다가, 그들은 단일 세포 분석에 특히 적용 가능하며, 따라서 분석 희석의 문제를 줄일. 단일 세포 분석을위한이 방법의 파워는 최근 한센 평행 17 단셀 수백 개 유전자 발현을 분석하는 동료에 의해 입증되었다.
단백질 및 대사 산물을 대상으로하는 경우, 분석 인해 최적의 부족으로 아주 어렵다mplification 방법, 다른 본 발명의 화합물 및 화학 특성에서의 변화의 큰 수입니다. 또한, 대부분의 세포 내 생체 분자가 몇 가지 수만 18의 순서로 낮은 사본 번호에 존재하는 것으로 예상된다, 따라서 사용 된 분석 방법은 높은 감도를 가지고 있어야합니다. 이러한 면역 효소 결합 면역 분석법 (ELISA)와 같은보다 강력한 분석은 여러 세척 및 배양 단계뿐만 아니라 표면의 고정을 필요로하기 때문에 마이크로 유체 장치에 통합하기가 어렵습니다.
때문에 이러한 문제로, 그것은 단백질 또는 대사 산물이 단일 세포 수준에서 정량화 된 곳에서만 몇 가지 예는보고 된 것은 놀라운 일이 아니다. 예를 들어, 형광 화합물의 분비 연구 19,20보고되었다. 최근, ELISA와 구현은 세포 배양에서 분비 (비 형광) 단백질 (THP-1 세포) (21)와 하나의 (난의 분석을 제시했다mmune) 세포 10. 세포 내 단백질을 표적시 등이. 면역 측정법 (11)의 수단에 의해 종양 세포에서의 신호 전달 경로의 분석을위한 세포 내 단백질의 식별을 용이하게 미세 유동 장치를 개발했다. 그러나, 단백질의 단지 상대적인 양을 결정하고, 어떤 효소 증폭 낮은 풍부한 단백질에 대한 신호를 증가하는 데 사용되지 않았다.
최근에는 형광 분석법 (8) 및 면역 분석 (22)와 단일 셀 트래핑 마이크로 디바이스 (도 1)에 결합 할 수 있었다. 세포는 수동적으로 공급하고 세포의 움직임이없는 매체 및 기타 화학 물질의 (빠른) 교환을 할 수 microsized 장애물 구조에 갇혀있다. 각 트랩의 주위에 고리 모양의 밸브는 매우 작은 양 ( "microchamber")에서 세포의 분리를 가능하게한다. 이 밸브는 바로 그가, 세포 용균 (hypoosmolar) 버퍼를 도입 한 후 작동되는NCE 멀리 확산 세포 내 분자 또는 분자의 분비를 방지한다. 가장 중요한 점으로 인해 부피 (625 PL)의 작은 사이즈에 분자의 대규모 희석은 회피된다. 용해 및 분석을 칩의 동일 위치에서 수행되기 때문에 한층, 운송에 의한 분석 물질의 손실이 없다. 여기에 설명 된 칩 설계는 60 microchambers 총 7,8 어느 microchambers 13 교번 행을 포함한다. 라인을 따라 교차 오염이 배제되도록 챔버, 행에 작동된다.
플랫폼은 형광 분석법뿐만 아니라 면역 분석법 (도 1D)와 조합하여 사용할 수있다. 후자의 경우에, 우리는 칩 생산 및 조립 공정과 호환되는 항체의 고정화를위한 프로토콜을 확립. 따라서 플랫폼은 단일 세포 수준에서, 중요한 신뢰성과 정량 분석을위한 길을 엽니 다. 지금까지, 우리는 I의 분석 장치를 사용했다ntracellular 분비 효소 (효소 분석에 의해 상대 정량), 세포 내 보조 인자, 단백질과 작은 분자 (엔드 포인트 분석 또는 ELISA에 의한 절대 정량). 이하에서, 우리는 마이크로 콘택트 프린팅 및 표면 화학에 의해 다층 소프트 리소그래피 및 항체의 패터닝을위한 프로토콜에 의해 칩의 제조 공정을 설명한다. 또한, 칩의 사용과 작업의 몇 가지 예는 제공됩니다.
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Protocol
1. SU-8 마스터 제작
다음과 같은 프로토콜을 사용하지만 서로 다른 마스크 패턴 (회로도 및 치수는 그림 2 참조, 유체 제어) 채널을 모두 마스터 금형을 준비합니다. 공정은도 3a에 도시된다.
- 180 ℃에서 10 분 동안 4 인치 실리콘 웨이퍼를 가열함으로써 시작 스핀 코터에 탈수 웨이퍼를 넣고 스핀 코팅 SU-8 2015 년 다음과 같은 프로토콜을 사용합니다 :
- (분배 후이 단계 닫아서 동안 SU-8을 분배, 스핀 코터의 열린 뚜껑) 20 초 동안 100 rpm에서 웨이퍼를 스핀.
- 10 초 동안 500 rpm으로 회전 웨이퍼 (이것은 웨이퍼 전체에 저항을 전파합니다.)
- 30 초 동안 1,750 rpm으로 회전 웨이퍼 (20 μm의 저항의 높이를 정의한다).
- 이것은, 그렇지 않으면 다음 단계에서 열판 행할 것이다 아세톤 (면봉을 사용)와 함께 웨이퍼의 에지로부터 레지스트를 제거한다. 아 웨이퍼 이동4 분 동안 95 ° C 열에서 otplate. 소프트 베이크 후, (365 nm에서 측정 된 150 엠제이 / cm 2) 자외선 마스크 얼 라이너에 유리 소다 라임에 녹화 포토 마스크를 통해 저항을 노출합니다.
- 노출 후, 핫 플레이트에서 5 분 동안 95 ° C에서 다시 웨이퍼를 가열한다. RT에 웨이퍼를 냉각 한 후 4 분간 SU-8 개발자의 목욕에 젖어. 노출되지 않은 SU-8을 제거하기 위해 부드럽게 흔들어. 클린 룸 등급의 이소프로판올로 웨이퍼를 세척하고 질소로 건조한다. 개발 (특히 세포 트랩)에 성공하면 현미경으로 확인합니다. 셀 트랩이 완전히 개발하는 경우, 실리콘 웨이퍼의 반사 표시해야한다. 필요한 경우, 몇 분 동안 다시 웨이퍼를 개발한다.
- 모든 잔류 용매를 제거하기 위해 180 ° C에서 2 시간 동안 오븐에서 웨이퍼를 굽는다. 단계 프로파일과 채널의 높이를 확인합니다. 높이가 원하는 높이와 다를 경우,이 프로토콜은 새로운 웨이퍼 단계 1.1에서 시작하여 반복회전 속도 (단계 1.1.3)를 변경합니다. 1H, 1H, 2H, 하룻밤 데시 케이 2H-퍼플 루오로 데실-dimethylchloro 실란과 웨이퍼 silanizing하여 마스터 몰드의 제조를 완결한다.
2. 미세 접촉 인쇄를위한 마스터 제작
- 마이크로 콘택트 인쇄 마스터 주형을 제조하기 위하여, 180 ℃에서 10 분 동안 실리콘 웨이퍼를 탈수 (저항이 실릴 화 표면에 잘 부착) 30 초 동안 7,500 rpm에서이 웨이퍼에 1 ㎖의 HDMS을 코트에게 스핀. AZ1518의 스핀 코트 2 ㎖ 긍정적이 프로토콜을 사용하여 저항 :
- 정적 분배는 웨이퍼에 저항한다.
- 500 rpm에서 5 초 동안 웨이퍼를 스핀.
- 4000 rpm에서 60 초 동안 웨이퍼를 스핀.
- 핫 플레이트에서 100 ° C에서 50 초 소프트 베이크 후, 노출하는 포토 마스크를 통해 마스크 얼 라이너에 UV 광 (365 nm에서 21 엠제이 / cm 2)에 저항한다.에게 75 초 동안 AZ (726)의 욕조에 저항을 개발한다. DI-물과 타격 D로 개발 된 웨이퍼를 씻어질소, 공예. 50 초 동안 115 ° C에서 웨이퍼를 가열하여 잔류 용매를 제거합니다. 밤새 진공 하에서 웨이퍼 Silanize.
3. 미세 유체 칩의 제조
이층 장치 설계는 이들 실험을 위해 사용된다. 칩 최종적 유리 슬라이드 (도 3b)에 접착되기 전에 두 층은 별도로 준비되어 함께 접착된다. 이 단계는 PDMS 층의 제조 및 마이크로 콘택트 인쇄 PDMS 스탬프를 설명한다.
- 10:1 PDMS의 혼합 및 경화제를 준비합니다. 총 약 80 g의 PDMS를 준비합니다 (우리의 디자인을 사용하여,이 10 칩 발생합니다). 혼합물이 자유로운 거품 (~ 30 분) 될 때까지 적극적으로하고 가스를 제거 두 부분 PDMS를 섞는다.
- 바닥에 페트리 접시와 테이프를 내부 제어 계층과 웨이퍼를 놓습니다. 다음으로, 위에 PDMS의 ~ 50g을 넣어 완전한 보장하기 위해 80 ° C의 오븐에서 최소 2 시간 동안 웨이퍼를 넣어PDMS의 경화. ~ 20g의 PDMS가 필요한이를 위해, 마이크로 콘택트 프린팅 웨이퍼에 대해 동일한 절차를 반복한다.
- 스핀 코트 웨이퍼상의 PDMS를 2000 rpm의 회전 속도로 유체 층을 약 40 ㎛의 높이 PDMS 층을 형성한다. 80 ℃에서 최소 1 시간 동안 오븐에서 PDMS 치료
- 두 부분이 경화 될 때, 웨이퍼로부터 제어 층을 제거하고 면도날 조각으로 잘랐다. 1mm 생검 펀치를 사용하여 압력 연결 구멍을 펀치. 스토리지의 경우, 채널을 통해 테이프의 조각을 넣어하는 것이 바람직하다.
- 두 층을 결합하기 위해, 스핀 코팅 웨이퍼와 상단 부분을 플라즈마 클리너 (23)에 배치합니다. 플라즈마 처리 후, 신속하게 큰 작동 거리를 가진 현미경으로 두 부분을 맞 춥니 다. 배치하는 상단 부분의 주위에 약간의 여분의 PDMS를 추가합니다. 그러나이 단계는 웨이퍼로부터 PDMS의 제거를 용이하게, 필수 아니다. 적어도 1 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 웨이퍼를 배치.
- 조심스럽게 웨이퍼에서 PDMS를 제거하고 마이크로 칩을 잘라 메스를 사용합니다. 1.5 mm 생검 펀치와 유체 연결에 대한 액세스 구멍을 펀치.
- PDMS 칩은 현재 완료와 달 동안 저장 될 수있다. 옵션 : 칩이 저수지와 함께 사용되는 경우, 200 μL 피펫 팁의 상부를 잘라 상단에 접착제 일부 예비, 반경 화 PDMS를 사용합니다. 적어도 1 시간 동안 80 ° C에서 다시 오븐에 칩을 넣어.
4. 유리 슬라이드에 결합
직접 효소 분석을위한 장치를 사용하려면, 접합 후 필요한 유일한 단계는 표면의 차단입니다. 이 프로토콜의 경우, 면역 또는 ELISA를위한 마이크로 유체 칩을 사용하는, 그러나 A.로 진행, 만 (즉, TIRF 현미경 또는 SPR에 대한) 유리 슬라이드에 결합 부위를 제한하는 프로토콜 B를 참조하십시오. 이러한 제한은 중요하지 않은 경우를 참조하지만, 단계 8.6에서 비오틴 콘쥬 게이트를 사용하여 단계 4.8를 계속프로토콜 B에 완전한 기능의 표면을 만들 수 있습니다.
이전 프로토콜 A와 B를 수행하기 : 그것은 이전의 칩에 그들을 소개에 사용 된 단백질의 모든 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다. 파편과 단백질 응집체는 그렇게함으로써, 분석을 위해 사용할 수있는 챔버의 수를 줄이고, 세포 트랩을 차단할 수있다. 이를 위해, 채널에 그들을 도입하기 전에 모든 해법을 필터링하는 비 단백질 흡착 필터 장치를 사용한다.
프로토콜 A (효소 분석)
- 미세 유동 장치를 마무리하기 위해, 유리 슬라이드 상에 PDMS 부품 접합. 이를 위해, 제 비누, 증류수와 에탄올을 유리 슬라이드를 청소. 질소 스트림을 사용하여 슬라이드를 건조. 스카치 테이프로 PDMS 부분을 청소합니다.
- 단단한 결합을 보장하기 위해 18 W.에서 45 초 동안 플라즈마 클리너로 PDMS 부분과 청소 유리 슬라이드를 넣고 5 분 동안 핫 플레이트 (100 ° C)에 칩을 넣어.
- 접합 후, F와 칩을 채우기luids. 이것을 달성하는 쉬운 방법은 원심력을 사용하는 것입니다. 200 μL 피펫 팁의 아래 부분을 잘라. 유체 채널의 경우, 블로킹 용액들을 채우기 (소 혈청 알부민 (4 % w / v) 또는 폴리-L-라이신) 그래프트 폴리에틸렌 글리콜 (0.05 % w / v) 및 유입구에 팁을 배치. 물 중 하나 또는 삼투 성 용액, 예를 들면 PBS로 제어 계층의 입구를 입력합니다. 5 분 동안 원심 분리기 (800 XG)에 칩을 놓습니다. 채널은 이제 완전히 액체로 가득해야합니다. 되지 않은 경우,이 단계를 반복합니다.
- 실온에서 적어도 30 분 동안 블로킹 용액을 배양한다. 주사기 펌프를 이용하여 10 μL / 분의 유속으로 PBS와 유체 층 중 용액을 씻는다. 이 장치는 현재 세포 실험을위한 준비가되어 있습니다.
프로토콜 B (면역)
이후 단계 4.7 표면 개질의 전체 개요는 표 1을 참조하십시오.
- 에BBSA / BSA 용액 (예를 들어 1 ~ 100)와 미세 접촉 인쇄를위한 cubate PDMS 스탬프. 30 분 후, 증류수로 철저히 우표를 청소하고 질소의 흐름에 따라 스탬프를 건조. 빨리 청소 유리 슬라이드 (그림 4)에서 스탬프를 배치합니다.
- 함께 플라즈마 클리너 최대 전력 (18 W)에서 45 초 동안 산소 플라즈마에 미세 유체 칩의 상단 부분에 스탬프 유리 슬라이드를 노출합니다. 플라즈마 처리 후, 스탬프를 제거하고 장치의 microchambers 아래에 인쇄 된 표면에 정렬. 50 ℃의 핫 플레이트에 30 분 동안 칩을 놓습니다
- 나머지 표면을 차단하려면 원심 분리기와 칩에 멸균 여과 BSA 용액 (4 %를 (W / V) PBS에서) (단계 4.2 참조) 소개합니다. 1 시간 동안 품어 PBS와 유체 층 (단계 4.3 참조) 밖으로 솔루션을 씻어. 이 칩은 습기가 상자에 4 ° C에서 직접 사용 또는 최대 2 주 동안 저장 될 수있다.
- 완전한 기능의 결합 계면에 대한전자, 저수지에 아비딘 (0.025 % (W / V) PBS에)을 소개합니다. 유체 채널을 통해 아비딘 용액을 인출을 30 분 동안 5 μL / 분의 유속을 사용한다. 그 후, 10 분 동안 PBS를 플러시. 철저하게 탱크를 씻어.
- 그 후, 단백질 G (0.0025 % (W / V) PBS에) 또 다른 30 분 동안 세척을 추가합니다. 그 후 또 다른 10 분 동안 PBS로 세척. 다음, 10 분 동안 관심의 항체 (0.0001 % (W / V) PBS에있는)를 추가합니다. 10 분 후, 바인딩 할 수 있도록 15 분 동안의 흐름을 중지합니다. 다음, 10 분 동안 PBS로 세척.
5. 세포 실험
프로토콜은있을 수 있기 때문에 분석의 다양성의 일반적인 용어로 작성됩니다. 예로서 G6PDH 독성 분석에 필요한 시약은 주어진다. 장치의 초기 셀 포집 효율 즉, 200 세포 중 5 갇혀되며, 약 2.5 %이다. 세포 트랩의 최종 인원은 강력하게 사용되는 세포주 일시 중단하는 프로토콜에 따라 달라집니다세포주 및 시간은 셀 채널을 통해 플러싱된다. 자연적으로 (예 : U937)를 서스펜션에서 성장 세포를 들어, 하나의 세포는 몇 분 후 챔버의 75 % 정도에서 찾을 수 있습니다. 다른 챔버들 중 하나 가득, 또는 두 개 이상의 셀에 의해 점유되지 않는다. 일반적으로, 단일 셀 점유도는 점착성 세포주 작다. 여기에 제시된 오히려 온화한 현탁 프로토콜을 사용하는 경우, 비율 (HEK MLT 세포)를 대략 30 %로 감소한다. 단일 셀 점유도는 세포를 트립신 처리에 의해 개선 될 수 있지만,이 또한 실험 결과를 변경할 수있다.
표적 분자에 따라, PDMS에 흡착 또는 흡수가 결과에 영향을 미칠 수있다. 흡착 BSA 또는 PLL-g-PEG를 가진 표면을 차단함으로써 감소 될 수있다. 흡수는 대부분 친수성 생체 분자에 대한 확률이지만, (소) 친 유성 세포 성분에 대해 검사되어야한다.
- 특정 프로토콜에 따라 세포를 준비 (예를 들어
- 주사기 펌프 및 순방향 흐름을 이용하여 칩 상에 세포를 넣고보다는 세포 현탁액을 철회. 채널 벽에 세포의 비특이적 부착을 감소시키기 위해 이후 접착제 셀 현탁 세포주 및 20 μL / 분의 높은 유량을위한 5 μL / 분의 유속을 사용한다.
- 트랩이 채워지면, 실을 닫습니다. 많은 세포 표면에 비특이적으로 부착하는 경우, 10-30 μL / 분의 유속으로 세포 해리 완충액으로 그들을 씻어 흘려하려고.
프로토콜 A (효소 분석)
- 칩을 통해 용해 버퍼를 철회. 이것은 예를 들어, 현재의 버퍼가 추가 트윈 20 (10 mM 트리스 - 염산, (10)와 버퍼이다 hypoosmolar밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 MgCl2를, 1 % (V / V) 트윈 20). 용해를 들어, 신속하게 개폐 챔버 (즉, 10 ~ 50 μL / 분 7,21의 유량을 500 밀리 초). G6PDH 분석의 경우, 2 mM의 포도당 -6 - 인산, 0.5 ㎜ NADP, 0.5 U / ㎖ 디아 포라 제 및 용해 버퍼에 레사 주린 0.3 ㎜를 추가합니다. 즉시 용해 후 운동 반응을 모니터링하기 시작합니다.
참고 : 분석에 적합합니다 모든 버퍼를 선택 (트리톤, SDS 등) 강한 세제를 Lyse 세포가 즉시 실 개방시 분석의 손실로 이어질 것입니다 염두에 그러나 벌거 벗은.
프로토콜 B (면역)
ELISA 세포 실험 (유량, 챔버 상태 등)에 대한 간단한 설명은 표 1을 참조하십시오.
- ELISA에 직접 용해 버퍼에 필요한 검출 시약 (예를 들면 차 항체, 표지 항원)를 추가합니다. 여기에는 트위 추가N (20)는 비특이적 흡착을 줄일 수 있습니다. 5.4 단계에 따른 세포를 Lyse. (사용 된 항원과 항체에 따라 배양 시간)를 결합 할 수 있도록 10 ~ 15 분 혼합물을 품어.
- 채널 벽에 비특이적으로 흡착 항체 효소 복합체는 이미 저장 및 채널 내부 검출 시약의 변환으로 이어질 수 있습니다. 이 흡착에서 문제를 줄이려면 (검출 시약을 추가하기 전에, 챔버는 폐쇄) 배양 시간 동안 칩을 사용 감지 효소의 영구 억제제를 플러시. HRP의 경우, 영구적으로 비특이적으로 흡착 효소를 불 활성화하기 위해 물에 20 mM의 염산을 사용합니다.
- 배양 시간 후에 칩 검출 시약 (예 Amplex 빨간색과 HRP 과산화수소)를 소개한다. 멀리 nonbound 차 항체를 씻어 곧 다시 실을 열고 검출 시약을 추가 할 수 있습니다. 즉시 운동 반응을 모니터링 시작합니다.
- 교정 : 무력화관심의 대상에 대한 항체. 닫기 실. 버퍼 또는 오프 칩 (off-chip) 세포 용 해물에 분석의 서로 다른 농도를 준비합니다. 칩의 농도를 적용하고 신속하게 챔버 (개관 시간 500 밀리 초) 내부의 볼륨을 교환한다. 이 개방 시간은 추가 축적 분석 플러싱에서 발생하지 않도록 충분히 짧고, microchamber의 볼륨에서 분자 만 특정 번호가 검색됩니다. 용액 안에 항원의 알려진 농도와 챔버 체적 (625 PL)에서, 챔버 내부의 양을 계산한다. 그 후, 단계 5.5 계속 검출 부분을 소개합니다.
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Representative Results
우리의 플랫폼에 존재하거나 단일 세포에 의해 생산 세포뿐만 아니라 다양한 분비 분자를 분석 할 수있다. 여기에서, 우리는 가능한 분석의 다양성을 강조하기 위해 다른 예를 들어 연구를 제시하고 싶습니다. 우리는 분비 효소 (그림 5a)뿐만 아니라 세포 내 효소 (그림 5b)와 단백질 (그림 5C와 D)에 대한 예를 제공합니다. 이러한 보조 인자 또는 작은 분자로 더 많은 예제를 위해, Eyer 등. Eyer 등으로 (2012) 참조하여주십시오. (2013).
첫째, 우리는 분비되는 효소 (그림 5a)에 대한 분석을 제시한다. 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)를 활성화시에, 사람의 단핵구는 리소자임의 분비, 세균 세포 용해를 유도 효소를 유도한다. 이 분석을 위해, 세포는 완충액 4 - 메틸 움 β-DN, N'-diacetylchitobioside, lysoz위한 약한 형광 기판을 포함YME. 효소에 의해 당 잔기의 절단시에, 형광 물질은 해방되고, 챔버 내부에서 검출 될 수있다. 여기서, microchamber의 장점은 짧은 기간 내에 낮은 효소 농도의 검출을 가능하게 분비 효소의 최소화 희석이다. 그림 5a에서, 몇 가지 예를 들어 곡선은 하나의 자극 U937 세포에서 분비 라이소자임의 효소 매출을 나타내는 표시됩니다. U937 세포주는 조직 구 림프종 환자에서 유래 한 단말 단핵구 분화하도록 유도 될 수있다. 셀 라인은 PMA로 자극 후 TNFα, 라이소자임과 β2-마이크로 글로불린을 생산하고 있습니다. 더 매출 오픈 챔버 또는 셀이없는 챔버 (점선)에서 검출되지 않습니다.
그림 5b는 세포 내 효소, 여기에 포도당 6 인산 탈수소 효소 (G6PDH)의 상대 정량을 보여줍니다. G6PDH 같은 조직 원점에서 하우스 키핑 단백질과 세포입니다해야하지 자신의 G6PDH 농도 24에서 크게 다릅니다. 여기에서, U937 세포는 챔버에 포집하고, 우리는 용해 버퍼 함께 G6PDH의 검출 용 형광 분석을 제공. 이는 글루코스 -6 - 인산, NADPH, 효소 및 디아 포라 G6PDH가 존재할 때 형광 레조 루핀 (resorufin)로 변환되고, 기판 레사 주린, 이루어져있다. 시간에 따른 형광의 증가 속도는 G6PDH의 양에 대응한다. 마이크로 칩은 상기 정의 된 시간 (60 분)에 대한 독소 (여기 테신)으로 세포의 배양, 예 독성 화합물의 효과에 대한 연구를 용이하게한다. 이 처리 후, 방출 효소 멀리 플러시시키고 세포를 용균시키고, G6PDH의 수준을 측정 하였다. 실제로, 세포 내 효소 내용의 상당한 손실은 형광의 느린 증가 (그림 5b에 빨간색 라인과 열)을 볼 수 있었다. 이 연구의 세부 사항은 Eyer 등에서 찾을 수 있습니다. 8
e_content는 "> 더욱이, 우리는 세포 내 GFP 량의 분석을위한 면역 분석의 결과를 보여준다. 유도 식의 경우, T-REX 발현 시스템으로 형질 감염된 HEK293 세포.이 시스템에서 GFP 발현은 테트라 사이클린의 첨가에 의해 유도 될 수있다 . 배양 8 시간 후, 세포가 일시 중단 된 칩에 플러시, 덫, 이후 안티 GFP 항체가 세포에서 방출 된 GFP를 바인딩 여기에 제시 프로토콜 다음과 같은 유리 표면에 고정 된 캡처. 용해. (c) 그림 항체에 GFP의 결합 동력학을 나타낸다.이 예에서, GFP가 직접 인한 단백질의 형광에 전체 내부 형광 현미경에 의해 측정 될 수있다. 우리는 비 형광 단백질도 샌드위치 ELISA 또는 유사한을 이용하여 검출 할 수있다 강조하려는 포맷이.이를 위해 필요한 구성 요소를 분석하여 세척 단계 후에 도입 될 수있다. ELISA의 장점으로 인해 신호 증폭이며효소, microchamber 안에 축적된다 형광 생성물을 얻었다.마지막으로, 우리는 표적 단백질로서 GAPDH 가진 단세포 샌드위치 ELISA를 제시하고자한다. 우리는 U937 서스펜션 세포에서 GAPDH뿐만 아니라 부착 HEK293 세포 (그림 5D)을 결정했다. 이를 위해, 우리는 반대로 GAPDH 항체 (포획 항체)를 고정화. 세포 용해 후, 제 효소 - 표식 항체 (검출 항체)가 도입되었다. 챔버가 열리고 인해 흐름, 언 바운드 탐지 항체는 멀리 세척하고 Amplex 레드 챔버에 도입되었다. HRP (검출 항체)로 레조 루핀 (resorufin) 형광등하기 Amplex 레드의 변환은 모두 동시에 60 microchambers 시간 동안 모니터링 하였다. 반응의 선형 부분으로부터 경사가 결정되었다. 이 경사면은 직접 분석 물의 농도에 따라서 효소의 농도에 상관된다. 단일 U937 세포로부터 결과 보통 GAPDH를 보였다각각 2.0 및 3.2 attomol의 최소 및 최대 값을 2.6 attomol의 양. 46 HEK 세포의 데이터 분석은 그 세포가 평균 2.5 attomol의 GAPDH (; 최대 4.1 attomol 최소 0.9 attomol)에 포함 된 것으로 나타났다.
그림 1. 다른 분석의 마이크로 디바이스 및 회로도.) 조립 마이크로 디바이스를 발표했다. 여기에서, 챔버 시각화 (녹색 형광)에 대한 형광으로 가득 차 있습니다. 또한 볼이 저수지, 제어 계층에 대한 연결 (압력, 뒤쪽에 2 × 커넥터는 왼쪽과 전면 오른쪽)과 주사기 펌프 (전면)에 대한 연결이. B) microchamber 영역을 확대합니다. 이러한 챔버의 대부분은 어레이로 배열 될 수있다. 시각화, 오렌지 식품 염료 반면, 챔버 내부에 고립 된 녹색 식품 염료는 채널을 통해 플러시됩니다. 압력 제어 층은 디바이스 동작의 단일 microchamber. d) 도식 물. c) 확대로 채워진다. microchamber (측면보기) 내에서 하나의 세포가 갇혀 격리됩니다. 세포 자극 배양 세척하고 최종적으로 칩 내에서 용해 될 수있다. 셀룰러 함량은 효소 또는 형광 부분이 반응 (왼쪽)에 생성되는 효소를위한 분석법으로 직접 분석 할 수있다. 다른 단백질의 경우, 표면에 표적 단백질 (오른쪽)에 특이 적으로 결합하는 항체로 변형 될 수있다. 항원이 표면에 결합되어 있기 때문에, 해물 멀리 세척 할 수 있고, 같은 차 항체로 검출 분자 표적 단백질의 양을 추가 할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. 유체 층의 채널 시스템과 microchamber의 차원의 개략도.) 마스크 디자인. 유체 층 (왼쪽에서 오른쪽으로) 출구, 챔버 지역, 입자와 세포 클러스터를 유지하기 위해 필터와 입구로 구성되어 있습니다. 웨이퍼 (4)는 10 칩의 생산을위한 구조물을 품고있다. 대응 제어 층의 b) 마스크 디자인. 때문에 정렬을 위해 필요한 공간, 웨이퍼 4 5 칩 정렬 층. C) 회로도 (왼쪽)의 생산을위한 구조를 포함하고있는 셀 트랩 (오른쪽), 두 길이 비늘을 보여주는 증설. 보려면 여기를 클릭하십시오 큰 이미지 .
그림 3. SU-8 처리 및 PDMS 생산의 개략도.) SU-8 처리 프로토콜의 개략도. 실리콘 웨이퍼에 스핀 코팅 SU-8과 4 분 동안 95 ° C에서 부드러운 구운입니다. 원하는 미세 유체 채널 설계는 포토 마스크 및 UV 광 노출을 사용하여 SU-8로 전사된다. 2 시간 동안 노광 후 베이크 (95 ° C, 5 분) 후, SU-8이 개발되고, 180 ° C에서 하드 구운. 마이크로 유체 칩 제조의 B) 도식. PDMS 올리고머와 경화제의 혼합물을 스핀 코팅 유체 채널 마스터 폼으로하고, 제어 층의 마스터 폼 붓고. 채널 제외는 분홍색으로 그려져있다. 두 층은 오븐에서 경화된다. 제어 층 칩 부분 (파란색에서 제어 채널) 웨이퍼로부터 분해 및 압력 연결 용 구멍 (흰색)를 천공한다. 부품 제어 및 두유체 층은-아르 산소 플라즈마에 넣고, 그 후, 이들은 정렬 및 접합. 전체 칩은 다음 (빨간색 유체 채널) 유체 마스터 양식에서 분해 및 유체 액세스 홀 (흰색)을 뚫는다. 마지막으로, 칩과 유리 슬라이드는 산소 플라즈마 표면 활성화 한 후에 결합하기. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 소프트 리소그래피 용 미세 접촉 인쇄의 개략도.) 마스터 제조. (1) PDMS 스탬프는 단백질 (BBSA) 솔루션을 배양한다. (2) 용액을 제거 스탬프 세정과 단백질의 단층은 스탬프에 남아있다. (3) 도장함으로써 단백질이 유리 쉬르에 전송된다, 유리 슬라이드 상에 배치된다 얼굴. 이 시간 동안, 유리에 스탬프와 함께 마이크로 칩은 산소 플라즈마에 노출된다. (4) 스탬프가 제거되고, 마이크로 칩은 유리 슬라이드에 결합된다. 시각화를 들어, 두 개의 예 구조가 도시되어 형광 BSA-형광 결합체로 인쇄. 챔버 당 B) 미세 접촉 인쇄 영역. 인쇄 및 챔버가 정렬되지 않기 때문에, 우리는 바인딩 세 가지 칩 (번호 1-3)에 반점 (인쇄 영역) 및 60 microchambers의 변화를 평가 하였다. 결과적으로, 챔버 대 챔버 변동성 (2.5 % <) 비교적 작고, 칩 간 가변성은 챔버 인쇄 구조를 정렬 할 필요가 실제로 없다는 것을 보여주는, (<1 %) 무시할 수 있었다. 클릭 여기에 더 큰 이미지를 볼 수 있습니다 .
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그림 5. G6PDH, 라이소자임, GFP 및 GAPDH의 분석의 결과. 하나의 세포에서 대표적인 결과.) 효소 분비. 남아 분비 효소에 대한 분석의 회로도를, 여기에 라이소자임. 리소자임은 단일, PMA 활성화 된 U937 세포에 의해 분비 해 형광 -4 - 메틸 움 벨리 페론의 생산을 촉진하는 경우, 폐쇄 microchambers 안에 축적된다. 오른쪽 : 분비 실험에서 얻은 데이터. 녹색 커브는 세포가없는 챔버 (검은 점선)이 도시되어 비교를 위해, 하나의 셀이 차지하는 챔버에 대한 시간에 따른 형광 강도를 보여줍니다. 하나의 세포에서 세포 내 효소의 B) 감지. 왼쪽 : 세포 내 효소 G6PDH에 대한 분석의 도식. 세포 용해되면, 세포 내 G6PDH은 효소 반응 캐스케이드의 다른 구성 요소가 존재하는 챔버로 방출된다. 오른쪽 : 예 곡선과 대표 데이터. 단일 U937세포들은 효소 함량 (블랙)에 대해 분석 하였다. 단일 세포의 세포 내 단백질의 막 permeabilizes 테신의 독성 영향에 따라, 효소의 3 분의 2가 (오렌지)를 잃었다. c) 면역 측정법. 왼쪽 : 면역의 회로도, 여기에 세포 내 단백질 GFP를위한. 항-GFP 항체는 본원에 기재된 표면 따른 프로토콜 상에 고정화 하였다. 후 세포 칩에 용해시키고, 바인딩 반점은 TIRF 현미경을 사용하여 시간에 걸쳐 모니터링 하였다. 오른쪽 : 고정 된 항체에 GFP의 결합 반응 속도를 보여주는 등의 실험에서 그래프. 시점 (1)는 용해 버퍼의 도입을 표시한다. 이 시점에서, GFP는 세포 용해가 발생했음을 의미 표면에 축적하기 시작한다. 항체 GFP의 결합이 시점 3. D) 단일 세포의 세포 내 단백질의 샌드위치 ELISA에 완료됩니다. 왼쪽 : 세포 내 단백질 GADPH 여기 샌드위치 ELISA의 개략도. 안티GAPDH-항체는 본원에 기재된 표면 따른 프로토콜 상에 고정화 하였다. 후 세포 칩에 용해 및 배양 하였다. 항체에 결합 해방 GPADH은 챔버 세정 및 검출 항체 (HRP-결합 된) 소개되었다. 마지막 단계에서, nonbound 검출 항체가 씻겨 검출 시약을 도입하고, 반응물을 시간이 지남에 따라 모니터 하였다. 오른쪽 :. U937 및 HEK293 세포 내부 GAPDH의 정량화 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
ELISA를위한 표면 개질 프로토콜
| 단계 | 시간 | 집중 | 유량 | 흐름이없는 배양 시간 | 상공 회의소 개방 / 폐쇄 | ||
| [분] | (W / V) % | [μL / 분] | [분] | </ TD> | |||
| BSA | (30) | 4 | - | 열린 | |||
| PBS | 10 | 5 | 열린 | ||||
| 아비딘 | (30) | 0.025 | 5 | 열린 | |||
| PBS | 10 | 5 | 열린 | ||||
| 단백질 G, 비오틴 | (30) | 0.0025 | 5 | 열린 | |||
| PBS | 10 | 5 | 열린 | ||||
| 항체 | (20) | 0.0001 | 5 | 15 | 열린 | ||
| PBS | 10 | 5 | 열린 | ||||
| 셀 (300,000 세포 / ㎖) | ~ 5 | (30) | 트랩이 점유하는 경우 닫습니다. | ||||
| 용해 완충액 | 5 | (30) | 오픈 곧 | ||||
| 억제제 (예를 들어, 20 mM의 염산) | 15 | 10 | 닫은 | ||||
| PBS | 2 | (30) | 닫은 | ||||
| 검출 시약 | 5 | (30) | 오픈 곧 | ||||
| 반응을 모니터링 시작 | |||||||
표 1. 표면 modificatioELISA를위한 N 프로토콜입니다. 설명은 텍스트를 참조하십시오.
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Discussion
미세 유체 기술은 단일 세포 분석을위한 새로운 매혹적인 가능성을 열었습니다. 특히, 트랩 가능성 및 미세 도구를 사용하여 개별적으로 세포를 고정화는 단일 셀의 속성과 응답에 대한 체계적인 장단기 연구를 허용했다. 또한, 마이크로 칩에서 생성 고주파 미세 방울, 셀의 캡슐화는, 통상적 계측법 장치로 수행 할 수없는 단일 세포 분비 연구를 사용할 수있다. 의 microdroplet 방법은, 그러나, 배양 및 세척 단계를 분석 프로토콜에 필요한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우리의 접근 방법은 셀 포착 및 분리의 개념을 모두 겸비하고 따라서, 표면에 고정화 된 항체에 근거 면역 포함한 더 복잡한 분석을 수행하기 용이하게한다. 또한, 상기 방법은 애플리케이션과 타겟 분석 물에 대해 매우 유연하다.
마이크로 칩의 설계는 (I) effi 수cient 셀 트래핑 각종 버퍼 및 시약 (ⅱ) 공급하고, 매우 작은 양의 (III)의 안정적인 절연 필수. 이러한 방식으로 타겟 분자의 희석은 회피된다. 육십 microchambers의 (수백)를 병렬로 많은 실험을 수 있도록 하나의 장치에 위치한다. microchambers을 닫는 둥근 모양의 밸브는 인접 챔버에 교차 오염이 방지되어야 할 때 중요하다, 행이나 열을 기준으로 함께 또는 개별적으로 해결할 수 있습니다. microchambers 폐쇄로, 채널은 포획 세포에 영향을주지 않고 목적 청소용 염산 등의 유해 용액으로 처리 될 수있다. 한편, microchamber 내부 부피의 빠른 교환이 가능하다. 현재 200 밀리의 최소 시간은 완전히 챔버를 개방해서 (microchamber 볼륨의 완전한 교환, 유량이 고려되어야하는) 새로운 시약을 도입 할 필요가있다.
우리의 방법은 매우 REL이지만iable 및 재현, 하나의 칩 제조 및 운영의 프로토콜에있는 두 가지 중요한 포인트가 있다는 것을 염두에 두어야한다. 먼저, 플라즈마 활성화 후에이 칩 층의 접합 빠르게 수행되어야한다. 정렬은 결합이 되돌릴 수 있기 때문에, 그렇지 않으면 일부 챔버 또는 전체 칩, 사용할 수없는 중요하다. 이 단계는 약간의 훈련 후도 경험이 적은 실험실 노동자는 일반적으로 좋은 결과를 얻을 수 있지만, 경험이없는 사용자 어려울 수 있습니다. 두 번째 중요한 점은 조립 및 마이크로 칩을 사용하는 동안 청결입니다. 먼지 입자가 상기 칩의 표면 상에 존재하는 경우, 그들은 제어 채널 및 밸브를 손상 또는 PDMS-PDMS 또는 PDMS - 유리 결합의 파단을 초래할 수있다. 따라서 우리는 청소 절차에 많은 관심을 보내고있다. 그것은 (클린 룸에서 수행) 마스터 폼 제조 게다가, 우리는 생산 및 정상적인 실험실 환경, 먼지에 마이크로 칩을 사용하는 것을 주목해야한다차 입자는 존재한다.
챔버가 정확하게 폐쇄하지 않으면 모든 치료에도 불구하고, 그것의 압력 라인 중 하나가 차단 또는 스핀 코팅 공정이 오른쪽 막 두께를 제공하지 않았다고 할 수있다. 또한, 수시로 우리는이 PDMS 층 사이의 결합의 파괴의 결과로, 불충분 한 본딩을 관찰했다. 동일한 배치에서 많은 칩이 문제를 도시하는 경우, 그것은 플라즈마 활성화 및 배향 사이의 시간이 너무 긴 것이 가능하다. 때때로, 우리는 제대로 제거 할 수 없습니다 웨이퍼에 스티커 PDMS를 경험하고 웨이퍼의 부족 실란 화의 결과였다.
제조 방법이 확립되면, 미세 유체 플랫폼은 단일 세포 수준에서 다양한 연구에 사용될 수있다. 여기에서, 우리는 다른 분석과 세포 내 분비 에이전트의 검출을 보여 주었다, 그러나 많은 다른 분석 칩에 가능합니다. 대부분의 단백질은 형광을받지 않으므로 드면역을 통해 tection은 간단하지 않습니다. 칩에 ELISA의 구현은 많은 혜택을 가져올 것이다. 우선, 분석은 (적당한 항체가 존재할 때) 목적 단백질에 대해 매우 특별히 설계 될 수있다. 둘째, ELISA로부터의 정보가 셀에 존재하는 단백질 또는 분자 매수를주는에서도 저농도 한계에서 정량화 될 수있다.
우리의 현재 칩은 하나의 포유 동물 세포의 분석을 위해 설계되었습니다. 그러나, 박테리아, 조류와 효모 등의 세포 칩의 변경이 가능해야한다. 지금까지의 실험에 대한 유일한 제한은 형광에 기초하여 분석의 필요성이다. 그러나 우리는 현재 검출 기술로 질량 분석의 구현을 연구하고있다. 이 확립되면, 플랫폼 조사 될 수 분석적 문제의 범위도 더 넓은 것이다. 또한, 아니 모든 분석은 세포 용해 버퍼의 존재 가능하기 때문에, 우리현재도 플랫폼에 다양한 용해 기술을 평가하고있다. 우리는 여기에서 제시된 다양한 미세 유체 플랫폼이 프로테옴, 대사 체 및 secretome 수준에서 새로운 단일 세포 연구에 대한 근거를 제공하고 있다고 확신합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 원고, 맞춤형 압력 제어 시스템의 건설을위한 C. Bärtschi 및 H. 벤츠의 증거 독서 톰 로빈슨을 인정합니다. 우리는 또한 클린 룸 시설 FIRST 두 ETH 취리히에서 빛을 현미경 센터 (LMC)의 사용을 인정하고 싶습니다. 작품은 7 번째 프레임 워크 프로그램 (ERC 그랜트를 시작, 프로젝트 없음. 203428, nμLIPIDs)에서 머크 세로 노, 유럽 연구위원회 (ERC)에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
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