Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Microfluidic Chip for Allsidig Kjemisk analyse av enkeltceller

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

I denne artikkelen presenterer vi en microfluidic chip for enkelt celle analyse. Den tillater kvantifisering av intracellulære proteiner, enzymer, kofaktorer og andre budbringere ved hjelp av fluorescerende assays eller immunoanalyser.

Abstract

Vi presenterer en microfluidic enhet som gjør det mulig for kvantitativ måling av intracellulære biomolekyler i flere enkeltceller i parallell. For dette formål blir cellene passivt fanget i midten av en mikrokammeret. Ved aktivering av kontrollsjikt, blir cellen isoleres fra det omkringliggende volumet i et lite kammer. Den omkringliggende volumet kan deretter utveksles uten å påvirke den isolerte celle. Imidlertid ved kort åpning og lukking av kammeret, løsningen i kammeret kan bli erstattet i løpet av noen få hundre millisekunder. På grunn av reversibiliteten av kamrene, kan cellene bli utsatt for ulike løsninger etter hverandre i en meget kontrollerbar måte, for eksempel for inkubering, vasking, og til slutt, cellelyse. De tettsittende microchambers aktivere oppbevaring av lysatet, minimere og kontrollere fortynning etter cellelyse. Etter lysering og analyse oppstå på samme sted, har høy sensitivitet beholdes fordi ingen ytterligere dilution eller tap av analyttene oppstår under transport. Mikrokammeret design muliggjør derfor pålitelig og reproduserbar analyse av svært små kopiere numre av intracellulære molekyler (attomoles, zeptomoles) frigjøres fra enkeltceller. Videre kan mange microchambers være anordnet i en matriseform som tillater at en analyse av mange celler på en gang, ettersom egnede optiske instrumenter benyttes for overvåking. Vi har allerede brukt plattformen for proof-of-concept studier for å analysere intracellulære proteiner, enzymer, kofaktorer og andre budbringere i enten relative eller absolutte kvantifiserbar måte.

Introduction

Mange studier i det siste har avslørt celle-til-celle-forskjeller innen en stor cellepopulasjon på 1-3, særlig signalprosesser 4, eller mengdene av intracellulære biomolekyler slik som proteiner 5,6, metabolitter og kofaktorer 7,8. Disse heterogeniteter anses å være fundamentalt viktig for celle tilpasning og evolusjon 9, men også spille en nøkkelrolle i fremveksten og behandling av sykdommer som kreft 10-13. Derfor studier på enkeltcellenivå er av stor interesse for biologisk og farmakologisk forskning, særlig hvis disse studiene viser de forskjellige celle responser etter behandling med bioaktive stoffer.

I de senere år har mange analytiske plattformer blitt utviklet for at lette analysen av enkelt levende celler eller den kjemiske sammensetning av celleinnholdet. Mens fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) er gull stAndard for meget høy gjennomstrømning analyse av enkelt levende celler, idet fremgangsmåten ikke kan anvendes for kvantifisering av intracellulært eller utskilt forbindelser. Fremveksten av microfluidic plattformer har lovet nye analytiske strategier for posisjonering, behandling og observasjon av enkeltceller. En milepæl i MicroFluidics ble nådd med integrering av fleksible PDMS ventiler realisert av Quake og kolleger 14,15. Disse ventilene er nyttige fordi de kan isolere regioner på chip, f.eks skille to kulturer 16. Videre er de anvendelig spesielt for enkeltcelleanalyse og dermed bidra til å redusere analytt fortynning problemer. Kraften i denne tilnærmingen for encellede analyse har nylig blitt demonstrert av Hansen og kollegaer som har analysert genuttrykk fra hundrevis av enkeltceller i parallell 17.

Når targeting proteiner og metabolitter, er analysen meget vanskelig på grunn av mangelen på passende enmplification metoder, det store antall forskjellige forbindelser til stede, og deres variasjoner i kjemisk natur. Videre er de fleste intracellulære biomolekyler forventet å være til stede i lavt kopitall i størrelsesorden noen få ti tusen 18, og dermed den analytiske metode som brukes må ha en høy følsomhet. Kraftigere assays slik som immunoassays og enzym-bundne immunoanalyser (ELISA) er vanskelige å integrere i microfluidic enheter, siden de krever flere vaske-og inkubasjons-trinn så vel som overflate immobilisering.

På grunn av disse utfordringene er det ikke overraskende at bare noen få eksempler er blitt rapportert, hvor proteiner eller metabolitter ble kvantifisert på enkeltcelle-nivå. For eksempel, har studier på utskillelsen av fluoriserende forbindelser er rapportert 19,20. Nylig ble gjennomføringen med ELISA presenteres for analyse av utskilt (nonfluorescent) proteiner fra en cellekultur (THP-1 celler) 21 og singel (immune) celler 10. Målretting intracellulære proteiner, Shi et al. Utviklet en mikrofluidenhet som muliggjort identifisering av intracellulære proteiner for analyse av signalveier i tumorceller ved hjelp av en immunoanalyse 11.. Det ble imidlertid kun relative mengder av proteiner bestemmes og ingen enzymatisk amplifisering ble brukt til å øke signal for lav overflod proteiner.

Nylig var vi i stand til å kombinere en encellet fangst microdevice med fluorescens analyser 8 og immunoassays 22 (figur 1). Celler blir passivt fanget i microsized hinderet konstruksjoner, som tillater tilførsel og (hurtig) utveksling av mediet og andre kjemiske midler uten noen bevegelse av cellene. En ringformet ventil rundt hver felle muliggjør isolering av cellen i et meget lite volum ("mikrokammeret"). Denne ventilen blir betjent like etter innføring i en celle-lysering (hypoosmolar) buffer, hanNCE hindre intracellulære molekyler eller skilles molekyler til diffuse unna. Det viktigste er, på grunn av den lille størrelsen av volumet (625 pl) stor fortynning av molekylene er unngått. Videre, siden lyse og analyse blir utført på i samme posisjon i brikken, er det ingen tap av analytter på grunn av transport. Den chip design beskrives her omfatter åtte vekslende rader med enten 7 eller 8 microchambers, totalt 60 microchambers. Kamrene blir påvirket i rader, slik at kryss-kontaminering langs en linje som er avskåret.

Plattformen kan anvendes i kombinasjon med fluorescens-analyser, så vel som immunologiske assays (Fig. 1d). For sistnevnte ble det etablert protokoller for immobilisering av antistoffer, som er kompatible med produksjons-og monteringsprosessen chip. Derfor plattformen åpner for sensitive, pålitelige og målbare analyser på celle-nivå. Opp til nå har vi brukt enheten for analyse av jegntracellular og utskilt enzymer (relativ kvantifisering ved enzymatisk assay), intracellulære kofaktorer, proteiner og små molekyler (absolutt kvantifisering av endepunkt assays eller ELISA). I det følgende beskrives prosessen med chip fabrikasjon ved hjelp av flerlags myk litografi og protokollene for fordelingen av antistoffene ved hjelp av microcontact trykking og overflatekjemi. I tillegg er noen eksempler på chip bruk og drift oppgitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. SU-8 Master Fabrication

Forbered både master former for kanalene (fluidic og kontroll, for skjemaer og dimensjoner se figur 2) med følgende protokoll, men med forskjellige maskemønstre. Prosessen er vist i figur 3a.

  1. Start ved å oppvarme en 4 tommers silisiumskive i 10 min ved 180 ° C. Laste dehydrert wafer på en spin-coater og bruker følgende protokoll for spin-belegg SU-8 2015:
    1. Spin wafer ved 100 opm i 20 sek (åpne lokket på spin-coater, dispensere SU-8 i løpet av dette trinnet, i nærheten av lokket etter dispensering).
    2. Spin wafer ved 500 rpm i 10 sekunder (dette vil spre motstå over hele wafer).
    3. Spin wafer ved 1750 opm i 30 sek (definerer høyden av resisten til 20 mikrometer).
  2. Fjern motstå fra kanten av skiven med aceton (bruk en bomullspinne) da det ellers vil holde seg til varmeplaten i neste trinn. Overfør wafer å ahotplate ved 95 ° C og varme i 4 min. Etter softbake, eksponere motstå gjennom en photomask tapet til sodalime glass i en maske aligner med UV-lys (150 mJ / cm 2, målt ved 365 nm).
  3. Etter eksponering, varme opp skiven igjen ved 95 ° C i 5 minutter på en varmeplate. Kjøle ned wafer til RT og deretter dyppe den i et bad av SU-8 utvikler for 4 min. Rist forsiktig for å fjerne ueksponert SU-8. Vask wafer med clean-room grade isopropanol og føn med nitrogen. Kontroller under et mikroskop hvis utviklings var vellykket (spesielt celle feller). Hvis celle fellene er fullstendig utviklet, bør refleksjon av silisiumskiven er synlig. Om nødvendig kan utvikle skiven igjen i noen minutter.
  4. Bake skiven i en ovn i 2 timer ved 180 ° C for å fjerne alt resterende oppløsningsmiddel. Kontroller høyden av kanalene med et skritt profiler. Hvis høyden er forskjellig fra den ønskede høyde, gjentar denne protokollen som starter med trinn 1.1 med en ny skive ogendre spin-hastighet (trinn 1.1.3). Ferdig fabrikasjon av hovedform ved silanizing wafer med 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silan i en eksikator natten over.

2. Master Fabrication for Microcontact Utskrift

  1. For å fremstille hovedformer for microcontact trykking, dehydrerer en silisiumskive i 10 min ved 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS på denne wafer ved 7500 rpm i 30 sek (motstå fester seg bedre til en silanbehandlet overflate). Spin-coat 2 ml AZ1518 positiv motstå med denne protokollen:
    1. Statisk dispensere av resisten på skiven.
    2. Spin wafer for 5 sek på 500 rpm.
    3. Spin wafer for 60 sek ved 4000 rpm.
  2. Etter en 50 sek softbake ved 100 ° C på en varmeplate, eksponere resisten for UV-lys (21 mJ / cm 2 ved 365 nm) gjennom en fotomaske, og på en maske aligner. Utvikle motstå i et bad av AZ 726 for 75 sek. Skyll utviklet wafer med DI-vann og blåse dry med nitrogen. Fjern gjenværende oppløsningsmiddel ved oppvarming av skiven ved 115 ° C i 50 sek. Silanize skiven under vakuum over natten.

Tre. Fabrikasjon av Microfluidic Chip

En to-lags enhet utforming benyttes for disse forsøkene. De to lagene er fremstilt separat og er bundet sammen, før brikken er slutt limt på en glass-slide (figur 3b). Dette trinn beskrives fremstillingen av PDMS lag og PDMS stempel for microcontact trykking.

  1. Forbered en 10:01 blanding av PDMS og herder. Forbered ca 80 g PDMS totalt (ved hjelp av våre design, vil dette resultere i 10 chips). Bland begge deler kraftig og avgasse PDMS inntil blandingen er fri boble (~ 30 min).
  2. Plasser wafer med kontroll sjikt inne i en petriskål, og båndet mot bunnen. Deretter helles ~ 50 g av PDMS på toppen og setter skiven i minst 2 timer i en ovn ved 80 ° C for å sikre fullstendigherding av PDMS. Gjenta samme prosedyre for microcontact utskrift wafer, for dette ~ 20 g PDMS er nødvendig.
  3. Spin-coat PDMS på wafer med fluidic sjikt ved en rotasjonshastighet på 2000 opm for å danne en ca 40 mikrometer høy PDMS lag. Kurere PDMS i en ovn i minst 1 time ved 80 ° C.
  4. Når begge deler er herdet, fjernes styrelaget fra skiven og kuttet i stykker med et barberblad. Punch press forbindelse hull ved hjelp av en 1 mm biopsi puncher. For lagring, er det tilrådelig å sette et stykke tape over kanalene.
  5. For å binde de to lagene, ta spin-belagt skive og den øverste delen og legg dem i en plasma renere 23. Etter plasma behandling, raskt justere begge deler under et mikroskop med stor arbeidsavstand. Legg noen ekstra PDMS rundt de monterte øvre delene. Dette trinnet er ikke obligatorisk, men det letter fjerning av PDMS fra wafer. Plasser skiven i en ovn ved 80 ° C i minst 1 time.
  6. Bruk en skalpell til å forsiktig fjerne PDMS fra wafer og å kutte microchips. Punch tilgang hull for fluidumstilknytningenes med en 1,5 mm biopsi puncher.
  7. PDMS chip er nå ferdig og kan lagres i månedsvis. Valgfritt: Hvis brikken brukes med et reservoar, kutte den øvre delen av en 200 mL pipette spissen og bruke noen ekstra, semi-herdet PDMS å lime den på toppen. Sett brikken inn i ovnen på nytt ved 80 ° C i minst 1 time.

4. Bonding til Glass Slide

For å bruke enheten for direkte enzymatiske analyser, det eneste trinnet som kreves etter bonding er blokkering av overflater. For denne protokollen, går du videre til A. Men, å bruke microfluidic chip for immunologiske analyser eller ELISAs, henvises det til protokoll B til å begrense bindingsstedene kun til glass-slide (dvs. for TIRF mikroskopi eller SPR). Hvis denne begrensningen er ikke viktig, se A, men bruker biotinylerte konjugater i trinn 4,3 og fortsett med trinn 4.8i protokoll B for å lage et fullt funksjonelt overflate.

Før utfører protokoll A og B: Det er tilrådelig å filtrere alle de brukte proteinoppløsninger før de føres inn i brikken. Rusk og proteinaggregater kan på annen måte blokkere celle feller, for derved å redusere antallet av kamre som kan benyttes til analyse. For dette formål brukes en nonprotein adsorberende filterenhet for å filtrere alle løsninger før innføring av dem i kanalene.

Protokoll A (enzymatiske analyser)

  1. For å sluttføre microfluidic enheten, binde de PDMS deler på en glass-slide. For å gjøre dette, må du først rense et glass lysbilde med såpe, destillert vann og etanol. Tørk slide ved hjelp av en nitrogenstrøm. Rengjør PDMS del med teip.
  2. Sett PDMS del og den rensede glass-slide inn i plasmarenser i 45 sek ved 18 V. For å sikre en tett binding, sett chip på en varm plate (100 ° C) i 5 min.
  3. Etter bonding, fylle chip med fluids. En enkel måte å oppnå dette på er å benytte sentrifugalkraft. Skjær den nedre delen av 200 mL pipette tips. For de fluidic kanaler, fylle dem med den blokkerende løsning (bovint serum-albumin (4% vekt / volum) eller poly-L-lysin) podet polyetylen-glykol (0,05% w / v), og spissene inn mot innløpet. Fyllkontroll lags innløp med vann eller med en isosmotisk løsning, f.eks PBS. Plasser brikken inn i sentrifugen (800 xg) i 5 min. Kanalene må nå fylles med fluidet helt. Hvis ikke, gjenta dette trinnet.
  4. Inkuber blokkeringsløsning i minst 30 min ved romtemperatur. Vask løsningen ut av fluidet sjikt med PBS ved en strømningshastighet på 10 mL / min ved hjelp av en sprøytepumpe. Anordningen er nå klar for celleeksperimenter.

Protokoll B (immunoassays)

For en fullstendig oversikt over overflaten endring fra trinn 4,7 og utover, kan du se Tabell 1.

  1. Icubate PDMS frimerker for microcontact utskrift med en bBSA / BSA løsning (f.eks 1-100). Etter 30 min, rense stemplene grundig med destillert vann og tørkes stempelet under en strøm av nitrogen. Raskt plassere frimerker på en rengjort glass slide (figur 4).
  2. Eksponer glass-slide med stemplet sammen med den øvre del av det mikrofluid chip til oksygen plasma etter 45 sekunder ved maksimal effekt (18 W) i en plasmarenser. Etter plasma behandling, fjerne stempelet og justere den trykte overflaten under microchambers av enheten. Plasser chip i 30 minutter på en varm plate ved 50 ° C.
  3. For å blokkere den gjenværende overflate, å innføre steril-filtrert BSA-løsning (4% (w / v) i PBS) i brikken med en sentrifuge (se trinn 4.2.) Inkuber i 1 time og vasker oppløsningen ut av fluidet sjikt med PBS (se trinn 4.3). Brikken kan deretter anvendes direkte eller lagres i opptil 2 uker ved 4 ° C i en fuktig-boksen.
  4. For et fullt funksjonelt binde surface, innføre avidin (0,025% (w / v) i PBS) i reservoaret. Bruke en strømningshastighet på 5 mL / min i 30 min for å trekke tilbake avidin løsning gjennom væskekanalene. Etterpå skylle PBS i 10 min. Skyll reservoaret grundig.
  5. Deretter legger Protein G (0,0025% (w / v) i PBS) og i flukt for ytterligere 30 min. Vask med PBS for en annen 10 min etterpå. Deretter legger antistoffet av interesse (0,0001% (w / v) i PBS) i 10 min. Etter 10 min, stoppe strømmen i 15 min for å tillate binding. Deretter vaskes med PBS i 10 min.

5. Cell Experiments

Protokollen er skrevet i generelle vendinger på grunn av mangfoldet av mulige analyser. Som et eksempel på de anvendte reagenser som trengs for G6PDH toksisitet analysen er gitt. Den opprinnelige cellefang effektiviteten av enheten er ca 2,5%, dvs. 5 av 200 celler vil bli fanget. Den endelige belegg av celle feller avhenger sterkt av brukte cellelinje, protokollen til å suspenderecellelinjen og det tidspunkt cellene blir spylt gjennom kanalen. For celler som vokser naturlig i suspensjon (f.eks U937), kan enkeltceller som befinner seg i omtrent 75% av kamrene etter noen få minutter. De andre kamrene har enten ikke er fylt eller opptatt av to eller flere celler. Generelt, er den encellede belegg mindre for adherente cellelinjer. Ved bruk av ganske mild suspensjons protokoll er presentert her, minsker prosentandelen til ca 30% (HEK, MLT-celler). Den encellede belegg kan bedres ved trypsin behandling av cellene, men dette kan også endre resultatene av forsøkene.

Avhengig av target-molekylet, kan adsorpsjon eller absorpsjon til PDMS påvirke resultatene. Adsorpsjon kan reduseres ved blokkering av overflatene med BSA eller PLL-g-PEG. Absorpsjon er usannsynlig for de fleste hydrofile biomolekyler, men det bør sjekkes for (små) lipofile cellekomponenter.

  1. Forbered cellene i henhold til bestemte protokollen (f.eks
  2. Last inn i cellene på brikken ved hjelp av en sprøytepumpe og videre strømning, heller enn å ta ut cellesuspensjonen. Bruke en strømningshastighet på 5 mL / min for suspensjon cellelinjer og høyere strømningshastigheter på 10 til 20 pl / min for lim-celler, siden for å redusere ikke-spesifikk binding av cellene til kanalveggene.
  3. Når fellene er fylt opp, lukke kamrene. Ved mange celler holder seg ikke-spesifikt til overflaten, prøve å vaske dem bort med celledissosieringsmedium buffer ved en strømningshastighet på 10 til 30 mL / min.

Protokoll A (enzymatiske analyser)

  1. Uttak lysis buffer gjennom brikken. For dette eksempel er denne bufferen en hypoosmolar buffer med tilsatt Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v / v) Tween 20). For lyse, raskt åpne og lukke kamre (dvs. 500 msek for strømningshastigheter på 10-50 mL / min 7,21). For G6PDH assay, tilsett 2 mM glukose-6-fosfat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml diaforase og 0,3 mM resazurin i lysis buffer. Begynne å overvåke den kinetiske reaksjon umiddelbart etter lyse.

Merk: Velg et buffer som er egnet for analysen, men bare i tankene at sterke vaskemidler (som Triton, SDS) lyse celler umiddelbart og vil føre til et tap av analytt under kammeråpningen.

Protokoll B (immunoassays)

For en kort beskrivelse av ELISA celleforsøk (strømningshastigheter, kammer status, osv.), kan du se Tabell 1.

  1. For ELISA, tilsett den nødvendige deteksjons reagens (f.eks sekundært antistoff, merket antigen) direkte til lysis buffer. Den heri lagt Tween 20 reduserer uspesifikke adsorpsjon. Lyse av cellene i henhold til trinn 5.4. Inkuber blandingen i 10-15 minutter for å tillate binding (inkubasjonstid, avhengig av den brukte antigen og antistoff).
  2. Antistoff enzym-konjugater som ikke-spesifikt adsorbert på kanalveggene kan føre til omdannelse av deteksjons reagenset allerede inne i reservoaret og kanalene. For å redusere problemer av denne adsorpsjon, spyle en permanent inhibitor av den brukte deteksjons enzymet gjennom brikken under inkubasjonstiden (kamre lukket, før tilsetning av deteksjon-reagens). For HRP bruke 20 mM HCl i vann for å permanent inaktivere ikke-spesifikt adsorbert enzymer.
  3. Etter inkubering tid, innfører deteksjons reagens (f.eks Amplex Red og hydrogenperoksid for HRP) til brikken. Åpne kamrene kort tid igjen å vaske nonbound sekundært antistoff bort og legge til deteksjon reagens. Begynne å overvåke den kinetiske reaksjonen umiddelbart.
  4. Kalibrering: Immobilizeantistoff mot mål av interesse. Lukk kamre. Forbered forskjellige konsentrasjoner av analytt i buffer, eller i celle-lysat off-chip. Påfør en konsentrasjon til chip og raskt utveksle volumet inne i kamrene (500 msek åpning tid). Denne åpning er tilstrekkelig kort til å sikre at ingen ytterligere akkumulering skjer fra analytten spyling, og bare et bestemt antall molekyler fra volumet av mikrokammeret er detektert. Fra den kjente konsentrasjonen av antigenet på innsiden av løsningen og volumet av kammeret (625 pl), beregne mengden inne i kammeret. Etterpå fortsetter du med trinn 5.5 og innføre påvisning resten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår plattformen er i stand til å analysere en rekke intracellulære samt utskilte molekyler tilstede i eller produseres av enkeltceller. Her ønsker vi å presentere forskjellige eksempelstudier for å understreke rekke mulige analyser. Vi vil gi et eksempel for et utskilt enzym (figur 5a), så vel som et intracellulært enzym (figur 5b) og protein (figurene 5c og d). For flere eksempler, som kofaktorer eller små molekyler, henvises det til Eyer et al. (2012) og Eyer et al. (2013).

Først, viser vi en assay for et utskilt enzym (figur 5a). Ved aktivering med forbolmyristatacetat (PMA), humane monocytter indusere sekresjon av lysozym, et enzym som induserer bakteriecellelyse. For denne analyse inneholder cellebufferen 4-Methylumbelliferyl β-DN, N'-diacetylchitobioside, et svakt fluorescerende substrat for lysozYme. Ved spalting av sukkerrester med enzymet, er fluoroforen frigjort og kan påvises inne i kammeret. Her er fordelen av mikrokammeret det minimerte fortynning av det utskilte enzym, tillater påvisning av lave enzymkonsentrasjoner i løpet av en kort tidsperiode. På figur 5a er flere eksempelkurver er vist som representerer den enzymatiske omsetning av lysozym utskilt fra enkelt-stimulerte U937-celler. Den U937-cellelinje avledet fra en pasient med histiocytisk lymfom, og kan induseres til å klemme monocyttisk differensiering. Denne cellelinjen produserer TNFa, lysozym og β2-mikroglobulin etter stimulering med PMA. Ingen omsetning er synlig i åpne kamre eller cellefrie kamre (stiplet linje).

Figur 5b viser den relative kvantifisering av et intracellulært enzym, her glukose 6-fosfat-dehydrogenase (G6PDH). G6PDH er en renhold protein og celler fra samme vev opprinnelse bør ikke varierer i stor grad i sin G6PDH konsentrasjon 24. Her ble U937-celler innfanget i kammeret, og vi som følger med en fluorescens-analyse for påvisning av G6PDH sammen med lyseringsbuffer. Den består av glucose-6-fosfat, NADPH, enzymet diaforase og substratet resazurin, som omdannes til fluorescerende resorufin når G6PDH er til stede. Selv om økningen i fluorescens over tid svarer til mengden av G6PDH. Microchip letter videre studier på effekten av giftige forbindelser, for eksempel ved inkubasjon av cellene med et giftstoff (her kamptotecin) for en definert tid (60 min). Etter denne behandling ble den frigjorte enzym spyles bort og cellene ble lysert, og nivået av G6PDH ble målt. Faktisk, et betydelig tap av intracellulær enzyminnholdet var synlig på grunn av en langsommere økning av fluorescens (røde linjer og kolonner i figur 5b). Detaljer av denne studien er å finne i Eyer et al. Åtte

e_content "> Videre viser vi resultatene fra en immunologisk for analyse av intracellulære GFP mengder. For indusert uttrykk, HEK293 celler der transfektert med T-rex uttrykk system. I dette systemet, GFP uttrykk kan induseres ved tilsetning av tetracyklin . Etter 8 timers inkubasjon ble cellene suspendert, spylt på brikken, fanget, og deretter lysert. fange anti-GFP antistoffer ble immobilisert på glassoverflaten å følge protokollen som er presentert her for å binde det frigjorte GFP fra cellen. Figur 5c viser bindingskinetikken av GFP til antistoffet. I dette eksemplet, GFP kunne bli direkte målt ved total intern fluorescens mikroskopi på grunn av fluorescens av proteinet. Vi ønsker å understreke at nonfluorescent proteiner kan også bli detektert ved hjelp av en sandwich-ELISA eller liknende formater. For dette kan de nødvendige analysekomponenter bli innført etter vasketrinnene. Fordelen med ELISA er signalforsterkning på grunntil enzymet, noe som gir et fluorescerende produkt som er akkumulert inne i mikrokammeret.

Til slutt ønsker vi å presentere en encellet sandwich-ELISA med GAPDH som målet protein. Vi har fastslått GAPDH i U937-suspensjonsceller så vel som adherente HEK293-celler (figur 5d). For dette immobiliserte vi anti-GAPDH-antistoff (fangst-antistoff). Etter at cellelyse ble den andre enzym-merket antistoff (deteksjonsantistoff) innført. Kamrene ble åpnet, og som følge av strømningen, ble ubundne deteksjon-antistoffer vasket bort og Amplex Red ble innført til kammeret. Omdannelsen av Amplex Red til fluorescerende resorufin med HRP (deteksjonsantistoff) ble overvåket over tid i alle 60 microchambers samtidig. Helningen fra den lineære delen av reaksjonsblandingen ble bestemt. Denne helling er direkte korrelert med konsentrasjonen av enzymet og dermed til konsentrasjonen av analytt. Resultatene fra enkelt-U937-cellene viste en gjennomsnittlig GAPDHmengde på 2,6 attomol, med minimale og maksimale verdier av 2,0 og 3,2 attomol hhv. Den dataanalyse av 46 HEK celler avdekket at disse cellene inneholdt i gjennomsnitt 2,5 attomol GAPDH (minimal 0,9 attomol; maksimal 4,1 attomol).

Figur 1
Figur 1. Den microdevice og skjemaer for de forskjellige analysene presentert. A) montert microdevice. Her er de kamre fylt med fluorescein for visualisering (grønn fluorescens). Også synlig er reservoaret, tilkoblingene for kontroll laget (press, 2x4 kontakter i det bakre venstre og høyre foran) og tilkoblingen til sprøytepumpen (foran). B) Zoom inn på mikrokammeret området. Mange av disse kammere kan være anordnet i en matrise. For visualisering, ble oransje mat fargestoff isolert inne i kamrene, mens grønn mat fargestoff er skylt gjennom kanalene. Den trykkreguleringslaget er fylt med vann. C) Zoom på en enkelt mikrokammeret. D) Skjematisk av operasjonen av enheten. Innenfor en mikrokammeret (sett fra siden), er en enkelt celle fanget og isolert. Cellen kan stimuleres, inkuberes, vasket og til slutt lysert i brikken. Den cellulære innhold kan bli analysert direkte med analyser for enzymer og koenzymer hvor en fluorescerende rest genereres ved reaksjon (til venstre). For andre proteiner, kan overflaten modifiseres med antistoffer som binder seg spesifikt til målet protein (høyre). Siden antigenet er bundet til overflaten, kan lysatet bli vasket bort og deteksjons molekyler slik som sekundære antistoffer kan tilsettes for å kvantifisere målprotein. for å vise større bilde .

e 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Skjematisk av kanalsystemer og dimensjonene til mikrokammeret. A) Maske av virvelsjiktet. Den fluidic laget består av (fra venstre mot høyre) et utløp, idet kammeret region, et filter som holder tilbake partikler og celleklynger og et innløp. A 4 i skiven kan havnen strukturene for produksjon av 10 chips. B) Maske av den tilsvarende kontrollsjiktet. På grunn av den nødvendige plass for oppstilling, en 4 i skiven inneholder strukturene for produksjon av 5 chips. C) Skjematisk av sammenstilte sjikt (til venstre) og utvidelse som viser en celle felle (til høyre), begge med lengdeskala. for å vise større bilde .

Figur 3 Figur 3. Skjematisk av SU-8 prosessering og PDMS produksjon. A) Skjematisk av SU-8 behandlingsprotokoll. En silisiumskive er spinn-belagt med SU-8 og myk-bakt ved 95 ° C i 4 min. Den ønskede mikrofluidkanal utformingen overføres til SU-8 ved hjelp av en fotomaske og UV-lys-eksponering. Etter en etter-eksponering bake (95 ° C, 5 min), blir SU-8 utviklet og hard-bakt ved 180 ° C i 2 timer. B) Skjematisk fremstilling av microfluidic chip fabrikasjon. En blanding av PDMS oligomer og herdemiddel er spinn-belagt på hovedskjema for fluidtekniske kanaler, og helt over på hovedskjema for styresjiktet. Kanalen negativer er avbildet i rosa. Begge lag er herdet i en ovn. Styre sjikt chip delen er demontert fra wafer (styrekanal i blått), og hull for trykkforbindelser stanses (hvitt). Begge deler-kontroll ogfluidsjikt-er plassert i oksygenplasma, og etterpå, de er på linje, og limt. Hele brikken blir deretter demontert fra det fluidic hovedform (væskekanal i rødt) og fluidic tilgangshullene stanses (hvitt). Endelig er chip og et glass lysbilde limt etter overflate aktivering i oksygen plasma. Klikk her for å se større bilde .

Figur 4
Figur 4. Skjematisk av microcontact utskrift. A) Master fabrikasjon for myk litografi. (1) En PDMS stempel blir inkubert med protein (bBSA) oppløsning. (2) Oppløsningen fjernes, stempelet er vasket, og et monosjikt av protein forblir i stempelet. (3) Et stempel er plassert på et objektglass, og dermed proteinene overføres til glasset sur ansikt. I løpet av denne tiden, er det mikro sammen med stempelet på glasset utsettes for en oksygenplasma. (4) Et stempel fjernes, og mikrobrikke er festet til glass-slide. For visualisering, er to eksempel strukturer vist, trykt med fluorescerende BSA-fluorescein konjugat. B) Microcontact trykte området per kammer. Siden utskrift og kamre ikke er justert, evaluert vi variasjoner på bindende flekker (trykt område) på tre forskjellige chips (tallene 1-3) og alle 60 microchambers. Som et resultat, er kammer til kammer variabilitet relativt liten (<2,5%) og chip-til-chip variabilitet var neglisjerbar (<1%), noe som viser at det faktisk ikke nødvendig å justere de trykte strukturer til kamrene. Klikk her for å se større bilde .

18/50618fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Resultater fra G6PDH, lysozym, GFP og GAPDH analyser. Representative resultater. A) Enzyme sekresjon fra enkeltceller. Venstre: skjematisk av assay for et utskilt enzym, her lysozym. Lysozym er utskilt av enkle, PMA-aktiverte U937-celler og akkumuleres inne i de lukkede microchambers, hvor den katalyserer produksjon av fluorescerende 4-methylufilbelli. Høyre: Data hentet fra et sekret eksperiment. De grønne kurvene viser fluorescens-intensitet over tid for kamrene okkupert av en celle, som også er vist i et kammer uten celler (sort, stiplet linje) for sammenligning. B) Deteksjon av intracellulære enzymer i enkeltceller. Venstre: Skjematisk av analysen for den intracellulære enzym G6PDH. Ved cellelyse, er intracellulær G6PDH slippes inn i kammeret, hvor de andre komponenter for en enzymatisk reaksjon kaskade er til stede. Høyre: Eksempel kurver og representative data. Enkelt U937Cellene ble analysert for enzyminnhold (svart). Ved toksisk påvirkning av camptothecin, hvor permeabilizes membranen, ble to tredjedeler av enzymet tapt (oransje). C) Immunoassay av intracellulære proteiner av enkeltceller. Venstre: Skjematisk fremstilling av et immunoassay, her for den intracellulære proteinet GFP. Anti-GFP antistoffer ble immobilisert på overflaten i henhold til protokollen som er beskrevet heri. Celler ble deretter lysert på brikken og bindingssteder ble overvåket over tid ved bruk av TIRF mikroskopi. Høyre: Figur fra et slikt eksperiment viser bindingskinetikken av GFP til de immobiliserte antistoffer. Tidspunkt 1 markerer innføring av lyseringsbuffer. På tidspunktet to, er GFP begynner å hope seg opp på overflaten, noe som betyr at cellelyse har funnet sted. Binding av GFP til antistoffene er fullført ved tidspunktet 3. D) Sandwich ELISA for intracellulære proteiner av enkeltceller. Venstre: Skjematisk av en sandwich ELISA, her for den intracellulære protein GADPH. AntiGAPDH-antistoffer ble immobilisert på overflaten ifølge protokollen beskrevet heri. Celler ble deretter lysert på brikken og inkubert. Frigjort GPADH bundet til antistoffet, ble kammeret vasket og deteksjon-antistoff (HRP-koblet) ble innført. I et siste trinn ble nonbound deteksjon-antistoff vaskes vekk, gjenkjennings-reagens ble innført og reaksjonen ble overvåket over tid. Høyre:. Kvantifisering av GAPDH inne U937 og HEK293 celler Klikk her for å se større bilde .

Overflatemodifisering protokoll for ELISA

Trinn Tid Konsentrasjon Strømningshastighet Flow-free inkubasjonstid Chamber åpen / lukket
[Min] (W / v)% [ML / min] [Min] </ Td>
BSA 30 4 - Åpent
PBS 10 5 Åpent
Avidin 30 0.025 5 Åpent
PBS 10 5 Åpent
Protein G, biotin 30 0.0025 5 Åpent
PBS 10 5 Åpent
Antistoff 20 0.0001 5 15 Åpent
PBS 10 5 Åpent
Celler
(300 000 celler / ml) 		~ 5 30 Lukkes når fellene er okkupert.
Lysis buffer 5 30 Åpne kort tid
Inhibitor (for eksempel 20 mM HCl) 15 10 Stengt
PBS 2 30 Stengt
Detection Reagent 5 30 Åpne kort tid
Begynne å overvåke reaksjon

Tabell 1. Overflate modification protokoll for ELISA. For forklaring, se tekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microfluidics teknologi har åpnet nye og spennende muligheter for encellede analyse. Spesielt har muligheten til å felle og immobilisere celler individuelt av microfluidic verktøy tillatt systema kort og langtidsstudier på encellede egenskaper og respons. I tillegg, innkapsling av cellene i høyfrekvente mikrodråper, generert på en mikrobrikke, har gjort det mulig enkelt celle sekresjon studier, som ikke kan utføres med konvensjonelle cytometri enheter. Den mikrodråpen tilnærming har imidlertid visse begrensninger ved inkubering og vasketrinnene er nødvendig for analyseprotokollen. Vår tilnærming kombinerer begge begrepene celle fangst og isolasjon, og derfor forenkler det å utføre mer kompliserte analyser inkludert immunoassays basert på overflate immobilisert antistoffer. I tillegg er metoden svært fleksibel med hensyn til programmet og målet analytter.

Utformingen av mikrobrikke gjør (i) effekstrekkelig celle overtrykk, (ii) tilførsel av forskjellige buffere og reagenser, og (iii) en sikker atskillelse i en meget lite volum når det er nødvendig. På denne måten utvanning av målmolekylene unngås. Seksti (til hundrevis) av microchambers er plassert på én enkelt enhet slik mange eksperimenter i parallell. Den runde-formet ventiler lukking de microchambers kan rettes sammen eller separat av rader eller kolonner, noe som er viktig når krysskontaminering til tilstøtende kamre bør forebygges. Med microchambers lukket, kan behandles kanalene med skadelige løsninger som for eksempel saltsyre til rengjøring uten å påvirke de fangede celler. På den annen side, er rask utveksling av volumet inne i mikrokammeret mulig. For tiden en minimal tid på 200 ms er nødvendig for å fullstendig åpne kammeret, og for å innføre nye reagenser (for fullstendig utveksling av mikrokammeret volum, har strømningshastigheten som skal behandles).

Mens vår metode er veldig reliable og reproduserbar, bør man huske på at det er to hoved kritiske punkter i protokollen av chip fabrikasjon og drift. For det første har de liming av de to chip lagene etter at plasmaaktivering må gjøres raskt. Justeringen er kritisk, ellers enkelte kamre eller hele brikken er ikke brukbart, siden bonding er irreversible. Dette trinnet kan være vanskelig for uerfarne brukere, men etter litt trening selv mindre erfarne laboratoriearbeidere får vanligvis gode resultater. Den andre kritiske punkt er renheten under montering og bruk av mikrochip. Hvis støvpartiklene er tilstede på overflaten av brikken, kan de invadere styrekanaler og ventiler eller til og med føre til en avbrytelse av PDMS-PDMS-eller PDMS-glass binding. Vi vil derfor bruke mye oppmerksomhet til rengjøringsprosedyrer. Det bør bemerkes at i tillegg til hovedskjemaet fabrikasjon (utført i et rent rom), produserer og bruke mikrobrikker i en vanlig laboratoriemiljø, hvor støv ennd partikler er til stede.

Til tross for all den omsorg, hvis kamrene ikke lukker riktig, kan det være at enten trykkledninger er blokkert eller spin coating prosessen ikke gi riktig membrantykkelse. Dessuten vi observerte utilstrekkelig binding fra tid til annen, noe som resulterer i brudd på bindingen mellom de to lag PDMS. Hvis mange chips fra samme batch viser dette problemet, er det mulig at tiden mellom plasma aktivering og justering er for lang. Noen ganger opplevde vi klebrige PDMS på wafere som ikke kunne være riktig fjernet og var et resultat av utilstrekkelig silanization av wafer.

Når produksjonsmetoden er etablert, kan den microfluidic plattformen skal brukes til mange forskjellige studier på enkeltcelle-nivå. Her vi viste påvisning av intracellulære og utskilt midler med forskjellige analyser, men mange andre analyser er tilgjengelig på brikken. De fleste proteinene ikke er fluorescerende og deres debeskyttelse via immunoassays er ikke enkelt. Implementering av ELISA i brikken vil gi mange fordeler. For det første, kan analysen bli laget meget spesifikt for det ønskede protein (når passende antistoffer er til stede). For det andre, kan informasjon fra ELISA kvantifiseres selv ved lave konsentrasjonsgrenser, slik at antallet av protein-eller molekyl kopier som er tilstede i cellen.

Vår nåværende brikken er utformet for analyse av enkeltpattedyrceller. Imidlertid modifikasjon av brikken for andre celler slik som bakterier, alger og gjær, bør være mulig. Opp til nå, er den eneste begrensning for eksperimenter behovet for et assay basert på fluorescens. Men, er vi for tiden studerer gjennomføringen av massespektrometri som deteksjonsteknikk. Når dette er etablert, vil rekken av analyseproblemer som kan bli undersøkt med plattformen være enda bredere. Videre, siden ikke alle analyser er mulig i nærvær av cellelyse buffere, vier for tiden vurderer også ulike andre lysis teknikker på plattformen. Vi er sikker på at den allsidige microfluidic plattform som presenteres her gir grunnlag for nye encellede studier på proteomet, metabolome og secretome nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Tom Robinson for bevis lesing av manuskriptet, C. Bärtschi og H. Benz for bygging av spesialbygde trykk kontrollsystem. Vi ønsker også å erkjenne bruk av clean room anlegget FØRST og Light Mikroskopi Center (LMC), både ved ETH Zürich. Arbeidet ble finansiert av Merck Serono og European Research Council (ERC) under syvende rammeprogram (ERC Starting Grant, prosjekt no. 203428, nμLIPIDs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

Tags

Immunologi Microfluidics proteomikk systembiologi encellede analyse Immunoassays Lab på en chip kjemisk analyse
En Microfluidic Chip for Allsidig Kjemisk analyse av enkeltceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S.,… More

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter