Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

В этой статье мы представляем микрофлюидных чип для анализа одного клеток. Это позволяет количественное внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных мессенджеров посредством люминесцентных анализов или иммунологических.

Abstract

Мы представляем микрофлюидных устройство, которое позволяет количественное определение внутриклеточных биомолекул в нескольких отдельных клеток параллельно. С этой целью клетки пассивно ловушке в середине микрокамеры. После активации уровнем управления, клетка изолирован от окружающей объема в небольшой камере. Окружающий объем может быть обменен, не влияя на изолированную клетку. Однако, после короткого открытия и закрытия камеры, решение в камере могут быть заменены в течение нескольких сотен миллисекунд. Благодаря обратимости палат, клетки могут быть подвержены различные решения последовательно в весьма контролируемым образом, например, для инкубации, стирки, и наконец, лизиса клеток. В плотно закрытых микрокамеры позволить удержание лизата, минимизировать и контролировать разбавление после лизиса клеток. С лизис и анализ происходят в том же месте, высокая чувствительность сохраняется, потому что не далее дilution или потеря анализируемых происходит во время транспортировки. Дизайн микрокамера поэтому позволяет надежную и воспроизводимую анализ очень небольшом количестве копий внутриклеточных молекул (attomoles, zeptomoles), освобожденных из отдельных клеток. Кроме того, многие микрокамеры могут быть организованы в формате массива, позволяя анализ многих клетках сразу, учитывая, что подходящие оптические приборы используются для мониторинга. Мы уже использовали платформу для доказательства правильности концепции исследований для анализа внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных посредников в либо относительной или абсолютной количественной форме.

Introduction

Многие исследования в прошлом показали клетки к клетке различия в большой популяции клеток 1-3, в частности сигнализации обрабатывает 4 или суммы внутриклеточных биомолекул, таких как белки 5,6, метаболиты, и кофакторов 7,8. Эти неоднородности считаются принципиально важно для адаптации клеток и эволюции 9, но также играют ключевую роль в появлении и лечения заболеваний, таких как рак 10-13. Таким образом, исследования на уровне одноклеточного имеют большой интерес в биологической и фармакологических исследований, особенно если эти исследования показывают различные клеточные реакции после лечения биологически активных химических веществ.

В последние годы многие аналитические платформы были разработаны облегчить анализ отдельных живых клеток или химический состав содержимого ячейки. В то время как люминесцентные сортировка клеток (FACS) является золотым улAndard для очень высокой пропускной анализа отдельных живых клеток, способ может не использоваться для количественного определения внутриклеточных или секретируемых соединений. Появление микрофлюидных платформ пообещал новые аналитические стратегии позиционирования, лечения и наблюдения отдельных клеток. Вехой в микрофлюидики была достигнута с интеграцией гибких PDMS клапанов, реализуемых Quake с сотрудниками 14,15. Эти клапаны полезны, так как они могут изолировать регионы на чипе, например разделения двух культур 16. Кроме того, они особенно применимо для анализа одного клеток и, следовательно, способствовать снижению аналита проблемы разрежения. Мощность этого подхода для анализа одноклеточных был недавно продемонстрировано Хансен и его коллеги, которые проанализировали экспрессию генов из сотен отдельных клеток в параллельном 17.

При ориентации белков и метаболитов, анализ очень сложно в связи с отсутствием подходящих аМетоды mplification, большое количество различных соединений, присутствующих и их вариаций в химической природы. Кроме того, большинство внутриклеточных биомолекул как ожидается, будет присутствовать в небольших количествах копирования в порядка нескольких десятков тысяч 18, следовательно, аналитический метод используется должны иметь высокую чувствительность. Более мощные анализы, такие как иммунологических и энзим-связанного иммунологических (ELISA) трудно интегрироваться в микрожидкостных устройств, так как они требуют несколько стирки и инкубационных этапа, а также поверхности иммобилизации.

Из-за этих проблем, это не удивительно, что только несколько примеров сообщалось где белки или метаболиты были количественно на уровне одной клетки. Например, исследования по секреции люминесцентных соединений были зарегистрированы 19,20. В последнее время реализация с ELISA был представлен для анализа секретируемых (нефлуоресцирующих) белков из культуры клеток (клеток ТНР-1) 21 и один (яmmune) клетки 10. Ориентация внутриклеточные белки, Ши и соавт. Разработали микрожидкостных устройств, что облегчает идентификацию внутриклеточных белков для анализа сигнальных путей в опухолевых клетках с помощью иммуноанализа 11. Однако только относительные количества белков были определены и амплификация не был использован, чтобы увеличить сигнал для низкое содержание белков.

В последнее время мы смогли объединить одноклеточного улавливания микроустройство с флуоресценции анализов 8 и иммунологических 22 (рис. 1). Клетки пассивно в ловушке microsized барьерами структур, которые позволяют питания и (быстрый) обмен среды и другие химические реагенты без движения клеток. Кольцеобразный клапан вокруг каждой ловушки позволяет изолировать клетки в очень малом объеме ("микрокамеры"). Этот клапан приводится в действие сразу же после введения клеток лизис (hypoosmolar) буфер, онсть предотвращения внутриклеточные молекулы или секретируемые молекулы диффундируют прочь. Самое главное, из-за небольшого размера тома (625 PL) большой разбавление молекул не происходит. Кроме того, поскольку лизис и анализ выполняется в то же самое положение в чипе, нет никакой потери аналитов из-за транспортировки. Дизайн чипа описано здесь состоит из 8 чередующихся рядов либо 7 или 8 микрокамеры, на общую сумму 60 микрокамеры. Камеры приводятся в строках, так что перекрестное загрязнение вдоль линии, исключается.

Платформа может быть использован в сочетании с флуоресцентные анализы, а также иммунологических анализах (рис. 1d). В последнем случае мы разработали протоколы для иммобилизации антител, которые совместимы с производством чипа и процесса сборки. Поэтому платформа открывает путь для чувствительных, надежных и поддающихся количественному анализов на одном уровне клетки. До сих пор мы использовали устройство для анализа Intracellular и выделяемые ферменты (относительно количественного ферментативными анализов), внутриклеточные кофакторов, белки и малые молекулы (абсолютного количественного по конечной точки анализов или ELISA). В дальнейшем, мы опишем процесс изготовления чипов с помощью многослойной мягкой литографии и протоколов для паттерна антител с помощью микроконтактной печати и химии поверхности. Кроме того, некоторые примеры использования чипа и операций даны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. СУ-8 Мастер Изготовление

Подготовьте обе мастер форм для каналов (жидкостных и контроля, для схемы и размеры см. рисунок 2) со следующими протокола, но с разными шаблонов масок. Процесс показан на фиг.3а.

  1. Начать нагреванием 4 дюйма кремниевой пластины в течение 10 мин при 180 ° С Загрузите обезвоженную пластины на спин-машины для нанесения покрытий и использовать следующий протокол для спин-покрытия СУ-8 2015:
    1. Спин пластины при 100 оборотах в минуту в течение 20 сек (открытой крышкой спин-машины для нанесения покрытий, обойтись SU-8 во время этого шага, закрывают крышкой после выдачи).
    2. Спин пластины при 500 оборотах в минуту в течение 10 сек (это будет распространяться противостоять по всей пластине).
    3. Спин пластины при 1750 оборотах в минуту в течение 30 сек (определяет высоту резиста до 20 мкм).
  2. Удалить сопротивление от края пластины с ацетоном (использовать тампон), как это будет в противном случае прилипают к плите на следующей стадии. Передача пластины ахotplate при 95 ° С и тепла в течение 4 мин. После softbake, подвергать сопротивляться через фотошаблон, приклеенный к Sodalime стекло в маске выравнивателя с ультрафиолетовым светом (150 мДж / см 2, измеренной при 365 нм).
  3. После экспозиции, нагревать пластину снова при 95 ° С в течение 5 мин на электрической плитке. Охладите пластины до комнатной температуры, а затем погрузите его в ванну с СУ-8 разработчиком в течение 4 мин. Осторожно встряхните, чтобы удалить Неэкспонированную СУ-8. Вымойте пластину с чистой комнаты класса изопропанола и сушить азотом. Проверка под микроскопом если развитие было успешным (особенно клеток ловушки). Если ячейка ловушки полностью разработана, отражение кремниевой пластины должны быть видны. При необходимости разрабатывать пластину снова в течение нескольких минут.
  4. Выпекать пластину в печи в течение 2 часов при 180 ° С, чтобы удалить все остатки растворителя. Проверьте высоту каналов с шагом профилирования. Если высота отличается от заданной высоты, повторить этот протокол, начиная с шагом 1,1 с новой пластины иизменить спин-скорость (шаг 1.1.3). Завершение изготовление мастер-формы путем silanizing пластину с 1Н, 1Н, 2Н, 2Н-Perfluorodecyl-dimethylchloro-силана в эксикаторе в течение ночи.

2. Мастер по изготовлению для микроконтактной печати

  1. Для того чтобы подготовить мастер-формы для микроконтактной печати, обезвоживают кремниевой пластины в течение 10 мин при 180 ° С Спин-Coat 1 мл HDMS на этот пластины при 7500 оборотах в минуту в течение 30 сек (сопротивляться придерживается лучше к силанизированного поверхности). Спин-пальто 2 мл AZ1518 позитивного резиста с этим протоколом:
    1. Статический дозировки резиста на пластины.
    2. Спин пластины в течение 5 сек при 500 оборотах в минуту.
    3. Спин пластины в течение 60 сек при 4000 оборотах в минуту.
  2. После 50 сек softbake при 100 ° С на электрической плитке, подвергать противостоять воздействию УФ-света (21 мДж / см 2 при 365 нм) через фотошаблон и на маске выравнивателя. Разработка сопротивляться в ванну с AZ 726 75 сек. Промойте разработанную подложку с DI-воды и выдувного гР.Ю. азотом. Удаление остаточного растворителя при нагревании пластины при 115 ° С в течение 50 сек. Silanize пластину под вакуумом в течение ночи.

3. Изготовление Микрожидкостных Chip

Конструкция устройства двухслойной используется для этих экспериментов. Два слоя готовят отдельно и соединены друг с другом до того, как чип, наконец, соединенный на предметное стекло (рис. 3б). Этот шаг описывает получение слоев PDMS и PDMS на печать для печати микроконтактной.

  1. Подготовка 10:01 смесь PDMS и отвердителя. Подготовьте около 80 г PDMS в общей сложности (с помощью наших проектов, то это приведет к 10 фишек). Смешайте обе части энергично и дегазации PDMS, пока смесь не пузырь бесплатно (~ 30 мин).
  2. Поместите пластину с контрольной слоя внутри чашки Петри и прикрепить ее на дно. Далее, заливают ~ 50 г ПДМС сверху и поставить пластину, по крайней мере, 2 ч в сушильном шкафу при 80 ° С, чтобы обеспечить полноеотверждение PDMS. Повторите ту же процедуру для микроконтактная печати пластины, для этого ~ 20 г PDMS необходим.
  3. Спин-Coat PDMS на пластине с жидкостного слоя при скорости вращения 2000 оборотов в минуту, чтобы сформировать приблизительно 40 мкм с высоким PDMS слой. Вылечить PDMS в печи в течение по крайней мере 1 час при 80 ° С
  4. Когда обе части вылечить, удалить уровень управления от пластины и нарезать на кусочки с лезвием бритвы. Удар присоединительные отверстия давление с помощью 1 мм биопсии панчер. Для хранения, рекомендуется положить кусочек ленты по этим каналам.
  5. Для склеивания двух слоев, возьмите спин-покрытием пластин и верхнюю часть и поместить их в плазменном очистителя 23. После плазменной обработки, быстро выровнять обе части под микроскопом с большим рабочим расстоянием. Добавить некоторые запасные PDMS вокруг размещенных лучших частей. Этот шаг не является обязательным, однако это облегчает удаление из PDMS от пластины. Поместите пластину в печи при 80 ° С в течение по крайней мере 1 часа.
  6. Используйте скальпель, чтобы тщательно удалить PDMS от пластины и сократить микрочипов. Пробивки отверстий доступа для жидкостных соединений с 1,5 мм биопсии перфоратором.
  7. Чип PDMS теперь завершена и могут быть сохранены в течение нескольких месяцев. Необязательно: Если чип используется с резервуаром, вырезать верхнюю часть пипетки 200 мкл и использовать некоторые запасные, полу-вылечить PDMS приклеить ее на первое место. Поместите микросхему в печи снова при 80 ° С в течение по крайней мере 1 часа.

4. Укладка в стекло

Для использования устройства для прямых ферментативных анализов, единственный шаг требуется после склеивания является блокирование поверхностей. Для этого протокола, перейдите к А. Однако использовать микрофлюидных чип для иммунологических или ИФА, пожалуйста, обратитесь к протоколу B ограничить сайты связывания только в предметное стекло (т.е. для TIRF микроскопии или SPR). Если это ограничение не важно, обратитесь к А, но использовать биотинилированных конъюгатов в шаге 4.3 и перейдите к шагу 4.8в протоколе B, чтобы создать полнофункциональную поверхность.

Перед выполнением протокола А и В: Желательно, чтобы фильтровать все из использованных растворов белков перед введением их в чипе. Мусора и белковые агрегаты в противном случае могут блокировать клеточные ловушки, тем самым уменьшая количество камер, которые можно использовать для анализа. Для этой цели используйте небелковых блок адсорбции фильтра для фильтрации все решения до введения их в каналы.

Протокол (ферментативные анализы)

  1. Чтобы завершить микрожидкостных устройств, скрепления частей PDMS на предметное стекло. Чтобы сделать это, сначала чистить стекло с мылом, дистиллированной водой и этанолом. Высушите слайд с помощью потока азота. Очистите участие PDMS скотчем.
  2. Положите часть PDMS и очищенный предметное стекло в пылесос плазмы в течение 45 сек при 18 Вт Для обеспечения жесткой сцепление, поставить чип на горячей плите (100 ° C) в течение 5 мин.
  3. После склеивания, заполнения чип с фluids. Самый простой способ добиться этого заключается в использовании центробежной силы. Отрежьте нижнюю часть 200 мкл кончика пипетки. Для жидкостных каналов, заполнить их блокирующим раствором (бычий сывороточный альбумин (4% вес / объем) или поли-L-лизин) привитым полиэтиленгликолем (0,05% вес / объем) и поместить ее концы в бухтах. Заполните Уровень управления входы водой или с isosmotic раствора, например PBS. Поместите микросхему в центрифугу (800 мкг) в течение 5 мин. Каналы должны быть сейчас заполнены жидкостью полностью. Если нет, повторите этот шаг.
  4. Инкубируйте блокирующий раствор в течение не менее 30 мин при комнатной температуре. Промыть раствор из жидкости слоя с PBS, при скорости потока 10 мкл / мин с помощью шприца. Теперь устройство готово для сотовых экспериментов.

Протокол В (иммунологические)

Для полного обзора модификации поверхности со стадии 4,7 года, пожалуйста, обратитесь к таблице 1.

  1. Вcubate PDMS марки для микроконтактной печати с раствором BBSA / BSA (например 1-100). Через 30 мин очистки марки тщательно дистиллированной водой и высушить штамп в токе азота. Быстро поставить штампы на очищенную стекло (рис. 4).
  2. Проэкспонируйте стекло с печатью вместе с верхней части микрофлюидный чип в кислородной плазме в течение 45 с при максимальной мощности (18 Вт) в чистой плазмы. После плазменной обработки, снимите отметку и выровнять поверхность отпечатанного материала под микрокамеры устройства. Поместите микросхему в течение 30 мин на горячей плите при 50 ° С
  3. Чтобы блокировать оставшуюся поверхность, ввести стерильно отфильтрованной раствора БСА (4% (вес / объем) в PBS) в чип с центрифугой (см. шаг 4.2). Инкубировать в течение 1 часа и промывки раствор, из жидкости слоя с PBS (см. шаг 4.3). Чип можно использовать непосредственно или хранили в течение до 2 недель при 4 ° С во влажной коробки.
  4. Для полнофункциональной связывания Surfacе, ввести авидин (0,025% (вес / объем) в ФБР) в резервуар. Использование скорости потока 5 мкл / мин в течение 30 мин, чтобы вывести авидин раствора через проточные каналы. После промывки PBS в течение 10 мин. Промойте резервуар тщательно.
  5. После этого добавить белок G (0,0025% (вес / объем) в ФБР) и заподлицо течение еще 30 мин. Промыть PBS еще 10 мин после этого. Затем добавьте интерес антитело (0,0001% (вес / объем) в PBS) в течение 10 мин. Через 10 мин остановить поток в течение 15 мин, чтобы позволить связывания. Далее, промывают PBS в течение 10 мин.

5. Сотовые Эксперименты

Протокол записывается в общих чертах из-за множества возможных анализов. В качестве примера реагенты, необходимые для анализа токсичности G6PDH даны. Первоначальный клеток захвата КПД устройства составляет около 2,5%, т.е. 5 из 200 клеток будет в ловушке. Окончательное размещение сотовых ловушек сильно зависит от используемой клеточной линии, протокол о приостановленииклеточная линия и время клетки смываются через канал. Для клеток естественно произрастающих в виде суспензии (например, U937), отдельные клетки могут быть найдены в около 75% из палат после нескольких минут. Остальные камеры или не заполнены, или занимают две или более ячеек. В общем, размещение одноклеточных меньше для адгезивных клеточных линий. При использовании довольно мягкий протокол суспендирующий представленные здесь, процент снижается до примерно 30% (HEK, MLT клетки). Размещение одноклеточных может быть улучшена путем обработки трипсином клеток, но это также может изменить результаты экспериментов.

В зависимости от молекулы-мишени, адсорбции или абсорбции в PDMS может повлиять на результаты. Адсорбция может быть уменьшена путем блокирования поверхности с БСА или PLL-п-ПЭГ. Поглощение вряд ли для большинства гидрофильных биомолекул, но это должны быть проверены на (малых) липофильных компонентов клетки.

  1. Подготовка клеток в зависимости от конкретного протокола (например,
  2. Загрузить клеток на чип с помощью шприцевого насоса и прямого потока, а не вывести клеточной суспензии. Использование скорости потока 5 мкл / мин в течение подвеска клеточных линий и более высокие скорости потока 10-20 мкл / мин в течение адгезивных клеток с уменьшить неспецифическую прикрепление клеток на стенках канала.
  3. Когда ловушки заполнены, закройте камеры. Если многие клетки придерживаться неспецифически к поверхности, попытайтесь смыть их диссоциации клеток с буфером при скорости потока 10-30 мкл / мин.

Протокол (ферментативные анализы)

  1. Вывод лизирующего буфера через чип. В данном примере этот буфер hypoosmolar буфер с добавлением Tween 20 (10 мМ Трис-HCl, 10мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1% (объем / объем) Твин 20). Для лизиса, быстро открывать и закрывать камеры (т.е. 500 мс для скорости потока 10-50 мкл / мин 7,21). Для анализа G6PDH, добавьте 2 мМ глюкозо-6-фосфат, 0,5 мМ НАДФ, 0,5 Е / мл диафораза и 0,3 мм резазурин в буфере для лизиса. Начните мониторинг кинетическую реакцию сразу после лизиса.

Примечание: Выберите любой буфер, который подходит для анализа, однако помните, что сильные моющие средства (например, Triton, SDS) лизируют клетки немедленно и приведет к потере анализируемого вещества во время открытия камеры.

Протокол В (иммунологические)

Для краткого описания экспериментов ELISA клеток (скоростей потока, состояние камеры и т.д.), пожалуйста, обратитесь к таблице 1.

  1. Для ELISA необходимо добавить нужную детектирующий реагент (например, вторичное антитело, меченого антигена) непосредственно в буфере для лизиса. Здесь добавил Tweeн 20 снижает неспецифической адсорбции. Лизиса клеток в соответствии со стадией 5,4. Выдержите смесь в течение 10-15 минут, чтобы позволить связывания (время инкубации в зависимости от используемого антигена и антитела).
  2. Антитела ферментные конъюгаты, что адсорбированные неспецифически в стенках канала может привести к конверсии реагента обнаружения уже внутри резервуара и каналов. Чтобы уменьшить проблемы с этим адсорбции, промойте постоянного ингибитор используемого фермента обнаружения через чип в течение времени инкубации (камеры закрыт, перед добавлением реагента обнаружения). Для HRP, используя 20 мМ HCl в воде, чтобы постоянно инактивации ферментов, адсорбированных неспецифически.
  3. После инкубационного периода, ввести детектирующий реагент (например Amplex Red и перекись водорода для HRP) на чипе. Откройте камер в ближайшее время еще раз, чтобы вымыть nonbound вторичного антитела в сторону и добавить реагент обнаружения. Начните сразу мониторинга кинетическую реакцию.
  4. Калибровка: Остановитеантитело против цели, представляющей интерес. Закрыть камеры. Подготовка различные концентрации анализируемого вещества в буфере или в клеточном лизате вне кристалла. Применить концентрацию на чип и быстро обмениваться объем внутри камеры (500 мс время размыкания). На этот раз открытие является достаточно коротким для того, чтобы никакие дополнительные накопления не происходит от анализируемого промывки, и только определенное число молекул из объема микрокамере обнаружены. Из известной концентрацией антигена внутри раствора и объема камеры (625 мкл), вычислить количество внутри камеры. После этого, перейдите к шагу 5.5 и введем группировку обнаружения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наша платформа способна анализировать различные внутриклеточные а также секретируемые молекулы, присутствующие в или произведенный одиночных клеток. Здесь мы хотели бы представить различные примеры исследований, чтобы подчеркнуть разнообразие возможных анализов. Приведем пример для секретируемого фермента (фиг.5А), а также внутриклеточного фермента (фиг.5В) и белка (фиг. 5c и г). Дополнительные примеры, такие, как кофакторов или малых молекул, пожалуйста, обратитесь к Eyer и соавт. (2012) и Айер и др.. (2013).

Во-первых, мы представляем анализ для секретированного фермента (рис. 5а). После активации форболмиристатацетатом (PMA), моноциты человека вызывают секрецию лизоцима, фермент, который вызывает бактериальный лизис клеток. Для этого теста, буфер ячейка содержит 4-метилумбеллиферил β-DN, N'-diacetylchitobioside, слабо флуоресцентный субстрат для lysozYME. После расщепления остатков сахаров под действием фермента, флуорофора освобождается и может быть обнаружен внутри камеры. Здесь преимущество микрокамеры является минимизированной разбавление фермента секретируемого, что позволяет обнаруживать низких концентрациях фермента в течение короткого периода времени. На фиг.5А, несколько примеров кривые приведены представляющий ферментативную оборот лизоцима секретируемый из отдельных стимулированных клеток U937. Клеточной линии U937 происходит от пациента с гистиоцитарной лимфомы, и может быть индуцирована к клемме моноцитарного дифференциации. Клеточная линия производит ФНО, лизоцим и β2-микроглобулина после стимуляции PMA. Нет оборот не обнаруживается в открытых камерах или бесклеточных камер (пунктирная линия).

5б показано относительное количественное определение внутриклеточного фермента, здесь глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PDH). G6PDH является уборка белка и клетки из той же ткани происхождения не должны в значительной степени различаются по своей концентрации G6PDH 24. Здесь, клетки U937 были пойманы в ловушку в камере, и мы поставили флуоресцентного анализа для обнаружения G6PDH вместе с буфером для лизиса. Он состоит из глюкозо-6-фосфат, NADPH, фермент диафоразу и подложкой резазурин, который преобразуется к флуоресцентным ресоруфина когда G6PDH присутствует. Скорость увеличения флуоресценции с течением времени соответствует сумме G6PDH. Микрочип дополнительно облегчает исследования о влиянии токсичных соединений, например, путем инкубации клеток с токсином (здесь камптотецина) в течение определенного времени (60 мин). После такой обработки выпущен фермент смывает и клетки лизировали, и уровень G6PDH измерялась. Действительно, значительная потеря внутриклеточного содержимого фермента было видно из-за более медленной увеличению флуоресценции (красные строк и столбцов в рисунке 5б). Детали этого исследования можно найти в Eyer и соавт. 8

e_content "> Кроме того, приведены результаты от иммунологического анализа для анализа внутриклеточных количеств GFP. Для индуцированной экспрессии, клетки HEK293, где трансфицированные системы экспрессии T-Rex. В этой системе экспрессии GFP может быть вызвано добавлением тетрациклина . Через 8 ч инкубации клетки суспендировали, промыть на чипе, в ловушке, а затем лизируют. Захват анти-GFP антитела иммобилизовали на поверхности стекла в соответствии с протоколом, представленной здесь, чтобы связать выпущенный GFP из клетки. фиг.5С показано связывание кинетика GFP с антителом. В этом примере GFP может быть непосредственно измерено полное внутреннее флуоресцентной микроскопии из-за флуоресценции белка. Мы хотим подчеркнуть, что нефлуоресцирующих белки также могут быть обнаружены с помощью сэндвич-ELISA или аналогичный форматах. Для этого необходимые компоненты пробы, могут быть введены после этапов промывки. Преимущество ELISA является усиление сигнала за счетс ферментом, получая флуоресцентный продукт, который накапливается внутри микрокамеры.

Наконец, мы хотели бы представить одноклеточного бутерброда ELISA с GAPDH в качестве целевого белка. Мы определили GAPDH в U937 суспензии клеток, а также прикрепленных HEK293 клетки (рис. 5, г). Для этого мы иммобилизованных анти-GAPDH антитела (захват антитела). После лизиса клеток, был введен второй меченное ферментом антитело (антитело обнаружения). Камеры были открыты, и за счет потока, несвязанные антитела распознавания были смыты и Amplex Красный был введен в камеру. Превращение Amplex Red от флуоресцентных резоруфином по HRP (детектирующего антитела) контролировали с течением времени во всех 60 микрокамеры одновременно. Наклон от линейной части реакции определяли. Этот наклон напрямую зависит от концентрации фермента и, следовательно, концентрации аналита. Результаты отдельных клеток U937 показали среднюю GAPDHколичество 2.6 attomol, с минимальными и максимальными значениями 2,0 и 3,2 attomol соответственно. Анализ данных из 46 НЕК клеток показали, что эти клетки, содержащиеся в среднем 2,5 attomol GAPDH (минимальное 0,9 attomol; максимальная 4.1 attomol).

Рисунок 1
Рисунок 1. Микроприбор и схемы различных анализов представлены. А) В собранном виде микроустройство. Здесь камеры заполнены флуоресцеина для визуализации (зеленая флуоресценция). Также заметным является резервуар, соединения для управления слоем (давление, 2x4 разъемы сзади слева и впереди справа) и подключение к шприцевой насос (спереди). Б) Нажмите на площади микрокамере. Многие из этих камер могут быть расположены в массиве. Для визуализации, оранжевый пищевой краситель был выделен внутри камер, в то время как зеленый пищевой краситель смывается через каналы. Система контроля давления в слой заполнен водой. С) Увеличить на одном микрокамере. Д) Схема работы устройства. В течение микрокамере (вид сбоку), одна ячейка в ловушке и изолированы. Ячейка может быть стимулировано, инкубируют, промывают и лизируют, наконец, в чипе. Клеточный содержание могут быть проанализированы непосредственно с анализов на ферменты или коферменты, где флуоресцентный фрагмент, генерируемых при реакции (слева). Для других белков, поверхность может быть модифицирован с антителами, которые специфически связываются с целевого белка (справа). Поскольку антиген связан с поверхностью, лизат могут быть смыты и молекулы обнаружения, такие как вторичными антителами могут быть добавлены для количественного определения целевого белка. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

е 2 "FO: содержание-шир =" 5 дюймов "Первоначально" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 2. Схема канальных систем и размеров микрокамере.) Маска дизайн жидкостного слоя. Жидкостный слой состоит из (слева направо) к розетке, региона камеру, фильтр, задерживающий частицы и клеточные кластеры и входом. 4 в пластине могут содержать структуры для производства 10 чипов. Б) маски конструкцию соответствующего слоя управления. В связи с необходимой пространство для выравнивания, 4 в пластины содержит структуры для производства 5 фишек. С) схема выровненных слоев (слева) и расширения показывая сотовый ловушку (справа), как с длинами. Щелкните здесь для просмотра увеличить .

Рисунок 3 Рисунок 3. Схема СУ-8 обработки и PDMS производства. А) Схема протокола обработки СУ-8. Кремниевая пластина является спин-покрытием с SU-8 и мягких выпекали при 95 ° С в течение 4 мин. Желаемый микрофлюидных канал дизайн, переносится на СУ-8 с использованием фотошаблона и экспозиции УФ-света. После выпекать постэкспозиционного (95 ° C, 5 мин), СУ-8 разработана и жестко запекать при 180 ° С в течение 2 часов. Б) Схема изготовления микрофлюидных чипа. Смесь олигомера PDMS и отвердителя спин-покрытием на мастер-формы для жидкостных каналов, и выливают в основной форме для управления слоем. Негативы канала изображены в розовый цвет. Оба слоя вылечить в духовке. Чип управления слой часть может быть демонтировано с пластины (канала управления в синий) и отверстия для подключения давления пробиты (белый). Обе части контроля ислой-которые жидкость помещают в кислородной плазме, а потом, они выравниваются и таможенные. Весь чип затем разобран от жидкостного основной форме (канал жидкости в красном) и отверстия жидкостный доступа пробиты (белый). Наконец, чип и стакан слайд связаны после активации поверхности в кислородной плазме. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4
Рисунок 4. Схема печати микроконтактной.) Мастер по изготовлению для мягкой литографии. (1) PDMS штамп инкубируют с белком (BBSA) решения. (2) раствор удаляют, штамп промывают и монослой белка остается на марке. (3) штамп помещают на предметное стекло, таким образом белки переносили в стеклянную Sur лицо. В течение этого времени микрочип вместе с печатью на стекле подвергаются воздействию кислородной плазмы. (4) штамп удаляется, а микрочип присоединена к стеклу. Для визуализации, два примера структуры показаны, печатается с флуоресцентным BSA-флуоресцеина конъюгату. Б) Микроконтакта печатной площади в камере. Поскольку печать и камеры не выровнены, мы оценили вариации на обязательных мест (печатная площадь) на трех различных чипов (номера 1-3) и все 60 микрокамеры. В результате камера к камере изменчивость является относительно небольшим (<2,5%) и чип-стружка изменчивость была незначительной (<1%), продемонстрировав, что там действительно нет необходимости, чтобы выровнять печатные структуры в камерах. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

18/50618fig5.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 5. Результаты G6PDH, лизоцим, GFP и GAPDH анализов. Представитель результаты.) Секреция ферментов из отдельных клеток. Слева: схема анализа для секретируемый фермент, здесь лизоцим. Лизоцим секретируется одно-, PMA-активированных клеток U937 и накапливается внутри закрытых микрокамеры, где она катализирует производство флуоресцентного 4-метилумбеллиферона. Справа: Данные, полученные из эксперимента секреции. Зеленые кривые показывают интенсивность флуоресценции с течением времени для камер, занимаемых одной клетки, также показали, представляет собой камеру без клеток (черный, пунктирная линия) для сравнения. Б) определение внутриклеточных ферментов в одиночных клеток. Слева: Схема анализа для внутриклеточного фермента G6PDH. После лизиса клеток, внутриклеточный G6PDH поступает в камеру, где другие компоненты для ферментативной реакции каскада присутствуют. Справа: Пример кривые и репрезентативные данные. Одноместный U937Клетки анализируют на содержание фермента (черный). По токсического влияния камптотецином, который permeabilizes мембрану, две трети фермента был потерян (оранжевый). В) Иммуноанализ внутриклеточных белков отдельных клеток. Слева: Схема иммуноанализе, здесь внутриклеточного GFP белка. Анти-GFP антитела иммобилизовали на поверхности согласно протоколу, описанному в данном документе. Затем клетки лизируют на чипе и связывающие пятна наблюдали в течение долгого времени с помощью TIRF микроскопии. Справа: График от такого эксперимента показаны связывания кинетику GFP с иммобилизованными антителами. Точка Время 1 отмечает введение буфера для лизиса. В момент времени 2, GFP начинает накапливаться на поверхности, а это означает, что лизис клеток не произошло. Связывание GFP с антителами завершается в момент времени 3. Г) сэндвич ELISA внутриклеточных белков одиночных клеток. Слева: Схема сэндвич ELISA, здесь для внутриклеточного GADPH белка. Анти-GAPDH антитела иммобилизовали на поверхности согласно протоколу, описанному в данном документе. Затем клетки лизируют на чипе и инкубировали. Освобожденный GPADH связан с антителом, камеру промывают и был введен антитело обнаружения (HRP связью). На последнем этапе, nonbound антитело обнаружения был смыт, был введен реагент обнаружение и реакцию контролируют с течением времени. Справа:. Количественная оценка GAPDH внутри U937 и НЕК293 Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Протокол Модификация поверхности для ELISA

Шаг Время Концентрация Расход Поток свободных время инкубации Палата открыто / закрыто
[Мин] (Вес / объем)% [Мкл / мин] [Мин] </ TD>
BSA 30 4 - Открыто
PBS 10 5 Открыто
Авидин 30 0.025 5 Открыто
PBS 10 5 Открыто
Белок G, биотин 30 0.0025 5 Открыто
PBS 10 5 Открыто
Антитело 20 0.0001 5 15 Открыто
PBS 10 5 Открыто
Клетки
(300000 клеток / мл) 		~ 5 30 Закройте когда ловушки заняты.
Буфера для лизиса 5 30 Открыть в ближайшее время
Ингибиторы (например, 20 мМ HCl) 15 10 Закрыто
PBS 2 30 Закрыто
Обнаружение реагент 5 30 Открыть в ближайшее время
Начать мониторинг реакции

Таблица 1. Поверхность modificatioн протокол для ELISA. Для объяснения, см. текст.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microfluidics технология открыла новые и увлекательные возможности для анализа одноклеточных. В частности, возможность ловушку и обездвижить отдельные участки при микрофлюидных инструментов позволило систематические короткие и долгосрочные исследования о свойствах и ответ одноклеточных. Кроме того, инкапсуляции клеток в высокочастотных микрокапель, генерируемых на микрочипе, позволило единичных исследований секреции клетки, которые не могут быть выполнены с помощью обычных устройств цитометрии. Подход микрокапелькой, однако, имеет некоторые ограничения при инкубации и промывки необходимые для аналитического протокола. Наш подход сочетает в себе обе концепции клеточной захвата и изоляции и, следовательно, это облегчает выполнение более сложных анализов в том числе иммунологических на основе поверхностно-иммобилизованных антител. Кроме того, способ является очень гибкой по отношению к программе и целевых аналитов.

Конструкция микрочипа позволяет (I) эфдостаточные клетки захвата, (II) поставка различных буферов и реагентов, и (III) надежную изоляцию в очень малом объеме, когда это требуется. Таким образом, разбавление молекул-мишеней можно избежать. Шестьдесят (до сотен) из микрокамеры расположены на одном устройстве, позволяя много экспериментов параллельно. В округлой формы закрытия клапанов в микрокамеры можно решить вместе или по отдельности по строкам или столбцам, что очень важно, когда перекрестное загрязнение с соседними камерами должны быть предотвращены. С микрокамеры закрыт, каналы можно лечить с помощью вредных решений, таких как соляная кислота для очистки, не влияя на захваченных клеток. С другой стороны, быстро обмен объема внутри микрокамеры возможно. В настоящее время минимальное время 200 мс необходимо, чтобы полностью открыть камеру и ввести новые реагенты (полный обмен объема микрокамеры, скорость потока должна быть рассмотрена).

В то время как наш метод очень отнiable и воспроизводимым, следует иметь в виду, что существует два основных критических точек в протоколе изготовления чипа и эксплуатации. Во-первых, склеивание двух слоев стружки после активации плазмы должно быть сделано быстро. Выравнивание имеет решающее значение, в противном случае некоторые камеры или даже вся фишка не может использоваться, так как склеивание является необратимым. Этот шаг может быть трудным для неопытных пользователей, однако, после некоторой тренировки даже менее опытные работники лаборатории получить, как правило, хорошие результаты. Вторая критическая точка является чистота при сборке и использование микрочипа. Если частицы пыли присутствуют на поверхности чипа, они могут поставить под угрозу каналы управления и клапаны или даже привести к разрыву в PDMS-PDMS или ПДМС-стекла связи. Поэтому мы тратим много внимания процедурам очистки. Следует отметить, что помимо основной форме изготовления (выполненной в чистой комнате), то производить и использовать микрочипы в нормальном лабораторных условиях, где пыль ай частицы присутствуют.

Несмотря на все заботы, если камеры не закрываются правильно, это может быть что либо напорные трубопроводы блокируются или процесс спин покрытия не обеспечивают правильную толщину мембраны. Кроме того, время от времени мы наблюдали недостаточное сцепление, в результате поломки связи между двумя PDMS слоев. Если количество фишек из той же партии показывают эту проблему, вполне возможно, что время между активацией плазмы и выравнивания слишком длинный. Иногда, мы испытали липкие PDMS на пластины, которые не могли быть полностью удалены и была результатом недостаточной силанизации пластины.

После того, как метод производства установлено, микрофлюидных платформа может использоваться для различных исследований по одном уровне клетки. Здесь мы показали, обнаружение внутриклеточных и секретируемых агентов с различными анализами, но и многие другие анализы возможны на чипе. Большинство белков не флуоресцентный и их деСРЕДЫ через иммунологических не является однозначным. Реализация ELISA в чип принесет огромную пользу. Во-первых, анализ может быть разработан специально для очень желаемого белка (при подходящие антитела присутствуют). Во-вторых, информация из ELISA может быть определена количественно даже при низких пределов концентрации, давая количество белка или молекул копий присутствующих в клетке.

Наш текущий микросхема предназначена для анализа одиночных клеток млекопитающих. Тем не менее, модификации чипа для других клеток, таких как бактерии, водоросли и дрожжи, должна быть возможной. До сих пор, единственным ограничением для экспериментов является необходимость анализа, основанного на флуоресценции. Тем не менее, мы в настоящее время изучают реализацию масс-спектрометрии в качестве метода обнаружения. Как только это установлено, диапазон аналитических задач, которые могут быть исследованы с платформой будет еще шире. Кроме того, поскольку не каждый анализ возможно в присутствии буфера для лизиса клеток, мыв настоящее время также оценки различных других методов лизиса на платформе. Мы уверены, что универсал микрофлюидных платформа, представленная здесь служит основой для новых одноклеточных исследований по протеома, метаболома и secretome уровне.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Тома Робинсона для корректуры рукописи, К. BÄRTSCHI и Х. Benz для строительства заказного системой контроля давления. Мы также хотели бы отметить использование чистое средство номер первый и световой микроскопии центра (LMC), как на ETH Zurich. Работа финансировалась Merck Serono и Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках 7-й Рамочной программы (ERC Starting Grant, проект №. 203428, nμLIPIDs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

Tags

Иммунологии выпуск 80 Microfluidics протеомика системная биология анализ одноклеточного Иммуноанализы Лаборатория на чипе химического анализа
Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S.,… More

Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter